CN112852937A

CN112852937A - 一种呼吸道病原微生物检测引物组合、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN112852937A
Application number: CN202110260532.9A
Authority: CN
Inventors: 陈澎明; 杨仁涛; 龚浩; 王东升; 詹太平; 蒋华
Original assignee: Meige Medical Laboratory Guangzhou Co ltd
Current assignee: Guangzhou Jingwei Medical Technology Co ltd
Priority date: 2021-03-10
Filing date: 2021-03-10
Publication date: 2021-05-28
Anticipated expiration: 2041-03-10
Also published as: CN112852937B

Abstract

本发明公开了一种呼吸道病原微生物检测引物组合、试剂盒和方法，属于微生物检测技术领域。所述呼吸道病原微生物检测引物组合包括分别具有SEQ ID No.1～20所示核苷酸序列的引物。本发明的方法针对临床疑似呼吸道感染样本，采用多重PCR技术结合靶向测序技术，分析样本中的常见病原微生物，可用于包括细菌、真菌、病毒(DNA及RNA病毒)、支原体、衣原体等病原微生物的检测，简单、快速、准确，有助于临床精准诊疗。

Description

一种呼吸道病原微生物检测引物组合、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体地，涉及一种呼吸道病原微生物检测引物组合、试剂盒及其应用。

背景技术

呼吸道常见的病原微生物主要有病毒、细菌、支原体、衣原体和立克次体等，据统计，90％以上急性呼吸道感染由病毒引起，一种病原微生物可引起多种临床症状，同一临床表现可由多种病原微生物引起。细菌引起呼吸道感染的机会比病毒少，一旦感染，症状多较严重，定位比较明显，如扁桃体炎、中耳炎、鼻窦炎等。病毒包括EBV、 CMV、HSV、HHV、博卡病毒、腺病毒、鼻病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、腺病毒等。

传统的病原微生物鉴定技术主要分为两类，基于培养的方法例如形态学观察、细胞生理生化特征、细菌培养分型、基因芯片、自动化微生物分析系统等；基于特异引物/探针/抗体的方法例如抗原抗体反应、PCR反应检测以及各种特异性的病原微生物快速检测系统等。这些技术在日常病原微生物确证中发挥了重要作用，但也存在一定的不足，前者需要依赖培养、周期长、鉴定精度低；后者需要一定的微生物序列先验知识、无法应对未知或突变病原微生物等。

发明内容

为了解决上述问题中的至少一个，本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供一种呼吸道病原微生物检测引物组合，包括分别具有SEQ IDNo.1～20所示核苷酸序列的引物，其中，SEQ ID No.为奇数的为正向引物，SEQ ID No. 为偶数的为反向引物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述呼吸道病原微生物检测引物组合包括分别由SEQ ID No.1～20所示核苷酸序列组成的引物。

在本发明的一些实施方案中，所述正向引物的5’端与SEQ ID No.21所示的核苷酸序列连接；所述反向引物的5’端与SEQ ID No.22所示的核苷酸序列连接。

在本发明的一些实施方案中，所述呼吸道病原微生物检测引物组合还包括正向引物Adptor F和反向引物Adptor R，其中，所述正向引物Adptor F由SEQ ID No.23所示核苷酸序列和SEQ ID No.24所示核苷酸序列按5'-3'方向首尾连接；所述反向引物 Adptor R由SEQ ID No.25所示核苷酸序列和SEQ ID No.26所示核苷酸序列按5'-3' 方向首尾连接。

在本发明的一些具体实施方案中，SEQ ID No.23所示核苷酸序列和SEQ ID No.24所示核苷酸序列之间，以及SEQ ID No.25所示核苷酸序列和SEQ ID No.26所示核苷酸序列还分别插入样本识别条码序列N_6-12，由此，

组合成的Adptor F的序列碱基组成如下(5'-3')：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCN_6-12CCTACACGACGCTC TTCCGATCT

组合成的Adptor R的序列碱基组成如下(5'-3')：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATN_6-12GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT CTTCCGATCT

其中N代表A、T、C、G任一种；下标6-12代表该样本识别条码的碱基序列数为6-12bp。

本发明第二方面提供一种呼吸道病原微生物检测试剂盒，包括本发明第一方面任一所述的引物组合。

在本发明的一些实施方案中，所述呼吸道病原微生物检测试剂盒还包括PCR缓冲液、聚合酶。

在本发明的一些实施方案中，所述呼吸道病原微生物检测试剂盒还包括IR DNA，所述IR DNA为人工合成DNA片段，且序列不具有任何物种同源性。在本发明的一些具体实施方案中，所述IR DNA具有SEQ ID No.27所示核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述呼吸道病原微生物检测试剂盒还包括核酸提取试剂和/或cDNA合成试剂。

本发明第三方面提供一种呼吸道病原微生物检测方法，包括以下步骤：

S1，获得待测样本的核酸样本，

S2，以步骤S1获得的核酸样本为模板，利用引物组合进行第一轮PCR扩增，获得第一轮PCR扩增产物；

S3，以步骤S2获得的第一轮PCR扩增产物为模板，利用正向引物Adptor F和反向引物Adptor R进行第二轮PCR扩增，获得第二轮PCR扩增产物；

S4，对S3获得的第二轮PCR扩增产物进行高通量测序，根据测序结果鉴定待测样本中的呼吸道病原微生物，

其中，所述引物组合包括分别具有SEQ ID No.1～20所示核苷酸序列的引物，其中，SEQ ID No.为奇数的为正向引物，SEQ ID No.为偶数的为反向引物，所述正向引物的5'端与SEQ ID No.21所示的核苷酸序列连接；所述反向引物的5'端与SEQ ID No. 22所示的核苷酸序列连接。

在本发明的一些实施方案中，所述待测样本为体液样本，包括但不限于唾液、痰液、血液、胸腹水、尿液；在本发明的另一些实施方案中，所述待测样本包括但不限于肺泡灌洗液、纤支镜灌洗液。在本发明的一些具体实施方案中，所述待测样本为痰液，针对痰液样本，在提取核酸前需利用液体试剂进行液化处理。在本发明的一些优选实施方案中，所述液化试剂为SD液化剂，其主要成分如下：

Saccomanno液：每50mL含有50％乙醇48mL，2％PEG 1mL，0.3％利福平1mL，其中；2％PEG：2g+100mL无菌水，0.3％利福平：0.3g+100mL无菌水；

DTT液(100×)：1g DTT，7.8g NaCl，0.2g KCl，1.12g磷酸二氢钠，0.2g磷酸二氢钾，加水至200mL；

SD液化剂：Saccomanno液每10mL加入100μL DTT液。

使用时，将等体积SD液化剂与取痰液样本混合均匀。

在本发明的一些实施方案中，步骤S1中，所述核酸样本包括DNA和RNA，即 TNA。在本发明的一个具体实施方案中，利用酶解结合化学裂解的方法裂解细胞释放出病原微生物DNA及RNA，再纯化、浓缩、洗脱，得到样本中疑似病原微生物TNA。在本发明的一些优选实施方案中，利用蛋白酶K进行所述酶解。在本发明的一些优选实施方案中，利用选自包括异硫氰酸胍和Trizol的化学裂解试剂中的一种进行所述化学裂解。

进一步地，在步骤S2之前，还包括将RNA反转录成cDNA的步骤：

取上述得到的TNA，加入一链合成试剂First Strand Enzyme和First Strandbuffer，混合均匀，进行cDNA合成。

在本发明的一些实施方案中，所述第一轮PCR扩增反应在同一反应管中进行，反应中使用的模板DNA(包括cDNA)含量为50～100ng；所述第一轮PCR扩增反应体系包括：Primer Mix 2μL，模板DNA7.5μL，2×PCR Buffer 12.5μL，Multiplex Polymerase 1μL，IRDNA 2μL，其中，所述Primer Mix即为所述引物组合，各引物等比例混合，总浓度不超过2μM，优选地为2μM；所述第一轮PCR扩增反应程序为：95℃预变性 5min；98℃变性20sec，60℃退火5min，68℃延伸40sec，循环8次；68℃后延伸5min，循环1次；4℃保存。

在本发明的一些实施方案中，所述第二轮PCR扩增反应在同一反应管中进行，反应中所使用的模板为第一轮PCR扩增的产物；扩增所使用的引物为接头序列PCR引物Adptor F和Adptor R，其序列碱基组成如下：

组合成的Adptor F的序列碱基组成如下(5'-3')：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCN_6-12CCTACACGACGCTC TTCCGATCT

组合成的Adptor R的序列碱基组成如下(5'-3')：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATN_6-12GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT CTTCCGATCT

所述第二轮PCR扩增反应体系包括：Adptor F 1μL，Adptor R R 1μL，模板DNA 22μL，2×PCR Buffer 25μL，Multiplex Polymerase 1μL。所述第二轮PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，循环1次；98℃变性15sec，60℃退火40sec，68℃延伸30sec，循环22次；68℃后延伸10min，循环1次；4℃保存。

在本发明的一些实施方案中，在第一轮PCR扩增结束后和第二轮PCR扩增结束后，分别对第一轮PCR扩增产物和第二轮PCR扩增产物进行纯化。在本发明的一些实施方案中，进行磁珠进行所述纯化。

在本发明的一些实施方案中，步骤S4中，对S3获得的第二轮PCR扩增产物进行高通量测序之前，进一步包括文库质控的步骤，包括但不限于使用Qubit 4.0测定文库浓度，及Agilent 4200测定文库片段大小。

在本发明的一些实施方案中，进行Illumina SBS测序方法进行所述高通量测序，包括但不限于Illumina MiSeq、MiniSeq、iSeq、NextSeq测序平台。在本发明的一些具体实施方案中，在测序前，将文库变性为单链，结合到测序芯片上，经桥式扩增将每个单链DNA分子富集成为一个cluster，再用Illumina SBS测序方法读取序列。在本发明的一些优选实施方案中，利用NaOH将文库变性为单链，具体地：文库经稀释至4nM，与浓度为0.2N的NaOH等量混合后，静置5min，双链DNA即在NaOH作用下变性为单链。

在本发明的一些实施方案中，步骤S4中，测序数据经数据质控、过滤低质量序列及接头序列、与病原微生物靶标序列数据库比对步骤，鉴定出样本中的呼吸道病原微生物。在本发明的一些具体实施方案中，利用fastqc去除低质量及过短序列；过滤后剩余序列使用bwa与病原微生物靶标序列数据库比对，统计准确比对上相应靶标的 reads数；识别病原微生物靶标序列cutoff值应为准确比对reads数大于3且覆盖对应病原微生物靶标数大于1。在本发明的一些优选实施方案中，所述病原微生物靶标序列数据库为病原微生物各靶标全序列的组合。

在本发明的一些实施方案中，所述呼吸道病原微生物检测方法是基于非诊断、非治疗目的的方法。

本发明的第四方面提供本发明第一方面所述的引物组合在制备用于诊断呼吸道病原感染的试剂盒中的应用。

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

利用本发明，可以简单、快速、准确、全面地对呼吸道病原微生物进行检测。具体的说，其优势表现为以下几个方面：

①低成本：本发明仅对检测范围内的病原微生物靶标进行多重PCR测序，与现有技术中广泛采用的mNGS方法相比，无人源基因组污染，所需测序数据量低，因此本发明成本相对较低；

②高通量：基于本发明，针对同一份样本，一次可检测多种病原微生物，而且在一次测序中，可实现多份样本并行检测；

③高灵敏度：本发明通过多重PCR富集病原微生物靶标，检测灵敏度高；

④可检测混合感染：本发明可检测多种病原微生物混合感染，包括细菌、真菌、病毒、寄生虫等；

⑤高分辨率：本发明基于扩增子测序的方法，可以准确鉴定病原微生物的种、亚种、株系、血清型等，且数据可用于微生物基因水平的标记及分类解析；

⑥可同时检测DNA及RNA病毒，本发明样本处理涵盖了常见以DNA为遗传物质的细菌、真菌、寄生虫、支原体、衣原体、DNA病毒，以及以RNA为遗传物质的 RNA病毒，如呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒、鼻病毒等。

附图说明

图1示出了本发明实施例2中肺泡灌洗液样本A1、A2文库片段大小峰图。A： A1；B：A2；其中Upper为Agilent 4200片段分析仪上游marker，大小为1500bp；Lower 为Agilent4200片段分析仪下游marker，大小为25bp。

图2示出了本发明实施例3中痰液样本B1、B2文库片段大小峰图。A：B1；B： B2；其中Upper为Agilent 4200片段分析仪上游marker，大小为1500bp；Lower为 Agilent 4200片段分析仪下游marker，大小为25bp。

具体实施方式

除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。

本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如，如果记载组分、物理或其它性质(如分子量，熔体指数等)是100至1000，意味着明确列举了所有的单个数值，例如100，101，102等，以及所有的子范围，例如100到166，155到170，198到200 等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1，1.5等)的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5) 的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。

术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本申请中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均按照《分子克隆实验指南》(第四版)(J.萨姆布鲁克、M.R.格林，2017)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。其他实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1呼吸道病原微生物检测引物设计及扩增方法

本实施例针对常见的呼吸道病原微生物：肺炎支原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体、结核分枝杆菌、白色念珠菌、耶氏肺孢子菌、人疱疹病毒4型(EBV)、人疱疹病毒5型(CMV)、呼吸道合胞病毒(RSV)和鼻病毒的特异性靶标序列设计特异性引物，引物序列如表1所示：

表1呼吸道病原微生物检测引物组

利用上述引物组可以制备用于检测呼吸道常见微生物的试剂盒。使用时的步骤如下：

(1)获得呼吸道样本的TNA(DNA/RNA)，在逆转录酶的作用下，以RNA为模板合成cDNA。

(2)以DNA和cDNA为模板进行第一轮扩增：

在进行第一轮PCR扩增时，将上述引物序列与连接序列Linker F和Linker R连接，连接序列与上述引物序列按5'-3'方向首尾连接。连接序列碱基组成如下(5'-3')：

Linker F：CCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID No.21)

Linker R：CAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID No.22)

(3)以第一轮PCR扩增产物为模板进行第二轮PCR扩增即可得到满足测序要求的文库。第二轮PCR扩增的引物包括正向引物Adptor F和反向引物Adptor R。

正向引物Adptor F由三部分组成：Adptor F1、样本识别条码序列和Adptor F2，三者按5'-3'方向首尾连接。其中Adptor F1和Adptor F2的序列碱基组成如下(5'-3')：

Adptor F1：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTC(SEQ ID No.23)

Adptor F2：CCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID No.24)

反向引物Adptor R由三部分组成：Adptor R1、样本识别条码序列和Adptor R2，三者按5'-3'方向首尾连接。其中Adptor R1和Adptor R2的序列碱基组成如下(5'-3')：

Adptor R1：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID No.25)

Adptor R2：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID No.26)

组合成的Adptor F的序列碱基组成如下(5'-3')：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCN_6-12CCTACACGACGCTC TTCCGATCT

组合成的Adptor R的序列碱基组成如下(5'-3')：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATN_6-12GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT CTTCCGATCT

其中N_6-12即为样本识别条码，N代表A、T、C、G任一种；下标6-12代表该样本识别条码的碱基序列数为6-12bp；

如只针对一个样本进行检测，则样本识别条码也可省略。

经扩增后即可得到满足要求的文库。

(4)文库质控：使用Qubit 4.0测定文库质量浓度，及使用Agilent 4200测定文库片段大小。

(5)高通量测序：文库经NaOH变性为单链后，结合到测序芯片上，经桥式扩增将每个单链DNA分子富集成为一个cluster，再用Illumina SBS测序方法读取序列。

(6)生物信息学分析：测序数据经数据质控、过滤低质量序列及接头序列、与病原微生物靶标序列数据库比对等步骤，鉴定出样本中的呼吸道病原微生物。

实施例2 2份肺泡灌洗液样本病原微生物检测

收集A1、A2疑似呼吸道感染患者肺泡灌洗液样本。

A1患者临床症状为：间断发热2天，最高体温39.7℃，稽留热。临床诊断为：1、败血症；2、真菌感染；3、肺炎(重症)病原。白细胞计数14.74×109/L、HGB：110g/L； PCT：306×109/L；CRP：20.98mg/L。其他检测结果：先天性免疫缺陷。抗菌素：美罗培南、哌拉西林他唑巴坦。根据临床症状及诊断，判断其可能存在呼吸道病原微生物感染。

A2患者临床症状为：咳嗽、咳痰、发热，临床诊断为：疑似肺炎、结核分枝杆菌感染。已使用抗菌素为比阿培南。根据临床症状及诊断，判断其可能存在呼吸道病原微生物感染。

利用实施例1的引物组合和方法，对A1、A2患者肺泡灌洗液样本进行检测，具体实施步骤如下：

1.DNA/RNA(TNA)提取

1.1原始样本颠倒混匀，取500μL样本至1.5mL的离心管中，12000rpm离心5min，弃上清留取底部液体约200μL。

1.2加入Buffer GB 200μL、Buffer LA 200μL，蛋白酶K 40μL，Carrier RNA 10μL，轻轻颠倒混匀5次，56℃孵育30min。

1.3加入预冷乙醇(96-100％)400μL，轻轻颠倒混匀样本，室温放置5min，短暂离心以去除管盖内壁的液滴。

1.4用移液器将上一步所得溶液转移至吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中，重复此步骤一次。

1.5吸附柱中加入500μL缓冲液PD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)， 12,000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

1.6吸附柱中加入500μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)， 12,000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中，重复此步骤1次。

1.7将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min，将将吸附柱转入一个干净的离心管中，室温放置5min。

1.8向吸附膜中间位置悬空滴加30μL Nuclease-Free Water至吸附膜中央，室温放置5min，12,000rpm离心2min，离心前离心机内盖、离心机孔需用75％酒精擦拭，离心后核对柱子管盖上的编号与1.5mL离心管管盖上的编号，核对无误后丢弃柱子。将溶液收集到离心管中即提取得到样本总TNA。

1.9提取所得TNA应及时进行下一步实验，如需短期保存，则保存条件应为-80℃。

2.cDNA合成

2.1取提取后的TNA 17μL到0.2mL PCR管，加入6μL FirstStrand Enzyme(Vazyme，NR21)和2μL FirstStrand buffer(Vazyme，NR21)，混匀离心。

2.2按如下条件设置cDNA合成反应条件：

25℃10min，42℃15min，70℃15min，4℃保存。

3.第一轮PCR扩增

以步骤2获得的cDNA和DNA为模板进行第一轮PCR扩增。

3.1取出PCR反应体系Primer Mix(即实施例1添加连接序列后的引物按等比例混合成引物组合物，浓度为2μM)，Multiplex Polymerase(Thermo Fisher，F562S)，2×PCRBuffer(Thermo Fisher，F562S)，解冻后混匀离心，置于冰上。按如下反应体系配制靶标基因多重PCR扩增体系：

其中，IR DNA的序列如下(5’-3’，200bp)：

GACAAAGATTCTCATATTTAAACACAACATGAAGATTGTGCATAGATCAGA ATGGTTTATAGACTGAGTAGGCAAACATCCTTGGGGAAGGGATTCGTGTCTATT CTACCTGTTGCTTCGCGTTCCGTGAGGTAGTGACTTCCCAACCTTCACCCCCACG ACCTCCGCCCTAGCAGCCTTCAGGGATGGTTTCCACCCGG(SEQ ID No.27)

3.2配制后，混合均匀，短暂离心。按如下条件设置靶标基因多重PCR扩增程序：

4.第一轮PCR扩增产物纯化

第一轮PCR后，进行下面的方法对第一轮PCR产物进行纯化：

4.1多重PCR后的产物用Nuclease-Free Water补至50μL，振荡混匀，短暂离心。

4.2充分振荡混匀AMPure XP beads，取55μL AMPure XP beads至1.5mL低吸附管，再加入50μL样本，混匀，短离心，室温放置5min。

4.3 5min后将样本管置于磁力架上，计时5min，等液体澄清后，小心弃去上清，注意不要扰动磁珠。

4.4加入200μL 80％乙醇，注意不要对着磁珠加入，孵育30sec后移除上清。重复一遍，共漂洗2次。

4.5取下管子，离心30sec，将管子置于磁力架上，用小规格移液器将底部的液体吸干，打开盖子，晾干至表面龟裂。

4.6磁珠晾干后，将管子从磁力架上取下，加入102μL Nuclease-Free Water，振荡混匀，短暂离心。室温放置5min。

4.7 5min后将管子置于磁力架上，等待液体澄清，取上清100μL收集于1.5mL 低吸附管，注意不要吸到磁珠。加入85μL AMPure XP beads，盖上盖子，低速涡旋振荡混合均匀，室温静置5min，短暂离心。

4.8将管置于磁力架上1min，直至液体澄清。小心吸取183μL上清至新的1.5mL 低吸附管中(不要吸到磁珠)。

4.9向上清中加入20μL涡旋振荡后的AMPure XP beads，盖上盖子，低速涡旋振荡混合均匀，室温静置5min，瞬离。

4.10将管置于磁力架上约2～5min，直至液体澄清。小心吸弃上清，不要吸到磁珠。

4.11加入200μL 80％乙醇，静置30sec，小心吸弃上清，不要吸到磁珠。重复一遍，共漂洗2次。盖上盖子，短暂离心。置于磁力架上1min，待磁力架吸附磁珠后，用20μL枪头将管底残留液体吸取，不要吸到磁珠。

4.12室温晾干至磁珠表面不反光(约2～5min，不要让磁珠晾干至出现裂痕)。

4.13从磁力架上取下EP管，加入24μL Nuclease-free Water。盖上盖子，低速涡旋振荡混合均匀，室温静置5min，短暂离心。将管置于磁力架上1min直至液体澄清。

4.14小心转移22μL上清至0.2mL PCR反应管中，注意不要吸到磁珠。

5.第二轮PCR扩增

5.1取出PCR反应体系Adptor F，Adptor R，Multiplex Polymerase(ThermoFisher， F562S)，2×PCR Buffer(Thermo Fisher，F562S)，解冻后混匀离心，置于冰上。按以下反应体系配制PCR mix：

5.2配制后吹打混匀，短暂离心，置于PCR仪上，在PCR仪上运行以下程序：

6.第二轮PCR产物纯化

利用步骤4.2-4.13的步骤对第二轮PCR产物进行纯化，最后转移22μL上清至1.5mL离心管中，注意不要吸到磁珠。

7.文库质控

7.1取1μL进行Qubit定量检测，定量结果如表2所示：

表2肺泡灌洗液样本A1、A2文库Qubit定量结果

文库编号	Qubit浓度(ng/μL)	体积(μL)
			A1-L	19.4	20
A2-L	21.3	20

7.2取1μL使用Agilient Bioanalyer 4200测定文库片段大小，质控片段大小分别为：331bp和333bp，如图1所示。

8.高通量测序

质检合格后的文库，稀释至4nM，取5μL加入1.5mL离心管，再加入5μL 0.2N NaOH，变性5min，双链DNA变性成单链DNA，再稀释至终浓度为1nM。

文库经NaOH变性为单链后，可与测序芯片上锚定的短链核酸互补配对，经桥式扩增方法将每个单链DNA分子富集成为一个簇(cluster)，再用Illumina SBS测序方法读取序列。

9.生物信息学分析

测序数据使用fastqc去除低质量及过短序列，过滤后剩余序列使用bwa与病原微生物靶标序列数据库即引物对应病原靶标基因全序列组合比对，统计准确比对上相应靶标的reads数，识别病原微生物靶标序列cutoff值为准确比对reads数大于3且覆盖对应病原微生物靶标数大于1。结果如表3所示：

表3肺泡样本A1、A2中检出的微生物

样本	类型	中文名	拉丁名	Reads	Reads占比
						A1	MC	鹦鹉热衣原体	Chlamydia psittaci	551	84.3％
A1	F	烟曲霉	Aspergillus fumigatus	103	15.7％
						A2	MT	结核分枝杆菌	Mycobacterium tuberculosis	49	4.0％
A2	V	人疱疹病毒4型(EBV)	Human herpesvirus 4	1120	91.7％
						A2	V	人疱疹病毒4型(CMV)	Human herpesvirus 5	53	4.3％

实施例3 2份痰液样本病原微生物检测

收集2份疑似感染病人的痰液样本B1、B2。

B1患者临床症状为：糖尿病，肺部阴影。临床诊断为：肺部CT发现肺及纵膈淋巴结可疑结核。血常规：WBC：7.3×10⁹/L；LY％：21％；Neu％：6％。根据临床症状，判断其可能存在病原微生物感染，较大可能为细菌感染。

B2患者临床症状为：发热，呼吸困难。临床诊断为：1、重症肺炎；2、肺出血； 3、呼吸衰竭；4、呼吸道合胞病毒肺炎；5、干细胞移植状态；6、粘多糖病(IV型)。血常规：WBC：0.7×10⁹/L；LY％：1％；Neu％：92％；CRP：2.23。根据临床症状，判断可能存在病原微生物感染，较大可能为呼吸道病毒感染。

利用实施例1的引物组合和方法，对B1、B2患者痰液样本进行检测，具体实施步骤如下：

1TNA提取

1.1取原始样本500μL，加入500μL SD液化剂，振荡混匀，56℃孵育30min。

1.2 12000rpm离心5min，取底部沉淀约200μL，加入Buffer GB 200μL、Buffer LA200μL，蛋白酶K 40μL，Carrier RNA 10μL，轻轻颠倒混匀5次，56℃孵育30min。

1.3用移液器将上一步溶液转移至吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中，重复此步骤一次。

1.4往吸附柱中加入500μL缓冲液PD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)， 12,000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

1.5往吸附柱中加入500μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)， 12,000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中，重复此步骤1次。

1.6将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min，将将吸附柱转入一个干净的离心管中，室温放置5min。

1.7向吸附膜中间位置悬空滴加30μL Nuclease-Free Water至吸附膜中央，室温放置5min，12,000rpm离心2min，离心前离心机内盖、离心机孔需用75％酒精擦拭，离心后核对柱子管盖上的编号与1.5mL离心管管盖上的编号，核对无误后丢弃柱子。将溶液收集到离心管中即提取得到样本总TNA。

1.8提取所得TNA应及时进行下一步实验，如需短期保存，则保存条件应为-80℃。

1.9参照实施例1的方法，对TNA样本进行cDNA合成、第一轮PCR扩增及产物纯化、第二轮PCR扩增及产物纯化，构建用于测序的文库。

2.文库质检

2.1取1μL进行Qubit定量检测，定量结果如表4所示：

表4痰液样本B1、B2文库Qubit定量结果

文库编号	Qubit浓度(ng/μL)	体积(μL)
			B1-L	26.3	20
B2-L	21.7	20

2.2取1μL使用Agilient Bioanalyer 4200测定文库片段大小，质控片段大小分别为：341bp和328bp，如图2所示。

8.高通量测序

质检合格后的文库，稀释至4nM，取5ul加入1.5ml离心管，再加入5ul 0.2N NaOH，变性5min，双链DNA变性成单链DNA，再稀释至符合上机的浓度。文库经NaOH 变性为单链后，可与测序芯片上锚定的短链核酸互补配对，经桥式扩增方法将每个单链DNA分子富集成为一个簇(cluster)，再用Illumina SBS测序方法读取序列。

9.生物信息学分析

测序数据使用fastqc去除低质量及过短序列，过滤后剩余序列使用bwa与病原微生物靶标序列数据库比对，统计准确比对上相应靶标的reads数，识别病原微生物靶标序列cutoff值为准确比对reads数大于3且覆盖对应病原微生物靶标数大于1。结果如表5所示：

表5痰液样本B1、B2中检出的微生物

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 美格医学检验所（广州）有限公司

<120> 一种呼吸道病原微生物检测引物组合、试剂盒及其应用

<130> XYD202110152

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggatcctt cccgtttttc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gactagggaa tgcctaccgt g 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgaaacgga cttatcaacc tag 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cactatgtgg gaaggtgctt ca 22

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gttttcgcgt tccctgcat 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggcgcgaatc aacttcaatt 20

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gatctcttgg ttctcgc 17

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cccgccttac cactaccg 18

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctgtttccct ttcgactatc tacctt 26

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cactgaatat ctcgagggag tatgaa 26

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cagtcaggca agcctatga 19

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctggttccgg tggagatga 19

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gcccgatttc aatatggagt tcag 24

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cggccgaatt ctcgctttc 19

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gcaaaacaat ccagcacaat gg 22

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tcaccaccac caaacagcat a 21

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gggacacact ccacacaaaa t 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gccacacacc ataagcaaca a 21

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cctacacgac gctcttccga tct 23

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cagacgtgtg ctcttccgat ct 22

<210> 23

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttc 35

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cctacacgac gctcttccga tct 23

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

caagcagaag acggcatacg agat 24

<210> 26

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atct 34

Claims

1.一种呼吸道病原微生物检测引物组合，其特征在于，包括分别具有SEQ ID No.1～20所示核苷酸序列的引物，其中，SEQ ID No.为奇数的为正向引物，SEQ ID No.为偶数的为反向引物。

2.根据权利要求1所述的呼吸道病原微生物检测引物组合，其特征在于，所述正向引物的5'端与SEQ ID No.21所示的核苷酸序列连接；所述反向引物的5'端与SEQ ID No.22所示的核苷酸序列连接。

3.根据权利要求1或2所述的呼吸道病原微生物检测引物组合，其特征在于，还包括正向引物Adptor F和反向引物Adptor R，其中，所述正向引物Adptor F由SEQ ID No.23所示核苷酸序列和SEQ ID No.24所示核苷酸序列按5'-3'方向首尾连接；所述反向引物AdptorR由SEQ ID No.25所示核苷酸序列和SEQ ID No.26所示核苷酸序列按5'-3'方向首尾连接。

4.根据权利要求3所述的呼吸道病原微生物检测引物组合，其特征在于，SEQ ID No.23所示核苷酸序列和SEQ ID No.24所示核苷酸序列之间，以及SEQ ID No.25所示核苷酸序列和SEQ ID No.26所示核苷酸序列还分别插入样本识别条码序列N_6-12，其中N代表A、T、C、G任一种；下标6-12代表该样本识别条码的碱基序列数为6-12bp。

5.一种呼吸道病原微生物检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任一所述的引物组合。

6.根据权利要求5所述的呼吸道病原微生物检测试剂盒，其特征在于，还包括PCR缓冲液、聚合酶和/或IR DNA。

7.根据权利要求5或6所述的呼吸道病原微生物检测试剂盒，其特征在于，还包括核酸提取试剂和/或cDNA合成试剂。

8.一种呼吸道病原微生物检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，获得待测样本的核酸样本，

S2，以步骤S1获得的核酸样本为模板，利用权利要求2所述的引物组合进行第一轮PCR扩增，获得第一轮PCR扩增产物；

S3，以步骤S2获得的第一轮PCR扩增产物为模板，利用权利要求4所述的正向引物Adptor F和反向引物Adptor R进行第二轮PCR扩增，获得第二轮PCR扩增产物；

S4，对S3获得的第二轮PCR扩增产物进行高通量测序，根据测序结果鉴定待测样本中的呼吸道病原微生物。

9.根据权利要求8所述的呼吸道病原微生物检测方法，其特征在于，步骤S1中，所述核酸样本包括DNA和RNA，其中，在步骤S2之前，进一步包括将RNA反转录成cDNA的步骤。

10.权利要求1所述的引物组合在制备用于诊断呼吸道病原感染的试剂盒中的应用。