JP2022082714A - 標的検出のための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2016年2月23日に出願された米国仮特許出願番号第62/298,937号の優先権の利益を主張しており、この仮特許出願は、その全体が本明細書によって援用される。
核酸ベースの検出方法は、費用効果が高く、迅速で、感度が高く、かつ正確であるべきである。また、検出プラットフォームは、使用および解釈が単純であり、広範な作動条件(温度、湿度、照明条件、およびインフラストラクチャーへのアクセス等)の下で安定であり、好ましくは携帯可能かつ使い捨て可能であるべきである。(Yagerら、Nature、2
006年、442巻、412~418頁)。さらには、それらは要求される感度および特異性を提供するべきである。(Weiglら、Lab Chip、2008年、8巻、1999~2014頁)。マルチプレックス試験を実行する能力は検出方法および検出デバイスにとって別の重要な必要条件である。
巻、3249~3266頁)。世界保健機関の2004年次報告書では、感染性疾患は、心臓血管疾患に次いで世界中での死亡の二番目に多い原因として特定されている(WHO、世界保健報告2004、ジュネーヴ、2004年)。この問題は、衛生状態が悪く、診断および治療用の集中施設へのアクセスが限られた地域において特に大きい。先進国においてさえ、食品産業、病原体の大発生および性感染疾患に関して対処すべき問題が残されている。政治面では、生物兵器戦争の脅威もまた現実的な可能性として存在する。効果的な病原体の検出および同定は、感染性疾患の予防および治療にとって決定的に重要である。
核酸配列の検出方法には、病原体の検出および同定に加えて、他の適用がある。例えば、毒素の由来となる植物(例えば、リシンを含有するトウゴマ)の検出、またはヒトの同定もしくは腫瘍のシークエンシングの目的での単一ヌクレオチド多型(SNP)の検出は、ほんの二つの例である。
ガイドRNA(gRNA)媒介性CRISPR/Cas系タンパク質等の標的特異的ガイド核酸(gNA)媒介性ヌクレアーゼ系タンパク質を使用する、標的核酸の検出および同定用の方法および組成物が、本明細書に提供される。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される:
(項目1)
試料中の標的を同定する方法であって、
a.試料由来の核酸を複数のガイド核酸(gNA)-核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体と接触させるステップであって、前記複合体は、少なくとも1つの標的へと標的化されており、かつ前記核酸、前記gNA-核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体、または前記核酸および前記gNA-核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の両方は標識を含む、ステップと、
b.前記標識由来の特定のシグナルを検出することによって達成される、前記試料中の前記標的を同定するステップであって、特定のシグナルの存在は、前記核酸への前記gNA-核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の結合を示す、ステップと
を含む方法。
(項目2)
前記核酸が、標識を含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記標識が、インターカレーター型の標識である、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記核酸が、前記接触ステップの前に標識される、項目2に記載の方法。
(項目5)
前記核酸が、前記接触ステップの後に標識される、項目2に記載の方法。
(項目6)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、CRISPR/Cas系タンパク質である、項目2に記載の方法。
(項目7)
小滴を生成するステップをさらに含み、前記小滴のサブセットが、gNA-核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体を含む、項目1から6のいずれかに記載の方法。
(項目8)
前記小滴のサブセットが、前記核酸に結合したgNA-核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体を含む、項目7に記載の方法。
(項目9)
複数の前記gNA-核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体が、標識を含む、項目1に記載の方法。
(項目10)
複数の前記gNA-核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体が、前記接触ステップの前に標識される、項目9に記載の方法。
(項目11)
複数の前記gNA-核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体が、前記接触ステップの後に標識される、項目9に記載の方法。
(項目12)
前記核酸が、標識を含む、項目9に記載の方法。
(項目13)
前記核酸および前記複数の前記gNA-核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の両方が、前記接触ステップの前に標識される、項目12に記載の方法。
(項目14)
前記核酸および前記複数の前記gNA-核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の両方が、前記接触ステップの後に標識される、項目12に記載の方法。
(項目15)
前記核酸が、接触の前に標識され、かつ前記複数の前記gNA-核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体が、前記接触ステップの後に標識される、項目12に記載の方法。
(項目16)
前記核酸が、接触の後に標識され、かつ前記複数の前記gNA-核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体が、前記接触ステップの前に標識される、項目12に記載の方法。
(項目17)
前記核酸が、第1の標識を含み、かつ前記gNA-核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体が、第2の標識を含み、前記第1の標識および前記第2の標識が、蛍光共鳴エネルギー移動用のドナー/アクセプターペアを含む、項目12に記載の方法。
(項目18)
前記接触させるステップが、室温で実行される、項目1から17のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
前記同定するステップが、単一のシグナルを検出することを含む、項目1から18のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
前記同定するステップが、複数のシグナルを検出することを含む、項目1から18のいずれか一項に記載の方法。
(項目21)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、Cas9、CasX、CasY、Cpf1、Cas3、Cas8a-c、Cas10、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Csm2およびCm5からなる群から選択されるCRISPR/Cas系タンパク質である、項目1から20のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質である、項目21に記載の方法。
(項目23)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、dCas9である、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系ニッカーゼタンパク質である、項目21に記載の方法。
(項目25)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、オフターゲット結合の低下を呈する、項目21に記載の方法。
(項目26)
前記標識が、酵素、酵素基質、抗体、抗原結合性断片、ペプチド、発色団、発光団、フルオロフォア、色原体、ハプテン、抗原、放射性同位元素、磁性粒子、金属ナノ粒子、酸化還元活性マーカー基、アプタマー、結合ペアの一方のメンバーおよびこれらの組合せからなる群から選択される、項目1から25のいずれか一項に記載の方法。
(項目27)
前記標識が、検出可能な標識である、項目1から25のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
前記試料が、臨床試料、法医学的試料、環境試料、メタゲノム試料および食品試料からなる群から選択される、項目1から27のいずれか一項に記載の方法。
(項目29)
前記試料が、ヒトに由来する、項目1から28のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
前記試料が、前記接触前に処理されない、項目1から29のいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
前記核酸、前記gNA-核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体、または前記核酸および前記gNA-核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の両方が、複数の標識を含む、項目1から30のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
前記複合体が、複数の標的へと標的化されている、項目1から31のいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
前記標的が、個体である、項目1から32のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
前記標的が、病原体である、項目1から32のいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
前記病原体が、表1に記載の病原体から選択される、項目33に記載の方法。
(項目36)
異なる標的へと標的化された前記複合体が、異なる標識を含む、項目32に記載の方法。
(項目37)
異なる標的へと標的化された前記複合体が、同じ標識を含む、項目32に記載の方法。
(項目38)
前記gNA-核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体が、基材に付着されている、項目1から37のいずれか一項に記載の方法。
(項目39)
前記基材が、シリカ、プラスチック、ガラスまたは金属である、項目38に記載の方法。
(項目40)
前記基材が、二次元の基材である、項目39に記載の方法。
(項目41)
前記基材が、三次元の基材を含む、項目39に記載の方法。
(項目42)
前記基材が、チャンバーを含むかまたは円筒状アレイである、項目39に記載の方法。
(項目43)
前記gNA-核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体が、既知の順序で基材に付着されている、項目38に記載の方法。
(項目44)
前記基材が、再使用可能である、項目38から43のいずれか一項に記載の方法。
(項目45)
前記gNA-核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体が、溶液中に存在する、項目1から37のいずれか一項に記載の方法。
(項目46)
前記gNA-核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体が、少なくとも1つの特異なgNAを含む、項目1から45のいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
前記接触が、溶液中で行われる、項目1から37のいずれか一項に記載の方法。
(項目48)
前記核酸が、基材に付着されている、項目1から37のいずれか一項に記載の方法。
(項目49)
前記基材が、シリカ、プラスチック、ガラスまたは金属である、項目48に記載の方法。
(項目50)
前記核酸が、シークエンシングによってさらに分析される、項目1から49のいずれか一項に記載の方法。
(項目51)
前記核酸が、せん断される、項目1から50のいずれか一項に記載の方法。
(項目52)
前記核酸が、増幅される、項目1から51のいずれか一項に記載の方法。
(項目53)
前記核酸が、伸長できないヌクレオチドを用いて1または複数の末端において遮断される、項目1から52のいずれか一項に記載の方法。
(項目54)
複数の標的が、同時に同定される、項目1から53のいずれか一項に記載の方法。
(項目55)
24時間未満で実行される、項目1から54のいずれか一項に記載の方法。
(項目56)
前記試料が、事前のスクリーニングステップに供される、項目1から55のいずれか一項に記載の方法。
(項目57)
前記試料が、複数の検出ステップに供される、項目1から55のいずれか一項に記載の方法。
(項目58)
前記核酸へのgNA-核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の結合が、標的の存在を示す、項目1から57のいずれかに記載の方法。
(項目59)
核酸へのgNA-核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の結合の欠如が、標的が存在しないことを示す、項目1から57のいずれかに記載の方法。
(項目60)
前記核酸が、DNAを含む、項目1から59のいずれかに記載の方法。
(項目61)
前記核酸が、DNAである、項目1から59のいずれかに記載の方法。
(項目62)
少なくとも1つの標的へと標的化されたガイド核酸(gNA)の収集物であって、複数の前記gNAが標識を含む、収集物。
(項目63)
複数の標的へと標的化されている、項目62に記載の収集物。
(項目64)
前記標的が、個体である、項目62から63のいずれか一項に記載の収集物。
(項目65)
前記標的が、病原体である、項目62から63のいずれか一項に記載の収集物。
(項目66)
前記病原体が、表1に記載の病原体から選択される、項目65に記載の収集物。
(項目67)
異なる標的へと標的化されている前記gNAが、異なる標識を含む、項目63から66のいずれか一項に記載の収集物。
(項目68)
異なる標的へと標的化されている前記gNAが、同じ標識を含む、項目63から66のいずれか一項に記載の収集物。
(項目69)
前記標識が、検出可能な標識である、項目62から68のいずれか一項に記載の収集物。
(項目70)
前記標識が、酵素、酵素基質、抗体、抗原結合性断片、ペプチド、発色団、発光団、フルオロフォア、色原体、ハプテン、抗原、放射性同位元素、磁性粒子、金属ナノ粒子、酸化還元活性マーカー基、アプタマー、結合ペアの一方のメンバーおよびこれらの組合せからなる群から選択される、項目62から69のいずれか一項に記載の収集物。
(項目71)
前記gNAが、2つ以上の標識を含む、項目62から70のいずれか一項に記載の収集物。
(項目72)
前記gNAが、基材に付着されている、項目62から71のいずれか一項に記載の収集物。
(項目73)
前記基材が、シリカ、プラスチック、ガラスまたは金属である、項目72に記載の収集物。
(項目74)
前記基材が、二次元の基材である、項目73に記載の収集物。
(項目75)
前記基材が、三次元の基材を含む、項目73に記載の収集物。
(項目76)
前記基材が、チャンバーを含むかまたは円筒状アレイである、項目73に記載の収集物。
(項目77)
前記gNAが、既知の順序で基材に付着されている、項目62から76のいずれか一項に記載の収集物。
(項目78)
前記基材が、再使用可能である、項目72から77のいずれか一項に記載の収集物。
(項目79)
前記gNAが、溶液中に存在する、項目62から71のいずれか一項に記載の収集物。
(項目80)
少なくとも1つの特異なgNAを含む、項目62から79のいずれか一項に記載の収集物。
(項目81)
前記gNAが、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質と複合体化している、項目62から80のいずれか一項に記載の収集物。
(項目82)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、CRISPR/Cas系タンパク質である、項目81に記載の収集物。
(項目83)
前記CRISPR/Cas系タンパク質が、Cas9、CasX、CasY、Cpf1、Cas3、Cas8a-c、Cas10、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Csm2およびCm5からなる群から選択される、項目82に記載の収集物。
(項目84)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質である、項目81に記載の収集物。
(項目85)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、dCas9である、項目84に記載の収集物。
(項目86)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系ニッカーゼタンパク質である、項目81に記載の収集物。
(項目87)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、オフターゲット結合の低下を呈する、項目81に記載の収集物。
(項目88)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、標識をさらに含む、項目62から87のいずれか一項に記載の収集物。
(項目89)
ガイド核酸(gNA)-核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の収集物であって、前記gNAが、少なくとも1つの標的へと標的化されており、かつ複数の前記複合体が、標識を含む、収集物。
(項目90)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、CRISPR/Cas系タンパク質である、項目89に記載の収集物。
(項目91)
複数の前記gNAが標識を含む、項目89に記載の収集物。
(項目92)
複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、標識を含む、項目89に記載の収集物。
(項目93)
複数のgNAおよび複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質の両方が、標識を含む、項目89に記載の収集物。
(項目94)
前記gNAが、複数の標的へと標的化されている、項目89から93のいずれか一項に記載の収集物。
(項目95)
前記標的が、個体である、項目89から94のいずれか一項に記載の収集物。
(項目96)
前記標的が、病原体である、項目89から94のいずれか一項に記載の収集物。
(項目97)
前記病原体が、表1に記載の病原体から選択される、項目96に記載の収集物。
(項目98)
異なる標的へと標的化されている前記gNAが、異なる標識を含む、項目89から97のいずれか一項に記載の収集物。
(項目99)
異なる標的へと標的化されている前記gNAが、同じ標識を含む、項目89から97のいずれか一項に記載の収集物。
(項目100)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、異なる標識を含む、項目89から97のいずれか一項に記載の収集物。
(項目101)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、同じ標識を含む、項目89から97のいずれか一項に記載の収集物。
(項目102)
前記標識が、検出可能な標識である、項目89から101のいずれか一項に記載の収集物。
(項目103)
前記標識が、酵素、酵素基質、抗体、抗原結合性断片、ペプチド、発色団、発光団、フルオロフォア、色原体、ハプテン、抗原、放射性同位元素、磁性粒子、金属ナノ粒子、酸化還元活性マーカー基、アプタマー、結合ペアの一方のメンバーおよびこれらの組合せからなる群から選択される、項目89から101のいずれか一項に記載の収集物。
(項目104)
前記複合体が、2つ以上の標識を含む、項目89から103のいずれか一項に記載の収集物。
(項目105)
前記複合体が、基材に付着されている、項目89から104のいずれか一項に記載の収集物。
(項目106)
前記gNAが、前記基材に付着されている、項目105に記載の収集物。
(項目107)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、前記基材に付着されている、項目105に記載の収集物。
(項目108)
前記基材が、シリカ、プラスチック、ガラスまたは金属である、項目105に記載の収集物。
(項目109)
前記基材が、二次元の基材である、項目108に記載の収集物。
(項目110)
前記基材が、三次元の基材である、項目108に記載の収集物。
(項目111)
前記基材が、チャンバーを含むかまたは円筒状アレイである、項目108に記載の収集物。
(項目112)
前記複合体が、既知の順序で基材に付着されている、項目89から105のいずれか一項に記載の収集物。
(項目113)
前記基材が、再使用可能である、項目89から112のいずれか一項に記載の収集物。
(項目114)
前記複合体が、溶液中に存在する、項目89から104のいずれか一項に記載の収集物。
(項目115)
少なくとも1つの特異なgNAを含む、項目89から114のいずれか一項に記載の収集物。
(項目116)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、Cas9、CasX、CasY、Cpf1、Cas3、Cas8a-c、Cas10、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Csm2およびCm5からなる群から選択されるCRISPR/Cas系タンパク質である、項目89から115のいずれか一項に記載の収集物。
(項目117)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質である、項目116に記載の収集物。
(項目118)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、dCas9である、項目117に記載の収集物。
(項目119)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系ニッカーゼタンパク質である、項目116に記載の収集物。
(項目120)
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、オフターゲット結合の低下を呈する、項目116に記載の収集物。
(項目121)
項目62から120に記載の収集物のいずれか一つを含むキット。
gRNA等の標的特異的(例えば、病原体特異的)ガイド核酸(gNA)、およびCRISPR/Cas系タンパク質等の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を使用する、標的(例えば、病原体)の検出および同定用の方法および組成物が、本明細書に提供される。一部の好ましい実施形態では、gNAはgRNAであり、かつ核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、Cas9等のCRISPR/Cas系タンパク質である。gRNAおよびCRISPR/Cas系タンパク質を用いる方法を本明細書中で論じる場合は常に、他の適切な核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質およびgNAを用いる関連方法もまた想定される。
「その(the)」は、他に断りがなければ、複数形の参照を含む。
標的の検出および同定用の方法および組成物が、本明細書に提供される。該方法は、標的特異的ガイド核酸(gNA)(ガイドRNA等)および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質(例えば、Cas9等のCRISPR/Cas系タンパク質)を利用する。標的は核酸を含有し、該核酸が同定および検出用に利用される。
病原体の検出および同定用の方法および組成物が、本明細書に提供される。病原体は、細菌、ウイルス、真菌、藻または原生動物であり得る。病原体は、真核生物または原核生物であり得る。
アクセス日:2016年2月18日)は、本明細書に提供されている方法および組成物を使用して同定され得る例示的な疾患を引き起こす病原体を提供する。
標的特異的ガイド核酸(gNA)が本明細書に提供される。これらの標的特異的gNAは、試料中の核酸標的の検出および同定のために利用される。gNAは、結合のために、核酸ガイド化ヌクレアーゼタンパク質をgNAと同族の標的にガイドする。
一部の実施形態では、gNAの収集物は、単一の病原体、少なくとも1つの病原体、または複数の病原体へと標的化されている。一部の実施形態では、病原体は、表1に挙げた疾患の1または複数を引き起こすものである。
本明細書に提供される標的特異的gNAは、表面上の領域として編成され得る。例えば、標的特異的gNAは、アレイまたは他の表面もしくは基材(例えば、ビーズ、プレート)上に、スポット、ブロック、ビーズ、小滴、ウェルまたは他の編成構造として編成され得る。gNA集団は、表面上の領域として、例えばウェルまたは小滴等の区画として編成され得る。gNA集団は、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質と共に編成および配置されて、該編成内における標的への結合を可能とし得る。
本開示の方法は、核酸ガイド化ヌクレアーゼを利用する。本明細書で使用する場合、「核酸ガイド化ヌクレアーゼ」は、DNA、RNAまたはDNA/RNAハイブリッドを切断し、特異性を付与するために1つまたは複数の核酸ガイド核酸(gNA)を使用する任意のヌクレアーゼである。核酸ガイド化ヌクレアーゼには、CRISPR/Cas系タンパク質ならびに非CRISPR/Cas系タンパク質が含まれる。
intestinalis、Neisseria cinerea、Gluconacetobacter diazotrophicus、Azospirillum、Sphaerochaeta globus、Flavobacterium columnare、Fluviicola taffensis、Bacteroides coprophilus、Mycoplasma mobile、Lactobacillus
farciminis、Streptococcus pasteurianus、Lactobacillus johnsonii、Staphylococcus pseudintermedius、Filifactor alocis、Legionella pneumophila、Suterella wadsworthensisまたはCorynebacter diphtheria由来の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質)由来であるまたはこれに由来する。
一部の実施形態では、CRISPR/Cas系タンパク質が使用される。一部の実施形態では、CRISPR/Cas系タンパク質は、CRISPR I型系、CRISPR II型系およびCRISPR III型系由来のタンパク質を含む。
一部の実施形態では、CRISPR/Cas系タンパク質、核酸ガイド化ヌクレアーゼは、Cas9であるかまたはCas9を含む。本発明のCas9は、単離されるか、組換えで生成されるか、または合成のものであってよい。Cas9は、天然に存在し得る、天然に存在するバージョンを模倣し得る、または操作されたバージョンであり得る。
520巻、186~191頁(2015年4月9日)doi:10.1038/nature14299、に見出すことができ、それは参照により本明細書に組み込まれる。
lavamentivorans、Roseburia intestinalis、Neisseria cinerea、Gluconacetobacter diazotrophicus、Azospirillum、Sphaerochaeta globus、Flavobacterium columnare、Fluviicola
taffensis、Bacteroides coprophilus、Mycoplasma mobile、Lactobacillus farciminis、Streptococcus pasteurianus、Lactobacillus johnsonii、Staphylococcus pseudintermedius、Filifactor alocis、Legionella pneumophila、Suterella wadsworthensisまたはCorynebacter diphtheriaに由来するII型CRISPR系である。
TT)、Streptococcus thermophilus(NNAGAA)およびTreponema denticola(NAAAAC)、これらは全て本発明から逸脱することなく使用可能である。
一部の実施形態では、非CRISPR/Cas系タンパク質が、本明細書で提供される実施形態で使用される。
pneumophila、Suterella wadsworthensis、Natronobacterium gregoryiまたはCorynebacter diphtheriaからのものであるかまたはそれに由来する。
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼの操作された例には、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ(CRISPR/Cas系の核酸ガイド化ヌクレアーゼまたは非CRISPR/Cas系の核酸ガイド化ヌクレアーゼ)が含まれる。用語「触媒活性がない」は、不活性化ヌクレアーゼ、例えば、不活性化HNHおよびRuvCヌクレアーゼを有する核酸ガイド化ヌクレアーゼを一般的に指す。そのようなタンパク質は任意の核酸中の標的部位に結合することができるが(標的部位はgNAによって決定される)、タンパク質は核酸を切断することもニックを入れることもできない。
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼの操作された例には、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ(ニッカーゼ-核酸ガイド化ヌクレアーゼと互換的に呼ばれる)が含まれる。
一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼが本明細書で提供される方法で使用される(耐熱性のCRISPR/Cas系の核酸ガイド化ヌクレアーゼまたは耐熱性の非CRISPR/Cas系の核酸ガイド化ヌクレアーゼ)。そのような実施形態では、反応温度が上昇し、タンパク質の解離を誘導する。反応温度は低下し、さらなる切断された標的配列の生成を可能にする。一部の実施形態では、少なくとも75℃で少なくとも1分の間維持されるとき、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、少なくとも50%の活性、少なくとも55%の活性、少なくとも60%の活性、少なくとも65%の活性、少なくとも70%の活性、少なくとも75%の活性、少なくとも80%の活性、少なくとも85%の活性、少なくとも90%の活性、少なくとも95%の活性、少なくとも96%の活性、少なくとも97%の活性、少なくとも98%の活性、少なくとも99%の活性または100%の活性を維持する。一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、少なくとも75℃で、少なくとも80℃で、少なくとも85℃で、少なくとも90℃で、少なくとも91℃で、少なくとも92℃で、少なくとも93℃で、少なくとも94℃で、少なくとも95℃、96℃で、少なくとも97℃で、少なくとも98℃で、少なくとも99℃で、または少なくとも100℃で少なくとも1分の間維持されるとき、少なくとも50%の活性を維持する。一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、少なくとも75℃で少なくとも1分、2分、3分、4分または5分の間維持されるとき、少なくとも50%の活性を維持する。一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、温度を上昇させ、25℃~50℃に低下させたとき、少なくとも50%の活性を維持する。一部の実施形態では、温度は、25℃に、30℃に、35℃に、40℃に、45℃に、または50℃に低下させられる。例示的な一実施形態では、耐熱性酵素は、95℃で1分間の後に少なくとも90%の活性を保持する。
標的特異的ガイド核酸(gNA)と複合体化した核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、本明細書に提供される。gNAは、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を標的核酸に向かわせる。核酸ガイド化ヌクレアーゼ系は、RNAガイド化ヌクレアーゼ系であり得る。核酸ガイド化ヌクレアーゼ系は、DNAガイド化ヌクレアーゼ系であり得る。場合によっては、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質をRNA標的に向かわせる標的特異的gNAと複合体化した核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質である。場合によっては、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質をDNA標的に向かわせる標的特異的gNAと複合体化した核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質である。
試料中に存在する核酸に基づく、試料中の標的の検出および同定用の方法および組成物が、本明細書に提供される。
標的特異的gNAおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を使用する、標的の検出および同定用の方法および組成物が、本明細書に提供される。該方法は、試料由来の試料中の核酸を標的特異的gNA-核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、核酸は、DNAを含む、またはDNAである。一部の実施形態では、核酸は、RNAを含む、またはRNAである。
30号、Yueら(1995年)の米国特許第5,410,030号、米国特許第5,86
3,753号、ならびに米国特許出願公開第2006/0211028号および同第2008/0145526号に記載されているものを含む。上記で言及した色素の多くは、Invitrogen、Sigma、Biotiumおよび多数の他の企業から市販されている。
子、金属ナノ粒子、酸化還元活性マーカー基(酸化還元反応を起こすことができる)、アプタマー、結合ペアの一方のメンバーおよびこれらの組合せを非限定的に含む。
Fluor(登録商標 488、Alexa Fluor(登録商標 532、Alexa Fluor(登録商標 546、Alexa Fluor(登録商標 568、Alexa Fluor(登録商標 594、Alexa Fluor(登録商標 633、Alexa Fluor(登録商標 647、Alexa Fluor(登録商標 660、Alexa Fluor(登録商標 680、7-アミノ-4-メチルクマリン-3-酢酸、BODIPY FL、BODIPY FL-Br2、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY
576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY TR、Quantum Dots、これらのコンジュゲートおよびこれらの組合せを含む。
基質およびアッセイ条件の存在下で検出可能なシグナルを生成できる。
本発明の標識の検出は、当該技術分野で公知の標準的な方法を用いて実行され得る。例えば、検出は、眼によって、可視変色を検出することによって、分光光度計、蛍光リーダーもしくは蛍光顕微鏡を使用することによって達成され得る。一部の実施形態では、検出のために携帯式装置が利用される。一部の実施形態では、シグナル検出は、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の原理に基づくものであり、FRETシグナルは、顕微鏡上でFRETチャネルを使用して検出され得る。
本発明は、標的特異的gNAおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を使用する、標的の検出および同定用の方法および組成物を提供する。この目的に有用な様々な基材が、本明細書に提供される。
標的特異的gNAおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を使用する、標的(すなわち、標的核酸、標的DNAおよび/または標的RNA)を検出および同定するための方法が、本明細書に提供される。
核酸を効果的に濃縮することもできる。体積排除剤(volume excluder)を使用して、体積排除剤が占める液体体積から試料物質を排除することにより、残りの液体体積中に試料物質を濃縮することができる。この機序は、基材への試料核酸のハイブリダイゼーション等による、試料物質の捕捉または結合を加速させるのを助けることができる。例えば、体積排除剤をハイブリダイゼーション緩衝液中に含めてハイブリダイゼーションの反応速度を向上させることができる。体積排除剤は、例えばビーズまたはポリマーであり得、硫酸デキストラン、フィコールおよびポリエチレングリコールを非限定的に含む。体積排除剤は、高分子量ポリマーであり得る。体積排除剤は、負に帯電していてもよく、これにより例えば、体積排除剤への核酸の結合を低減し得る。
本出願は、キットを提供し、該キットは、標的特異的gNA、標的特異的gNAの収集物、標識された標的特異的gNA、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質(例えば、CRISPR/Cas系タンパク質)と複合体化した標的特異的gNA、基材に付着された標的特異的gNA、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質(例えば、CRISPR/Cas系タンパク質)と複合体化し、かつ基材に付着された標的特異的gNA、病原体特異的gNA、病原体特異的gNAの収集物、標識された病原体特異的gNA、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質(例えば、CRISPR/Cas系タンパク質)と複合体化した病原体特異的gNA、基材に付着された病原体特異的gNA、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質(例えば、CRISPR/Cas系タンパク質)と複合体化し、かつ基材に付着された病原体特異的gNA、基材等に限定されない本明細書に記載されているいずれか1または複数の組成物および収集物を含む。一実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、Cas9である。
臨床試料中の病原体の検出
この実施例では、臨床試料(例えば、血液、スワブ、脳脊髄液)を得、(例えば、Qiagen Blood DNAまたはRNA抽出キットを使用して)DNAまたはRNAを抽出する。RNAを抽出したら、標準的な方法を使用してそれをcDNAに変換する。任意選択で、酵素的または機械的手段を使用してDNAをせん断することができる。次いで、dCas9と複合体化した病原体特異的なgRNAを既知の特定の順序で含有する基材にDNAを注ぐ。比色計または蛍光の読み取りにより、存在する病原体の種類(例えば、エボラ、HIV、Mycobacterium tuberculosis等)を決定する。検出器において使用される特定のgRNAライブラリーを用意することにより、異なる場合(例えば、肺炎、尿路感染症、食物媒介性の感染症)において病原体を検出することができる。検出器の迅速な読み取りは、培養またはRT-PCR等の標準的な方法と比べて試料収集と診断との間の時間を短縮し、検出を現場(例えば、大発生の場所にある現地)で実行することができる。標的DNAを基材から溶出した後、シークエンシングして病原体に関する追加の情報を得ることもできる。
環境試料中の生物兵器(病原体)の検出
この実施例では、環境試料(例えば、空気清浄器、土壌試料、表面スワブ)を得、(例えば、MO Bio Soil DNA抽出キットを使用して)DNAまたはRNAを抽出する。RNAを抽出したら、標準的な方法を使用してそれをcDNAに変換する。任意選択で、酵素的または機械的手段を使用してDNAをせん断することができる。次いで、一連の潜在的な生物兵器剤を標的化するgRNAを含有する基材にDNAを注ぎ、比色計または蛍光の読み取りにより、存在する病原性生物兵器の種類(例えば、Bacillus anthracis、Yersinia pestis)を決定する。検出器の迅速な読み取りは、RT-PCR等の標準的な方法と比べて試料収集と脅威の検出との間の時間を短縮し、検出を現場(例えば、現地)で実行することができる。標的DNAを基材から溶出した後、シークエンシングして病原体に関する追加の情報を得ることもできる。
毒性植物起源
この実施例では、生物兵器毒素の試料を得、(例えば、MO Bio Soil DNA抽出キットを使用して)DNAまたはRNAを抽出する。RNAを抽出したら、標準的な方法を使用してそれをcDNAに変換する。任意選択で、酵素的または機械的手段を使用してDNAをせん断することができる。次いで、一連の潜在的な毒素剤を標的化するgRNAを含有する基材にDNAを注ぐ。例えば、毒素がリシンであれば、トウゴマそれ自体の亜種により、毒素ならびにあり得る亜種およびトウゴマの起源の場所の迅速な同定を可能とし得る。
製造物の検証およびバーコード化
製造物に特異的なgRNAを作製して、材料の異なるロットまたは起源を同定し得、それにより製造物の起源を追跡し得る。例えば、ベークド製品が複数の原料国の原材料を含有すること、または牛肉試料に馬肉が混ざっていることがあり得る。位置特異的なgRNAのアレイは、施行機関に対して製造物のバルク原材料の位置を教え得る。それはまた、製造物パッケージ上のDNAマーカーを同定することによって、当該国に密輸入された模造品の検出にも有用であり得る。
ヒトの同定
この実施例では、ヒトDNAを含有する試料(例えば、法医学的試料)を得、(例えば、QIAmp DNA Micro kitのキットを使用して)DNAを抽出する。任意選択で、酵素的または機械的手段を使用してDNAをせん断することができる。次いで、ヒトの同定用に選択した一連のSNPを標的化するgRNAを含有する基材にDNAを注ぎ、比色計または蛍光の読み取りを、各個体に特異となるように選択し得る。異なるSNPの対立遺伝子がgRNAの差次的な結合を生じるようにgRNAを選択する。検出器の迅速な読み取りは、PCRおよびキャピラリー電気泳動等の標準的な方法と比べて試料収集と疑わしい者の同定との間の時間を短縮し、検出を現場(例えば、現地)で実行することができる。標的DNAを基材から溶出した後、シークエンシングして個体に関する追加の情報(例えば、表現型の情報)を得ることもできる。
腫瘍DNAの突然変異の検出
この実施例では、がんのDNAを含有する試料(例えば、腫瘍試料)を得、(例えば、Qiagen DNeasy tissue kitを使用して)DNAを抽出する。任意選択で、酵素的または機械的手段を使用してDNAをせん断することができる。次いで、がんにおいてよく見られる一連の突然変異の部位を標的化するgRNAを含有する基材にDNAを注ぎ、比色計または蛍光の読み取りを、各変異に特異となるように選択し得る。異なるSNPの対立遺伝子がgRNAの差次的な結合を生じるようにgRNAを選択する。検出器の迅速な読み取りは、エクソームシークエンシング等の標準的な方法と比べて試料収集と腫瘍プロファイリングとの間の時間を短縮し、検出を現場(例えば、診療所)で実行することができる。標的DNAを基材から溶出した後、シークエンシングして追加の情報を得ることもできる。
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