JPH1019891A - 水源病原微生物の計測方法 - Google Patents
水源病原微生物の計測方法Info
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- JPH1019891A JPH1019891A JP19417496A JP19417496A JPH1019891A JP H1019891 A JPH1019891 A JP H1019891A JP 19417496 A JP19417496 A JP 19417496A JP 19417496 A JP19417496 A JP 19417496A JP H1019891 A JPH1019891 A JP H1019891A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 水源病原微生物の容易かつ正確な計測方法を
提供する。 【解決手段】 次の各工程により試料水中の水源病原微
生物の嚢子を計測する。 ａ試水をスクリーンフィルターを用いて吸引ろ過し、フ
ィルター上に水源病原性微生物の嚢子及び試水中の夾雑
物を捕捉する。 ｂ捕捉された嚢子と夾雑物を超音波により溶出液で剥離
し、遠心分離により集め沈さを生成させる。 ｃ前記沈さに界面活性剤を添加した後、浮遊液を上部よ
り沈さに注入し、軽く攪拌し、分離に適切な比重とす
る。 ｄ前記溶液を遠心分離し、嚢子を浮遊液層と水層の界面
部分に集める。 ｅ前記集積した水層と界面部分を別の容器に分取し、純
水を加えて遠心分離、分取、洗浄、吸引除去を繰り返
す。 ｆ残液部分を絶対孔径１〜１．２μｍのフィルターに吸
引ろ過し、数時間以上放置した後、蛍光抗体染色を行
い、落射型蛍光顕微鏡にて前記嚢子を計数する。
提供する。 【解決手段】 次の各工程により試料水中の水源病原微
生物の嚢子を計測する。 ａ試水をスクリーンフィルターを用いて吸引ろ過し、フ
ィルター上に水源病原性微生物の嚢子及び試水中の夾雑
物を捕捉する。 ｂ捕捉された嚢子と夾雑物を超音波により溶出液で剥離
し、遠心分離により集め沈さを生成させる。 ｃ前記沈さに界面活性剤を添加した後、浮遊液を上部よ
り沈さに注入し、軽く攪拌し、分離に適切な比重とす
る。 ｄ前記溶液を遠心分離し、嚢子を浮遊液層と水層の界面
部分に集める。 ｅ前記集積した水層と界面部分を別の容器に分取し、純
水を加えて遠心分離、分取、洗浄、吸引除去を繰り返
す。 ｆ残液部分を絶対孔径１〜１．２μｍのフィルターに吸
引ろ過し、数時間以上放置した後、蛍光抗体染色を行
い、落射型蛍光顕微鏡にて前記嚢子を計数する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、上水道、飲料水原
水、飼育用水、その他特に人体及び動物の飲料に用いる
水中の病原性微生物、特に嚢子を形成する原生動物、例
えば、ランブル鞭毛虫、ジアルジア（Giardia)、特にク
リプトスポリジウム（Cryptosporidium sp. ；以下Ｃ
ｒ）の計測方法に関する。
水、飼育用水、その他特に人体及び動物の飲料に用いる
水中の病原性微生物、特に嚢子を形成する原生動物、例
えば、ランブル鞭毛虫、ジアルジア（Giardia)、特にク
リプトスポリジウム（Cryptosporidium sp. ；以下Ｃ
ｒ）の計測方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】クリプトスポリジウム（Ｃｒ）は、下痢
症を引き起こすとして欧米で問題となっている原虫であ
る。原虫の検出には概ね休眠状態にある嚢子（Oocysts)
の計測が通例である。この原虫は、嚢子の径が４〜５μ
ｍと小さく、また寒天培地培養法などの手段がとれない
ため、フィルター上に捕捉し顕微鏡で計数する必要があ
る。Ｃｒ−嚢子の測定方法としては、ＡＷＷＡ標準方法
（STANDARD METHODS) の方法がある。前記ＡＷＷＡ標準
方法は以下の手順にて測定を行う。Ｃｒ−嚢子が含まれ
た試水を、孔径１μｍのポリプロピレン製カートリッジ
フィルターを用いてろ過し、試水中の嚢子と夾雑物を捕
捉する。
症を引き起こすとして欧米で問題となっている原虫であ
る。原虫の検出には概ね休眠状態にある嚢子（Oocysts)
の計測が通例である。この原虫は、嚢子の径が４〜５μ
ｍと小さく、また寒天培地培養法などの手段がとれない
ため、フィルター上に捕捉し顕微鏡で計数する必要があ
る。Ｃｒ−嚢子の測定方法としては、ＡＷＷＡ標準方法
（STANDARD METHODS) の方法がある。前記ＡＷＷＡ標準
