CN116949212A - 一种检测传染性疾病病原体的引物组、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测传染性疾病病原体的引物组、试剂盒及其应用，涉及生物技术领域。本发明提供了检测传染性疾病病原体的引物组，并采用该引物组制备检测传染性疾病病原体的试剂盒。本发明的试剂盒具有以下优点：(1)能够同时检测单个样本的多种病原，并在一批实验中可同时检测多个样本；(2)检测灵敏度及特异性高，可将低浓度样本中核酸信息放大化捕捉；(3)对单个病原多靶点进行检测能够提高可信度，检测结果可精准到种、分型；(4)操作简便，无人源基因组污染，所需数据量小；(5)可同时检测样本中DNA及RNA信息，涵盖不同遗传物质的病原体样本类型。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测传染性疾病病原体的引物组、试剂盒及其应用。
背景技术
传染性疾病是全球致死、致残的主要原因，突发急性传染病不断出现，成为威胁人类健康，影响社会稳定和经济发展的重要因素之一。
针对这些引起大规模传染性疾病原体的检测方法一般有病原体分离培养法、血清学诊断、涂布镜检法、PCR法、基于酶联免疫学的方法(酶联免疫吸附法或凝集法)，对多种病原体共检测的方法还有多重PCR、宏基因组技术、DNA微阵列、液相芯片技术等。基于病原学的检测方法包括病原体分离培养法和涂布镜检法，其中病原体分离培养法为下呼吸道感染检测的“金标准”。基于分子生物学的检测方法包括聚合酶链式反应(PCR)、多重PCR、宏基因组、DNA微阵列和微球体芯片悬浮技术(液相芯片技术)。聚合酶链式反应(PCR)具有检测较为迅速、灵敏、迅速、特异性强的特点；多重PCR操作简便，特异性及灵敏度高，价格低廉，适用于各种病原样本检测，对于样本中少量核酸信息能够放大化精准捕捉；宏基因组能够对样本中所有微生物进行全基因组测序，可以更准确的鉴定到细菌、真菌等微生物的种水平，对爆发性新发病原检测中具有突出优势；DNA微阵列：将带标记的DNA与DNA分子进行杂交，实现分子信息的快速检测；微球体芯片悬浮技术(液相芯片技术)是一种芯片技术与流式细胞仪结合的新型技术，通过微球体标记特异性探针与荧光，待测样本标记另一种荧光，微球体上探针与待测样本结合产生的荧光来实现对目标分子的检测。基于免疫学的检测方法包括酶联免疫吸附法(ELISA)、凝集法和间接免疫荧光法。
针对于以上提到的多种检测方法，分离培养方法适用于少数可培养微生物，但目前仅不足1％的细菌可以通过这种方式进行鉴定，且存在敏感性低、培养条件要求高、周期长等不足；显微镜观察从形态学上进行鉴定，但灵敏度较低；血清学诊断容易出现交叉反应，特异性差。单重PCR和荧光定量PCR技术虽然灵敏度高且检测速度快，但一次检出病原体数量有限，个别的多重病原体PCR检测试剂盒至多只能检测20种左右的病原体，用于病原体的监测方面通量不足。酶联免疫吸附法操作简便快速，但灵敏度低，容易出现假阳性。宏基因组测序技术需要把样本中所有的核酸序列进行测序，宏基因组技术能够捕捉到样本中的多个病原，在未知疫情防控中有重要作用，对于新发病原的检出与溯源有着重要意义，但其建库过程复杂耗时长且对样本的起始投入量要求高，同时其测序过程需依赖大型测序仪，并且其数据分析过程对测序数据量需求较大，因此导致测序成本高，除此之外该方法的样本检测重复性差，难以实现在一线筛查中应用。DNA微阵列特异性及灵敏度都较高，但因为价格较昂贵也不适用于大批量样本检测。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测传染性疾病病原体的引物组、试剂盒及其应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一组检测传染性疾病病原体的引物组，所述引物组包括针对不同病原体基因组的特异性引物；所述特异性引物包括特异性正向引物和特异性反向引物；所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.148所示。本发明提供了一种灵敏性和特异性高的检测传染性疾病病原体的引物组，解决了现有技术中由于样本提取浓度低造成的灵敏度低，或者容易出现假阳性(假阴性)结果的问题。
本发明还提供一种检测传染性疾病病原体的PCR引物体系，包括PCR引物1、PCR引物2、PCR引物3、PCR引物4和PCR引物5；所述PCR引物1从5’端到3’端依次为测序接头2A、所述的特异性正向引物；所述PCR引物2从5’端到3’端依次为测序接头1A、1所述的特异性反向引物；所述PCR引物3从5’端到3’端依次为测序接头1B、测序标签1、测序接头1A；所述PCR引物4从5’端到3’端依次为测序接头2C、测序标签2、测序接头2B、测序接头2A；所述PCR引物5为测序接头1B。
作为本发明所述检测传染性疾病病原体的PCR引物体系的优选实施方式，所述测序接头1A的序列为：TAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT；所述测序接头1B的序列为GCATGGCGACCTTATCAG；所述测序接头2A的序列为：ACGACATGGCTACGATCCGACTT；所述测序接头2B的序列为：TGTGAGCCAAGGAGTTG；所述测序接头2C的序列为：CTCTCAGTACGTCAGCAGTT。
本发明还提供一种检测传染性疾病病原体的试剂盒，所述试剂盒包括所述的PCR引物体系。本发明的试剂盒针对目标病原体具有多个检测靶点，部分病原体具有从属(种)到种(亚种或血清型)的检测位点，能够增加其检出率与检出可靠性，达到多重验证和实现复杂病原体进行分型的效果，其中包括对登革、诺如病毒等主要流行株的分型，能够精准定位到具体分型，同时本试剂盒还覆盖了新冠位点。本发明的试剂盒具有高效、高通量、灵敏度及特异性较高，且价格低、可操作性强等优点。
本发明还提供所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：提取样本DNA，使用所述的PCR引物1、PCR引物2、PCR引物3进行第一轮PCR扩增反应，纯化后得第一轮PCR纯化产物；再使用所述的PCR引物4和PCR引物5进行第二轮PCR扩增反应，纯化后得测序文库；将文库进行测序和分析，确定样本中的传染性疾病病原体。
作为本发明所述试剂盒的使用方法的优选实施方式，所述第一轮PCR扩增反应的反应体系为：2x Amplicon PCR buffer 12.5μl、10μM的PCR引物1 0.5μl、10μM的PCR引物20.17μl、10μM的PCR引物3 3.5μl、Amplicon Enzyme Mix 0.6μl、内参2μl；DNA模板5μl、DEPCH2O 3.73μl；所述第一轮PCR扩增反应程序为：95℃预变性3min，循环内95℃变性30s，60℃退火1min，57℃延伸1min，54℃延伸1min，25个循环；循环结束后72℃延伸5min；4℃保存。
作为本发明所述试剂盒的使用方法的优选实施方式，所述第二轮PCR扩增反应的反应体系为：UPM PCR Mix 12.5μl、10μM的PCR引物4 2.5μl、10μM的PCR引物5 2.5μl、第一轮PCR纯化产物7.5μl；所述第二轮PCR扩增反应程序为：95℃预变性3min，循环内98℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环；循环结束后72℃延伸3min；4℃保存。
作为本发明所述试剂盒的使用方法的优选实施方式，所述纯化为磁珠纯化。
本发明还提供所述的引物组在制备用于检测传染性疾病病原体的试剂盒中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供一种检测传染性疾病病原体的引物组、试剂盒及其应用。本发明的试剂盒具有以下优点：(1)能够同时检测单个样本的多种病原，并在一批实验中可同时检测多个样本；(2)检测灵敏度及特异性高，可将低浓度样本中核酸信息放大化捕捉；(3)对单个病原多靶点进行检测能够提高可信度，检测结果可精准到种、分型；(4)操作简便，无人源基因组污染，所需数据量小；(5)可同时检测样本中DNA及RNA信息，涵盖不同遗传物质的病原体样本类型。
附图说明
图1为实施例2的扩增示意图。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方法，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1呼吸道引物的设计
本实施例提供一组能够同时检测多种传染性疾病病原体的引物组，其所能够检测的病原体如表1所示。
表1传染性疾病检测病原体
根据表1的病原体在基因组不同位置设计引物组，引物组如表2所示。
表2传染性疾病病原检测引物组
实施例2
本实施例收集8份已知病原体的口咽拭子核酸样本，具体样本信息如表3所示。
表3
| 样本编号 | 样本病原体信息 |
| Sample 1 | 鲍曼不动杆菌 |
| Sample 2 | EB病毒 |
| Sample 3 | 新型冠状病毒 |
| Sample 4 | 单纯疱疹病毒1型 |
| Sample 5 | 单纯疱疹病毒6型 |
| Sample 6 | 登革病毒I型 |
| Sample 7 | 登革病毒II型 |
| Sample 8 | 诺如病毒Ⅱ型 |
运用实施例1提供的引物组进行建库，如图1所示，包括以下步骤：
2.1样本反转录
2.1.1配液准备：加2μl随机引物加至新的八连管中。再准备好反转录预混液：2×RT Mix 10μl、Enzyme Mix 2μl混合，各取12μl分配至另一新的八连管中。
2.1.2加样操作：将6μl总核酸样本加至已加入随机引物的八连管中轻缓混匀，随后65℃加热5min进行变性后，冰上迅速冷却，并在冰上静置2min。
2.1.3反应程序：将以上变性后反应液加至以上反转录预混液中缓慢混匀，进行反转录程序，25℃5min，50℃45min，85℃2min，4℃hold。
2.2第一轮PCR反应
2.2.1体系配制：将以上病原引物分成两个单独的引物混合池分别进行扩增。具体操作体系如下表4、表5所示。将PCR管置于PCR仪中，设置表6程序并运行。
表4反应体系一
表5反应体系二
表6PCR反应程序
2.2.2产物纯化：将以上完成PCR的反应体系一和反应体系二产物进行等比例混合为50μl体系，用0.7×(35μl)磁珠进行纯化，再用80％无水乙醇进行漂洗，最后53μl 1×TEbuffer进行洗脱。重复以上纯化步骤一次，最后使用20μl 1×TE buffer进行洗脱。
2.2.3第二轮PCR：将以上纯化产物进行二轮PCR，具体操作反应体系如表7所示。将PCR管置于PCR仪中，设置表8程序并运行，时长约45min。
表7第二轮PCR反应体系
表8第二轮PCR反应程序
2.2.4二轮PCR产物纯化：将二轮PCR产物取20μl体积，补充30μlTE，加入0.7×(35μl)磁珠进行纯化，再用80％无水乙醇进行漂洗，最后用20μl 1×TE buffer进行洗脱。
2.3文库质控：
将以上产物使用Qubit进行浓度测定，需满足建库上机质控要求不低于5ng/μl，否则建库失败。文库浓度如下表9所示。
表9
2.4文库环化及DNB制备：将以上质检合格的文库使用华大双Barcode环化试剂盒，严格按照供应商要求操作，进行文库单链环化和纯化，并使用ssDNA Assay Kit单链DNA荧光定量试剂盒，按照定量试剂盒的操作说明对环化纯化后产物进行定量，最终环化产物要求摩尔产量≥80fmol，随后使用华大DNB制备试剂盒对质控合格的环化产物进行DNB制备，反应步骤严格按照操作说明进行，DNB制备完成后，使用/>ssDNA Assay Kit和Fluorometer仪器进行浓度测定，浓度8ng/μl以上为合格，如浓度超过40ng/μL，需要用DNB加载缓冲液I稀释至20ng/μL后使用。
2.5上机测序、测序数据分析：将以上质检合格的DNB使用华大测序平台进行SE100上机测序，步骤严格按照供应商要求进行。将下机数据进行接头去除和低质量Reads过滤后，利用比对软件BWA将其比对到参考病原数据库上，通过分析不同扩增子的测序深度(reads)与设定阈值来判断病原体检出reads数。
2.6试验结果如表10所示。
表10
最后应当说明的是，上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所述技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (9)
1.一组检测传染性疾病病原体的引物组，其特征在于，所述引物组包括针对不同病原体基因组的特异性引物；所述特异性引物包括特异性正向引物和特异性反向引物；所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.148所示。
2.一种检测传染性疾病病原体的PCR引物体系，其特征在于，包括PCR引物1、PCR引物2、PCR引物3、PCR引物4和PCR引物5；所述PCR引物1从5’端到3’端依次为测序接头2A、权利要求1所述的特异性正向引物；所述PCR引物2从5’端到3’端依次为测序接头1A、权利要求1所述的特异性反向引物；所述PCR引物3从5’端到3’端依次为测序接头1B、测序标签1、测序接头1A；所述PCR引物4从5’端到3’端依次为测序接头2C、测序标签2、测序接头2B、测序接头2A；所述PCR引物5为测序接头1B。
3.根据权利要求2所述的PCR引物体系，其特征在于，所述测序接头1A的序列为：TAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT；所述测序接头1B的序列为GCATGGCGACCTTATCAG；所述测序接头2A的序列为：ACGACATGGCTACGATCCGACTT；所述测序接头2B的序列为：TGTGAGCCAAGGAGTTG；所述测序接头2C的序列为：CTCTCAGTACGTCAGCAGTT。
4.一种检测传染性疾病病原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2～3任一项所述的PCR引物体系。
5.权利要求4所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：提取样本DNA，使用权利要求3所述的PCR引物1、PCR引物2、PCR引物3进行第一轮PCR扩增反应，纯化后得第一轮PCR纯化产物；再使用权利要求3所述的PCR引物4和PCR引物5进行第二轮PCR扩增反应，纯化后得测序文库；将文库进行测序和分析，确定样本中的传染性疾病病原体。
6.根据权利要求4所述的使用方法，其特征在于，所述第一轮PCR扩增反应的反应体系为：2x Amplicon PCR buffer 12.5μl、10μM的PCR引物1 0.5μl、10μM的PCR引物2 0.17μl、10μM的PCR引物3 3.5μl、Amplicon Enzyme Mix 0.6μl、内参2μl；DNA模板5μl、DEPC H2O3.73μl；所述第一轮PCR扩增反应程序为：95℃预变性3min，循环内95℃变性30s，60℃退火1min，57℃延伸1min，54℃延伸1min，25个循环；循环结束后72℃延伸5min；4℃保存。
7.根据权利要求4所述的使用方法，其特征在于，所述第二轮PCR扩增反应的反应体系为：UPM PCR Mix 12.5μl、10μM的PCR引物4 2.5μl、10μM的PCR引物5 2.5μl、第一轮PCR纯化产物7.5μl；所述第二轮PCR扩增反应程序为：95℃预变性3min，循环内98℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环；循环结束后72℃延伸3min；4℃保存。
8.根据权利要求4所述的使用方法，其特征在于，所述纯化为磁珠纯化。
9.权利要求1所述的引物组在制备用于检测传染性疾病病原体的试剂盒中的应用。
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| CN202310730351.7A CN116949212A (zh) | 2023-06-20 | 2023-06-20 | 一种检测传染性疾病病原体的引物组、试剂盒及其应用 |
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