JP2016111941A - 微生物の検出装置 - Google Patents

Abstract

【課題】代謝活性を有していた微生物由来の蛍光を正確かつ容易に検出可能な検出装置を提供する。【解決手段】微生物を含みうる検査対象溶液に糖を添加する糖添加機構３０と、糖を添加された検査対象溶液に微生物を固定する固定剤を添加する固定剤添加機構８０と、糖及び固定剤を添加された検査対象溶液に励起光を照射する光源１０と、励起光を照射された検査対象溶液で生じる蛍光を検出する蛍光検出部１０２と、を備える微生物の検出装置。【選択図】図１

Description

本発明は検出技術に関し、微生物の検出装置に関する。

微生物が発する自家蛍光を検出することにより、微生物の存在を検出する方法が提案されている（例えば、非特許文献１ないし４参照。）。微生物が発する自家蛍光は、微生物に含まれるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）等の代謝産物に由来すると考えられている（例えば、非特許文献４参照。）。皮膚細胞においては、培養液にグルコースを添加すると、ＮＡＤＨの量が増加するとの報告がある（例えば、特許文献１参照。）。

微生物が発する自家蛍光は微弱であり、自家蛍光を観察する前に、微生物に紫外線を照射することによって、微生物が発する自家蛍光の強度を上げることが提案されている（例えば、特許文献２参照。）。また、自家蛍光によらずに、蛍光染色法で染色した微生物を検出することも提案されている（例えば、特許文献３参照。）。さらには、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を検出することにより、細胞の存在の検出する方法も提案されている（例えば、特許文献４参照。）。

特開２０１１−１０７１２４号公報 特開２０１４−１５３１９９号公報 特許第４４８７９８５号公報 特開２０１３−１１６０８３号公報

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本発明者は、鋭意研究の末、特許文献２に記載されているように、紫外線を微生物に照射すると、生きている微生物のみならず、死んでいる微生物においても自家蛍光の強度が上がることを見出した。そのため、特許文献２に記載された方法では、死んでいる微生物に対して、生きていて代謝活性を有する微生物のみの自家蛍光の強度を上げることができない。

また、特許文献３に記載された蛍光染色法は、生菌と死菌の判別が可能であるが、蛍光染色剤は高価かつ有害である。さらに、蛍光染色剤は不安定であり、冷蔵あるいは冷凍して遮光条件下で保管する必要があり、使用期限も短い。

またさらに、特許文献４に記載された方法は、生細胞の細胞壁を破壊し、かつＡＴＰ分解酵素を失活させることによって、細胞内のＡＴＰを抽出する工程が必要である。そのため、特許文献４に記載された方法は、手順が煩雑である。

そこで、本発明は、代謝活性を有していた微生物由来の蛍光を正確かつ容易に検出可能な検出装置を提供することを目的の一つとする。なお、蛍光とは、自家蛍光を含む。

本発明の態様によれば、（ａ）微生物を含みうる検査対象溶液に糖を添加する糖添加機構と、（ｂ）糖を添加された検査対象溶液に微生物を固定する固定剤を添加する固定剤添加機構と、（ｃ）糖及び固定剤を添加された検査対象溶液に励起光を照射する光源と、（ｄ）励起光を照射された検査対象溶液で生じる蛍光を検出する蛍光検出部と、を備える、微生物の検出装置が提供される。

糖添加機構が、糖を添加された検査対象溶液を保管する検査対象溶液タンクを含んでいてもよい。検査対象溶液タンクが、糖を添加された検査対象溶液を所定の時間保管してもよい。糖添加機構が、検査対象溶液タンク内の糖を添加された検査対象溶液の温度を調節する温度調節器を更に含んでいてもよい。

糖添加機構が、検査対象溶液タンクに接続された、糖を含む溶液を保管する糖溶液タンクを更に含んでいてもよい。糖添加機構が、糖溶液タンクから検査対象溶液タンクに、糖を含む溶液を送る糖溶液ポンプを更に含んでいてもよい。

検査対象溶液タンクが、糖を添加された検査対象溶液中に酸素が取り込まれないように、糖を添加された検査対象溶液を保管してもよい。

糖が、グルコース、フルクトース、マンノース、及びヘキソースからなる群から選択される少なくとも一つであってもよい。

固定剤添加機構が、検査対象溶液タンクに接続された、固定剤を含む溶液を保管する固定液タンクを含んでいてもよい。また、固定剤添加機構が、固定液タンクから検査対象溶液タンクに、固定剤を含む溶液を送る固定液ポンプをさらに含んでいてもよい。固定剤がホルムアルデヒド又はメタノールであってもよい。

光源が、糖及び固定剤を添加された、流れている検査対象溶液に励起光を照射してもよい。あるいは、光源が、糖及び固定剤を添加された、静止している検査対象溶液に励起光を照射してもよい。

上記検出装置が、死んでいる微生物が発する自家蛍光の強度と、生きており、糖を与えられた微生物が発する自家蛍光の強度と、の境界値以上の強度の蛍光を検出したときに、検査対象溶液に生きている微生物が含まれていたと判定する判定部をさらに備えていてもよい。

本発明によれば、代謝活性を有していた微生物由来の蛍光を正確かつ容易に検出可能な検出装置を提供可能である。

本発明の実施の形態に係る微生物の検出装置の模式図である。 本発明の実施の形態に係る微生物の検出装置の模式図である。 本発明の実施の形態に係る微生物の炭素代謝系を示す模式図である。 本発明の実施の形態に係る微生物の好気呼吸鎖を示す模式図である。 本発明の実施の形態の実施例１に係る大腸菌のセル・ケーキから発せられた蛍光のスペクトルを示すグラフである。 本発明の実施の形態の実施例１に係る表皮ブドウ球菌のセル・ケーキから発せられた蛍光のスペクトルを示すグラフである。 本発明の参考例に係るＮＡＤＨの励起蛍光マトリックスを示すグラフである。 本発明の実施の形態の実施例２に係る大腸菌の蛍光画像である。 本発明の実施の形態の実施例２に係る表皮ブドウ球菌の蛍光画像である。 本発明の実施の形態の実施例２に係る大腸菌及び表皮ブドウ球菌の蛍光強度を示すグラフである。 本発明の実施の形態の実施例３に係る大腸菌及び表皮ブドウ球菌におけるＮＡＤＨの合成量に相関する４９０ｎｍにおける溶液の吸光度を示すグラフである。 本発明の実施の形態の実施例４に係る大腸菌におけるＮＡＤＨの合成量に相関する５４６ｎｍにおける溶液の吸光度を示すグラフである。 本発明の実施の形態の実施例４に係る表皮ブドウ球菌におけるＮＡＤＨの合成量に相関する５４６ｎｍにおける溶液の吸光度を示すグラフである。 本発明の比較例に係る退色前の死んでいる大腸菌の蛍光画像である。 本発明の比較例に係る退色後の死んでいる大腸菌の蛍光画像である。 本発明の比較例に係る退色後、紫外線を照射されたことにより蛍光強度が上昇した、死んでいる大腸菌の蛍光画像である。

以下に本発明の実施の形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。但し、図面は模式的なものである。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。

実施の形態に係る微生物の検出装置は、図１及び図２に示すように、微生物を含みうる検査対象溶液に糖を添加する糖添加機構３０と、糖を添加された検査対象溶液に微生物を固定する固定剤を添加する固定剤添加機構８０と、糖及び固定剤を添加された検査対象溶液に励起光を照射する光源１０と、励起光を照射された検査対象溶液で生じる蛍光を検出する蛍光検出部１０２と、を備える。

検査対象溶液は、例えば、純水、製薬用水、注射用水、及び培養液であるが、これらに限定されない。また、微生物を含みうるとは、検査対象溶液が微生物を含む可能性があることを意味し、検査のうえ、検査対象溶液が微生物を含んでいないと判定されることもある。

微生物の例としては細菌及び真菌が含まれる。細菌の例としては、グラム陰性菌及びグラム陽性菌が挙げられる。グラム陰性菌の例としては、大腸菌が挙げられる。グラム陽性菌の例としては、表皮ブドウ球菌、枯草菌、マイクロコッカス、及びコリネバクテリウムが挙げられる。真菌の例としては、黒カビ等のアスペルギルスが挙げられる。ただし、微生物はこれらに限定されない。

微生物が励起光を照射されると、微生物に含まれるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）等の蛍光性の代謝産物が、蛍光を発する。なお、蛍光とは、自家蛍光を含む。

糖添加機構３０は、微生物を含むか否かを検査される検査対象溶液を保管する検査対象溶液タンク３１と、検査対象溶液タンク３１内の溶液の温度を調節する温度調節器３２と、を含む。検査対象溶液タンク３１には、検査対象溶液タンク３１に検査対象溶液を送液するためのパイプ等の流路６１が接続されている。流路６１には、第１の送液ポンプ７１が設けられている。流路６１は、例えばプラントの配管に接続されていてもよいが、これに限定されない。

糖添加機構３０は、流路６２を介して検査対象溶液タンク３１に接続された、糖を含む溶液を保管する糖溶液タンク３３をさらに含む。糖としては、グルコース、フルクトース、マンノース、及びヘキソース等を挙げることができる。流路６２には、糖溶液タンク３３から検査対象溶液タンク３１に、糖を含む溶液を送る糖溶液ポンプ７２が設けられている。

例えば、第１の送液ポンプ７１によって流路６１から検査対象溶液タンク３１内に検査対象溶液が貯められ、さらに糖溶液ポンプ７２によって流路６２から糖溶液が検査対象溶液タンク３１内の検査対象溶液に添加される。その後、検査対象溶液タンク３１は、糖を添加された検査対象溶液を、例えば３０分間等、所定の時間保管する。その間、温度調節器３２は、検査対象溶液タンク３１内の糖を添加された検査対象溶液の温度を調節して、例えば３０℃から３７℃に保つ。これにより、検査対象溶液内に含まれうる微生物がインキュベートされる。

なお、検査対象溶液タンク３１が糖を添加された検査対象溶液を保管する時間は、後述するように、検査対象溶液に含まれうる微生物においてＮＡＤＨ等の蛍光性の代謝産物が増大する時間であれば、特に限定されない。また、温度調節器３２が調節する、糖を添加された検査対象溶液の温度は、後述するように、検査対象溶液に含まれうる微生物においてＮＡＤＨ等の蛍光性の代謝産物が増大する温度であれば、特に限定されない。

例えば検査対象溶液に微生物が含まれている場合、検査対象溶液タンク３１内で糖を添加されることによって微生物が富栄養状態となる。富栄養状態となると、図３に示すように、例えば微生物の炭素代謝系において蛍光性の代謝産物であるＮＡＤＨが生成される。ＮＡＤＨは、励起光を照射されると、自家蛍光を発する。そのため、糖を与えられた、生きており代謝活性を有している微生物は、励起光を照射されたときに、貧栄養状態のときと比べて、強い自家蛍光を発するようになる。

なお、代謝活性を有していない微生物、あるいは死んでいる微生物は、糖添加機構３０によって微生物に糖が添加されても、ＮＡＤＨの合成量が増大することはない。そのため、代謝活性を有していない微生物、あるいは死んでいる微生物は、糖添加機構３０によって微生物に糖が添加されても、貧栄養状態のときと比べて、強い自家蛍光を発するようにはならない。

また、図４に示すように、微生物の好気呼吸鎖において、ＮＡＤＨの水素が酸化される。そのため、励起光を照射されたときに微生物から発せられる自家蛍光の強さは、微生物の呼吸活性と反比例する傾向にある。したがって、微生物の酸素呼吸によるＮＡＤＨの消費を抑制するために、図１に示す検査対象溶液タンク３１は、糖を添加された検査対象溶液中に酸素が取り込まれないよう、糖を添加された検査対象溶液を保管してもよい。例えば、糖を添加された検査対象溶液の体積が検査対象溶液タンク３１の体積の８割以上１０割以下となるよう、検査対象溶液タンク３１に糖を添加された検査対象溶液が充填される。これにより、糖を添加された検査対象溶液に空気中の酸素が取り込まれることを抑制することが可能となる。

固定剤添加機構８０は、流路６６を介して検査対象溶液タンク３１に接続された、固定剤を含む溶液を保管する固定液タンク３５を含む。固定剤としては、ホルムアルデヒド、及びメタノールを挙げることができる。固定剤を含む溶液としては、ホルマリン、及び任意の濃度のメタノールを挙げることができる。流路６６には、固定液タンク３５から検査対象溶液タンク３１に、固定剤を含む溶液を送る固定液ポンプ７５が設けられている。

固定剤添加機構８０は、検査対象溶液タンク３１で糖を添加されて所定の時間保管された検査対象溶液に、固定剤を含む溶液を添加する。これにより、検査対象溶液に含まれている微生物が固定される。糖を与えることによってＮＡＤＨの蓄積量が増大した微生物は、固定されると、代謝が止まる。そのため、固定された微生物においては、ＮＡＤＨの蓄積量が減少しない。

検査対象溶液タンク３１で糖及び固定剤を添加された検査対象溶液は、第２のポンプ７３によって流路６３を経てリザーバータンク３４に送られる。リザーバータンク３４は、流量に制限があるセル４０に送られる糖及び固定剤を添加された検査対象溶液を一時保管する。リザーバータンク３４内の糖及び固定剤を添加された検査対象溶液は、第３のポンプ７４によって流路６４を経てセル４０に送られる。セル４０は透明であり、光源１０が照射する励起光の焦点に位置する。

光源１０は、セル４０中を流れる、糖及び固定剤を添加された検査対象溶液に向けて、励起光を照射する。光源１０としては、例えば、発光ダイオード（ＬＥＤ）及びレーザが使用可能である。励起光の波長は、例えば２５０ないし５５０ｎｍである。励起光は、可視光であっても、紫外光であってもよい。励起光が可視光である場合、励起光の波長は、例えば４００ないし５５０ｎｍの範囲内であり、例えば４０５ｎｍである。励起光が紫外光である場合、励起光の波長は、例えば３００ないし３８０ｎｍの範囲内であり、例えば３６５ｎｍ又は３４０ｎｍである。ただし、励起光の波長は、これらに限定されない。図２に示すように、光源１０には、光源１０に電力を供給する光源駆動電源１１が接続されている。光源駆動電源１１には、光源１０に供給される電力を制御する電源制御装置１２が接続されている。

蛍光検出部１０２は、微生物が発する自家蛍光を検出する。蛍光検出部１０２は、蛍光波長帯域の光を受光する受光素子２０を備える。受光素子２０としては、フォトダイオード及び光電子増倍管等が使用可能であり、光を受光すると、光エネルギーを電気エネルギーに変換する。

受光素子２０には、受光素子２０で生じた電流を増幅する増幅器２１が接続されている。増幅器２１には、増幅器２１に電力を供給する増幅器電源２２が接続されている。また、増幅器２１には、増幅器２１で増幅された電流を受け取り、受光素子２０が受光した光の強度を算出する光強度算出装置２３が接続されている。光強度算出装置２３は、例えば、検出した光のスペクトルの面積に基づいて、光の強度を算出する。光強度算出装置２３には、光強度算出装置２３が算出した光の強度を保存する光強度記憶装置２４が接続されている。

微生物の検出装置は、励起光を照射された液体中で生じた、励起光と波長が同じ散乱光を検出する散乱光検出部１０５をさらに備えていてもよい。散乱光検出部１０５は、検査光を照射された微生物で生じる散乱光を検出する。散乱光検出部１０５は、散乱光を受光する散乱光受光素子５０を備える。散乱光受光素子５０としては、フォトダイオード等が使用可能であり、光を受光すると、光エネルギーを電気エネルギーに変換する。

散乱光受光素子５０には、散乱光受光素子５０で生じた電流を増幅する増幅器５１が接続されている。増幅器５１には、増幅器５１に電力を供給する増幅器電源５２が接続されている。また、増幅器５１には、増幅器５１で増幅された電流を受け取り、散乱光受光素子５０が受光した散乱光の強度を算出する光強度算出装置５３が接続されている。光強度算出装置５３には、光強度算出装置５３が算出した散乱光の強度を保存する光強度記憶装置５４が接続されている。

セル４０内を検査対象溶液が流れると、光源１０が励起光を照射し、蛍光検出部１０２が蛍光波長帯域の光の強度を測定し、時系列的に光強度記憶装置２４に保存する。また、散乱光検出部１０５が、散乱光を測定し、散乱光の光強度を時系列的に光強度記憶装置５４に保存する。セル４０を流れた検査対象溶液は、流路６５から排出される。

実施の形態に係る微生物の検出装置は、中央演算処理装置（ＣＰＵ）３００をさらに含む。ＣＰＵ３００は、判定部３０１を含む。判定部３０１は、蛍光波長帯域の光の強度の値を光強度記憶装置２４から読み出す。また、判定部３０１は、散乱光の強度を、光強度記憶装置５４から読み出す。判定部３０１は、蛍光波長帯域の光と、散乱光と、が、同時に検出されたとき、検査対象溶液に微生物が含まれていると判定する。

また、判定部３０１は、予め、死んでいる微生物が発する自家蛍光の強度と、生きており、糖を与えられた微生物が発する増大した自家蛍光の強度と、の境界値を設定し、当該境界値以上の自家蛍光の強度を検出したときに、固定剤が添加される前は生きていた微生物が検査対象溶液に含まれていたと判定してもよい。

判定部３０１は、例えば、判定結果を出力装置４０１から出力する。出力装置４０１としては、ディスプレイ、スピーカ、及びプリンタ等が使用可能である。

以上説明した、実施の形態に係る微生物の検出装置によれば、検査対象溶液が、微生物にとって栄養に乏しいものであった場合においても、糖添加機構３０によって微生物に糖が添加され、生きており代謝活性を有している微生物においてＮＡＤＨの合成量が増大する。そのため、蛍光検出部１０２において、生きており代謝活性を有している微生物に含まれるＮＡＤＨ由来の蛍光の強度が強くなる。よって、検査対象溶液に含まれる、生きており代謝活性を有していた微生物を正確かつ容易に検出することが可能となる。

また、固定剤を添加する前から代謝活性を有していない微生物、あるいは死んでいる微生物は、糖添加機構３０によって微生物に糖が添加されても、ＮＡＤＨの合成量が増大することはない。そのため、実施の形態に係る微生物の検出装置は、固定剤を添加する前から代謝活性を有していない微生物、あるいは死んでいる微生物に対して、固定剤を添加するまで代謝活性を有していた微生物を高い感度で検出することが可能である。

さらに、微生物の種類によっては、代謝速度が速く、代謝の中間産物であるＮＡＤＨの消費が速いものがある。そのため、糖添加機構３０によって微生物に糖を与えることによってＮＡＤＨの蓄積量を増大させても、その後、すみやかにＮＡＤＨが消費されてしまう場合がある。ＮＡＤＨが消費されてしまうと、微生物が発する自家蛍光も弱くなる。これに対し、固定剤添加機構８０によって、糖添加によりＮＡＤＨの蓄積量が増大した微生物を固定すると、ＮＡＤＨの蓄積量が減少しない。そのため、固定剤添加機構８０は、糖添加によるＮＡＤＨの蓄積量の増大による、上昇した自家蛍光強度の維持を可能にする。

（その他の実施の形態）
上記のように本発明を実施の形態によって記載したが、この開示の一部をなす記述及び図面はこの発明を限定するものであると理解するべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかになるはずである。例えば、粒子による散乱光の強度は、粒子の粒径と相関する。また、微生物の粒径は、微生物の種類によって異なる。そのため、検出した散乱光の強度から、検査対象溶液に含まれる微生物の種類を特定してもよい。また、図１においては、セル４０内を流れている検査対象溶液に励起光を照射する例を示したが、容器中に保存された、流れていない、静止している検査対象溶液に励起光を照射してもよい。このように、本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を包含するということを理解すべきである。

（調製例１）
微生物として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，ＡＴＣＣ１３７０６）と、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ，ＡＴＣＣ１２２２８）を用意した。次に、−８０℃でストックされた大腸菌、及び表皮ブドウ球菌のそれぞれを容積が３００ｍＬの三角フラスコ中の１５０ｍＬのトリプトソイ液体培地（ベクトン・ディッキンソン アンド カンパニー、型番：２１１８２５）に植菌し、定常期に達するまで３２℃で一夜、好気的に培養した。

培養後、培養液を遠心機（久保田商事株式会社、２４１０）で２，１００ｇｘ１０分で遠心して集菌した。上清の培地を取り除いた後、菌を５％グルコース−リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。さらに、同条件で遠心し、上清を取り除くことで菌を洗浄した。当該洗浄を計３回繰り返し、再度、菌を、２０ｍＬの５％グルコース−ＰＢＳに懸濁した。また、対照として、糖を添加していないＰＢＳで同様の処理をした菌の懸濁液も調製した。

次に、懸濁液を、蓋をしっかり締めることによって、酸素の供給を制限した５０ｍＬの遠心管中で、３２℃、３〜４時間、菌体が沈まないよう振とうしながらインキュベートした。インキュベート終了後、ただちに終濃度４％になるようにホルムアルデヒド（シグマアルドリッチ、型番：Ｆ８７７５）を添加して菌を固定し、遠心してその沈殿をセル・ケーキ（Ｃｅｌｌ ｃａｋｅ）とした。また、セル・ケーキの一部を１．５ｍＬの遠心管に取り分け、滅菌水を加えて遠心機（日立、ＣＴ−１３Ｒ）で１回遠心洗浄したのち、沈殿物を滅菌水に再懸濁して、菌の懸濁液を得た。

（実施例１）
調製例１で調製したセル・ケーキをスライドガラス上に十分量塗布し、スライドガラスを蛍光分光光度計（日本分光株式会社、ＦＰ８５００）のフィルム測定ホルダに固定した。蛍光分光光度計において、励起光の励起波長を３６５ｎｍとし、励起光源側に３６０−３７０ｎｍ透過のバンドパスフィルター、蛍光検出器側に４２０ｎｍカットオンのロングパスフィルターを使用し、セル・ケーキから発せられる蛍光スペクトルを取得した。

その結果、図５に示すように、糖を添加された溶液でインキュベートされた大腸菌のセル・ケーキから発せられた蛍光のスペクトルは、糖を添加されなかった溶液でインキュベートされた大腸菌のセル・ケーキから発せられた蛍光のスペクトルと比較して、ピークにおける蛍光強度が増大した。このことは、糖（グルコース）の添加により、大腸菌内においてＮＡＤＨが蓄積されたことを示している。

また、図６に示すように、糖を添加された溶液でインキュベートされた表皮ブドウ球菌のセル・ケーキから発せられた蛍光のスペクトルは、糖を添加されなかった溶液でインキュベートされた表皮ブドウ球菌のセル・ケーキから発せられた蛍光のスペクトルと比較して、ピークにおける蛍光強度が増大した。このことは、糖（グルコース）の添加により、表皮ブドウ球菌内においてＮＡＤＨが蓄積されたことを示している。

（参考例）
終濃度が１３μｍｏｌ／ＬとなるようにＮＡＤＨ・２Ｎａ（和光純薬、型番：０４２−１６２３３）をＰＢＳに溶解し、ＮＡＤＨ溶液を得た。得られたＮＡＤＨ溶液の励起・蛍光マトリックス（ＥＥＭ：Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ−Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｍａｔｒｉｘ）蛍光分光光度計（日本分光株式会社、ＦＰ８５００）で測定した。励起・蛍光マトリックスは、励起波長を連続的に変化させながら蛍光スペクトル計測し、得られた蛍光スペクトルを 励起波長ごとに並べることによって得られる。結果として、図７に示すＮＡＤＨの励起・蛍光マトリックスが得られた。図７に示すように、ＮＡＤＨは、約３５０ｎｍの励起光を照射すると、強い蛍光を発するが、４０５ｎｍの励起光で照射された場合は、弱い蛍光を発する。

（実施例２）
調製例１で得た菌の懸濁液０．５μＬをスライドガラスに塗布し、風乾した後に、スライドガラス上の菌を蛍光顕微鏡（オリンパス、ＢＸ５１）で観察し、励起波長４０５ｎｍによる蛍光画像を撮影した。蛍光顕微鏡には、蛍光ミラーユニット（オリンパス、Ｕ−ＭＮＶ２フィルターキューブ）を使用した。その結果、図８及び図９に示すように、大腸菌及び表皮ブドウ球菌のいずれにおいても、糖（グルコース）を添加せずにインキュベートした場合と比較して、糖（グルコース）を添加してインキュベートした場合の方が、明るい蛍光画像が得られた。

さらに、撮影した蛍光画像を、画像解析ソフトウェア（メディアサイバーネティックス社、ＩｍａｇｅＰｒｏ Ｐｌｕｓ）で、グレースケール変換した後、同画像解析ソフトウェアに菌を認識させ、ピクセルあたりのグレースケール値の平均値をとることで、菌が発した蛍光の強度を数値化した。その結果、図１０に示すように、大腸菌及び表皮ブドウ球菌のいずれにおいても、糖（グルコース）を添加せずにインキュベートした場合と比較して、糖（グルコース）を添加してインキュベートした場合の方が、強い蛍光を発することが明らかとなった。

また、参考例で示したように、励起光の波長が４０５ｎｍのときは、励起光の波長が約３５０ｎｍのときと比べて、ＮＡＤＨは弱い蛍光を発する。しかし、本実施例の結果は、糖（グルコース）及び固定剤（ホルムアルデヒド）の添加によりＮＡＤＨの蓄積を図ることで、励起光の波長が４０５ｎｍでも、明るい蛍光画像が得られることを示している。

（調製例２）
−８０℃でストックされた大腸菌、及び表皮ブドウ球菌を３ｍＬのトリプトソイ液体培地に植菌し、定常期に達するまで３２℃で一夜、好気的に培養した。培養後、培養液を遠心機（日立、ＣＴ−１３Ｒ）で２，１００ｇｘ５分で遠心して集菌した。上清の培地を取り除いた後、菌を５％グルコース−ＰＢＳに再懸濁した。さらに、同条件で遠心し、上清を取り除くことで菌を洗浄した。当該洗浄を計３回繰り返し、再度、菌を、５％グルコース−ＰＢＳに懸濁して、懸濁液を得た。また、対照として、糖を添加していないＰＢＳで同様の処理をした菌の懸濁液も調製した。

（実施例３）
調製例２で調製した懸濁液を、ただちに、６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ：Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ）が０．７５となるように、希釈して、希釈液を得た。さらに、代謝阻害剤プロクリン２００（シグマアルドリッチ）を終濃度１５ｐｐｍになるように添加した希釈液も調製した。

その後、ただちに、希釈液にＮＡＤＨ検出試薬（プロメガ社、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標） ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ）を添加し、遮光して３７℃で４時間インキュベートした。ＮＡＤＨ検出試薬の取扱説明書によれば、この間、ＮＡＤＨ検出試薬に含まれるテトラゾリウム化合物が菌によって生物的に還元され、溶液に可溶な発色性のホルマザン産物へと変換される。この変換は、代謝活性がある菌のデヒドロゲナーゼによって産生されるＮＡＤＨによって行われると考えられる。反対に、菌に代謝活性がない場合、この変換は生じない。そのため、ホルマザン産物の量は、代謝活性を有する菌のＮＡＤＨの合成量に比例するものと考えられる。

４時間インキュベートした後、希釈液を遠心して菌を除き、ホルマザン産物の量を示す４９０ｎｍにおける希釈液の吸光度を測定した。その結果、図１１に示すように、大腸菌及び表皮ブドウ球菌のいずれにおいても、糖（グルコース）の添加により、ＮＡＤＨの合成量が増加することが示された。一方、大腸菌及び表皮ブドウ球菌のいずれにおいても、糖（グルコース）とともに代謝阻害剤を添加すると、ＮＡＤＨの合成量が減少することが示された。このことは、ＮＡＤＨ由来の自家蛍光を測定することによって、代謝活性を有する微生物を検出することが可能であることを示している。

（調製例３）
−８０℃でストックされた大腸菌、及び表皮ブドウ球菌を３ｍＬのトリプトソイ液体培地に植菌し、定常期に達するまで３２℃で一夜、好気的に培養した。培養後、培養液を遠心機（日立、ＣＴ−１３Ｒ）で２，１００ｇｘ５分で遠心して集菌した。上清の培地を取り除いた後、菌を５％グルコース−滅菌水に再懸濁した。さらに、同条件で遠心し、上清を取り除くことで菌を洗浄した。当該洗浄を計３回繰り返し、再度、菌を、５％グルコース−滅菌水に懸濁して、懸濁液を得た。また、対照として、糖を添加していない滅菌水で同様の処理をした菌の懸濁液も調製した。

（実施例４）
調製例３で調製した懸濁液を、ただちに、６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ：Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ）が０．７５となるように、希釈して、希釈液を得た。その後、ただちに、希釈液に、ＮＡＤＨ検出試薬（プロメガ社、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標） ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ）を添加し、遮光して３７℃でインキュベートした。ＮＡＤＨ検出試薬添加直後を０時間として、希釈液の一部を採取、遠心して菌を除き、ＮＡＤＨの合成量を示す５４６ｎｍにおける希釈液の吸光度を測定した。以後、１時間ごとに同様に測定した。その結果、図１１及び図１２に示すように、大腸菌及び表皮ブドウ球菌のいずれにおいても、糖（グルコース）の添加により、ＮＡＤＨの合成量が増加することが示され、糖（グルコース）無添加のサンプルとの差異は、インキュベート３０分後から確認できることが示唆された。

（比較例）
滅菌水に懸濁した大腸菌に、終濃度が４％になるようにホルムアルデヒドを添加し、約２分間静置して、大腸菌を殺菌し、固定した。次に、遠心機（日立、ＣＴ−１３Ｒ）を使用して、滅菌水で２回、大腸菌を洗浄した後、大腸菌を滅菌水に再懸濁した。その後、０．５μＬの懸濁液をスライドガラスに滴下して風乾し、蛍光顕微鏡（オリンパス、ＢＸ５１）で、Ｕ−ＭＮＶ２フィルターキューブを使用して大腸菌を観察した。このとき、励起光で大腸菌を９０秒間露光したところ、図１４及び図１５に示すように、蛍光の退色が確認された。

その後、蛍光顕微鏡で観察したスライドガラスを、蛍光分光光度計（日本分光株式会社、ＦＰ８５００）にセットし、２００ｎｍの紫外線を１０分間照射した。その後、再び、蛍光顕微鏡でスライドガラス上の大腸菌を観察したところ、図１６に示すように、紫外線照射前と比較して、蛍光強度が強くなったことが確認された。この結果は、紫外線の照射により、一度退色した蛍光が明るくなること、また、紫外線の照射により、死んでいる微生物でも蛍光強度が強くなり、代謝活性を有する微生物の検出の妨げになることを示している。

以下に限定されないが、本発明は、医薬用精製水、食品用精製水、飲料用精製水、及び半導体装置製造用精製水の製造現場等で利用可能である。

１０ 光源
１１ 光源駆動電源
１２ 電源制御装置
２０ 受光素子
２１ 増幅器
２２ 増幅器電源
２３ 光強度算出装置
２４ 光強度記憶装置
３０ 糖添加機構
３１ 検査対象溶液タンク
３２ 温度調節器
３３ 糖溶液タンク
３４ リザーバータンク
３５ 固定液タンク
４０ セル
５０ 散乱光受光素子
５１ 増幅器
５２ 増幅器電源
５３ 光強度算出装置
５４ 光強度記憶装置
６１、６２、６３、６４、６５、６６ 流路
７１ 第１の送液ポンプ
７２ 糖溶液ポンプ
７３ 第２のポンプ
７４ 第３のポンプ
７５ 固定液ポンプ
８０ 固定剤添加機構
１０２ 蛍光検出部
１０５ 散乱光検出部
３０１ 判定部
４０１ 出力装置

Claims (14)

1. 微生物を含みうる検査対象溶液に糖を添加する糖添加機構と、
   前記糖を添加された検査対象溶液に前記微生物を固定する固定剤を添加する固定剤添加機構と、
   前記糖及び前記固定剤を添加された前記検査対象溶液に励起光を照射する光源と、
   前記励起光を照射された前記検査対象溶液で生じる蛍光を検出する蛍光検出部と、
   を備える、微生物の検出装置。
2. 前記糖添加機構が、前記糖を添加された検査対象溶液を保管する検査対象溶液タンクを含む、請求項１に記載の微生物の検出装置。
3. 前記検査対象溶液タンクが、前記糖を添加された検査対象溶液を所定の時間保管する、請求項２に記載の微生物の検出装置。
4. 前記糖添加機構が、前記検査対象溶液タンク内の前記糖を添加された検査対象溶液の温度を調節する温度調節器を更に含む、請求項２又は３に記載の微生物の検出装置。
5. 前記糖添加機構が、前記検査対象溶液タンクに接続された、糖を含む溶液を保管する糖溶液タンクを更に含む、請求項２ないし４のいずれか１項に記載の微生物の検出装置。
6. 前記糖添加機構が、前記糖溶液タンクから前記検査対象溶液タンクに、前記糖を含む溶液を送る糖溶液ポンプを更に含む、請求項５に記載の微生物の検出装置。
7. 前記検査対象溶液タンクが、前記糖を添加された検査対象溶液中に酸素が取り込まれないように、前記糖を添加された検査対象溶液を保管する、請求項２ないし６のいずれか１項に記載の微生物の検出装置。
8. 前記糖が、グルコース、フルクトース、マンノース、及びヘキソースからなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の微生物の検出装置。
9. 前記固定剤添加機構が、前記検査対象溶液タンクに接続された、固定剤を含む溶液を保管する固定液タンクを含む、請求項２ないし７のいずれか１項に記載の微生物の検出装置。
10. 前記固定剤添加機構が、前記固定液タンクから前記検査対象溶液タンクに、前記固定剤を含む溶液を送る固定液ポンプを更に含む、請求項９に記載の微生物の検出装置。
11. 前記固定剤がホルムアルデヒド又はメタノールである、請求項１、９及び１０のいずれか１項に記載の微生物の検出装置。
12. 前記光源が、前記糖及び前記固定剤を添加された、流れている前記検査対象溶液に励起光を照射する、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の微生物の検出装置。
13. 前記光源が、前記糖及び前記固定剤を添加された、静止している前記検査対象溶液に励起光を照射する、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の微生物の検出装置。
14. 死んでいる微生物が発する自家蛍光の強度と、生きており、糖を与えられた微生物が発する自家蛍光の強度と、の境界値以上の強度の蛍光を検出したときに、前記検査対象溶液に生きている微生物が含まれていたと判定する判定部を更に備える、請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の微生物の検出装置。