方法は以下の手順にて測定を行う。Ｃｒ−嚢子が含まれ
た試水を、孔径１μｍのポリプロピレン製カートリッジ
フィルターを用いてろ過し、試水中の嚢子と夾雑物を捕
捉する。
【０００３】フィルターを嚢子の散乱に注意しながらナ
イフ等を用いて細かく裂いた後、超音波処理を行いフィ
ルターに捕捉されている嚢子と夾雑物を剥離し、遠心分
離により沈さを集める。嚢子と夾雑物を含む沈さに界面
活性剤を添加後、ポリビニルピロリドンでコートされた
コロイド状シリカ（percoll)４５ｍｌと純水４５ｍｌ及
び２．５Ｍショ糖溶液１０ｍｌを混合して調製し、比重
が１．０９〜１．１０の範囲にあることを確認した浮遊
液を、沈さの下部にカニューレという器具を用いて静か
に注入する。又は、ピペットを用いて浮遊液の上に、嚢
子と夾雑物を含む沈さを注入する。注入の際には、浮遊
液と沈さの界面を崩さないよう注意して静かに行う。浮
遊液と嚢子の比重差を利用して、遠心分離により嚢子を
浮遊液層と水層の界面部分に集める。水層と界面部分を
別の容器に分取する。この部分に嚢子が含まれている。
イフ等を用いて細かく裂いた後、超音波処理を行いフィ
ルターに捕捉されている嚢子と夾雑物を剥離し、遠心分
離により沈さを集める。嚢子と夾雑物を含む沈さに界面
活性剤を添加後、ポリビニルピロリドンでコートされた
コロイド状シリカ（percoll)４５ｍｌと純水４５ｍｌ及
び２．５Ｍショ糖溶液１０ｍｌを混合して調製し、比重
が１．０９〜１．１０の範囲にあることを確認した浮遊
液を、沈さの下部にカニューレという器具を用いて静か
に注入する。又は、ピペットを用いて浮遊液の上に、嚢
子と夾雑物を含む沈さを注入する。注入の際には、浮遊
液と沈さの界面を崩さないよう注意して静かに行う。浮
遊液と嚢子の比重差を利用して、遠心分離により嚢子を
浮遊液層と水層の界面部分に集める。水層と界面部分を
別の容器に分取する。この部分に嚢子が含まれている。
【０００４】孔径０．２μｍの酢酸セルロース系フィル
ター（フィルター直径２５ｍｍ）に先の分取した溶液を
ろ過し、蛍光物質でラベルされた免疫グロブリンを用い
て、蛍光抗体染色を行い、落射型蛍光顕微鏡にて計数す
る。前記ＡＷＷＡ標準方法では、サンプリングの際に円
筒状のディプスフィルターであるカートリッジフィルタ
ー、ポンプ、流量計からなるサンプリング装置が必要で
ある。前記カートリッジフィルターは大量のサンプルを
ろ過するのには適しているが、フィルターに捕捉された
嚢子を溶出する際には、カートリッジを壊して中のフィ
ルターを細かく裂くなどの手間がかかる。また、沈さへ
の浮遊液添加の際には、沈さと浮遊液層との界面を乱さ
ないよう注意が必要で、熟練を要する等の問題点があっ
た。
ター（フィルター直径２５ｍｍ）に先の分取した溶液を
ろ過し、蛍光物質でラベルされた免疫グロブリンを用い
て、蛍光抗体染色を行い、落射型蛍光顕微鏡にて計数す
る。前記ＡＷＷＡ標準方法では、サンプリングの際に円
筒状のディプスフィルターであるカートリッジフィルタ
ー、ポンプ、流量計からなるサンプリング装置が必要で
ある。前記カートリッジフィルターは大量のサンプルを
ろ過するのには適しているが、フィルターに捕捉された
嚢子を溶出する際には、カートリッジを壊して中のフィ
ルターを細かく裂くなどの手間がかかる。また、沈さへ
の浮遊液添加の際には、沈さと浮遊液層との界面を乱さ
ないよう注意が必要で、熟練を要する等の問題点があっ
た。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】前記のＡＷＷＡ標準方
法は、上記のように常時各所で多量のサンプルを計測す
る必要があるにもかかわらず、必ずしも実用的とは言え
なかった。そこで、本発明は、特段の用具を必要とせ
ず、通常の技術者が容易にかつ正確に嚢子の検出、計測
ができる水源病原微生物の計測方法を提供することを課
題とする。
法は、上記のように常時各所で多量のサンプルを計測す
る必要があるにもかかわらず、必ずしも実用的とは言え
なかった。そこで、本発明は、特段の用具を必要とせ
ず、通常の技術者が容易にかつ正確に嚢子の検出、計測
ができる水源病原微生物の計測方法を提供することを課
題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明では、水源病原微生物を含む試水を、次の
（ａ）〜（ｆ）の工程を順次行うことによって、該試水
中の水源病原微生物の嚢子を計測することを特徴とする
水源病原性微生物の計測方法としたものである。 （ａ）、試水をスクリーンフィルターを用いて吸引ろ過
