CN115418395B - Mgb探针溶解方法及其溶液 - Google Patents
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Abstract
本发明提供MGB探针溶解方法，所述MGB探针在实时荧光定量PCR反应中应用，所述MGB探针包含至少4个连续鸟嘌呤，向所述MGB探针中加入1×TE缓冲液，70℃‑80℃条件下加热振荡溶解，然后添加10%‑30%体积比例甲酰胺或添加比例15%‑30%体积比例乙酰胺。本发明的方法可以使得含有Poly(dG) MGB探针溶解度提高，避免了MGB探针中Poly(dG)结构对于溶解度的影响，避免了溶解后探针的析出，使其在QPCR过程中更加稳定。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及MGB探针溶解方法及其溶液。
背景技术
MGB（minor groove binding，小沟结合淬灭剂）核酸探针，一般指的是核酸探针的3’端标记小沟结合剂（minor groove binder）的单链核酸。小沟结合剂具有大的共轭结构以及小沟嵌合结构，跟双链DNA有更好的结合力，从而可以提高核酸探针的Tm值，因此3’端用MGB作为淬灭基团的荧光探针，序列可以比常规Taqman探针设计的更短，从而更好的淬灭5’端荧光修饰产生的荧光信号。MGB探针具有荧光本底更低，更高的灵敏度和特异性等特点，广泛应用于基因分析和基因表达等领域。但是由于MGB的结构特征导致疏水性强（如式1所示），这类MGB探针在常规的溶解体系（超纯水/1×TE缓冲液）中，溶解度较差。
式1
在设计实时荧光定量PCR反应所需的MGB探针时，针对特定的检测位点，有时会存在探针序列中出现连续4个及以上鸟嘌呤（dG）的情况，通常将这类探针称为Poly(dG)MGB探针。鸟嘌呤（dG）是一个能够自我结合、自我组装的核酸碱基，探针序列中连续的4个鸟嘌呤可通过氢键作用力形成一个相互连接的刚性结构（式2所示），具有这种结构的探针溶解度比较差，再加上MGB类探针溶解性本身就较差，Poly(dG)MGB探针就更加难以溶解。从而导致后续QPCR测试过程中荧光信号值降低或荧光不稳定的情况。
式2。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种在实时荧光定量PCR反应中应用的MGB探针溶解方法。
在一种实施方式中，本发明提供一种MGB探针溶解方法，所述MGB探针在实时荧光定量PCR反应中应用，所述MGB探针包含至少4个连续鸟嘌呤，向所述MGB探针中加入1×TE缓冲液，70℃-80℃条件下加热振荡溶解，然后添加10%-30%体积比例甲酰胺或添加比例15%-30%体积比例乙酰胺。
在一种实施方式中，添加10%-15%体积比例甲酰胺。
在一种实施方式中，添加15%体积比例甲酰胺。
在一种实施方式中，70℃-80℃条件下加热振荡溶解1-3分钟。
在一种实施方式中，70℃条件下加热振荡溶解3分钟。
在一种实施方式中，所述MGB探针的荧光基团包括FAM、VIC、HEX、ROX和CY5。
在一种实施方式中，提供上述方法制备的MGB探针溶液。
本发明方法适用于序列中含有Poly(dG)MGB探针的溶解，能够充分溶解这类核酸探针。本发明通过引入甲酰胺添加剂，增大了序列中含有Poly(dG)MGB探针的溶解度，使得含有Poly(dG)MGB探针溶解度提高；避免了MGB探针中Poly(dG)结构对于溶解度影响，避免了溶解后探针的析出，使其在QPCR过程中更加稳定，且该添加剂对QPCR实验不会造成影响，对于QPCR反应信号起到增强作用。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。
实施例一对于含Poly(dG)MGB探针的溶解测试
