CN109182527B

CN109182527B - 一种用于胶质瘤中预后评价及化疗效果预测的干扰素相关试剂盒

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Publication number: CN109182527B
Application number: CN201811221911.1A
Authority: CN
Inventors: 吴安华; 程文; 朱晨; 邹存义; 管格非
Original assignee: First Hospital of China Medical University
Current assignee: First Hospital of China Medical University
Priority date: 2018-10-19
Filing date: 2018-10-19
Publication date: 2022-03-01
Anticipated expiration: 2038-10-19
Also published as: CN109182527A

Abstract

本发明生物医学专业领域，具体涉及一种用于胶质瘤中预后评价及化疗效果预测的干扰素相关试剂盒。本发明首次描绘了胶质瘤中的干扰素状态，建立了胶质瘤中首个干扰素相关模型，将该模型转化为试剂盒，用来区分干扰素状态，指导胶质瘤的诊断、预测不良预后以及化疗敏感性等多方面应用，同时解释了胶质瘤中干扰素治疗的不稳定性，为寻找最佳适合干扰素治疗的患者亚群提供了建设性的指导策略。

Description

一种用于胶质瘤中预后评价及化疗效果预测的干扰素相关试剂盒

技术领域

本发明属于生物医学专业领域，具体涉及一种用于胶质瘤中预后评价及化疗效果预测的干扰素相关试剂盒。

背景技术

胶质母细胞瘤（GBM）是中枢神经系统最常见也是最恶性的肿瘤，即使经过标准化治疗，GBM患者的中位生存期也仅有14个月。最近的研究证实异常的免疫反应是胶质瘤恶性进展的重要驱动力。发明人研究发现过度激活的免疫反应及异常的免疫微环境可推动胶质瘤的恶性进展及治疗抵抗。干扰素作为调控免疫反应的重要组分，其主要依赖于激活抗原提成细胞及免疫效应细胞的细胞毒性作用。尽管干扰素治疗在肿瘤包括胶质瘤中广泛应用于临床研究但获益群体较为有限。这可能是由于干扰素在胶质瘤中价值的不确定性。一些研究显示干扰素可通过免疫监视、增强化疗敏感性、抑制血管生成等发挥抗肿瘤效应；然而还有一些研究显示胶质瘤中的干扰素自分泌可介导免疫逃逸及免疫调控点治疗抵抗。因此，急需探究胶质瘤中干扰素的价值并开发标记物为胶质瘤的诊疗提供辅助。

现有技术中胶质瘤中的预后标记物层出不穷，但多为单基因标记物，而多基因COX模型具有单基因无法比拟的稳定性和适用性；从临床问题出发建立的多基因COX预后模型少之又少。越来越多的研究显示，干扰素相关基因可用来指导患者预后及评价治疗效果。目前，关于用于胶质瘤中干扰素预后评价模型的试剂盒还未见报道。本发明提供了胶质瘤中的干扰素状态，并且建立首个干扰素相关模型，并制备成试剂盒，用来评价不良预后及对化疗的效果。

发明内容

鉴于现有技术存在的缺陷，本发明提供一种用于胶质瘤中预后评价及化疗效果预测的干扰素相关试剂盒，在发明研究中首次描绘了胶质瘤中的干扰素状态，建立了胶质瘤中首个干扰素相关模型，将该模型转化为试剂盒，用来区分干扰素状态，指导胶质瘤的诊断、预测不良预后以及化疗敏感性等多方面应用，同时也在一定程度上很好地解释了胶质瘤中干扰素治疗的不稳定性，为寻找最佳适合干扰素治疗的患者亚群提供了建设性的指导策略。

本发明的目的在于提供一种用于胶质瘤中预后评价及化疗效果预测的干扰素相关试剂盒，用于胶质瘤中预后评价及化疗效果预测。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种用于胶质瘤中预后评价及化疗效果预测的干扰素相关试剂盒，其建立方法具体步骤如下。

1）选取132个干扰素相关基因，通过单因素COX分析筛选出五个同预后相关的基因，并根据每个基因的表达值及回归系数建立了风险模型，评分公式为：风险值= (0.1730x SOCS3 表达量) + (0.2370 x ISG20 表达量) + (-0.4303 x IFIT5 表达量) + (-0.2914 x NLRC5 表达量) + (-0.2829 x IRF9 表达量)。

2）选取6个公共数据库中的胶质母细胞瘤患者，分别根据风险值的中位值将患者分为高风险组和低风险组，结果显示该模型具有稳定的预后指导价值，即高风险组生存期显著短于低风险组，该风险模型同样适合于低级别胶质瘤患者（LGG）以及具体细化的不同层次不同亚群患者；并且高风险值提示存在化疗抵抗。

3）将该模型同常规的胶质瘤独立预后因素（KPS及放疗、化疗）联合起来预后准确性进一步提高。

4）将该模型转化为试剂盒。

所述的用于胶质瘤中干扰素预后评价模型的的试剂盒，该试剂盒由组成该模型的5个干扰素相关基因构成，分别为SOCS3、ISG20、NLRC5、IRF9和IFIT5。试剂盒中含有组成该干扰素模型的五个基因的上下游引物，作为内参的GAPDH的上下游引物，以及RNA提取试剂：Trizol、异丙醇、氯仿、无水乙醇，反转录试剂，SYBR Green聚合酶链式反应体系：PCR缓冲液、荧光染料、dNTPs、无RNA酶、水。

所述的一种干扰素相关试剂盒，用于胶质瘤中预后评价及化疗效果预测方法如下。

1）选取合适大小新鲜患者组织标本，充分研磨、抽提RNA。

2) 反转录成cDNA模板。

3) 筛选组成干扰素模型的五个基因及GAPDH的特异性引物，进行实时定量PCR。

4) 以内参GAPDH为参照，记录每个反应的Ct值，检测结果以ΔCt表示，其中ΔCt＝Ct目的基因-CtGAPDH，最终算出五个目的基因相对于内参GAPDH的表达倍数（1/2Δ^Ct）。

5) 代入表达式，胶质母细胞瘤中截点为评分大于4.1定义为高风险组；小于4.1定义为低风险组；对于低级别胶质瘤患者，截断值为-6.2，评分大于-6.2定义为高风险组；小于-6.2 定义为低风险组。

本发明相对现有技术比，具有如下的优点及有益效果。

（1）本发明基于表达谱数据建立了胶质瘤中首个干扰素预后评价模型，并刻画了不同级别胶质瘤中干扰素状态，揭示了干扰素进程在胶质瘤恶性进展中的重要作用，阐明了干扰素相关基因可以成为诊断恶性GBM表型的分子标志物，并为研究胶质瘤疾病进展的分子机理提供新的思路。

（2）本发明提供的用于胶质瘤中预后评价及化疗效果预测的干扰素相关试剂盒具有稳定的预后及化疗效果评估价值，模型的预测能力较强较稳定，并在多个大样本数据库中进行了验证，可以作为临床上预测预后的可靠指标，具有重要的临床指导意义。

（3）本发明中干扰素相关试剂盒具有简单易操作、成本低、时间短、灵敏度高等优点，且有多个大型数据库佐证，评价效能比较稳定，且在指导治疗方面具有较强的临床转化价值，干扰素高风险提示可能存在化疗抵抗及干扰素治疗抵抗，具有广泛的临床应用前景。

附图说明

图1为干扰素相关通路在GBM中显著富集，本发明建立的干扰素相关模型可区分GBM中干扰素状态。

图2为干扰素模型同级别、IDH1野生型及间质型（Mesenchymal）等恶性表型相关。

图3为干扰素模型在6个数据库中具有稳定的预后价值。

图4为风险评分在低级别胶质瘤中同样适用。

图5为分层生存分析提示该模型在不同亚组内均有较好的预后价值。

图6为模型评价生存预后准确性较高；同传统指标结合可更准确评价预后。

图7为高风险组患者提示存在化疗抵抗。

图8为中国医科大学附属第一医院的标本库中，GBM的风险评分显著高于LGG。

具体实施方式

下面结合附图和实施例详细描述本发明。

实施例。

1. 胶质瘤中干扰素状态的描述及GBM中干扰素相关模型的建立。

为了探究干扰素反应在LGG与GBM中的差异，发明人根据一系列干扰素相关反应进行了gene set variation analysis (GSVA) 分析。结果显示干扰素相关通路在GBM中显著富，提示GBM中干扰素状态较为活跃（图1A）。为了探究干扰素相关基因在GBM患者中的预后价值，本发明选取了132个干扰素直接相关的基因。通过单因素COX回归分析，本发明筛选出五个潜在的预后基因 (SOCS3、 ISG20、IFIT5、NLRC5 和 IRF9)。其中，SOCS3 和ISG20是风险性基因（HR>1），而IFIT5、NLRC5 和 IRF9 被认为是保护性基因（HR<1）。根据这五个基因的表达值及回归系数建立了风险模型，评分公式为：风险值 = (0.1730 x SOCS3 表达量)+ (0.2370 x ISG20 表达量) + (-0.4303 x IFIT5 表达量) + (-0.2914 x NLRC5 表达量) + (-0.2829 x IRF9 表达量)，根据风险评分的中位值将患者分为低风险 (n=63) 和高风险组(n=64)。

以干扰素相关基因为背景做PCA主成分分析，发现高低风险组分布于不同的方向，提示二组干扰素状态明显不同(图1B)。本发明进一步进行了GSEA分析，发现干扰素介导的通路在高风险组显著富集(图1C-D)。这些结果说明了高风险组可能伴随更强烈而复杂的干扰素状态。

本发明进一步比较了不同级别以及GBM中不同亚群患者干扰素风险评分的差异，发现风险值随胶质瘤级别升高而增高（图2B），并且同一些恶性临床表型密切相关，发现在年老人群、IDH1野生型及间质型GBM中风险值较高(图2A 和C)。

2.稳定的预后评价指标。

为了评价该模型的预后价值，发明人在发现组及验证组中均应用了此公式去计算风险评分，然后根据中位值将每个数据库的患者分为高风险低风险两组。在发现组，高风险组生存时间显著短于低风险组(median OS= 363 vs 551 days；HR=2.218, 95%confidence interval：1.498-3.284；P<0.0001；图3A)。同时各个验证组的生存分析也证实了这一结果(Figure 2B-F)。与此同时本发明在LGG中应用了本发明的干扰素模型进行生存分析发现同样适用，即在LGG中，高风险组患者预后显著差于低风险组(图4A-D)。

进一步通过分层生存分析来评价干扰素模型的预后价值是否稳定。本发明分别通过年龄、KPS、IDH1突变状态及MGMT甲基化状态将患者分为两组，在发现组中，高风险组的生存时间均明显短于低风险组(图5A-H)。在验证组中也得到了相同的趋势。此外通过多因素COX回归分析，本发明发现同年龄、性别、KPS、放疗及化疗等信息联合分析时，干扰素模型可作为独立的预后指标见表1。并且在多数验证组中，该模型均为独立的风险性预后因素。

3.干扰素模型评价预后的准确性。

为了评估该干扰素模型预测预后的准确性，本发明通过受试者工作曲线比较了包括干扰素模型在内的几种临床参数对2年及3年存活率的预测能力。结果显示该干扰素模型的预测准确性显著高于大多数传统的临床特征(图6A-B)；在各验证组中干扰素模型也展现了较好的预测能力。

接下来，在发现组中通过整合几种独立预后指标建立了nomogram模型，以更准确的评价预后并向临床转化(图6C)。该nomogram的C INDEX值为 0.704，显著高于组成它的各个独立预后指标(图6D)。校准分析提示预测生存与实际生存的拟合度也较好（图6E)，验证组得到了类似的结果。

4.高干扰素风险提示存在化疗抵抗。

为了探究干扰素相关风险同治疗反应的关系，在不同治疗状态下进行生存分析。发现在低风险组，放化疗的患者生存时间显著长于单纯接受放疗的患者(图7A)。然而这种联合治疗的优势在高风险组中并未体现(图7B)。 MGMT 启动子甲基化被认为是GBM中较好的提示化疗敏感型的标记物，进一步整合了干扰素模型、MGMT甲基化状态以及治疗情况进行生存分析。本发明发现，GBM患者群体中，低风险且伴随MGMT启动子甲基化的群体生存时间显著长于MGMT非甲基化群体，高风险组即使伴随MGMT甲基化，预后同MGMT非甲基化相比也无明显差异(图7C-D)。而在接受化疗的GBM患者中，只有低风险伴MGMT甲基化的亚群生存时间显著长于其它组(图7E-F)。该结果在TCGA sequence数据库中得到了验证。这些结果提示了高风险组可能提示存在化疗抵抗，即使伴随MGMT启动子甲基化。

5.相关试剂盒的制备及临床转化。

为了更好地将该干扰素相关预后模型转化为临床应用，特制定了对应的干扰素相关预后及化疗评价试剂盒，该试剂盒中含有组成该干扰素模型的五个基因的上下游引物，作为内参的GAPDH的上下游引物，以及RNA提取试剂、反转录试剂、SYBR Green聚合酶链式反应体系（PCR缓冲液、荧光染料、dNTPs、无RNA酶水等）。对于临床胶质瘤患者，术中选取合适大小新鲜患者组织标本，充分研磨、抽提RNA；反转录成cDNA模板；进行实时定量PCR，引物为组成干扰素模型的五个基因及GAPDH；以内参GAPDH为参照，计算其余五个基因每个基因的相对表达量；代入表达式，对于低级别胶质瘤患者来说，截点为评分大于-6.2；对于胶质母细胞瘤患者，截断值为4.1，高于截断值归类为高风险组，提示预后较差及化疗不敏感。具体实验步骤如下。

1）胶质瘤样本的收集、处理及RNA提取。

术中收集中国医科大学附属第一医院经病理诊断确定为低级别胶质瘤（LGG）及胶质母细胞瘤（GBM）患者肿瘤组织各30例，存储于液氮中；每例标本取少许剪碎研磨，Trizol、氯仿、异丙醇法抽提RNA并测浓度。

2）cDNA模板的制备。

根据以下反转录体系及条件将抽提RNA反转为cDNA。

反转录体系为。

1ugRNA体积： X ul。

5 X RT master mix: 4ul。

无RNA酶水：16-Xul。

总体系：20ul。

反转录条件为：37℃ 15min， 85℃ 5S， 4℃1min 。

3）引物的设计及筛选。

通过Primer Bank网站进行试剂盒组成基因的引物设计，并通过Pubmed进行特异性比对，每个靶基因选取三对目的引物，进行琼脂糖凝胶电泳和实时定量PCR，通过观察特异性条带及溶解曲线，最终确定试剂盒组成基因的特异性引物序列如下。

GAPDH上游引物 ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG。

GAPDH下游引物 GCCATCACGCCACAGTTTC。

NLRC5上游引物 AACGAGACCTTGGACCCTGAA。

NLRC5下游引物 GCTGGTGAACCCATCATCATAG。

ISG20上游引物 CTCGTTGCAGCCTCGTGAA。

ISG20下游引物 CGGGTTCTGTAATCGGTGATCTC。

IFIT5上游引物 GGCCAAAATAAAGACGCCCTT。

IFIT5下游引物 GACCAGGCTTCGTACTTCTTC。

IRF9上游引物 GCCCTACAAGGTGTATCAGTTG。

IRF9下游引物 TGCTGTCGCTTTGATGGTACT。

SOCS3上游引物 AGAGTCCTGTAGCTCTGGGG。

SOCS3下游引物 TGTGGTTGCTATCGTCCCAC。

4）实时定量PCR检测。

根据以下体系及反应条件进行实时定量PCR检测，每例样本对应的每种目的基因设置4个复孔，记录每个反应的Ct值，检测结果以ΔCt表示，其中ΔCt＝Ct目的基因-CtGAPDH，最终算出目的基因相对于内参GAPDH的表达倍数（1/2Δ^Ct）。

5）风险值计算。

将上述每例组织中目的基因相对于GAPDH的表达倍数代入风险评分公式风险值 =(0.1730 x SOCS3 表达量) + (0.2370 x ISG20 表达量) + (-0.4303 x IFIT5 表达量)+ (-0.2914 x NLRC5 表达量) + (-0.2829 x IRF9 表达量)；结果显示在胶质母细胞瘤患者的整体风险评分显著高于低级别胶质瘤患者（图8）；根据中位风险值及离散度确定低级别胶质瘤患者截断值为-6.2；对于胶质母细胞瘤患者，截断值为4.1，高于截断值归类为高风险组，提示预后较差及化疗不敏感。

Claims

1.一种用于胶质瘤中预后评价及化疗效果预测的干扰素相关试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含能够测定胶质瘤组织中干扰素相关模型五基因SOCS3、ISG20、NLRC5、IRF9、IFIT5表达量的相关试剂，包括：SOCS3、ISG20、NLRC5、IRF9和IFIT5的上下游引物，作为内参的GAPDH的上下游引物，以及RNA提取试剂：Trizol、异丙醇、氯仿、无水乙醇，反转录试剂，SYBR Green聚合酶链式反应体系：PCR缓冲液、荧光染料、dNTPs、无RNA酶、水；

所述干扰素模型的建立方法具体步骤如下：

1）选取132个干扰素相关基因，通过单因素COX分析筛选出五个同预后相关的基因，并根据每个基因的表达值及回归系数建立了风险模型，评分公式为：风险值= (0.1730 xSOCS3 表达量) + (0.2370 x ISG20 表达量) + (-0.4303 x IFIT5 表达量) + (-0.2914x NLRC5 表达量) + (-0.2829 x IRF9 表达量)；

2）选取6个公共数据库中的胶质母细胞瘤患者，分别根据风险值的中位值将患者分为高风险组和低风险组，结果显示该模型具有稳定的预后指导价值，即高风险组生存期显著短于低风险组，该风险模型同样适合于低级别胶质瘤患者以及具体细化的不同层次不同亚群患者；并且高风险值提示存在化疗抵抗；

3）将该模型同常规的胶质瘤独立预后因素包括KPS及放疗、化疗联合起来预后准确性进一步提高；

4）将该模型转化为试剂盒。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于胶质瘤中预后评价及化疗效果预测的使用方法如下：

1）选取合适大小新鲜患者组织标本，充分研磨、抽提RNA；

2) 反转录成cDNA模板；

3) 筛选组成干扰素模型的五个基因及GAPDH的特异性引物，进行实时定量PCR；

4) 以内参GAPDH为参照，记录每个反应的Ct值，检测结果以ΔCt表示，其中ΔCt＝Ct目的基因-CtGAPDH，最终算出五个目的基因相对于内参GAPDH的表达倍数1/2Δ^Ct；

5) 代入表达式，胶质母细胞瘤中截点为评分大于4.1定义为高风险组；小于4.1 定义为低风险组；对于低级别胶质瘤患者，截断值为-6.2，评分大于-6.2定义为高风险组；小于-6.2 定义为低风险组。