し、フィルター上に水源病原微生物の嚢子及び試水中の
夾雑物を捕捉する捕捉工程、（ｂ）、捕捉された前記嚢
子と夾雑物を超音波により溶出液で剥離し、遠心分離に
より集め沈さを生成させる沈さ生成工程、（ｃ）、前記
沈さに界面活性剤を添加した後、浮遊液を上部より該沈
さに注入し、軽く攪拌し、溶液を前記嚢子の分離に適切
な比重とする比重調整工程、（ｄ）前記比重調整溶液を
遠心分離し、前記嚢子を浮遊液層と水層の界面部分に集
める集積分離工程、（ｅ）、前記集積した水層と界面部
分を別の容器に分取し、純水を加えて攪拌後遠心分離を
行い、上澄みを吸引除去し、残された残液に再び前記浮
遊液を加え遠心分離後、界面部分を別の容器に分取し、
同様に純水で洗浄後、上澄みを吸引除去することを繰り
返す濃縮洗浄工程、（ｆ）、前記洗浄工程の残液部分を
絶対孔径１〜１．２μｍのフィルターに吸引ろ過し、フ
ィルター上に前記嚢子を集積し、フィルターをスライド
グラス上に乗せて冷暗所にて数時間以上放置した後、フ
ィルター上を蛍光物質でラベルされた抗体を用いて蛍光
抗体染色を行い、落射型蛍光顕微鏡にて前記嚢子を計数
する計数工程。前記計測方法において、工程（ａ）のス
クリーンフィルターとしては、絶対孔径５μｍの親水性
のテフロン系スクリーンフィルターを用いるのがよく、
また、工程（ｆ）の嚢子の計数は、画像処理による自動
計数装置を用いるのがよい。
に、本発明では、水源病原微生物を含む試水を、次の
（ａ）〜（ｆ）の工程を順次行うことによって、該試水
中の水源病原微生物の嚢子を計測することを特徴とする
水源病原性微生物の計測方法としたものである。 （ａ）、試水をスクリーンフィルターを用いて吸引ろ過
し、フィルター上に水源病原微生物の嚢子及び試水中の
夾雑物を捕捉する捕捉工程、（ｂ）、捕捉された前記嚢
子と夾雑物を超音波により溶出液で剥離し、遠心分離に
より集め沈さを生成させる沈さ生成工程、（ｃ）、前記
沈さに界面活性剤を添加した後、浮遊液を上部より該沈
さに注入し、軽く攪拌し、溶液を前記嚢子の分離に適切
な比重とする比重調整工程、（ｄ）前記比重調整溶液を
遠心分離し、前記嚢子を浮遊液層と水層の界面部分に集
める集積分離工程、（ｅ）、前記集積した水層と界面部
分を別の容器に分取し、純水を加えて攪拌後遠心分離を
行い、上澄みを吸引除去し、残された残液に再び前記浮
遊液を加え遠心分離後、界面部分を別の容器に分取し、
同様に純水で洗浄後、上澄みを吸引除去することを繰り
返す濃縮洗浄工程、（ｆ）、前記洗浄工程の残液部分を
絶対孔径１〜１．２μｍのフィルターに吸引ろ過し、フ
ィルター上に前記嚢子を集積し、フィルターをスライド
グラス上に乗せて冷暗所にて数時間以上放置した後、フ
ィルター上を蛍光物質でラベルされた抗体を用いて蛍光
抗体染色を行い、落射型蛍光顕微鏡にて前記嚢子を計数
する計数工程。前記計測方法において、工程（ａ）のス
クリーンフィルターとしては、絶対孔径５μｍの親水性
のテフロン系スクリーンフィルターを用いるのがよく、
また、工程（ｆ）の嚢子の計数は、画像処理による自動
計数装置を用いるのがよい。
【０００７】
【発明の実施の形態】次に、本発明を各工程別に詳しく
説明する。先ず、工程（ａ）の捕捉工程は、例えばラン
ブル鞭毛虫、ジアルジア、前記したクリプトスポリジウ
ム（Ｃｒ）等の水源病原微生物の嚢子が含まれた試水
を、オムニポアメンブレンフィルターを含むスクリーン
フィルターを用いて吸引ろ過しフィルター上に嚢子及び
試水中の夾雑物を捕捉する。本発明でサンプリングに用
いている前記のスクリーンフィルターとは、孔径が正確
に決められたもので、円筒状の細孔が均一に分布してい
る構造を持ち、粒子はフィルター表面で捕捉されるとい
う特徴を持つ。これに対し、公知のＡＷＷＡ標準方法で
サンプリングに用いているカートリッジフィルターは、
ディプスフィルターと呼ばれる、粒子がフィルター表面
及びフィルター内部で捕捉されるという特徴を持つフィ
ルターで構成されている。スクリーンフィルターとディ
プスフィルターを比べた場合、フィルター表面で粒子の
捕捉を行うスクリーンフィルターの方が、フィルターを
破壊することなく捕捉された粒子を剥離することができ
るという利点を持つ。
説明する。先ず、工程（ａ）の捕捉工程は、例えばラン
ブル鞭毛虫、ジアルジア、前記したクリプトスポリジウ
ム（Ｃｒ）等の水源病原微生物の嚢子が含まれた試水
を、オムニポアメンブレンフィルターを含むスクリーン
フィルターを用いて吸引ろ過しフィルター上に嚢子及び
