CN110628925B - 用于检测艰难梭菌的引物、试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测艰难梭菌的引物组合物，其中，所述引物组合物基于艰难梭菌的毒素基因tcdB的保守序列设计。本发明还提供了一种用于检测艰难梭菌的试剂盒，所述试剂盒包括所述引物组合物、识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶和具有链置换功能的DNA聚合酶。本发明还提供了用于检测艰难梭菌的方法。本发明提供的方法能够正确的检测靶序列，特异性良好，并且极大的提高了检测灵敏度和检测效率。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种用于检测艰难梭菌的引物组合物，本发明还涉及用于检测艰难梭菌的试剂盒及方法。
背景技术
艰难梭菌(Clostridium difficile，C.difficile)是一种产毒素或非产毒素的厌氧芽孢杆菌，是人类肠道正常菌群之一。当由于大量应用广谱抗生素等原因造成肠道正常菌群失调，该菌过度繁殖，就会引起抗菌药物相关性腹泻、艰难梭菌相关性腹泻等，严重时可引起伪膜性肠炎甚至死亡。临床上，约15％～25％的抗菌药物相关性腹泻，50％～75％的抗菌药物相关性结肠炎和95％～100％的伪膜性肠炎是由CDI(艰难梭菌感染)引起。在美国和欧洲，CDI已成为相关性腹泻的首要病因，总体发病率高于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染，而在中国CDI潜在威胁远高于国际水平。
现有的实验室用于诊断艰难梭菌的方法包括培养、谷氨酸脱氢酶(GDH)试验、艰难梭菌毒素A/B(CDAB)试验、核酸扩增技术(NAATs)、产毒素培养(TC)、细胞毒素中和试验等。目前国际上公认的检测艰难梭菌的“金标准”为传统的粪便标本培养和细胞毒素实验，但该方法检测周期长，操作难度大，对设备和检测人员的技术要求高，所以目前并未常规应用于临床微生物实验室。目前常用的检测艰难梭菌的方法主要有核酸扩增技术(NAATs)和酶联免疫法(EIAs)。EIAs可以直接通过单克隆抗体特异性结合艰难梭菌A/B毒素蛋白对粪便中的艰难梭菌毒素进行检测，EIAs的优点是特异性高，能区分产毒和非产毒艰难梭菌，且检测周期短，数小时能出结果，操作简便、应用广泛，但是敏感性较低(39％～76％)，因此常和NAATs或GDH试验联合应用，用于艰难梭菌感染实验室两步法或三步法诊断。
NAATs通过对毒素基因的保守序列设计特异性引物，检测毒素基因，检测艰难梭菌具有快速、准确、可定量等优势，其中TaqMan探针、TaqMan-MGB探针、复合探针、染料及分子信标等方法目前已成功应用到病原菌分子诊断领域，但成本较高不宜大规模推广。环介导等温扩增技术(LAMP)、滚环扩增技术(RCA)、链置换扩增技术(SDA)等恒温扩增技术使用的兴起降低了NAATs在检测方面仪器和试剂的费用，但都具有一定的缺点。LAMP产物复杂，很难对产物实施进一步的序列特征等相关的分析，导致后续应用复杂，不太容易进一步实施多重序列的同时分析。RCA依赖于环状模板，但绝大多数基因组DNA为线性分子，且合成滚环扩增锁式探针的成本高，存在信号背景问题SDA需要经过DNA单链模板的准备、5’端3’端均含酶切位点的目的DNA片段的生成和链置换反应多个阶段，且需要经修饰的dNTP作为底物、靶序列准备复杂。
因此，开发一种快速、特异性强、灵敏度高且成本相对更低的艰难梭菌毒素基因检测方法意义重大。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种用于检测艰难梭菌的引物组合物，本发明提供的引物组合物是通过对艰难梭菌的毒素基因tcdB的保守序列进行设计，获得的特异性引物组合物。本发明的发明人发现，采用本发明提供的引物组合物，以待测样品的基因组DNA为模板，在胸腺嘧啶DNA糖基化酶和Bst DNA聚合酶的作用下进行恒温扩增反应，并且在荧光染料的作用下对待测结果进行定量，能够高特异性、高灵敏度地检测艰难梭菌。与其它恒温扩增相比，本发明的方法使用四条引物，通过对引物对上的碱基进行特殊修饰，并在反应中加入胸腺嘧啶DNA糖基化酶和Bst DNA聚合酶，使反应能够在恒温的条件下实现对tcdB目标序列的指数级扩增，极大的提高了扩增反应的灵敏度和特异性。
本文所述的常规DNA碱基是指腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)，本文所述的非常规DNA碱基是指除腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)之外的DNA碱基。
一方面，本发明提供了一种用于检测艰难梭菌的引物组合物，其中，所述引物组合物基于艰难梭菌的毒素基因tcdB的保守序列设计，并且，所述引物组合物包括第一引物对P1和P3、第二引物对P2和P4；其中所述第一引物对包括分别与毒素基因tcdB的保守序列的上游端和下游端互补的一对引物，而且其中每一引物从5’端到3’端依次包含修饰部分和未修饰部分，其中在所述修饰部分中至少与未修饰部分相邻的常规DNA碱基被替换成非常规DNA碱基；所述第二引物对中的每一引物分别与第一引物对中的每一引物的修饰部分相同；
优选地，所述非常规DNA碱基选自：5-羧基胞嘧啶(5caC)、乙烯基胞嘧啶(EthenoC)、乙烯基腺嘌呤(EthenoA)、3-甲基腺嘌呤(3-MeA)、7-甲基腺嘌呤(7-MeA)、3-甲基鸟嘌呤(3-MeG)、7-甲基鸟嘌呤(7-MeG)、N6-甲基腺嘌呤(m6A)、次黄嘌呤、脱氧次黄嘌呤、8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)，及其任意组合。
更优选地，所述非常规DNA碱基为5-羧基胞嘧啶(5caC)。
优选地，所述修饰部分和未修饰部分的长度分别为12-30个碱基。
优选地，所述非常规碱基的数量为2-15个。
根据本发明所述的引物组合物，其中，所述艰难梭菌的毒素基因tcdB的保守序列如SEQ ID NO:13所示；
根据本发明所述的引物组合物，其中，所述引物组合物如SEQ ID NO:1-4、5-8或9-12中任一组所示；更优选地，所述引物组合物如SEQ ID NO:9-12所示。
另一方面，本发明还提供了一种用于检测艰难梭菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组合物、识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶和具有链置换功能的DNA聚合酶。
优选地，所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶选自DNA糖基化酶或核酸内切酶V。
优选地，其中所述DNA糖基化酶选自：胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)、甲基嘌呤DNA糖基化酶(AAG)、8-羟基鸟嘌呤糖基化酶1(OGG1)、8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶(Fpg)，及其任意组合。
优选地，所述试剂盒包含pH值调节剂，使得所述反应混合物的pH值维持在7.5-9.5之间。
优选地，其中所述具有链置换功能的DNA聚合酶选自：Phi29 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、PyroPhage 3137DNA聚合酶、Vent聚合酶、9°Nm聚合酶、Klenow DNA聚合酶、缺少3’-5’外切酶活性的T7 phase DNA聚合酶变种、超保真DNA聚合酶、Taq聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶、LongAmpTaq DNA聚合酶、OneTaq DNA聚合酶、TopoTaq DNA聚合酶，及其任意组合；更优选地，所述Vent聚合酶选自Deep Vent聚合酶、Vent(-exo)聚合酶或Deep Vent(-exo)聚合酶；
优选地，所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶和具有链置换功能的DNA聚合酶分别为胸腺嘧啶DNA糖基化酶和Bst DNA聚合酶。
优选地，所述试剂盒包含一种或多种选自下组的成分：Mg2+、K+、NH4 +、H+、Cl-、SO4 2-、Tris-HCl和细胞表面活性剂；更优选地，所述细胞表面活性剂为Triton X-100。优选地，Mg2+的浓度为6mM-10mM；K+的浓度为4mM-8mM；NH4 +的浓度为6mM-15mM；H+的浓度为15mM-25mM；Cl-的浓度为4mM-8mM；SO4 2-的浓度为6mM-15mM；Tris-HCl的浓度为15mM-25mM；所述细胞表面活性剂的浓度为0.01g/mL-0.02g/mL；三磷酸脱氧腺苷(dATP)、三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)、三磷酸脱氧胞苷(dCTP)、三磷酸脱氧胸苷(dTTP)的浓度分别为1.0mM-2.0mM；所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶的浓度为40U/mL-100U/mL；所述具有链置换功能的DNA聚合酶，例如Bst DNA聚合酶的浓度为300U/mL-350U/mL；第一引物对的浓度为0.2μM-1.0μM；第二引物对的浓度为0.2μM-1.0μM；；
更优选地，所述试剂盒包含一种或多种选自下组的成分：Mg2+的浓度为8mM；K+的浓度为6mM；NH4 +的浓度为10mM；H+的浓度为20mM；Cl-的浓度为6mM；SO4 2-的浓度为10mM；Tris-HCl的浓度为20mM；Triton X-100的浓度为0.01g/mL；三磷酸脱氧腺苷(dATP)、三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)、三磷酸脱氧胞苷(dCTP)、三磷酸脱氧胸苷(dTTP)的浓度分别为1.4mM；所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规碱基的酶如胸腺嘧啶DNA糖基化酶的浓度为50U/mL；所述具有链置换功能的DNA聚合酶，例如Bst DNA聚合酶的浓度为320U/mL；第一引物对的浓度为0.2μM；第二引物对的浓度为0.8μM
再一方面，本发明提供了一种用于检测艰难梭菌的方法，所述方法使用上述引物或试剂盒。
优选地，所述方法包括以下步骤：
(1)提取待测样品DNA；
(2)使用上述引物或试剂盒，通过恒温扩增反应扩增样品DNA；
(3)分析扩增产物中是否存在艰难梭菌的毒素基因tcdB的保守序列，以确定所述样品中是否存在艰难梭菌。
根据本发明所述的方法，其中，在步骤2)中，所述恒温扩增反应的反应条件为：反应总体系为25μL或者30μL；反应温度为55～68℃；反应PH值7.0-9.0；扩增时间为45～90min；DNA模板为2μL；
根据本发明所述的方法，其中，在步骤3)中，所述分析为实时荧光分析或凝胶电泳。
根据本发明所述的方法，其中所述方法用于检测所述待测样品是否为艰难梭菌或者所述待测样品是否含有艰难梭菌。
根据本发明所述的DNA恒温扩增方法的反应机制简述如下：
a.将反应混合物置于恒定温度，例如60～65℃温度下，在Bst DNA聚合酶的作用下，第一引物对中的每一引物和第二引物对中的每一引物分别以待扩增的DNA中的一条链为模板进行DNA扩增，引物延伸，形成引物延伸链，从而获得引物延伸链与模板DNA形成的双链DNA；
b.在胸腺嘧啶DNA糖基化酶的作用下，第一引物对和第二引物对中的所述修饰部分中的所述非常规碱基被识别并切除，使得步骤a获得的双链DNA释放非常规DNA碱基，从而降低所述第一引物对和所述第二引物对的修饰部分与所述模板DNA结合的稳定性；
c.剩余的第二引物对中的每一引物分别进入释放非常规DNA碱基的位置(即第一引物对和第二引物对中的修饰部分的区域)，与模板DNA结合，在Bst DNA聚合酶的作用下，剩余的第二引物延伸，形成剩余的第二引物的延伸链，从而获得剩余的第二引物的延伸链与模板DNA形成的双链DNA，同时，置换释放步骤a获得的双链DNA中的引物延伸链，形成释放的引物延伸DNA单链；
d.循环进行上述步骤b至c，其中上一轮循环所获得的剩余的第二引物的延伸链与模板DNA形成的双链DNA中的剩余的第二引物的延伸链被释放，从而产生通过持续置换释放双链DNA中的引物延伸链而获得大量的释放的引物延伸DNA单链；
e.剩余的第一引物对中的每一引物的未修饰部分分别与所述释放的引物延伸DNA单链结合，以所述释放的引物延伸DNA单链为模板在Bst DNA聚合酶的作用下继续进行DNA延伸反应，形成剩余的第一引物对中的每一引物的延伸链，同时释放的引物延伸DNA单链以第一引物对中的每一引物的修饰部分为模板进行DNA延伸反应，得到与引物的修饰部分配对的序列，形成释放的引物延伸DNA单链的延伸链，所述剩余的第一引物对中的每一引物的延伸链和所述释放的引物延伸DNA单链的延伸链形成双链DNA；
f.循环进行上述步骤a至e。
其中，经过第一次步骤a至e后，第一引物对中的每一引物和第二引物对中的每一引物分别扩增并释放的大量的引物延伸DNA单链均可以作为模板用于后续循环进行DNA扩增反应，以此类推，循环进行上述步骤a至e使得DNA扩增反应的模板数急速增加，大大提高了反应速度。
与现有技术相比，采用本发明的方法进行DNA扩增为一步操作，即在恒温扩增混合液中加入待扩增模板后，立刻封闭反应管置于恒温下进行反应即可，极大地简化了扩增反应的操作过程。此外，闭管反应也避免了反复开管可能带来的样品交叉污染、造成假阳性的问题，而恒温反应则避免了如PCR技术对温度精密控制设备的依赖，降低了实验仪器成本。此外，采用本发明的方法能实现核酸的指数扩增，每一个完整地流程中能得到无数个模板链，从而极大地改善扩增效率，缩短扩增时间。本发明方法能检测模板浓度低至数百aM的样本。本发明方法能够正确的检测靶序列，特异性良好，提高了检测灵敏度和检测效率。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为根据本发明所述的DNA恒温扩增方法的反应原理图。
图2为根据本发明的方法，使用三套引物组合物扩增艰难梭菌的实时荧光曲线。
图3为根据本发明的方法，使用本发明的引物组合物扩增并检测不同浓度的艰难梭菌的实时荧光曲线。
图4为根据本发明的方法，使用本发明的引物组合物扩增艰难梭菌及其它细菌基因组DNA的实时荧光曲线。
具体实施方式
下面通过实施例及附图对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1艰难梭菌毒素B基因tcdB的扩增与检测
使用含有毒素B基因tcdB质粒DNA作为检测靶标，用于筛选优势引物。
其中，所述艰难梭菌的毒素基因tcdB的保守序列如SEQ ID NO:13所示。
SEQ ID NO:13
TCTATTTCTGATGCACTATGTGACTTAAAACAACAGAATGAATTAGAAGATTCTCATTTTATATCTTTTGAGGACATATCAGAGACTGATGAGGGGTTTAGTATAAGATTTATTAATAAAGAAACTGGAGAATCTATATTTGTAGAAACTGAAAAAACAATATTCTCTGAATATGCTAATCATATAACTGAAGAGATTTCTAAGATAAAAGGTACTATATTTGATACTGTAAATGGTAAGTTAGTAAAAAAAGTAAATTTAGATACTACACACGAAGTAAATACTTTAAATGCTGCATTTTTTATACAATCATTAATAGAATATAATAGTTCTAAAGAATCTCTTAGTAATTTAAGTGTAGCAATGAAAGTTCAAGTTTACGCTCAATTATTTAGTACTGGTTTAAATACTATTACAGATGCAGCCAGAGTTGTTGAATTAGTATCAACTGCATTAGATGAAACTATAGACTTACTTCCTACATTATCTGAAGGATTACCTATAATTGCAACTATTATAGATGGTGTAAGTTTAGGTGCAGCAATCAAAGAGCTAAGTGAAACGAGTGACCCATTATTAAGACAAGAAATAGAAGCTAAGATAGGTATAATGGCAGTAAATTTAACAACAGCTACAACTGCAATCATTACTTCATCTTTGGGGATAGCTAGTGGATTTAGTATACTTTTAGTTCCTTTAGCAGGAATTTCAGCAGGTATACCAAGCTTAGTAAACAATGAACTTGTACTTCGAGATAAGGCAACAAAGGTTGTAGATTATTTTAAACATGTTTCATTAGTTGAAACTGAAGGAGTATTTACTTTATTAGATGATAAAGTAATGATGCCACAAGATGATTTAGTGATATCAGAAATAGATTTTAATAATAATTCAATAGTTTTAGGTAAATGTGAAATCTGGAGAATGGAAGGTGGTTCAGGTCATACTGTAACTGATGATATAGATCACTTCTTTTCAGCACCATCAATAACATATAGAGAGCCACACTTATCTATATATGACGTATTGGAAGTACAAAAAGAAGAACTTGATTTGTCAAAAGATTTAATGGTATTACCT
申请人设计并筛选出3套引物，第1套引物序列如SEQ ID NO:1到SEQ ID NO:4所示，第2套引物序列如SEQ ID NO:5到SEQ ID NO:8所示，第3套引物序列如SEQ ID NO:9到SEQ ID NO:12所示。
每套引物包括第一引物对P1和P3、第二引物对P2和P4，其中，第一引物对P1和P3包括分别与待扩增的tcdB基因质粒DNA的上游端和下游端互补的一对引物，而且其中每一引物从5’端到3’端依次包含修饰部分和未修饰部分，其中5’端修饰部分中的部分胞嘧啶被选择性修饰为5-羧基胞嘧啶；第二引物对P2和P4分别与所述第一引物对P1和P3中的每一引物的所述修饰部分相同，不包含未修饰部分，相应的序列及胞嘧啶修饰如表1所示。
本实施例中使用的引物根据如下原则设计：
(1)第一引物对由分别与靶基因组DNA的上游和下游互补的一对引物构成，并且分别从5’端到3’端包含具有非常规碱基的修饰部分和未修饰部分，识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶能够特异识别所述非常规碱基。
(2)第二引物对由分别与第一引物对的5’端修饰部分相同的一对引物构成，不包含未修饰部分。第二引物对与第一引物对的5’端修饰部分均可在靶基因组DNA的相同区间与该靶基因组DNA配对杂交。
(3)第一引物对和第二引物对中的非常规碱基相对均匀地分布在修饰部分中。
表1艰难梭菌tcdB基因扩增引物序列表
注：aN为5-羧基胞嘧啶(5caC)。
制备恒温扩增反应混合物，其中该反应混合物含有8mM Mg2+、6mM K+、10mM NH4 +、20mM H+、6mM Cl-、10mM SO4 2-、20mM Tris-HCl、0.01g/mL Triton X-100、dNTP即dATP、dTTP、dGTP和dCTP均为1.4mM、50U/mL非常规碱基的识别酶(胸腺嘧啶DNA糖基化酶，TDG)、320U/mLBst DNA聚合酶、表1中P1所示的引物0.2μM、P2所示的引物0.8μM、P3所示的引物0.2μM、P4所示的引物0.8μM，以及SYBR Green I为实时荧光分析染料。
以反应温度为63℃，时间为90min为反应条件对目标序列进行扩增。
以图1为例，说明本发明的反应过程，第一引物对中的P1或第二引物对中的P2与作为模板的tcdB基因DNA(以下简称为“模板DNA”)的正义链互补杂交，Bst DNA聚合酶从第一引物对中的P1或第二引物对中的P2的3’端延伸引物，产生与正义链模板互补的引物延伸链，该引物延伸链与模板DNA正义链形成双链DNA；胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)特异性地识别并切除该双链DNA中的引物延伸链中的5’端修饰部分的非常规碱基5-羧基胞嘧啶，在非常规碱基切除区域处，因切除后互补碱基的缺失降低了引物延伸链在5’端修饰部分与模板DNA正义链的杂交稳定性，此时，溶液中游离的、完整的、剩余的第二引物对中的P2插入引物延伸链与模板DNA正义链的不稳定杂交区间，形成剩余的第二引物对中的P2与模板DNA正义链的稳定的双链结构，并进一步在具有链置换功能的Bst DNA聚合酶的作用下，该剩余的第二引物对中的P2发生3’端延伸反应，形成剩余的第二引物对中的P2的引物延伸链，从而获得剩余的第二引物对中的P2的引物延伸链与模板DNA正义链形成的双链DNA，同时，置换释放出上一轮Bst DNA聚合酶延伸反应产生的引物延伸链，获得置换释放的引物延伸DNA单链，该引物延伸DNA单链即为模板DNA反义链；而TDG特异性地识别并切除此时与模板DNA正义链形成稳定双链DNA的剩余的第二引物对中的P2的引物延伸链5’端修饰部分的非常规碱基，降低第二引物对中的P2的延伸产物链在5’端与模板DNA的杂交稳定性，从而形成“游离第二引物对中的P2插入与模板DNA杂交、Bst DNA聚合酶延伸并置换上一轮的引物延伸链、TDG特异性地识别并切除双链中第二引物对中的P2的引物延伸链5’端修饰部分的非常规碱基、第二引物对中的P2的引物延伸链在5’端与模板DNA的杂交稳定性降低”的循环，不断产生与模板DNA正义链互补的、通过引物延伸形成的反义链序列，反义链得到扩大；而第一引物对中的P3或第二引物对中的P4又以扩大的反义链序列为模板，在Bst DNA聚合酶与TDG的协同作用下，发生与上述反义链序列扩增类似的循环反应，得到扩大的正义链序列；更进一步地，该扩大得到的正义链序列可与游离的第一引物对中的P1结合，并以游离第一引物对中的P1为模板，在聚合酶的作用下，3’端被延伸并获得可与第二引物对中的P2杂交的序列区间，进入聚合酶与TDG协同作用下的第二引物对中的P2插入杂交、引物延伸、非常规碱基切除的循环扩增反应，得到扩大的反义链序列；同理，此循环产生的扩大的反义链以游离的第一引物对中的P3为模板，在聚合酶的作用下，3’端被延伸并获得可与第二引物对P4杂交的序列区间，并发生类似于第二引物对中的P2与正义链相互作用下的正义链循环扩增反应，得到扩大的正义链序列，并进入下一轮的循环反应。上述扩增反应过程中，具有较长序列的第一引物对P1和P3与具有较短序列的第二引物对P2和P4相互配合，第一引物对P1和P3作为长引物在与扩大的正义链序列和扩大的反义链序列配对后，将其作为模板进行聚合酶延伸反应，同时负责让扩大的正义链序列和扩大的反义链序列以第一引物对P1和P3为模板，使得扩大的正义链序列和扩大的反义链序列的3’端被聚合酶延伸，得到与引物的修饰部分配对的序列，即可被作为短引物对的第二引物对P2和P4结合的序列，此被延伸的扩大的正义链序列和被延伸的扩大的反义链序列进入循环，起到加快聚合酶链置换扩增反应的作用，加速链置换反应进程，产生更多的新生成的模板，一长一短两套引物相互配合，从而实现恒温下靶DNA的指数级扩增。
扩增产物的实时荧光分析
用实时荧光定量PCR仪进行检测，每间隔30s读取一次荧光值，结果记录为实时荧光曲线图，经过软件分析筛选出的3套引物再经过实验进行进一步的反应效率验证，确定效率相对最高的一套引物；再从灵敏度和特异性方面验证本发明序列扩增检测的性能。
实施例2不同引物的反应效率验证
制备恒温扩增反应混合物，其中该反应混合物含有Mg2+的浓度为8mM；K+的浓度为6mM；NH4 +的浓度为10mM；H+的浓度为20mM；Cl-的浓度为6mM；SO4 2-的浓度为10mM；Tris-HCl的浓度为20mM；Triton X-100的浓度为0.01g/mL；dNTP浓度为1.4mM；胸腺嘧啶DNA糖基化酶的浓度为50U/mL；Bst DNA聚合酶的浓度为320U/mL；表1中P1所示的引物0.2μM、P2所示的引物0.8μM、P3所示的引物0.2μM、P4所示的引物0.8μM，以及SYBR Green I为实时荧光分析染料。使用经设计、筛选以及比对后得出的3套引物配置的3套引物混合物，使用浓度为10fM的tcdB质粒DNA作为检测靶标，以RNase-free water作为阴性对照，以反应温度为63℃，时间为90min为反应条件进行核酸扩增反应，用实时荧光定量PCR仪进行检测，每间隔30s读取一次荧光值，结果记录为实时荧光曲线图，具体结果即实时荧光曲线图请参见附图2。实时荧光曲线图显示：对于tcdB质粒DNA，反应效率最高的为第3套引物，在10min的时候出峰，表明第3套引物为优选引物。
实施例3反应灵敏度验证
如实施例2所述的扩增检测混合液及第3套引物配置的引物混合液在63℃、90min条件下进行扩增和实时荧光检测不同浓度的tcdB质粒DNA的实时荧光曲线，各浓度依次是10pM、1pM、100fM、10fM、1fM、100aM、0aM。用实时荧光定量PCR仪进行检测，每间隔30s读取一次荧光值，具体结果实时荧光曲线图请参见附图3。实时荧光曲线图显示：本实施例中tcdB质粒DNA可被检测到的浓度可低至100aM，表明本发明方法的高灵敏度和极低的检测下限。
实施例4反应灵敏度验证
分别以副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、乙型溶血性链球菌、肺炎克雷伯菌、嗜肺军团菌、志贺氏菌、铜绿假单胞菌、单核细胞增生李斯特菌、表皮葡萄球菌、阴沟肠杆菌、耐甲氧西林葡萄球菌、沙门氏菌基因组DNA为模板(湖南省疾病预防控制中心)，以RNase-free water为阴性对照，以具有tcdB毒素基因的艰难梭菌产毒株(来自湘雅医院医院感染控制中心，湖南省医院感染管理质量控制中心)为阳性对照，并使用本发明试剂盒所述的扩增检测混合液及第3套引物配置的引物混合液在63℃、90min条件下进行扩增和实时荧光检测，所得的实时荧光曲线请参见附图4。实时荧光曲线显示：只有阳性对照曲线呈标准S型，其他基因组DNA模板均未起峰，表明只有阳性对照发生了扩增反应，检测到艰难梭菌中的tcdB，其余均未检测到艰难梭菌tcdB。说明本发明的艰难梭菌tcdB的检测方法具有较高的特异性，可以特异性地检测到艰难梭菌tcdB。
实施例5：临床样本的验证
使用凯杰QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit粪便DNA提取试剂盒，按照说明书上的提取步骤对湘雅医院的10个临床粪便样本提取DNA，然后使用本发明提供的实施例2所述的扩增检测混合液及第3套引物配置的引物混合液在63℃、90min条件下对临床样本进行检测，同时对所选临床样本进行培养鉴定。本发明检测及培养鉴定结果如表2所示。表2中结果显示：本发明的艰难梭菌tcdB的检测方法检临床样本的准确度与检艰难梭菌金标准的培养鉴定方法一致，说明本方法对检测艰难梭菌临床样本的准确性高。
表2临床样本的检测及培养鉴定
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖南融健基因生物科技有限公司
<120> 用于检测艰难梭菌的引物、试剂盒和方法
<130> DIC19110083
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<223> n为5-羧基胞嘧啶（5cac）
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tgntgaaaag aagtgatnta tatcatnagt tacagtatga cctgaaccac cttccattc 59
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<220>
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<223> n为5-羧基胞嘧啶（5cac）
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<222> (27)..(27)
<223> n为5-羧基胞嘧啶（5cac）
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tgntgaaaag aagtgatnta tatcatn 27
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<212> DNA
<213> Clostridium difficile
<400> 13
tctatttctg atgcactatg tgacttaaaa caacagaatg aattagaaga ttctcatttt 60
atatcttttg aggacatatc agagactgat gaggggttta gtataagatt tattaataaa 120
gaaactggag aatctatatt tgtagaaact gaaaaaacaa tattctctga atatgctaat 180
catataactg aagagatttc taagataaaa ggtactatat ttgatactgt aaatggtaag 240
ttagtaaaaa aagtaaattt agatactaca cacgaagtaa atactttaaa tgctgcattt 300
tttatacaat cattaataga atataatagt tctaaagaat ctcttagtaa tttaagtgta 360
gcaatgaaag ttcaagttta cgctcaatta tttagtactg gtttaaatac tattacagat 420
gcagccagag ttgttgaatt agtatcaact gcattagatg aaactataga cttacttcct 480
acattatctg aaggattacc tataattgca actattatag atggtgtaag tttaggtgca 540
gcaatcaaag agctaagtga aacgagtgac ccattattaa gacaagaaat agaagctaag 600
ataggtataa tggcagtaaa tttaacaaca gctacaactg caatcattac ttcatctttg 660
gggatagcta gtggatttag tatactttta gttcctttag caggaatttc agcaggtata 720
ccaagcttag taaacaatga acttgtactt cgagataagg caacaaaggt tgtagattat 780
tttaaacatg tttcattagt tgaaactgaa ggagtattta ctttattaga tgataaagta 840
atgatgccac aagatgattt agtgatatca gaaatagatt ttaataataa ttcaatagtt 900
ttaggtaaat gtgaaatctg gagaatggaa ggtggttcag gtcatactgt aactgatgat 960
atagatcact tcttttcagc accatcaata acatatagag agccacactt atctatatat 1020
gacgtattgg aagtacaaaa agaagaactt gatttgtcaa aagatttaat ggtattacct 1080
Claims (16)
1.一种用于检测艰难梭菌的试剂盒，其包括引物组合物，所述引物组合物基于艰难梭菌的毒素基因tcdB的保守序列设计，并且，所述引物组合物包括第一引物对P1和P3、第二引物对P2和P4；其中所述第一引物对包括分别与毒素基因tcdB的保守序列的上游端和下游端互补的一对引物，而且其中每一引物从5’端到3’端依次包含修饰部分和未修饰部分，其中在所述修饰部分中至少与未修饰部分相邻的常规DNA碱基被替换成非常规DNA碱基；所述第二引物对中的每一引物分别与第一引物对中的每一引物的修饰部分相同；其中所述非常规DNA碱基的数量为2-15个；
所述试剂盒包括识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶和具有链置换功能的DNA聚合酶，其中所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶为DNA糖基化酶。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述非常规DNA碱基选自：5-羧基胞嘧啶(5caC)、乙烯基胞嘧啶(EthenoC)、乙烯基腺嘌呤(EthenoA)、3-甲基腺嘌呤(3-MeA)、7-甲基腺嘌呤(7-MeA)、3-甲基鸟嘌呤(3-MeG)、7-甲基鸟嘌呤(7-MeG)、N6-甲基腺嘌呤(m6A)、次黄嘌呤、脱氧次黄嘌呤、8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)，及其任意组合。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，所述非常规DNA碱基为5-羧基胞嘧啶(5caC)。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述修饰部分和未修饰部分的长度分别为12-30个碱基。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述艰难梭菌的毒素基因tcdB的保守序列如SEQ ID NO:13所示。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述引物组合物如SEQ ID NO:1-4、5-8或9-12中任一组所示。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述引物组合物如SEQ ID NO:9-12所示。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述DNA糖基化酶选自：胸腺嘧啶DNA糖基化酶、甲基嘌呤DNA糖基化酶、8-羟基鸟嘌呤糖基化酶1、8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶，及其任意组合。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包含pH值调节剂，使得反应混合物的pH值维持在7.5-9.5之间。
10.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述具有链置换功能的DNA聚合酶选自：Phi29DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、PyroPhage 3137 DNA聚合酶、Vent聚合酶、9°Nm聚合酶、KlenowDNA聚合酶、缺少3’-5’外切酶活性的T7 phase DNA聚合酶变种、超保真DNA聚合酶、Taq聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶、LongAmpTaq DNA聚合酶、OneTaq DNA聚合酶、TopoTaq DNA聚合酶，及其任意组合。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其中，所述Vent聚合酶选自Deep Vent聚合酶、Vent(-exo)聚合酶或Deep Vent(-exo)聚合酶。
12.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶和具有链置换功能的DNA聚合酶分别为胸腺嘧啶DNA糖基化酶和Bst DNA聚合酶。
13.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包含一种或多种选自下组的成分：Mg2+、K+、NH4 +、H+、Cl-、SO4 2-、Tris-HCl和细胞表面活性剂以及三磷酸脱氧腺苷(dATP)、三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)、三磷酸脱氧胞苷(dCTP)和三磷酸脱氧胸苷(dTTP)。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中，所述细胞表面活性剂为Triton X-100。
15.根据权利要求13所述的试剂盒，其中，Mg2+的浓度为6mM-10mM；K+的浓度为4mM-8mM；NH4 +的浓度为6mM-15mM；H+的浓度为15mM-25mM；Cl-的浓度为4mM-8mM；SO4 2-的浓度为6mM-15mM；Tris-HCl的浓度为15mM-25mM；所述细胞表面活性剂的浓度为0.01g/mL-0.02g/mL；三磷酸脱氧腺苷(dATP)、三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)、三磷酸脱氧胞苷(dCTP)、三磷酸脱氧胸苷(dTTP)的浓度分别为1.0mM-2.0mM；所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶的浓度为40U/mL-100U/mL；所述具有链置换功能的DNA聚合酶的浓度为300U/mL-350U/mL；第一引物对的浓度为0.2μM-1.0μM；第二引物对的浓度为0.2μM-1.0μM。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包含一种或多种选自下组的成分：Mg2+的浓度为8mM；K+的浓度为6mM；NH4 +的浓度为10mM；H+的浓度为20mM；Cl-的浓度为6mM；SO4 2-的浓度为10mM；Tris-HCl的浓度为20mM；Triton X-100的浓度为0.01g/mL；三磷酸脱氧腺苷(dATP)、三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)、三磷酸脱氧胞苷(dCTP)、三磷酸脱氧胸苷(dTTP)的浓度分别为1.4mM；胸腺嘧啶DNA糖基化酶的浓度为50U/mL；Bst DNA聚合酶的浓度为320U/mL；第一引物对的浓度为0.2μM；第二引物对的浓度为0.8μM。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 410000 Room 405, building D, Zhongying Plaza, No. 368, Section 1, Xiaoxiang South Road, Yanghu street, Yuelu District, Changsha City, Hunan Province Applicant after: Hunan Rongjian Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 410000 Room 405, building D, Zhongying Plaza, No. 368, Section 1, Xiaoxiang South Road, Yanghu street, Yuelu District, Changsha City, Hunan Province Applicant before: HUNAN RONGJIAN GENE BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. |
|
| CB02 | Change of applicant information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |