KR101135717B1

KR101135717B1 - 미생물 활성 측정방법

Info

Publication number: KR101135717B1
Application number: KR1020100000471A
Authority: KR
Inventors: 김선용; 형기우; 형성훈
Original assignee: (주)동양화학; 동양하이테크산업주식회사
Priority date: 2010-01-05
Filing date: 2010-01-05
Publication date: 2012-04-13
Also published as: KR20110080305A

Abstract

본 발명은 미생물의 활성 또는 개체수를 정밀하게 측정할 수 있는 미생물 활성 측정방법에 관한 것으로서, 원수 중의 미생물의 농도를 실시간으로 감시할 수 있는 모니터링 시스템의 구축이 용이한 미생물 활성 측정방법에 관한 것이다.
본 발명의 미생물 활성 측정방법은 원수이송라인을 통해 이동되는 원수 중의 일부를 시료저장용기로 유입시켜 시료를 채취하는 제 1단계와, 시료저장용기와 제 1연결관으로 연결되고 상기 시료를 운반하기 위한 이송용액이 저장된 이송용액저장용기와 제 2연결관으로 연결되어 상기 제 1연결관 또는 제 2연결관의 유로를 선택적으로 단속하는 유로변환부로부터 상기 시료 또는 이송용액을 인젝션밸브로 교대로 펌핑하는 제 2단계와, 인젝션 밸브로부터 배출되는 시료 및 이송용액에 광을 조사하여 시료 중에 함유된 미생물로부터 생성된 형광을 검출하는 제 3단계와, 제 3단계에서 검출된 형광신호 중 시료 내의 기포 또는 광원에 의해 발생된 시그널 노이즈를 제거하는 제 4단계와, 제 4단계에서 출력되는 신호를 디스플레이하는 제 5단계를 포함한다.

Description

미생물 활성 측정방법{Microoraganisms activity measuring method}

본 발명은 미생물의 활성 또는 개체수를 정밀하게 측정할 수 있는 미생물 활성 측정방법에 관한 것으로서, 원수 중의 미생물의 농도를 실시간으로 감시할 수 있는 모니터링 시스템의 구축이 용이한 미생물 활성 측정방법에 관한 것이다.

오늘날 심각한 환경오염으로 인해 수질이나 대기 오염원에 대한 측정과 예방에 대한 연구가 필수불가결하다.

특히, 상수원이 지하수인 선진국과 달리 우리나라는 90%이상 지표수(강물)를 사용한다. 지표수에 유기물이 유입되면 수질의 부영양화 현상이 심화되어 미생물의 개체수가 증가되며 이는 곧바로 심각한 수질오염을 초래하게 된다.

수질 내 미생물은 인체에 유입되면 식중독이나 각종 질병을 야기시켜 미생물 자체가 유해할 수 있고 유독성 물질이 미생물(Virus, Bacteria, Giardia 등)에 부착되어 포낭(Cyst)형태로 생존할 경우 약품 소독에도 내성이 강할 뿐 아니라 소독효과도 떨어져 식수의 안전을 위협한다.

이러한 식수의 안정적인 관리 및 모니터링을 위해서는 수질 내 미생물의 정확한 검출이 필요하다.

기존의 미생물 검출법으로는 미생물 시료를 고체배지에 도말하여 배양한 후 생성된 미생물 콜로니수를 측정하는 고체배지 도말법을 사용하였다. 최근에는 광학현미경으로 미생물 시료의 이미지를 저장하여 미생물 수를 검출하는 센서나 미생물 발효공정에서 고농도의 미생물을 측정하는 센서도 개발되었다.

그러나 이러한 상기 센서들은 빈번한 샘플채취나 이로 인한 미생물 시료의 오염, 저농도 대역의 미생물 불검출 및 검출시간이 오래 걸린다는 등의 문제점을 가지고 있다.

또 다른 검출방법으로 수질 내 미생물의 검출에는 미생물의 대사물질인 NADH나 NAD(P)H를 형광검출하여 측정된 검출 값에 상응하는 미생물의 개체수로 변환하는 방법이 있다.

미생물은 대사과정에서 NADH를 생산하거나 소비하는데, NADH는 340 nm의 빛에 의해 여기되어 450 nm에서 방출하는 특성을 지닌다. 따라서 미생물의 검출을 위해 340 nm의 빛이 조사되어 미생물 내부 또는 외부로 방출한 NADH에 전달될 때 450 nm에서 방출되는 형광을 측정하여 미생물의 존재 여부를 파악할 수 있다.

대한민국 등록 공개특허 제 10-2009-0075739호에는 미생물 농도측정센서 및 미생물 농도측정 시스템이 개시되어있다.

상기 개시된 미생물 농도측정센서는 금을 증착시킨 실리콘 웨이퍼를 전극으로 또한 PDMS 고분자를 지지체로 사용하여 미생물의 농도를 측정하게 되어있다. 이러한 미생물 농도측정 센서는 미생물의 농도에 따라 전극표면에서 발생하는 도전율(Conductivity)이 달라진다는 원리를 이용하며 시료수 내 미생물의 농도가 증가할수록 전극표면에 많은 미생물이 점착되어 전극표면에서 발생하는 도전율이 증가한다. 이러한 종래의 미생물 농도측정 센서는 전극측정 방법을 이용하는 것으로서, 광학적 측정법에 비해 측정값이 부정확하며 전극표면에 미생물의 점착으로 인해 센서의 수명이 단측된다는 문제점이 있다.

본 발명은 상기의 문제점을 개선하고자 창출된 것으로서, 본 발명은 측정 대상이 되는 원수로부터 주기적으로 시료를 채취하고, 채취한 시료 중에 함유된 미생물의 농도를 측정함으로써 원수 중의 미생물의 농도를 실시간으로 감시할 수 있는 모니터링 시스템의 구축이 용이한 미생물 활성 측정방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 미생물 활성 측정방법은 원수이송라인을 통해 이동되는 원수 중의 일부를 시료저장용기로 유입시켜 시료를 채취하는 제 1단계와; 상기 시료저장용기와 제 1연결관으로 연결되고 상기 시료를 운반하기 위한 이송용액이 저장된 이송용액저장용기와 제 2연결관으로 연결되어 상기 제 1연결관 또는 제 2연결관의 유로를 선택적으로 단속하는 유로변환부로부터 상기 시료 또는 이송용액을 인젝션밸브로 교대로 펌핑하는 제 2단계와; 상기 인젝션 밸브로부터 배출되는 시료 및 이송용액에 광을 조사하여 시료 중에 함유된 미생물로부터 생성된 형광을 검출하는 제 3단계와; 상기 제 3단계에서 검출된 형광신호 중 시료 내의 기포 또는 광원에 의해 발생된 시그널 노이즈를 제거하는 제 4단계와; 상기 제 4단계에서 출력되는 신호를 디스플레이하는 제 5단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 제 4단계는 락인앰프를 통해 상기 제 3단계에서 검출되어 출력된 신호를 참조신호와 승산하고, 승산결과신호를 로우패스 필터를 통해 출력하는 것을 특징으로 한다.

상기 제 3단계는 빛의 유입이 차단된 챔버의 내부에 설치되며 상기 인젝션밸브의 출구와 연결된 튜브로 시료 및 이송용액을 유입시킨 후 상기 튜브를 통과하는 시료로 광을 조사하여 미생물로부터 발생된 형광을 필터링한 다음 형광의 진로를 직각으로 변환시켜 광검출기에서 형광을 검출하는 것을 특징으로 한다.

상술한 바와 같이 본 발명에 의하면 원수로부터 소량의 시료를 자동으로 채취하기 때문에 빈번한 샘플 채취로 인한 미생물 시료의 오염을 방지할 수 있으며 closed system에서 처리되므로 미생물 시료를 검출하는데 적합하고 시료 소모량이 적고 발생 폐수의 양을 최소화할 수 있다.

또한, 음용수 중의 미생물의 농도를 실시간으로 감시할 수 있는 모니터링 시스템을 구축할 수 있는 기반을 제공한다.

도 1은 본 발명의 일 실시 예에 적용된 미생물 활성측정장치를 간략하게 나타낸 구성도이고,
도 2는 검출부의 다른 예를 나타내는 구성도이고,
도 3은 본 발명에 적용된 검출부에서 검출한 출력신호를 나타내는 그래프이고,
도 4는 미생물의 농도에 따른 형광 검출량을 측정한 그래프이고,
도 5는 NADH의 농도에 따른 형광 검출량을 측정한 그래프이고,
도 6은 시험구와 대조구의 표면에 부착된 E. coil JM109를 나타내는 SEM사진과 이를 정량적으로 나타낸 그래프이고,
도 7은 시험구와 대조구의 표면에 침착된 B. cereus 318을 나타내는 SEM사진과 이를 정량적으로 나타낸 그래프이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 미생물 활성 측정방법에 대해서 구체적으로 설명한다.

본 발명의 일 실시 예에 따른 미생물 활성 측정방법은 원수 중의 일부를 시료저장용기로 유입시켜 시료를 채취하는 제 1단계와, 시료 또는 이송용액을 인젝션밸브로 교대로 펌핑하는 제 2단계와, 인젝션 밸브로부터 배출되는 시료 및 이송용액에 광을 조사하여 시료 중의 미생물을 검출하는 제 3단계와, 제 3단계에서 출력된 신호 중 시그널 노이즈를 제거하는 제 4단계와, 출력되는 신호를 디스플레이하는 제 5단계를 포함한다.

먼저, 상술한 본 발명에 적용되는 미생물 활성측정장치의 일 예를 설명한다.

도 1을 참조하면, 미생물 활성 측정장치는 시료저장용기(10)와, 이송용액저장용기(20)와, 유로변환부(30)와, 펌프(40)와, 인젝션밸브(50)와, 검출부(60)와, 신호변환부(91)와, 락인앰프(92)와, 제어부(93)와, 표시부(95)를 구비한다.

시료저장용기(10)에는 일정량의 시료가 저장된다. 시료저장용기(10)에는 원수이송라인(미도시)으로부터 분기된 분기유입관(11)을 통해 측정하고자 하는 원수, 즉 시료가 유입된다. 그리고 유입량만큼 분기유출관(13)을 통해 다시 원수이송라인으로 유출된다. 원수이송라인으로 상수도 라인이 적용될 수 있다.

본 발명에서 원수는 미생물의 농도를 측정하고자 하는 대상수를 의미한다. 본 발명은 음용이 가능한 상수 또는 식수 중의 미생물의 농도를 측정하여 안전한 음용수를 제공하고자 하는 것이나, 이와 달리 음용할 수 없는 상수 또는 식수 외에의 물도 대상수가 될 수 있다.

이송용액저장용기(20)에는 일정량의 이송용액이 저장된다. 이송용액은 시료를 운반하기 위한 캐리어(carrier)의 역할을 하는 것으로서, 간헐적으로 공급되는 시료를 운반하여 인젝션밸브(50)의 출구로 밀어낸다. 본 발명에서 이송용액으로 멸균된 증류수를 이용할 수 있다.

유로변환부(30)는 시료저장용기(10)와 제 1연결관(15)으로 연결되고, 이송용액저장용기(20)와는 제 2연결관(25)으로 연결된다. 그리고 유로변환부(30)의 출구는 이송관(35)과 연결된다. 유로변환부(30)는 선택적으로 제 1연결관(15)과 이송관(35)을 연결시키도록 유로를 형성하거나, 제 2연결관(25)과 이송관(35)을 연결시키도록 유로를 형성한다. 따라서 펌프(40)의 흡입력에 의해 유로변환부(30)의 출구를 통해 시료저장용기(10)에 저장된 시료 및 이송용액저장용기(20)에 저장된 이송용액이 교대로 배출된다. 유로변환부(30)의 일 예로 통상적인 멀티포트밸브를 이용한다. 멀티포트밸브로 자동 쓰리웨이밸브를 이용할 수 있다.

펌프(40)는 이송관(35)의 중간에 설치되어 시료저장용기(10)에 저장된 시료 및 이송용액저장용기(20)에 저장된 이송용액을 펌핑하여 인젝션 밸브(50)로 공급한다. 이때 상기 유로변환부(30)에 의해 시료 및 이송용액이 교대로 펌핑된다. 이송관(35)을 통해 이송되는 유체는 일정한 체적의 시료와 이송용액이 번갈아가면서 흐르게 된다. 본 발명에서 펌프(40)로 튜빙펌프를 이용하는 것이 바람직하다.

이송관(35)에 연결된 통상적인 인젝션밸브(50)의 출구는 검출부(60)와 연결된다.

검출부(60)는 인젝션밸브(50)의 출구를 통해 교대로 배출되는 시료 및 이송용액에 광을 조사하여 시료 중에 함유된 미생물로부터 생성된 형광을 검출한다. 검출부(60)는 빛의 유입이 차단된 챔버(61)의 내부에 설치된다.

도시된 검출부의 일 예로 인젝션밸브(50)의 출구와 연결되며 시료 및 이송용액이 이동하는 튜브(70)와, 튜브(70)의 내부로 미생물을 검출하기 위한 광을 조사하는 광원(63)과, 튜브(70)를 통과하는 시료 중의 미생물로부터 발생된 형광을 검출하는 광검출기(65)를 구비한다. 그리고 튜브(70)에는 폐수배출관(75)이 연결되어 튜브(70)를 통과한 시료 및 이송용액이 배출된다.

튜브(70)로는 내부에 유로가 형성된 석영관을 이용할 수 있다. 그리고 광원으로 340nm의 파장의 광을 발산하는 발광 다이오드를 이용한다. 광검출기(65)는 형광을 검출하는 것으로 광증배관(Photo-multiplication Tube: PMT)을 적용할 수 있다.

이와 같은 검출부(60)의 구성에 의해 튜브(70)를 통과하는 시료 중의 미생물 농도를 측정할 수 있다. 미생물은 일정한 영양분과 성장조건에서 개체수를 기하급수적으로 늘리면서 성장한다. 미생물은 성장하면서 대사과정 중 하나인 해당작용으로 인해 환원력을 가지는 NADH(조효소의 일종)를 생성하는데 미생물의 개체수가 증가할수록 생성량이 증가하게 된다. 생성된 NADH는 340 nm 파장의 광을 조사하면 450 nm의 형광을 발현하게 되고, 이때의 형광은 광검출기를 이용하여 검출함으로써 미생물의 개체수를 측정할 수 있다.

시료 내에 존재하는 미생물량은 형광 피크 높이로 표시되며, 이러한 형광신호는 신호변환부(91)로 전달되어 전압(V)값으로 전환된다. 상기 신호변환부(91)로부터 출력되는 신호는 락인앰프를 거쳐 제어부(93)에 의해 표시부(95)에 디스플레이된다.

신호변환부(91)에서 변환되어진 신호 중 시료 내의 기포나 광원에 의해 발생된 시그널 노이즈(Signal noise)는 락인앰프(Lock in amplifier)(92)를 이용하여 제거함으로써 노이즈에 의해 검출되지 않았던 미세신호까지 검출할 수 있다. 시그널 노이즈가 제거된 신호는 제어부(93)로 출력된다.

락인앰프(92)는 신호변환부(91)에서 출력되는 신호 중 측정하고자 하는 신호성분 이외의 노이즈를 제거하기 위해 적용된 것으로 승산기, 참조신호 발생기 및 로우패스 필터(LPF)를 구비한다. 참조신호 발생기는 광원의 중심 주파수에 대응되는 주파수의 참조신호를 출력한다. 이러한 락인앰프는 신호변환부(91)에서 출력되는 신호를 참조신호발생기에서 출력되는 참조신호와 승산기에서 승산하고, 승산기의 출력신호에 대해 로우패스 필터를 통해 필터링 하여 초저농도의 미생물도 검출할 수 있다.

제어부(93)는 각 구성의 구동을 제어하고, 입력된 신호를 연산 및 처리하여 표시구동회로를 통해 표시부(95)로 전기적 신호를 출력한다. 제어부(93)는 챔버(61)에 설치된 통상적인 컨트롤러를 이용하거나, 독립적으로 연결되어 구비되는 CPU를 이용할 수 있다.

그리고 상술한 바와 달리 신호변환부(91)로부터 출력되는 신호는 락인앰프를 거치지 않고 제어부(93)로 출력되어 표시부(95)에 디스플레이될 수 있음은 물론이다.

검출부의 다른 예를 도 2에 도시하고 있다. 도 2에 도시된 검출부는 인젝션밸브의 출구와 연결되며 시료 및 이송용액이 이동하는 튜브(70)와, 튜브(70)의 내부로 미생물을 검출하기 위한 광을 조사하는 광원(63)과, 튜브(70)를 통과하는 시료 중의 미생물로부터 발생된 형광을 필터링하는 광필터(81)와, 광필터(81)를 통과한 형광의 진로를 직각으로 변환시키는 광로변환부재(83)와, 광로변환부재(83)를 통해 입사되는 형광을 검출하는 광검출기(65)로 구성된다.

도 2에서 튜브(70), 광원(63), 광검출기(65)는 도 1에 도시된 예와 동일하므로 구체적인 설명은 생략한다. 광필터(81)는 미생물로부터 방출된 형광파장 중 460nm의 파장 대의 형광만을 검출하기 위해 400nm 이하의 파장을 제거하는 것을 이용한다. 광필터(81)는 튜브(70)를 사이에 두고 광원(63)과 마주하도록 설치된다.

그리고 광로변환부재(83)는 광필터(81)의 하부에 설치되어 광필터(81)를 통과한 형광의 진로를 90도로 변환시켜 광검출기(65)로 형광을 입사시킨다. 광로변환부재(83)로 거울 등의 반사체를 이용할 수 있다. 광원(63)과 광검출기(65)가 일직선상에 위치하는 경우 광원(63)에서 발생한 광에 의해 형광이 검출되지 않을 수 있기 때문이다. 따라서 광로변환부재(83)를 이용하여 형광을 반사시켜 형광의 진로를 직각으로 변환시킴으로써 광검출기(65)에서 형광을 더욱 정밀하게 측정할 수 있다.

광검출기(65)로부터 출력되는 전기적 신호는 신호변환부에서 전압 값으로 변환된다. 그리고 신호변환부로부터 출력되는 신호는 락인앰프를 거쳐 제어부로 입력된다.

도 3에 검출부에서 검출되는 형광신호의 일 예를 도 3의 그래프에 도시하였다. 그래프의 하부 그림은 튜브를 통과하는 이송용액(1) 및 시료(5)를 나타낸 것이다.

튜브에 시료(5)와 이송용액(1)이 일방향으로 흘러간다. 이때 일정한 체적의 시료와 이송용액은 번갈아가면서 흘러간다. 시료(5)와 이송용액(1)이 광원을 통과하면서 미생물로부터 발생된 형광신호는 광검출기에 의해 검출된다. 이때 검출된 형광신호의 피크는 시료 내에 함유된 미생물의 농도에 따라 높이가 달라진다. 형광신호의 피크는 그래프 상에 일정한 지연시간을 두고 주기적으로 발생한다. 지연시간은 1초 내지 60초 범위 이내로 설정될 수 있다. 지연시간은 이송용액이 광원을 통과하는 시간과 일치한다. 튜브로 흘러드는 이송용액은 시료의 블랭크(blank)로 사용되어 발현된 형광신호의 기준점이 된다.

본 발명의 운전조건은 일 예로 이송용액의 유량은 1.38㎖/min이고, 시료의 유량은 0.236㎖/min이고, sample loop volume(인젝션밸브에서 폐수배출관 출구까지의 유로의 볼륨)은 125ℓ이고, 측정온도는 실온, cyclus time(이송용액 또는 시료가 인젝션밸브에서 주입된 후 폐수배출관을 통해 배출되기까지 유로를 통과하는 시간)은 300초다.

한편, 검출부에 적용되는 튜브의 내부면에 시료 중에 함유된 미생물 또는 부유물질이 부착하는 것을 방지하기 위해 상기 튜브의 내부면에 고분자막을 형성할 수 있다. 여기서 부착은 시료 중의 미생물 또는 각종 부유물질 등이 표면에 달라 붙는 것을 의미한다.

소수성 졸-겔을 이용한 고분자막(80)은 전구체 물질(Precursor)로 디메톡시디메틸실란(Dimethoxydimethylsilane:DiMe- DMOS)과 테트라메틸오르도실리케이트 (Tetramethyl-orthosilicate:TMOS)을 사용하여 조성된다.

TMSO: DiMe-DMOS: 증류수: 0.1M HCl의 부피비가 각각 1: 2.45: 1.70: 1.1이 되도록 혼합하여 얻어진 졸-겔 용액은 3.5 시간동안 가수분해와 축합 반응을 위해 교반한다.

교반된 졸-겔 용액에서 침전된 소수성 졸(Sol)을 얻기 위하여 7500 rpm으로 5min동안 원심분리한다. 원심 분리하여 얻은 침전된 졸 1ml에 약 50 ul의 0.1 M 인산완충 용액(0.1 M Potassium phosphate buffer, pH 7)을 첨가한다.

상기와 같이 만들어진 소수성 졸-겔은 물과 결합할 수 있는 수산화기(-OH)가 존재하지 않기 때문에 시료수 중에 함유된 미생물 또는 부유물질과의 상호결합력을 감소시켜 부착을 방지할 수 있다.

졸-겔은 튜브의 내주면에 고르게 도포시킨 후 막표면의 균열을 방지하기 위해 4~5일 동안 실온에서 건조시켜 투명하고 얇은 고분자막(80)을 형성시킨다. 통상적인 담금코팅이나 스프레이코팅 기법을 이용하여 튜브의 내주면에 졸-겔을 도포시킬 수 있다.

이하, 상술한 미생물 활성장치를 이용한 본 발명의 미생물 활성 측정방법에 대해서 설명한다.

먼저, 원수이송라인을 통해 이동되는 원수 중의 일부를 시료저장용기(10)로 유입시켜 시료를 채취한다.

그리고 시료저장용기(10)에 저장된 시료와 이송용액이 저장된 이송용액저장용기(20)로부터 시료 및 이송용액을 펌프(40)에 의해 인젝션밸브(50)로 펌핑한다. 이때 펌프(40)와 연결된 유로변환밸브(30)는 제 1연결관(15) 또는 제 2연결관(25)의 유로를 선택적으로 단속한다.

따라서 펌프(40)에 의해 펌핑된 시료 및 이송용액은 이송관(35)을 따라 번갈아가면서 교대로 흐르게 된다. 인젝션밸브(50)를 통해 순차적으로 배출되는 시료 및 이송용액은 챔버(61)의 내부에 설치된 튜브(70)로 유입된다. 튜브(70)를 통과하는 시료로 광을 조사하여 미생물로부터 발생된 형광을 광검출기에서 검출한다. 광검출기(65)로부터 출력되는 전기적 신호는 신호변환부(91)에서 전압 값으로 변환시킨 후 락인앰프(92)에서 시그널 노이즈를 제거한 다음 표시부(95)에 디스플레이한다.

그리고 도 2에 도시된 바와 같이 시료 중의 미생물로부터 발생한 형광을 필터링한 다음 형광의 진로를 직각으로 변환시켜 광검출기(65)에서 형광을 검출한 다음 신호변환부(91)에서 전압 값으로 변환시키고 락인앰프(92)에서 시그널 노이즈를 제거한 후 표시부(95)에 디스플레이할 수 있다.

<제 1실험예: 미생물 검출실험>

미생물 검출실험을 위해 시료를 도 2에 적용된 검출부를 이용하여 측정하였다. 시료를 석영관으로 흘려보내고, 광원으로 340nm의 파장을 갖는 자외선 다이오드(SEOUL OPTO DEVICE Co., S8D28, 340 nm)를 이용하였다. 그리고 광검출기로는 광증배관(PMT, H5783, Hamamatsu Co., Japan)을 사용하였다. 시료 내의 미생물에 의해 발생되어진 형광을 90°각도에서 검출, 증폭하여 전압으로 표시하도록 하였다.

실제 미생물의 검출을 위해 E. coli JM109를 이용하였다. E. coli JM109를 진탕배양기를 이용하여 37℃, 180 rpm 조건에서 24시간 배양한 후 원심분리하여 상등액을 제거하고 미생물만 획득하였다. 획득한 미생물은 3차 증류수를 이용하여 희석하여 0 - 500 CFU 농도로 희석하여 시료를 제조하였다. 시료의 검출결과는 도 4에 나타냈다.

도 4를 참조하면, 미생물의 개체수가 증가함에 따라 감지되는 출력신호도 선형적으로 증가하였다. 이는 미생물의 농도에 따라 대사과정에서 발생되는 NADH의 양이 많아지고 발광되는 형광세기가 증가함에 기인하는 것으로 보인다.

다음으로, 미생물의 대사과정에서 생산되는 NADH를 이용하여 농도별 검출전압 값을 측정하여 도 5에 나타냈다. 검출 실험을 위해 β-nicotinamide adenine dinucleotide(NADH)은 씨그마사로부터 구입하여 사용하였다. 시료수는 상기의 NADH를 3차 증류수에 희석하여 0~0.5 mM 농도로 제작하였고, 시료수에 340 nm의 파장대역을 가지는 자외선 광을 조사하였다.

도 5를 참조하면, 시료 중 NADH의 농도가 0에서 0.5 mM로 농도가 높아짐에 따라 형광방출량도 함께 증가하였으며, 이에 따른 변환 출력전압도 증가함을 보였다.

<제 2실험예: 고분자막의 미생물 부착특성>

TMSO: DiMe-DMOS: 증류수: 0.1M HCl의 부피비가 각각 1: 2.45: 1.70: 1.1이 되도록 혼합한 후 3.5 시간동안 가수분해와 축합 반응을 위해 교반하였다. 교반된 졸-겔 용액에서 침전된 소수성 졸을 얻기 위하여 원심분리(조건: 7500 rpm, 5min)를 하였다. 원심 분리하여 얻은 침전된 졸에 50 ul/mL(졸)의 0.1 M 인산완충 용액(0.1 M Potassium phosphate buffer, pH 7)을 첨가하여 소수성 졸-겔을 얻었다. 졸-겔은 직경 12mm의 크기의 유리 표면에 주입한 후 스핀코팅 기법(조건: 1단계 400 rpm, 10 sec, 2단계 1200 rpm, 20 sec)으로 표면에 고르게 도포시킨 다음 5일 동안 실온(20℃)에서 건조시켜 투명하고 얇은 고분자막을 형성하였다.

상기의 고분자막에 대한 성능검증을 위하여 고분자막의 미생물 부착력을 테스트하였다. 고분자막이 형성된 유리를 시험구로 하고, 이와 비교되는 대조구로는 고분자막이 형성되지 않은 유리를 이용하였다.

미생물의 부착력 테스트를 위해 Escherichia coli JIM109, Bacillus cereus 318균주를 사용하였다. 본 테스트에서는 Escherichia coli의 배양을 위해 LB 복합배지(Yeast extract: 5 g/L, Tryptone: 10 g/L, NaCl: 10 g/L), Bacillus cereus의 배양을 위해 바실러스용 배지(Glucose: 5 g/L, Peptone: 5 g/L, Yeast extract: 5 g/L, NaHCO₃: 3g/L)을 사용하였다. 한편, 배양실험을 수행하기 전 외부 물질에 의한 오염을 방지하기 위해 시험구 및 대조구를 자외선광을 조사하여 24시간 동안 멸균처리하였다. Escherichia coli 과Bacillus cereus 배양액에 각각 시험구와 대조구를 투입한 후 37℃, 80rpm조건에서 진탕배양기(KoBiotech Co.,Korea)를 이용하여 24시간동안 배양하였다.

배양 중 일정한 시간 간격으로 수집한 시험구 및 대조구는 미생물의 부착도 측정대상 표면을 증류수로 1 회 세척한 후, 증류수가 담긴 비이커에 넣고 교반기에서 150 rpm으로 3 분간 세척하였다. 부유세포가 제거된 측정대상 표면은 그람염색을 하기 위해 60 ℃에서 10 분간 건조하였고, 부착도 측정 대상 표면에 부착된 미생물을 고정하기 위해 화염멸균을 시켰다. 화염멸균 후 그람염색을 하기 위해 0.2 mL의 크리스탈 바이올렛용액(Crystal violet)을 이용하여 1 분간 염색시켰다. 증류수로 세척된 측정대상 표면은 0.2 mL 요오드(Iodine) 용액으로 다시 1 분간 염색한 후 95 % 에탄올로 세포외막을 탈색시킨 후, 0.2 mL의 샤프라닌 O 용액(Safranin O)으로 1분간 재염색하였다. 최종적으로, 증류수로 세척한 시험구 및 대조구는 70 ℃에서 10분간 건조하여 수분을 제거하였다.

위의 염색과정이 끝난 시험구 및 실험구의 측정 대상 표면을 SEM (Scanning electron microscope) 촬영을 한 후 부착된 미생물의 갯수를 정량적으로 측정하여 그 결과를 도 6 및 도 7에 각각 나타내었다.

도 6은 각종 의약품이나 생물제품의 생산에 가장 많이 이용되는 미생물 중의 하나인 Escherichia coli의 부착특성을 나타내고 있다. 도 6은 일정한 시간별(6, 12, 18, 24시간)로 시료를 수집하였고 각 표면에 부착된 미생물의 SEM 촬영 자료에 근거하여 단위면적(mm²)당 시험구 및 대조구의 표면에 부착된 미생물의 개체수를 정량적으로 나타낸 것이다. 도 6에서 sol-gel coated surface는 시험구를 의미하고, glass는 대조구를 뜻한다.

도 6을 살펴보면, 대조구의 표면에서는 Escherichia coli은 배양 후 6시간에서 약 7.7×10⁴cells/mm²가 부착되었으나, 배양 6시간 이후에는 세포성장 주기에서 정지기와 사멸기에 접어들기 때문에 유리표면에 부착된 미생물의 수가 점차적으로 감소하였다.

이에 비해 시험구에서는 배양 후 18시간에서 단위면적당 부착된 Escherichia coli의 수가 대조구에 부착된 미생물의 최대 개체수에 비해 97%이상 감소하였다. 즉, 고분자막을 구성하는 소수성의 졸-겔은 그람 음성균인 미생물과 막표면 사이의 물리적 상호 결합력을 감소시켜 미생물의 부착을 방지함을 알 수 있다.

도 7은 Bacillus cereus의 부착특성을 나타내고 있다. 도 7은 일정한 시간별(3, 6, 12, 18, 24시간)로 시료를 수집하였고 각 표면에 부착된 미생물의 SEM 촬영 자료에 근거하여 단위면적(mm²)당 시험구 및 대조구의 표면에 부착된 미생물의 개체수를 정량적으로 나타낸 것이다. 도 7에서 sol-gel coated surface는 시험구를 의미하고, glass는 대조구를 뜻한다.

도 7을 살펴보면, 대조구에서 Bacillus cereus는 배양 후 12시간에서 약 3.2×10⁴cells/mm² 부착되었고, 12시간 이후 사멸기에 접어들면서 부착된 미생물의 수가 크게 감소하였다. 이에 비해 시험구에 부착된 Bacillus cereus는 배양 3시간 후에 최대 부착 세포의 수가 6.2×10²cells/mm²로서 대조구에 비해 약 98%이상 감소하였다. 따라서 고분자막은 그람 양성균인 Bacillus cereus 미생물의 부착을 방지할 수 있음을 알 수 있다.

이상, 본 발명은 도면에 도시된 일 실시 예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 실시 예가 가능하다는 점을 이해할 것이다.

따라서 본 발명의 진정한 보호 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 정해져야 할 것이다.

10: 시료저장용기 20: 이송용액저장용기
30: 유로변환부 35: 이송관
40: 펌프 50:인젝션밸브
60: 검출부 63: 광원
65: 광검출기 70: 튜브

Claims

원수이송라인을 통해 이동되는 원수 중의 일부를 시료저장용기로 유입시켜 시료를 채취하는 제 1단계와;
상기 시료저장용기와 제 1연결관으로 연결되고 상기 시료를 운반하기 위한 이송용액으로 멸균된 증류수가 저장된 이송용액저장용기와 제 2연결관으로 연결되어 상기 제 1연결관 또는 제 2연결관의 유로를 선택적으로 단속하는 유로변환부로부터 상기 시료 또는 이송용액을 인젝션밸브로 교대로 펌핑하는 제 2단계와;
상기 인젝션 밸브로부터 배출되는 시료 및 이송용액에 340nm의 광을 조사하여 시료 중에 함유된 미생물로부터 생성된 450nm의 형광을 검출하는 제 3단계와;
상기 제 3단계에서 검출된 형광신호 중 시료 내의 기포 또는 광원에 의해 발생된 시그널 노이즈를 제거하는 제 4단계와;
상기 4단계에서 출력되는 신호를 디스플레이하는 제 5단계;를 포함하고,
상기 제 3단계는 빛의 유입이 차단된 챔버의 내부에 설치되며 상기 인젝션밸브의 출구와 연결된 튜브로 시료 및 이송용액을 유입시킨 후 상기 튜브를 통과하는 시료로 광을 조사하여 미생물로부터 발생된 형광을 필터링한 다음 형광의 진로를 직각으로 변환시켜 광검출기에서 형광을 검출하는 것을 특징으로 하는 미생물 활성 측정방법.
제 1항에 있어서, 상기 제 4단계는 락인앰프를 통해 상기 제 3단계에서 검출되어 출력된 신호를 참조신호와 승산하고, 승산결과신호를 로우패스 필터를 통해 출력하는 것을 특징으로 하는 미생물 활성 측정방법.
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