試水中の夾雑物を捕捉する。本発明でサンプリングに用
いている前記のスクリーンフィルターとは、孔径が正確
に決められたもので、円筒状の細孔が均一に分布してい
る構造を持ち、粒子はフィルター表面で捕捉されるとい
う特徴を持つ。これに対し、公知のＡＷＷＡ標準方法で
サンプリングに用いているカートリッジフィルターは、
ディプスフィルターと呼ばれる、粒子がフィルター表面
及びフィルター内部で捕捉されるという特徴を持つフィ
ルターで構成されている。スクリーンフィルターとディ
プスフィルターを比べた場合、フィルター表面で粒子の
捕捉を行うスクリーンフィルターの方が、フィルターを
破壊することなく捕捉された粒子を剥離することができ
るという利点を持つ。
【０００８】該吸引ろ過用のフィルターは、超音波処理
工程においてフィルター自身が壊れないこと、またその
孔径分布も５μｍで９９．９％以上を吸引圧２０〜３０
Ｔｏｒｒでの吸引ろ過又は１ｋｇ／ｃｍ2 の加圧ろ過で
捕捉できること、さらにフィルター１枚あたりのろ過量
も大きくとれるメリットもあること、生きたクリプトス
ポリジウム パルブム（Cryptosporidium parvum) を用
いた前記ろ過法においてほぼ１００％の捕捉ができる。
次に、沈さ生成工程（ｂ）は、捕捉工程（ａ）で捕捉さ
れた嚢子と夾雑物を超音波により、ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）溶液とポリオキシエチレン（２０）ソル
ビタンモノオレエート（ Tween８０）溶液（いずれも界
面活性剤）とリン酸緩衝液に塩化ナトリウム（食塩）と
塩化カリウムを添加して調整した溶液（リン酸緩衝液と
して、ＰＨの変動を避け生理食塩水と同じ様な働きで生
物を保護、ＰＢＳ（Phosphate-buffered saline)）を混
合して調製した溶出液で剥離したのち遠心分離により集
め沈さを生成させる。なお、前記ＰＢＳの組成は、水１
０リットル中に、ＮａＣｌ ７９．６５ｇ、ＫＣｌ
２．０１ｇ、Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ ２９．０１
ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ２．０４ｇである。
工程においてフィルター自身が壊れないこと、またその
孔径分布も５μｍで９９．９％以上を吸引圧２０〜３０
Ｔｏｒｒでの吸引ろ過又は１ｋｇ／ｃｍ2 の加圧ろ過で
捕捉できること、さらにフィルター１枚あたりのろ過量
も大きくとれるメリットもあること、生きたクリプトス
ポリジウム パルブム（Cryptosporidium parvum) を用
いた前記ろ過法においてほぼ１００％の捕捉ができる。
次に、沈さ生成工程（ｂ）は、捕捉工程（ａ）で捕捉さ
れた嚢子と夾雑物を超音波により、ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）溶液とポリオキシエチレン（２０）ソル
ビタンモノオレエート（ Tween８０）溶液（いずれも界
面活性剤）とリン酸緩衝液に塩化ナトリウム（食塩）と
塩化カリウムを添加して調整した溶液（リン酸緩衝液と
して、ＰＨの変動を避け生理食塩水と同じ様な働きで生
物を保護、ＰＢＳ（Phosphate-buffered saline)）を混
合して調製した溶出液で剥離したのち遠心分離により集
め沈さを生成させる。なお、前記ＰＢＳの組成は、水１
０リットル中に、ＮａＣｌ ７９．６５ｇ、ＫＣｌ
２．０１ｇ、Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ ２９．０１
ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ２．０４ｇである。
【０００９】比重調整工程（ｃ）は、沈さ生成工程
（ｂ）で集めた沈さに界面活性剤 Tween８０を添加後、
ポリビニルピロリドンでコートされたコロイド状シリカ
（percoll)と純水及びショ糖溶液を混合して比重１．１
５〜１．２５、好ましくは比重１．２に調製した浮遊液
を上部より沈さに注入し、軽く攪拌し溶液を嚢子の分離
に適切な比重とする。集積分離工程（ｄ）は、工程
（ｃ）で嚢子の分離に適切な比重に調整した溶液を遠心
分離により、嚢子を浮遊液層と水層の界面部分に集め
る。濃縮洗浄工程（ｅ）は、工程（ｄ）で得た水層と界
面部分を別の容器に分取し、純水を加えて攪拌後、遠心
分離を行い、上澄みをアスピレーター等にて吸引除去
し、残された残液に再び前記浮遊液を加え遠心分離後、
界面部分を別の容器に分取し、同様に純水で洗浄後、上
澄みを吸引除去することを少なくとも２回以上繰り返
す。
（ｂ）で集めた沈さに界面活性剤 Tween８０を添加後、
ポリビニルピロリドンでコートされたコロイド状シリカ
（percoll)と純水及びショ糖溶液を混合して比重１．１
５〜１．２５、好ましくは比重１．２に調製した浮遊液
を上部より沈さに注入し、軽く攪拌し溶液を嚢子の分離
に適切な比重とする。集積分離工程（ｄ）は、工程
（ｃ）で嚢子の分離に適切な比重に調整した溶液を遠心
分離により、嚢子を浮遊液層と水層の界面部分に集め
る。濃縮洗浄工程（ｅ）は、工程（ｄ）で得た水層と界
面部分を別の容器に分取し、純水を加えて攪拌後、遠心
分離を行い、上澄みをアスピレーター等にて吸引除去
し、残された残液に再び前記浮遊液を加え遠心分離後、
界面部分を別の容器に分取し、同様に純水で洗浄後、上
澄みを吸引除去することを少なくとも２回以上繰り返
す。
【００１０】最後の計数工程（ｆ）は、洗浄工程（ｅ）
の残液部分を絶対孔径１〜１．２μｍのフィルター、好
ましくは親水性のテフロン系又はセルロース混合エステ
ル系のフィルターの中心部分に、はっ水ペンであらかじ
め直径７ｍｍ程度の円を書き、該フィルターの円を中心
で吸引ろ過し、フィルター上に嚢子を集積し、該フィル
ターをスライドグラス上に乗せて、冷暗所にて数時間以
上、好ましくは一晩放置した後、フィルターを蛍光物質
でラベルされた抗体を用いて蛍光抗体染色を行い、落射
型蛍光顕微鏡にて嚢子を計数する。この計数には、画像
処理による自動計数装置を用いる。なお、蛍光物質とし
ては、フルオレセイン（青緑色）、例えばフルオレセイ
ンイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ジクロロトリアジ
ニルアミノ フルオレセイン（ＤＴＡＦ）や１−ジメチ
ルアミノナフタレン−５−スルホニルクロライド（ＤＡ
ＮＳ、青緑色）又はローダミン（赤橙色）、例えばテト
ラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴ
Ｃ）、テトラエチルローダミン等の公知のものが使用で
きる。
の残液部分を絶対孔径１〜１．２μｍのフィルター、好
ましくは親水性のテフロン系又はセルロース混合エステ
ル系のフィルターの中心部分に、はっ水ペンであらかじ
め直径７ｍｍ程度の円を書き、該フィルターの円を中心
で吸引ろ過し、フィルター上に嚢子を集積し、該フィル
ターをスライドグラス上に乗せて、冷暗所にて数時間以
上、好ましくは一晩放置した後、フィルターを蛍光物質
でラベルされた抗体を用いて蛍光抗体染色を行い、落射
型蛍光顕微鏡にて嚢子を計数する。この計数には、画像
処理による自動計数装置を用いる。なお、蛍光物質とし
ては、フルオレセイン（青緑色）、例えばフルオレセイ
ンイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ジクロロトリアジ
ニルアミノ フルオレセイン（ＤＴＡＦ）や１−ジメチ
ルアミノナフタレン−５−スルホニルクロライド（ＤＡ
ＮＳ、青緑色）又はローダミン（赤橙色）、例えばテト
ラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴ
Ｃ）、テトラエチルローダミン等の公知のものが使用で
きる。
【００１１】
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。 実施例１ 本発明による測定方法は以下のように行い、併せて従来
法（ＡＷＷＡ標準方法）による測定方法を行った。 （１）試水 試水は、以下の所で得た。 Ａ；浄水場原水（藻類を含まない地下水） Ｂ；河川水（藻類を含まない） Ｃ；浄水場原水（藻類を多く含む河川水）
る。 実施例１ 本発明による測定方法は以下のように行い、併せて従来
法（ＡＷＷＡ標準方法）による測定方法を行った。 （１）試水 試水は、以下の所で得た。 Ａ；浄水場原水（藻類を含まない地下水） Ｂ；河川水（藻類を含まない） Ｃ；浄水場原水（藻類を多く含む河川水）
【００１２】（２）サンプリング方法 本方法（以下改良法と記述する）では、簡便化を図り、
孔径絶対５μｍのオムニポアメンブレンフィルター（テ
フロン系；フィルター直径４７ｍｍ）を用いて、Ｃｒ−
嚢子の回収を試みた。Ｃｒ−嚢子１０3 個を添加した試
水をフィルターに通水後、捕捉されたＣｒ−嚢子及び夾
雑物を超音波処理（２８ｋＨｚ）しながら、ＳＤＳ溶液
と Tween８０溶液とＰＢＳ（Phosphate-buffered salin
e)を混合して調製した溶出液で剥離し、遠心分離にて沈
さを生成させ、本発明の手順でＣｒ−嚢子を分離した。
従来のＡＷＷＡ標準方法（以下従来法と記述する）で
は、孔径１μｍのポリプロピレンカートリッジフィルタ
ーでサンプルをろ過し、Ｃｒ−嚢子の散乱に注意を払い
ながらカートリッジを細かく裂いた後、超音波処理によ
りＣｒ−嚢子と夾雑物を剥離し、沈さを生成させる。
孔径絶対５μｍのオムニポアメンブレンフィルター（テ
フロン系；フィルター直径４７ｍｍ）を用いて、Ｃｒ−
嚢子の回収を試みた。Ｃｒ−嚢子１０3 個を添加した試
水をフィルターに通水後、捕捉されたＣｒ−嚢子及び夾
雑物を超音波処理（２８ｋＨｚ）しながら、ＳＤＳ溶液
と Tween８０溶液とＰＢＳ（Phosphate-buffered salin
e)を混合して調製した溶出液で剥離し、遠心分離にて沈
さを生成させ、本発明の手順でＣｒ−嚢子を分離した。
従来のＡＷＷＡ標準方法（以下従来法と記述する）で
は、孔径１μｍのポリプロピレンカートリッジフィルタ
ーでサンプルをろ過し、Ｃｒ−嚢子の散乱に注意を払い
ながらカートリッジを細かく裂いた後、超音波処理によ
りＣｒ−嚢子と夾雑物を剥離し、沈さを生成させる。
【００１３】（３）Ｃｒ−嚢子と夾雑物の分離方法 上記２で剥離した沈さから、従来法又は改良法でＣｒ−
嚢子を分離し、測定を行った。どちらの分離も沈さに界
面活性剤を添加後、ポリビニルピロリドンでコートされ
たコロイド状シリカ（percoll)と純水及びショ糖溶液を
混合して調製する浮遊液を注入し、比重差を利用して遠
心分離させる方法である。浮遊液の注入方法として、従
来法では、比重を１．０９〜１．１になるよう調製した
浮遊液をＣｒ−嚢子と夾雑物を含んだ溶液の底部にカニ
ューレで注入する。これに対し、改良法では、比重を
１．１５〜１．２５、好ましくは１．２になるよう調製
した浮遊液をＣｒ−嚢子と夾雑物を含んだ溶液の上部に
注入する。遠心分離により界面部に浮遊したＣｒ−嚢子
を分離し、孔径絶対１μｍのオムニポアメンブレンフィ
ルター（ポリエチレン系；フィルター直径２５ｍｍ）上
で一次血清（抗クリプトスポリジウム ウサギ血清）と
二次血清（蛍光物質でラベルされたウサギの親和純正抗
体１ｇＧ（Ｈ＋Ｌ））を用いて蛍光抗体染色後、顕微鏡
で計数した。
嚢子を分離し、測定を行った。どちらの分離も沈さに界
面活性剤を添加後、ポリビニルピロリドンでコートされ
たコロイド状シリカ（percoll)と純水及びショ糖溶液を
混合して調製する浮遊液を注入し、比重差を利用して遠
心分離させる方法である。浮遊液の注入方法として、従
来法では、比重を１．０９〜１．１になるよう調製した
浮遊液をＣｒ−嚢子と夾雑物を含んだ溶液の底部にカニ
ューレで注入する。これに対し、改良法では、比重を
１．１５〜１．２５、好ましくは１．２になるよう調製
した浮遊液をＣｒ−嚢子と夾雑物を含んだ溶液の上部に
注入する。遠心分離により界面部に浮遊したＣｒ−嚢子
を分離し、孔径絶対１μｍのオムニポアメンブレンフィ
ルター（ポリエチレン系；フィルター直径２５ｍｍ）上
で一次血清（抗クリプトスポリジウム ウサギ血清）と
二次血清（蛍光物質でラベルされたウサギの親和純正抗
体１ｇＧ（Ｈ＋Ｌ））を用いて蛍光抗体染色後、顕微鏡
で計数した。
【００１４】（４）Ｃｒ−嚢子の測定結果 表１に測定結果を示す。
【表１】
【００１５】（ａ）藻類を含まない原水中のＣｒ−嚢子
の回収率 藻類を含まない原水（Ａ，Ｂ）中からＣｒ−嚢子を分離
した場合の回収率は、従来法で１７．４％、改良法では
４６．３％となった。 （ｂ）藻類を含んだ原水中のＣｒ−嚢子の回収率 藻類を多く含んだ原水（Ｃ）中からＣｒ−嚢子の分離に
は従来法及び改良法のどちらにおいても非常に困難であ
り、回収率は従来法で１．６％、改良法で１．７％と非
常に低くなった。これは、藻類とＣｒ−嚢子の比重差が
少なく、分離が難しいためと考えられる。上記（ａ）、
（ｂ）の結果より、飲料水のように夾雑物の少ない水中
のＣｒ−嚢子の測定については、従来法より改良法の方
が回収率が高かった。また、たとえ藻類が多いような水
を対象とした場合でも、改良法は従来法と同程度の回収
率が得られており、改良法でも水中のＣｒ−嚢子の測定
は可能と考えられる。改良法の分析所用時間は、サンプ
リングに１日、Ｃｒ−嚢子と夾雑物の分離に１日、蛍光
抗体染色及び計数に１日で、合計３日必要である。
の回収率 藻類を含まない原水（Ａ，Ｂ）中からＣｒ−嚢子を分離
した場合の回収率は、従来法で１７．４％、改良法では