对于含Poly(dG)MGB探针的溶解度进行探究，合成探针序列信息如表1所示，详细的操作步骤如下：
1. 取200nmol含MGB淬灭基团的固相载体CPG，装入合成柱管中制成固相合成柱，装载至寡核苷酸自动合成仪的柱座上。
2. 准备合成使用的脱保护剂、活化耦合剂、盖帽剂、氧化剂，其中脱保护剂为3%(w/v)三氯乙酸的二氯甲烷溶液，每次使用量为200ul；活化耦合剂为0.25M乙巯基四氮唑的乙腈溶液，每次使用量为75ul；盖帽剂CAP A为10%(v/v)乙酸酐的四氢呋喃溶液，每次使用量为80ul，盖帽剂CAP B为16%(v/v)1-甲基咪唑的四氢呋喃溶液，每次使用量为80ul，盖帽剂CAP A和盖帽剂CAP B由机器自动同时加入到合成柱中；氧化剂为0.05M MGB专用碘试剂，每次使用量为150ul。用450ml无水乙腈溶解20g DNA亚磷酰胺单体并用氩气保护，每次使用量为63ul，用4.5ml无水乙腈溶解250mg 6-荧光素亚磷酰胺单体（FAM），每次使用量为80ul；将上述所有合成试剂装载至寡核苷酸自动合成仪上。
3. 将表1中的探针序列导入寡核苷酸自动合成仪中并核对；清洗合成仪设备管道并预打管道流量；检查设备压力、试剂瓶压力、试剂用量等参数，确认无误后点击“开始合成”按钮开始合成。
4. 合成过程中检查试剂用量和设备运行状态直至合成结束。
5. 合成结束后采用水浴氨解脱保护，将合成结束后连接有MGB探针的CPG粉末放入1 ml浓氨水（28%）中加热至55℃，反应8小时，反应结束后冷却至室温。
6. 过滤去除CPG粉末，将含有MGB探针的过滤液装载至高效液相色谱仪上，采用乙腈与0.1M 三乙胺醋酸盐（TEAA）水溶液进行纯化。通过比例阀调节在30min内乙腈的比例从2%提升至35%，而0.1M 三乙胺醋酸盐（TEAA）水溶液的比例从98%下降至65%，纯化得到高纯度的含有机相的Poly(dG)MGB探针溶液。
7．取10ul上述MGB探针溶液，用超纯水稀释至100ul，装载至高效液相色谱仪上进行纯度分析。
8. 从得到的高纯度的Poly(dG)MGB探针溶液中取2ul使用Nanodrop one分光光度计测量A260的吸光值，转换为nmol值，按照每管50nmol分装至2mL透明离心管中；
9. 将分装完成的Poly(dG)MGB探针无损冻干；
10. 在干粉状的Poly(dG)MGB探针中分别加入500ul的1×TE缓冲液，溶解后的理论浓度是100uM。一般来说，普通探针在1分钟内就可以通过振荡溶解完全，但本实施例溶解过程中，发现探针溶解很不彻底，因此统一采用旋涡振荡仪在室温下振荡30分钟。
11. 振荡结束后使用Nanodrop one分光光度计测量溶液的吸光值，并转化成nmol值。
12. 取10ul上述MGB探针溶液，用水稀释至100ul，装载至高效液相色谱仪上再次进行纯度分析。测量的结果如下表1所示。
表1
从上表1测试结果显示，常规室温条件下振荡溶解，Poly(dG)MGB探针的纯度没有明显变化，溶解时间延长至30分钟后，也只有约69-73%的Poly(dG)MGB探针溶解，其最主要的原因是Poly(dG)MGB探针序列中由于存在连续4个及以上鸟嘌呤形成不易溶解的刚性结构。因此尝试提高溶解温度，打开序列内部形成的刚性结构，借助温度变性对其进行助溶。
按照上述操作步骤1-9，放大5倍量重新合成MGB探针，分析确认各条MGB探针的纯度，并按照每管50nmol量各自分装5份并无损冻干，加入500ul的1×TE缓冲液。在进行步骤10时将室温下振荡操作更换为加热振荡溶解，分别在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃条件下，振荡直至溶液变澄清为止，记录下溶解完成时间，测量计算溶液中的nmol值和高效液相色谱仪纯度分析，测量的数据如下表2所示。
表2
从表2数据上看，50℃、60℃条件下，振荡溶解30分钟，仍存在明显的Poly(dG)MGB探针不溶物，且因为溶解时间长，纯度对比结果显示均有1.4-2.7%的探针降解。70℃、80℃条件下，Poly(dG)MGB探针在1-3分钟内几乎可以完全溶解，且纯度无明显变化。在90℃下加热2分钟，所有的Poly(dG)MGB探针都可以完全溶解，但因为溶解温度较高，有1.9-3.4%的探针降解。考虑到加热温度较低，Poly(dG)MGB探针难以溶解，而温度过高，Poly(dG)MGB探针又不稳定，选择70℃作为助溶条件为最佳选项，振荡溶解的时间可控制在3分钟以内。
将上述完全溶解的各探针溶液室温放置1小时，发现已经溶解的溶液均有沉淀析出。测量溶液中的吸光值，折算nmol值，判断Poly(dG)MGB探针的析出程度。数据见表3。
表3
从表3数据看，已经溶解的Poly(dG)MGB探针仍出现探针析出，导致这一现象的原因是在加热情况下，加热提供的能量能够打开连续鸟嘌呤形成的刚性结构，但是当温度慢慢降低时，基于氢键作用形成的刚性结构再次形成，降低了Poly(dG)MGB探针溶解度，探针慢慢析出。
实施例二添加剂对于含Poly(dG)MGB探针的溶解度测试
由实施例一的结果可知，通过加热的方式可以打开Poly(dG)形成的刚性结构，但是温度平衡到室温后，由于Poly(dG)的氢键作用，恢复成原先的刚性结构，探针再次析出。因此考虑通过向溶解体系中添加辅助试剂，通过氢键作用与探针结合，阻碍探针在温度下降后Poly(dG)的刚性结构再次形成。本实施例选择了表4所示的辅助添加剂和不同的添加体积占比。
操作流程如下：
1.按照实施例1中操作步骤1-9，合成投入量放大24倍重新合成MGB探针，分析确认各条MGB探针的纯度，并按照每管50nmol量各自分装24份并无损冻干。
2. 按照下表4所示，先加入对应量的1×TE缓冲液，70℃加热振荡3分钟，
再加入对应的添加剂用量，将探针溶解至100uM，室温静置1小时。
表4
3.静置后使用Nanodrop one分光光度计测量溶液的吸光值，并转化成nmol值；并取10ul上述MGB探针溶液，用超纯水稀释至100ul，装载至高效液相色谱仪上进行纯度分析；测试结果如下表5-8所示。
表5
根据表5测试数据显示，二甲基亚砜（DMSO）比例从5%增加至30%，溶解的程度几乎没有变化，溶液中nmol值约为34.5~38.6之间，溶解比率在69%~78%左右，相较于不加添加剂的溶解比例几乎没有增加，此时纯度分析几乎不变。因此当DMSO作为添加剂时，并没有提升Poly(dG)MGB探针的溶解度。
表6
根据表6测试数据显示，DMF测试结果与DMSO基本一致，当添加剂比例从5%增加至30%时探针溶解nmol值无明显变化，溶解比率保持在71%~78%左右；同时测得的纯度分析没有变化，因此当DMF作为添加剂时，并没有提升Poly(dG)MGB探针的溶解度。
表7
根据表7测试数据显示，甲酰胺添加比例5%，探针的溶解nmol比率达到91%-94%，甲酰胺添加比例10%-30%，探针的溶解nmol比率约为99.8~100%，表明添加甲酰胺后能明显提升探针的溶解度，探针不再析出添加不同比例的甲酰胺，探针的纯度也没有变化，因此甲酰胺的添加比例在10%~30%时，对于Poly(dG)MGB探针的溶解效果较好。
表8
根据表8测试数据显示，当乙酰胺添加剂比例从5%增加至30%时溶解探针的比率从80.6%提升至100%；其中当乙酰胺的添加量超过15%时溶解探针比例约为99.8~100%，这表明Poly(dG)MGB探针已经在溶液中完全溶解。同时随着乙酰胺添加比例上升，探针的纯度也几乎没有变化，因此当乙酰胺的添加比例在15%~30%时都可以完全溶解Poly(dG)MGB探针。
测试结果可以看出加入四种不同的试剂，其中二甲基亚砜与二甲基甲酰胺对探针的助溶效果不如甲酰胺与乙酰胺，尽管DMF与DMSO对引物都有一定溶解能力，但是对于Poly(dG)MGB探针来讲，这两种试剂在探针升温变性后，不能很好的与探针形成氢键，在温度降低过程中，连续的鸟嘌呤又形成了刚性结构，导致探针从溶液中析出，因此不能提升探针在溶液中的溶解度。而加入甲酰胺与乙酰胺时，探针升温变性后甲酰胺与乙酰胺的活泼氢可与连续鸟嘌呤形成稳定氢键，阻碍了连续鸟嘌呤形成刚性结构，提升了探针在溶液中的溶解度。
从上述数据得出，添加10%-30%比例甲酰胺或添加比例15%-30%比例乙酰胺都可以很好地溶解Poly(dG)MGB探针。
实施例三实时荧光定量PCR测试
从上述实施例一、二的结果可知，在Poly(dG)MGB探针溶解液中加入不同比例的甲酰胺、乙酰胺，能促使探针在溶液中完全溶解，但是对于QPCR应用中，甲酰胺、乙酰胺及其添加比例对QPCR反应体系会存在关联的影响，可能会抑制酶的活性，导致CT值偏大，影响检测灵敏度。因此需要进一步验证甲酰胺或乙酰胺不同的添加比例下，QPCR实验的性能结果。
操作流程如下：
1.按照实施例1中操作步骤1-9，放大10倍量合成MGB探针，分析确认各条MGB探针的纯度，并按照每管50nmol量各自分装10份并无损冻干，其中一份作为空白对照组，剩余九份为测试组。
2. 按照添加体积比例，其中九组样品中先加入对应量的1×TE缓冲液，70℃加热振荡3分钟，再加入对应量的添加剂；剩余一组样品只加入500ul的1×TE缓冲液，70℃加热振荡3分钟将探针溶解至100uM备用。
3. 将步骤2得到的100uM探针取1ul加入39ul的1×TE缓冲液稀释至2.5uM，探针配对的两条100uM引物取1ul加入19ul的1×TE缓冲液稀释至5uM，各取10ul稀释后的引物、探针溶液均匀混合成30ul的探针引物混合液。
4. 将反应体系所需的超纯水、10×PCR缓冲液、dNTPs、探针引物混合液，根据下表9体积比例混合成QPCR反应混合液。
表9
5. 配制好的QPCR反应混合液振荡混匀1分钟，6000转/分钟离心2分钟，将离心后的反应液分装至4个反应孔中，每个孔加入10ul，向三个复孔中分别加入2ul，总量为20ng的DNA模板，剩余一个孔中加入10ul超纯水作为阴性对照，完成后振荡混匀1分钟，6000转/分钟离心2分钟。
6. 将配制好的反应体系放入ABI7500中，荧光基团“Reporter”选择“FAM”通道，淬灭基团“Quencher”选择“MGB”通道；按照下表10的程序设备温度、时间、信号采集时间、反应循环数；设置完成后，点击“Run”开始运行。
表10
7. 程序运行结束后，点击“分析”查看数据处理结果，收集数据如下表11所示。
表11
QPCR反应中，荧光值越高，扩增效率越好，数据显示当加入15%及以上比例的乙酰胺时，其荧光信号值均低于空白对照组，这一现象表明乙酰胺的添加抑制了QPCR的扩增过程；而当甲酰胺添加比例为10%时，荧光信号值对比空白组、乙酰胺组都有了明显的提升；当甲酰胺添加比例为15%时，荧光信号值达到了最高的545417~687890；当甲酰胺的量提升超过20%时荧光信号值急剧下降，30%的甲酰胺荧光信号值降至122348~181238左右。这些数据表明10-15%的甲酰胺有助于Poly(dG)MGB 探针的QPCR反应，其中添加15%比例甲酰胺为最优选项。
实施例四多个序列的验证
以上三个实施例验证得到溶解Poly(dG)MGB 探针时，先加入1×TE缓冲液后70℃加热3分钟，再加入体积比15%的甲酰胺为溶解最优的方法，为了进一步验证该溶解方法和配方的普适性，针对如下表14中的不同荧光修饰的Poly(dG)MGB 探针，使用新的溶解方法溶解进行QPCR应用验证，同时用常规1×TE缓冲液溶解，不加添加剂的溶解方案作为空白对照。本实施案例中所用的荧光修饰包括但不限于VIC（2'-氯-7'-苯基-1，4'-二氯荧光素）、HEX（6-羧基-2'，4，4'，5'，7，7'-六氯荧光素）、ROX（6-羟基-X-罗丹明）、CY5（花菁素-5）。
操作流程如下所示：
1. 按照实施例1中操作步骤1-9，根据表14所示的12条探针每条放大2倍量合成MGB探针，纯化后并按照每条探针每管50nmol量分装2份并无损冻干，24组样品中空白对照组为12管，测试组为12管。
2. 向测试组的Poly(dG)MGB探针中先加入425ul 1×TE缓冲液，70℃加热振荡3分钟，再加入75ul甲酰胺振荡2分钟；空白对照组直接加入500ul 1×TE缓冲液，70℃加热振荡3分钟。
3. 从步骤2得到的100uM探针溶液中取1ul加入39ul的1×TE缓冲液稀释至2.5uM，配对两条100uM的引物取1ul加入19ul的1×TE缓冲液稀释至5uM，各取10ul稀释后的引物、探针溶液均匀混合成30ul的引物混合液。
4. 将反应体系所需的超纯水、10×PCR缓冲液、dNTPs、探针引物混合液根据下表12体积比例混合成QPCR反应混合液。
表12
5. 配制好的QPCR反应混合液振荡混匀1分钟，6000转/分钟离心2分钟，将离心后的反应液分装至4个反应孔中，每个孔加入10ul，向三个复孔中分别加入2ul总量为20ng的DNA模板，剩余一个孔中加入10ul超纯水作为阴性对照，完成后振荡混匀1分钟，6000转/分钟离心2分钟。
6. 将配制好的反应体系放入ABI7500 QPCR仪中，荧光基团“Reporter”选择对应的荧光通道，淬灭基团“Quencher”选择“MGB”通道；按照下表13的程序设备温度、时间、信号采集时间、反应循环数；设置完成后，点击“Run”开始运行。
表13
7. 程序运行结束后，点击“分析”查看数据处理结果，收集数据如下表14所示。
表14
从表14测试结果可以看出，对含有不同修饰的Poly(dG)的MGB探针中使用1×TE缓冲液稀释加热3分钟后，再加入15%（v/v）的甲酰胺时，QPCR功能性验证数据得出测试组的荧光信号值都高于空白对照组，表明Poly(dG)MGB探针的溶解体系中加入15%的甲酰胺后，不仅能够保持溶液稳定不析出，同时能够提升QPCR反应的扩增效率，从而提升了反应中的荧光信号值，本发明的溶解添加剂及其配方具有较好的应用价值。
本领域的技术人员容易理解的是，在不冲突的前提下，上述各有利方式可以自由地组合、叠加。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.MGB探针溶解方法，其特征在于，所述MGB探针在实时荧光定量PCR反应中应用，所述MGB探针包含至少4个连续鸟嘌呤，向所述MGB探针中加入1×TE缓冲液，70℃-80℃条件下加热振荡溶解，然后添加10%-30%体积比例甲酰胺或添加比例15%-30%体积比例乙酰胺。
2.根据权利要求1所述的MGB探针溶解方法，其特征在于，添加10%-15%体积比例甲酰胺。
3.根据权利要求2所述的MGB探针溶解方法，其特征在于，添加15%体积比例甲酰胺。
4.根据权利要求1所述的MGB探针溶解方法，其特征在于，70℃-80℃条件下加热振荡溶解1-3分钟。
5.根据权利要求4所述的MGB探针溶解方法，其特征在于， 70℃条件下加热振荡溶解3分钟。
6.根据权利要求1-5任一所述的MGB探针溶解方法，其特征在于，所述MGB探针的荧光基团包括FAM、VIC、HEX、ROX和CY5。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法制备的MGB探针溶液。
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