４６．３％となった。 （ｂ）藻類を含んだ原水中のＣｒ−嚢子の回収率 藻類を多く含んだ原水（Ｃ）中からＣｒ−嚢子の分離に
は従来法及び改良法のどちらにおいても非常に困難であ
り、回収率は従来法で１．６％、改良法で１．７％と非
常に低くなった。これは、藻類とＣｒ−嚢子の比重差が
少なく、分離が難しいためと考えられる。上記（ａ）、
（ｂ）の結果より、飲料水のように夾雑物の少ない水中
のＣｒ−嚢子の測定については、従来法より改良法の方
が回収率が高かった。また、たとえ藻類が多いような水
を対象とした場合でも、改良法は従来法と同程度の回収
率が得られており、改良法でも水中のＣｒ−嚢子の測定
は可能と考えられる。改良法の分析所用時間は、サンプ
リングに１日、Ｃｒ−嚢子と夾雑物の分離に１日、蛍光
抗体染色及び計数に１日で、合計３日必要である。
【００１６】参考例 凝集ろ過及びセラミックフィルターによるＣｒ−嚢子の
除去方法を検討した。 （１）凝集ろ過 カオリンを１０ｍｇ／ｌ加えた純水にＣｒ−嚢子１０4
個を添加し、ＰＡＣ１５ｍｇ／ｌ、急速攪拌５分、緩速
攪拌１５分の条件で凝集沈殿、 No.５Ａのフィルターで
ろ過後、ろ過水中のＣｒ−嚢子数を本発明の方法により
計数した。 （２）セラミックフィルターによるろ過 セラミックフィルターに、ＬＶ２．５ｍ／ｈでＣｒ−嚢
子１０5 個を添加した純水を通水し、処理水中のＣｒ−
嚢子数を本発明の方法により計数した。
除去方法を検討した。 （１）凝集ろ過 カオリンを１０ｍｇ／ｌ加えた純水にＣｒ−嚢子１０4
個を添加し、ＰＡＣ１５ｍｇ／ｌ、急速攪拌５分、緩速
攪拌１５分の条件で凝集沈殿、 No.５Ａのフィルターで
ろ過後、ろ過水中のＣｒ−嚢子数を本発明の方法により
計数した。 （２）セラミックフィルターによるろ過 セラミックフィルターに、ＬＶ２．５ｍ／ｈでＣｒ−嚢
子１０5 個を添加した純水を通水し、処理水中のＣｒ−
嚢子数を本発明の方法により計数した。
【００１７】（３）Ｃｒ−嚢子の除去結果 表２に示すとおり、除去率は凝集ろ過で９９．９９％以
上、セラミックフィルターろ過では９９．９９％と極め
て高く、この２法におけるＣｒ−嚢子の除去は有効であ
る。また、セラミックフィルターをサンプリングに用い
ることも考えられる。
上、セラミックフィルターろ過では９９．９９％と極め
て高く、この２法におけるＣｒ−嚢子の除去は有効であ
る。また、セラミックフィルターをサンプリングに用い
ることも考えられる。
【表２】
【００１８】
【発明の効果】サンプリングの際には、通常実験室で使
用しているろ過器具を用いて行うことが可能で、嚢子の
溶出の際にはフィルターをそのまま超音波処理すること
ができるため、操作が簡便になった。なお、サンプリン
グに使用しているスクリーンフィルターは、捕捉対象物
がフィルターの表面で捕捉されるため、ろ過によりフィ
ルター上に捕捉された試水中の嚢子及び夾雑物を超音波
処理により簡便に剥離することができる。また、採水現
場にろ過器具とフィルターを持って行けば、現場でろ過
操作を行い、フィルターを分析施設に送付して、嚢子の
剥離操作を実験室で行うことができる。沈さへの浮遊液
添加の際には、沈さの上部から浮遊液を入れるだけで良
く、浮遊液層と沈さとの界面を乱さないなどの特別な注
意を払う必要はなく、初心者でも行うことが可能であ
る。
用しているろ過器具を用いて行うことが可能で、嚢子の
溶出の際にはフィルターをそのまま超音波処理すること
ができるため、操作が簡便になった。なお、サンプリン
グに使用しているスクリーンフィルターは、捕捉対象物
がフィルターの表面で捕捉されるため、ろ過によりフィ
ルター上に捕捉された試水中の嚢子及び夾雑物を超音波
処理により簡便に剥離することができる。また、採水現
場にろ過器具とフィルターを持って行けば、現場でろ過
操作を行い、フィルターを分析施設に送付して、嚢子の
剥離操作を実験室で行うことができる。沈さへの浮遊液
添加の際には、沈さの上部から浮遊液を入れるだけで良
く、浮遊液層と沈さとの界面を乱さないなどの特別な注
意を払う必要はなく、初心者でも行うことが可能であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 長南 勘六 東京都大田区羽田旭町11番１号 株式会社 荏原製作所内
Claims (3)
- 【請求項１】 水源病原微生物を含む試水を、次の
（ａ）〜（ｆ）の工程を順次行うことによって、該試水
中の水源病原微生物の嚢子を計測することを特徴とする
水源病原性微生物の計測方法。 （ａ）、試水をスクリーンフィルターを用いて吸引ろ過
し、フィルター上に水源病原微生物の嚢子及び試水中の
夾雑物を捕捉する捕捉工程、（ｂ）、捕捉された前記嚢
子と夾雑物を超音波により溶出液で剥離し、遠心分離に
より集め沈さを生成させる沈さ生成工程、（ｃ）、前記
沈さに界面活性剤を添加した後、浮遊液を上部より該沈
さに注入し、軽く攪拌し、溶液を前記嚢子の分離に適切
な比重とする比重調整工程、（ｄ）前記比重調整溶液を
遠心分離し、前記嚢子を浮遊液層と水層の界面部分に集
める集積分離工程、（ｅ）、前記集積した水層と界面部
分を別の容器に分取し、純水を加えて攪拌後遠心分離を
行い、上澄みを吸引除去し、残された残液に再び前記浮
遊液を加え遠心分離後、界面部分を別の容器に分取し、
同様に純水で洗浄後、上澄みを吸引除去することを繰り
返す濃縮洗浄工程、（ｆ）、前記洗浄工程の残液部分を
絶対孔径１〜１．２μｍのフィルターに吸引ろ過し、フ
ィルター上に前記嚢子を集積し、フィルターをスライド
グラス上に乗せて冷暗所にて数時間以上放置した後、フ
ィルター上を蛍光物質でラベルされた抗体を用いて蛍光
抗体染色を行い、落射型蛍光顕微鏡にて前記嚢子を計数
する計数工程。 - 【請求項２】 前記工程（ａ）のスクリーンフィルター
としては、絶対孔径５μｍの親水性のテフロン（登録商
標）系スクリーンフィルターを用いることを特徴とする
請求項１記載の水源病原微生物の計測方法。 - 【請求項３】 前記工程（ｆ）の計数は、画像処理によ
る自動計数装置を用いることを特徴とする請求項１又は
２記載の水源病原微生物の計測方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19417496A JP3422402B2 (ja) | 1996-07-05 | 1996-07-05 | 水源病原微生物の計測方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19417496A JP3422402B2 (ja) | 1996-07-05 | 1996-07-05 | 水源病原微生物の計測方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1019891A true JPH1019891A (ja) | 1998-01-23 |
| JP3422402B2 JP3422402B2 (ja) | 2003-06-30 |
Family
ID=16320166
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19417496A Expired - Fee Related JP3422402B2 (ja) | 1996-07-05 | 1996-07-05 | 水源病原微生物の計測方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3422402B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000310641A (ja) * | 1999-04-28 | 2000-11-07 | Nippon Steel Corp | 微生物の検査方法 |
| CN107271413A (zh) * | 2017-06-07 | 2017-10-20 | 暨南大学 | 提高隐孢子虫和贾第虫检测回收率的洗脱液及洗脱方法 |
-
1996
- 1996-07-05 JP JP19417496A patent/JP3422402B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000310641A (ja) * | 1999-04-28 | 2000-11-07 | Nippon Steel Corp | 微生物の検査方法 |
| CN107271413A (zh) * | 2017-06-07 | 2017-10-20 | 暨南大学 | 提高隐孢子虫和贾第虫检测回收率的洗脱液及洗脱方法 |
| CN107271413B (zh) * | 2017-06-07 | 2020-04-14 | 暨南大学 | 提高隐孢子虫和贾第虫检测回收率的洗脱液及洗脱方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3422402B2 (ja) | 2003-06-30 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |