WO2021010446A1 - マクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法 - Google Patents

マクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法 Download PDF

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悠平 田中
一信 尾内
一平 宮田
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学校法人川崎学園
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a macrolide antibiotic-resistant mutant bacterium.
  • the present invention comprises detecting a point mutation of two adenins bound by a macrolide antibiotic in the 23SrRNA domain V region of a macrolide antibiotic resistant mutant by PCR amplification.
  • the present invention relates to a method for detecting an antibiotic-resistant mutant bacterium.
  • the present invention particularly relates to a method for detecting drug-resistant bacteria of Mycoplasma pneumoniae , which comprises detecting point mutations of Adenin at positions 2063 and 2064 in the 23SrRNA domain V region of Mycoplasma pneumoniae. Regarding the detection method of resistant bacteria.
  • the present invention also comprises detecting point mutations of Adenin at positions 2037 and 2038 of the domain V region of 23S rRNA of Bordetella pertussis , particularly relating to a method for detecting macrolide-resistant bacteria of Bordetella pertussis . It is also related to the method of detecting macrolide-resistant bacteria of Bordetella pertussis.
  • Macrolide antibiotics Mycoplasma pneumoniae (Mycoplasma pneumoniae), pertussis (Bordetella pertussis), Helicobacter pylori (Helicobacter pylori), Campylobacter jejuni bacteria (Campylobacter jejuni), Chlamydia trachomatis bacteria (Chlamydia trachomatis), It is positioned as a first-line drug or a first-line drug in the treatment of infectious diseases caused by Mycobacterium avium , Mycobacterium intracellulare, etc.
  • Macrolide antibiotics act as antibiotics by inhibiting their function by binding to domain V of 23S rRNA and suppressing protein synthesis.
  • the important sites for this macrolide antibiotic to bind to domain V are two adjacent adenines whose base numbers are 2058 and 2059 in Escherichia coli, and there are base substitution and methylation mutations in these sites.
  • macrolide antibiotics cannot bind to domain V, cannot inhibit protein synthesis, and the bacterium acquires resistance to clinically problematic macrolide antibiotics. Will be done. Therefore, if these sites can be detected and whether or not base substitution has occurred, it is possible to detect bacteria and determine drug resistance.
  • Campylobacter jejuni bacteria standard strain Campylobacter jejuni subsp jejuni; NCBI Reference sequence :. NC_002163.1) 2074 and 2075, Chlamydia trachomatis D / UW-3 / CX; NCBI Reference Sequence: NC_000117.1, 2038 and 2039, Mycobacterium avium (standard strain Mycobacterium avium 104; NCBI Reference)
  • NC_008595.1), 2279 and 2280 and in Mycobacterium intracellulare (standard strain Mycobacterium intracellulare ATCC 13950; NCBI Reference Sequence: NC_016946.1), 2266 and 2267 are domains of 23S rRNA to which macrolide antibiotics bind. Corresponds to the position of two adjacent Adenins in V. Therefore, if these sites can be detected and whether or not base substitution has occurred, it is possible to detect bacteria and determine drug resistance.
  • the most important mechanism in drug-resistant bacteria of Mycoplasma pneumoniae is a point mutation of adenine at positions 2063 and 2064 in the domain V region, which is the functional site of 23S rRNA.
  • Conventional methods for detecting point mutations are known as (1) PCR-RFLP method, (2) sequence method, and (3) Qprobe method. Nucleotide sequences containing mutations are used in both methods.
  • (1) PCR-RFLP method the product amplified by the Wested PCR method is treated with a restriction enzyme, and the cleavage pattern is confirmed by electrophoresis.
  • amplification is performed by the PCR method, and the DNA base sequence of the amplified product is compared with the base sequence of the standard strain using BLAST.
  • a quenching probe is bound to and dissociated from the mutation site by a temperature change, and the presence or absence of mutation is confirmed using the difference in Tm value at the time of fluorescence emission.
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 are known as conventional methods for detecting drug-resistant bacteria of Mycoplasma pneumoniae by the PCR method, which is characterized by DNA polymerase.
  • Patent Document 1 relates to a method for detecting an A2063G mutation (a mutation in which adenine (A) at position 2063 is replaced with guanine (G)) of 23SrRNA of Mycoplasma pneumoniae, and a primer vulcanized at the 3'end and Q5High-Fidelity DNA.
  • A2063G mutation a mutation in which adenine (A) at position 2063 is replaced with guanine (G)
  • G guanine
  • Use a polymerase Use a polymerase.
  • the Q5High-Fidelity DNA polymerase is a DNA polymerase that is introduced by the New England Biolabs (NEB) and is characterized by being highly accurate and amplifyable and independent of GC content.
  • Non-Patent Document 1 is a detection method using a High-Fidelity DNA polymerase and a 3'phosphorothioate modification-specific primer developed for assaying a 23S rRNA gene mutation site (mainly at positions 2063, 2064 and 2617) of Mycoplasma pneumoniae. Regarding.
  • Both High-Fidelity DNA polymerases described in Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 recognize primers having a difference of 1 base at the 3'end, and when there is a mismatch pair, the amplification efficiency is significantly reduced. different. Further, the primers described in Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 require special modification, and the methods described in Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 are inexpensive and easy to detect drug-resistant bacteria of Mycoplasma pneumoniae. I can't say that.
  • the PCR-RFLP method has the disadvantage that it requires two base sequence amplifications and further restriction enzyme treatment, and is complicated with many steps.
  • the sequencing method has the disadvantage that it takes time and effort to sequence and analyze the base sequence.
  • the Qprobe method has the disadvantages that it is necessary to prepare a probe that is labeled with a fluorescent dye, exhibits fluorescence by itself, and the fluorescence is reduced by hybrid formation, and also requires an expensive real-time PCR fluorescence detection system. In addition, if the target site is other than a known mutation, it may not be recognized correctly.
  • a device for detecting mutations in 23SrRNA using the Qprobe method (fully automatic gene analysis device GENECUBE (registered trademark), main unit price of 16 million yen) and research reagents (Genecube (registered trademark) test pyrrol 23SrRNA, 96 kits / 15). (10,000 yen) exists and is expensive.
  • the present invention comprises: 1.
  • Macrolides in the 23S rRNA domain V region of macrolide antibiotic-resistant mutants using DNA polymerase that recognizes primers with a one-base difference at the 3'end and significantly reduces amplification efficiency in the presence of mismatched pairs A method for detecting a macrolide-resistant mutant bacterium, which comprises detecting an amplification reaction by PCR amplification of a point mutation of two adenines to which a system antibiotic binds. 2.
  • the macrolide antibiotic-resistant mutant is a drug-resistant bacterium of Mycoplasma pneumoniae, and the two adenins to which the macrolide antibiotic in the 23S rRNA domain V region binds are Mycoplasma pneumoniae (standard strain M129; NCBI Reference Sequence: NC_000912.1).
  • the macrolide antibiotic-resistant mutant is a drug-resistant bacterium of Bordetella pertussis, and the two adenins to which the macrolide antibiotic in the 23S rRNA domain V region binds are Bordetella pertussis (standard strain Tohama I; NCBI Reference Sequence: NC_002929.2). ), The method according to the preceding item 1, which is the 2037 position and the 2038 position of the 23S rRNA domain V region. 4. The method according to item 1 or 2 above, wherein the DNA polymerase is HiDi DNA polymerase (registered trademark). 5.
  • Reverse primer for detecting adenine mutations at positions 2063 and 2064 of the 23S rRNA sequence of Mycoplasma pneumoniae in PCR amplification ⁇ A primer having a length of 20 to 35 bases containing the sequence shown in 5'-GTAAAGCTTCACGGGGTCTC -3'on the 3'side. A primer with a length of 20 to 35 bases containing the sequence shown in 5'-TAAAGCTTCACGGGGTCTTT -3'on the 3'side, and a primer having a length of 20 to 35 bases containing the sequence shown in 5'-TAAAGCTTCACGGGGTCTTC -3'on the 3'side. 2. The method according to 2 or 4 above, which uses the primer of. 6.
  • the reverse primer is a primer consisting of the sequence shown in 5'-GCTACAGTAAAGCTTCACGGGGTCTC-3'(SEQ ID NO: 1). 5. The primer consisting of the sequence shown in 5'-TTAAGCTACAGTAAAGCTTCACGGGGTCTTT -3'(SEQ ID NO: 2) and the primer consisting of the sequence shown in 5'-TTAAGCTACAGTAAAGCTTCACGGGGTCTTC -3'(SEQ ID NO: 3).
  • Reverse primer for detecting adenine mutations at positions 2037 and 2038 of the 23S rRNA sequence of Bordetella pertussis in PCR amplification A primer having a length of 20 to 35 bases containing the sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 5 to 11 on the 3'side. A primer having a length of 20 to 35 bases containing the sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 12 to 18 on the 3'side, and a sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 19 to 25 on the 3'side.
  • the method according to item 3 or 4 above, wherein a primer having a length of 20 to 35 bases is used.
  • the reverse primer is composed of a primer consisting of any one of SEQ ID NOs: 5 to 11, a primer consisting of any one of SEQ ID NOs: 12 to 18, and a primer consisting of any one of SEQ ID NOs: 19 to 25.
  • the conditions of the thermal cycler are (1) 98 ° C, 1 minute, 1 cycle, (2) 98 ° C, 10 seconds, (3) 72 ° C to 56 ° C, 15 seconds, (4) 72 ° C, 30 seconds (2). )-(4) for a total of 36 cycles, followed by (5) 72 ° C for 1 minute and 1 cycle.
  • the step (3) is always performed in 15 seconds, but the first cycle.
  • the temperature of the above item is described in any one of 1 to 8 above, wherein the temperature is started at 72 ° C., lowered by 1 ° C. every cycle to 57 ° C. at the 16th cycle, and the 17th to 36th cycles are performed at 56 ° C. Method.
  • macrolide antibiotic-resistant mutant bacteria can be easily detected inexpensively, accurately, in a short time, and easily in a laboratory environment where the PCR method can be performed.
  • a DNA polymerase that recognizes a primer for detecting Mycoplasma pneumoniae drug-resistant bacteria used in the present invention and a primer having a difference of 1 base at the 3'end, and if there is a mismatch pair, the amplification efficiency is significantly reduced. It is possible to discriminate mutations in resistance genes to macrolide antibiotics, and to determine the presence or absence of mutants resistant to macrolide antibiotics in Mycoplasma pneumoniae.
  • a macrolide antibiotic for Bordetella pertussis is used to recognize a primer for detecting Bordetella pertussis drug-resistant bacteria and a primer that has a 1-base difference at the 3'end, and if there is a mismatch pair, the amplification efficiency is significantly reduced. The presence or absence of resistant mutant bacteria can be determined.
  • FIG. 1 shows the results of PCR using a nucleotide sequence containing a mutation of 23S rRNA, a primer for detecting Mycoplasma pneumoniae drug-resistant bacteria, and HiDi DNA polymerase (registered trademark).
  • a specific amplification product was confirmed at 250 bp.
  • FIG. 2 shows the results of PCR using a nucleotide sequence containing a mutation of 23S rRNA, a primer for detecting Bordetella pertussis drug-resistant bacteria, and HiDi DNA polymerase (registered trademark).
  • the amplified PCR product was electrophoresed on a 2% agarose gel at 100 V for 30 minutes, a specific amplification product was confirmed at 0.33 kbp.
  • Example 2 shows the results of PCR using a nucleotide sequence containing a mutation of 23S rRNA, a primer for detecting Mycoplasma pneumoniae drug-resistant bacteria, and HiDi DNA polymerase (registered trademark).
  • the present invention recognizes primers with a one-base difference at the 3'end and uses a DNA polymerase that significantly reduces amplification efficiency in the presence of mismatched pairs, using the 23S rRNA domain V of macrolide antibiotic-resistant mutants.
  • a method for detecting a macrolide resistant mutant which comprises detecting a point mutation of two adenines to which a macrolide antibiotic in a region binds by PCR amplification.
  • the present invention uses HiDi DNA polymerase® to provide adenine at positions 2063 and 2064 of the 23S rRNA domain V region of Mycoplasma pneumoniae (standard strain M129; NCBI Reference Sequence: NC_000912.1).
  • a method for detecting a drug-resistant bacterium of Mycoplasma pneumoniae which comprises detecting a point mutation.
  • the invention uses HiDi DNA polymerase® at positions 2037 and 2038 of the 23S rRNA domain V region of Bordetella pertussis (standard strain Tohama I; NCBI Reference Sequence: NC_002929.2).
  • a method for detecting a drug-resistant strain of Bordetella pertussis, which comprises detecting a point mutation in adenine is provided.
  • two adjacent adenines in domain V of the 23S rRNA to which a macrolide antibiotic binds eg, 2058 or 2059 in Escherichia coli, 2063 and 2064 in mycoplasma pneumoniae, 2037 in pertussis.
  • positions (positions and 2038) for example, in Escherichia coli, the point mutation in which adenine (A) at position 2058 was replaced with guanine (G) was replaced with GA, and in Escherichia coli, adenine (A) at position 2059 was replaced with guanine (G).
  • the point mutation made is also called AG, and in Escherichia coli, it is also called AA when the adenine (A) at positions 2058 and 2059 is not mutated.
  • DNA polymerase extends the daughter DNA molecule from the 3'end of the primer in the 5'to 3'direction.
  • the replication fidelity of DNA polymerase refers to the accuracy of polymerization and the ability of DNA polymerase to distinguish between correct and incorrect nucleotides when synthesizing DNA complementary to a template. The higher the replication fidelity of DNA polymerase, the less likely it is that DNA polymerase will mistakenly incorporate nucleotides into the growth strand during DNA synthesis.
  • DNA polymerases having increased replication fidelity examples include Phusion DNA polymerases and Pyrococcus friosus (Pfu) DNA polymerases.
  • HiDi DNA polymerase (registered trademark) is included in the DNA polymerase that recognizes a primer having a difference of 1 base at the 3'end and significantly reduces the amplification factor when it does not completely match.
  • a DNA polymerase that recognizes a primer having a difference of 1 base at the 3'end and significantly reduces the amplification factor if it does not completely match is a primer that forms a primer / template complex with the DNA that serves as a template. It is a DNA polymerase that recognizes a base pair of guanine (G) / cytosine (C) or adenine (A) / timine (T) with one base located at the 3'end at the corresponding position of the template DNA. , G / C or A / T base pairs are not formed, that is, the amplification factor by DNA polymerase decreases when mismatched pairs occur.
  • HiDi DNA polymerase® (High Discrimination TaqDNA Polymerase) is a highly selective variant of DNA polymerase that has been genetically modified based on the Klenow fragment of TaqDNA polymerase (M. Drum et al., PLoS One). . 2014 May6; 9 (5): e96640). For example, in allele-specific PCR or methylation-specific PCR, it may be selected for assays that require high discrimination. While many DNA polymerases allow mismatched primer / template complexes, HiDi DNA polymerase® efficiently identifies them and produces specific amplification products only with perfectly matched primer pairs. HiDi DNA polymerase (registered trademark) recognizes primers having a difference of 1 base at the 3'end, and if they do not completely match, the amplification factor is significantly reduced.
  • the DNA polymerase of the present invention is HiDi DNA polymerase®.
  • the term "primer” refers to a single-stranded oligonucleotide that is extended by a covalent bond of a nucleotide monomer during amplification or polymerization of a DNA molecule.
  • the primer is preferably 15 to 40 bases long, more preferably 20 to 35 bases long.
  • the 3'end of the primer provides a free 3'-OH group to which additional nucleotides can be attached by a DNA polymerase that establishes a 3' ⁇ 5'phosphodiester bond.
  • the "primer for detecting mycoplasma pneumoniae drug-resistant bacteria” is a primer used for detecting a nucleic acid molecule encoded by a drug-resistant bacterium against macrolide antibiotics in mycoplasma pneumoniae, and is a primer used for detecting mycoplasma pneumoniae (standard strain).
  • M129; NCBI Reference Sequence: NC_000912.1) is a primer used to detect point mutations of adenine at positions 2063 and 2064 in the V region of the 23S rRNA domain.
  • a primer for detecting AG with a length of 20 to 35 bases containing the sequence shown in 5'-GTAAAGCTTCACGGGGTCTC-3'on the 3'side, 5'-TAAAGCTTCACGGGGTCTTT- 20-35 base length AA detection primer containing the sequence shown in 3'on the 3'side, and 20-35 base length GA detection primer containing the sequence shown in 5'-TAAAGCTTCACGGGGTCTTC-3'on the 3'side.
  • the primer is a set containing a primer and a forward primer consisting of a primer base sequence having a length of 20 to 40 bases including the sequence shown in 5'-CTGCCCAGTGCTGGAAGGTT-3'on the 5'side. More preferably, the primer is a set containing a reverse primer consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 and a forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the "primer for detecting Bordetella pertussis drug-resistant bacteria” is a primer used for detecting a nucleic acid molecule encoded by a drug-resistant bacterium against a macrolide antibiotic of Bordetella pertussis, and is a standard strain of Bordetella pertussis. It is a primer used to detect point mutations of adenine at positions 2037 and 2038 of the 23S rRNA domain V region of Tohama I; NCBI Reference Sequence: NC_002929.2).
  • the primer for AA detection of any one of SEQ ID NOs: 5 to 11 the primer for AG detection of any one of SEQ ID NOs: 12 to 18, and the primer of SEQ ID NO:
  • a primer consisting of any one base sequence of SEQ ID NOs: 5 to 11 a primer consisting of any one base sequence of SEQ ID NOs: 12 to 18, and any one base sequence of SEQ ID NOs: 19 to 25. It is a set including a reverse primer of the primer and a forward primer consisting of any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 26 to 29. Even more preferably, a primer consisting of any one of 5 to 11 base sequences, a primer consisting of any one of SEQ ID NOs: 12, 13, 15 and 16 and any of SEQ ID NOs: 20, 22 and 23.
  • a reverse primer of a primer consisting of one base sequence and a forward primer consisting of any one of the base sequences of SEQ ID NOs: 27 to 29.
  • a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13, a reverse primer of the primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20, and a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 are used. It is a set including.
  • Oligonucleotide refers to a synthetic molecule or a natural molecule containing a covalent bond sequence of a nucleotide in which the 3'position of the 5-carbon sugar of a nucleotide and the 5'-position of a 5-carbon sugar of a neighboring nucleotide are bonded by a phosphodiester bond. Oligonucleotides can be used as primers and probes.
  • nucleotide refers to a combination of base-sugar-phosphoric acid. Nucleotides include deoxyribonucleoside triphosphates (eg, dATP, dCTP, dITP, dUTP, dGTP, dTTP, or derivatives thereof). Nucleotides used herein also refer to dideoxyribonucleoside triphosphate (ddNTP) and its derivatives. Examples of examples of dideoxyribonucleoside triphosphates include, but are not limited to, ddATP, ddCTP, ddGTP, ddITP, and ddTTP.
  • ddNTP dideoxyribonucleoside triphosphate
  • nucleotides can be unlabeled or detectably labeled by well-known techniques.
  • Detectable labels include, for example, radioisotopes, fluorescent labels, chemiluminescent labels, bioluminescent labels, and enzyme labels.
  • Mycoplasma pneumoniae is classified as a bacterium because it does not require host cells for self-proliferation and some antibiotics are effective.
  • mycoplasma pneumoniae does not have the cell wall that is characteristic of bacteria, so it is used as the first choice for the treatment of bacterial infections and is a ⁇ -lactam antibiotic that damages the cell wall of bacteria and kills bacteria.
  • Macrolide antibiotics erythromycin (EM), clarithromycin (CAM), azithromycin (AZM), etc.
  • EM erythromycin
  • CAM clarithromycin
  • AAM azithromycin
  • the “macrolide antibiotic resistant mutant bacterium” refers to a bacterium that has acquired resistance to a macrolide antibiotic due to a gene mutation.
  • the macrolide antibiotic resistant mutations bacteria include Mycoplasma pneumoniae (Mycoplasma pneumoniae), pertussis (Bordetella pertussis), Helicobacter pylori (Helicobacter pylori), Campylobacter jejuni bacteria (Campylobacter jejuni), Chlamydia trachomatis bacteria ( Chlamydia trachomatis ), Mycobacterium avium , and Mycobacterium intracellulare include drug-resistant bacteria against macrolide antibiotics.
  • mycoplasma pneumoniae drug-resistant bacteria refers to mycoplasma pneumoniae having drug resistance to macrolide antibiotics.
  • the two adjacent adenines in domain V of 23S rRNA to which macrolide antibiotics bind are at positions 2058 and 2059 in the most well-studied Escherichia coli, but pneumonia mycoplasma (standard strain M129; NCBI Reference Sequence: NC_000912. 1) at 2063 and 2064, pertussis (standard strain Tohama I; NCBI Reference Sequence: NC_002929.2) at 2037 and 2038, Helicobacter pylori 26695; NCBI Reference Sequence: NC_000915.1 ) in 2146 position and the position 2147 (also references to 2142 position and the position 2143 of the sequence of Accession No.
  • Campylobacter jejuni bacteria standard strain Campylobacter jejuni subsp jejuni; NCBI Reference sequence :. NC_002163.1 ) Is 2074 and 2075, Chlamydia trachomatis D / UW-3 / CX; NCBI Reference Sequence: NC_000117.1 is 2038 and 2039, Mycobacterium avium (standard strain Mycobacterium avium 104; NCBI) In Reference Sequence: NC_008595.1), positions 2279 and 2280, and in Mycobacterium intracellulare (standard strain Mycobacterium intracellulare ATCC 13950; NCBI Reference Sequence: NC_016946.1), positions 2266 and 2267 are 23S rRNA to which macrolide antibiotics bind.
  • the primer for detecting Mycoplasma pneumoniae drug-resistant bacteria or the primer for detecting Bordetella pertussis drug-resistant bacteria used in the present invention corresponds to the position of two adjacent adenins in the domain V of 23S rRNA of the macrolide antibiotic-resistant mutant. By changing to, it becomes possible to detect the above-mentioned macrolide antibiotic-resistant mutant bacteria.
  • Mycoplasma pneumoniae Mycoplasma pneumoniae
  • pertussis Bacillus pertussis
  • Helicobacter pylori bacteria macrolide antibiotic is positioned as a first line drug or major drug of choice (Helicobacter Detecting the presence or absence of macrolide antibiotic-resistant mutants by examining the 23S rRNA gene mutations in pylori ), Campylobacter jejuni , Chlamydia trachomatis , Mycobacterium avium , and Mycobacterium intracellulare. Can be done.
  • amplification refers to any in vitro method for increasing copy number of nucleotide sequences using DNA polymerase. Nucleic acid amplification results in the uptake of nucleotides into DNA molecules or primers, thereby forming new DNA molecules that are complementary to the DNA template. The formed DNA molecule and its template can be used as a template for synthesizing additional DNA molecules. As used herein, a single amplification reaction consists of a large number of DNA replications. The DNA amplification reaction includes, for example, a polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • a single PCR can usually consist of 20-100 "cycles" of DNA molecule denaturation and synthesis, including thermal denaturation of the template DNA molecule, primer annealing, and primer extension steps.
  • the characteristics of DNA polymerase, the type of PCR buffer, the complexity of template DNA, the melting temperature (Tm) of primers, and the like are listed as PCR reaction conditions.
  • the thermal cycler conditions refer to the conditions for setting the temperature and time of PCR used in the thermal cycler.
  • the conditions of the thermal cycler are (1) 98 ° C, 1 minute, 1 cycle, (2) 98 ° C, 10 A total of 36 cycles consisting of (3) 72 ° C. to 56 ° C., 15 seconds, (4) 72 ° C., 30 seconds (2) to (4) were performed, and then (5) 72 ° C., 1 minute, 1 minute.
  • the cycle is performed, and the step (3) is always performed in 15 seconds, but the temperature of the first cycle starts at 72 ° C, the temperature is lowered by 1 ° C every cycle to 57 ° C of the 16th cycle, and the 17th cycle.
  • the 36th cycle is performed at 56 ° C.
  • the conditions of the thermal cycler can be set under conditions known to those skilled in the art, not limited to this.
  • the temperature of the step (3) above is constant in the range of 40 ° C. to 70 ° C., preferably in the range of 50 ° C. to 70 ° C., most preferably 60 ° C. used in ordinary PCR. Can be.
  • the lower the temperature the easier it is for unintended sequences to be amplified, and the higher the temperature, the lower the annealing efficiency, that is, the lower the amplification efficiency.
  • PCR is the process of amplifying a target DNA template using DNA polymerase and deoxyribonucleoside triphosphate.
  • two primers one primer is complementary to the 3'end of the first strand of the amplified DNA molecule and the other primer is 3 of the second strand of the amplified DNA molecule. 'Complementary to the ends) are hybridized to their respective DNA strands.
  • the DNA polymerase in the presence of deoxyribonucleoside triphosphate, synthesizes a third DNA molecule complementary to the first strand and a fourth complementary to the second strand of the amplified DNA molecule. Allows the synthesis of DNA molecules. This synthesis results in two double-stranded DNA molecules.
  • Such double-stranded DNA molecules can then be used as DNA templates for the synthesis of additional DNA molecules by providing DNA polymerase, primers, and deoxyribonucleoside triphosphates.
  • test nucleic acid in the present invention may be, for example, single-stranded or double-stranded.
  • double strand for example, in order to hybridize the test nucleic acid and the probe to form a hybrid, it is preferable to include a step of dissociating the double strand into a single strand by heating.
  • Detecting the amplification reaction includes detecting the amplification product by PCR as an amplification product including electrophoresis in a gel, staining the nucleic acid in the gel, and detecting as a band according to the base length of the nucleic acid. It also includes detecting fluorescent probes by real-time PCR.
  • Known methods for detecting fluorescence in real-time PCR include an intercalator method using a fluorescent dye that binds to double-stranded DNA, a hydrolysis probe method that uses a fluorescent probe that specifically binds to a gene product, and a HybProbe method. ing.
  • the intercalator method is highly versatile because a fluorescent dye that binds to double-stranded DNA can be used for any sequence.
  • the hydrolysis probe method is a method using a hydrolysis probe containing a base sequence complementary to the PCR amplification product to be detected, and the hydrolysis probe is a fluorescent dye at the 5'end of a target nucleic acid-specific oligonucleotide, 3 A probe labeled with a quencher at the end.
  • a fluorescent signal is emitted, and by detecting this, trace amounts of nucleic acids can be detected and quantified. It can be carried out.
  • the HybridProbe method uses a probe labeled with a fluorescent dye at the 3'end containing a base sequence complementary to the PCR amplification product of interest to be detected, and a light cycler® Red labeled at the 5'end and the 3'end.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the probe for detecting Mycoplasma pneumoniae drug-resistant bacteria of the present invention can be redesigned so that a mutation in two adjacent adenins in domain V of 23SrRNA to which a macrolide antibiotic binds can be detected, whereby real-time PCR can be performed.
  • the presence or absence of macrolide antibiotic-resistant mutants can be detected by examining the 23S rRNA gene mutation by the method for detecting fluorescence of.
  • the type of nucleic acid to be tested is not particularly limited, and examples thereof include DNA, total RNA, RNA such as mRNA, and the like.
  • examples of the nucleic acid to be tested include nucleic acids contained in samples such as a culture sample of Mycoplasma pneumoniae, a catheter cleaning solution, and a biological sample. These samples may be used as they are, or may be diluted with an appropriate solution. Suitable solutions include water, saline, buffers, alkaline aqueous solutions, acidic aqueous solutions, nucleic acid extraction reagents, surfactants, organic solvents and the like.
  • the biological sample is not particularly limited, and examples thereof include pus, spinal fluid, pleural effusion, nasal swab, pharyngeal swab, sputum, bronchial lavage fluid, tissue section, and blood (whole blood).
  • the method for collecting a sample, the method for preparing nucleic acids such as DNA and RNA, and the like are not limited, and conventionally known methods can be adopted.
  • three types of reverse primers (primers corresponding to wild-type strains, A2063G and A2064G) in which adenine at positions 2063 and 2064 of the 23SrRNA sequence of Mycoplasma pneumoniae is arranged at the 3'end: Primer No. 1 ⁇ 3) is prepared, a primer having a difference of 1 base at the 3'end including HiDi DNA polymerase (registered trademark) is recognized, and if there is no exact match, the amplification efficiency is significantly reduced from the subject using a DNA polymerase.
  • HiDi DNA polymerase registered trademark
  • A2063G a mutation in which adenine (A) at position 2063 was replaced with guanine (G)
  • A2064G position 2064
  • the present invention consists of three types of reverse primers (one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 5 to 11) in which adenine at positions 2037 and 2038 of the 23S rRNA sequence of Bordetella pertussis is arranged at the 3'end.
  • a primer consisting of any one base sequence of SEQ ID NOs: 12-18, and a primer consisting of any one base sequence of SEQ ID NOs: 19 to 25
  • 3'containing HiDi DNA polymerase registered trademark
  • A2037G (a mutation in which adenine (A) at position 2037 is replaced with guanine (G)
  • A2038G (a mutation in which adenine (A) at position 2038 is replaced with guanine (G))
  • 2037 which account for the largest number of mutations.
  • the present invention provides a 23S rRNA gene detection kit for macrolide antibiotic resistant mutants, particularly Mycoplasma pneumoniae or Bordetella pertussis .
  • the macrolide antibiotic-resistant mutant strain detection kit for Mycoplasma pneumoniae of the present invention includes a primer set containing a reverse primer consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 and a forward primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4. Including, it can be used for detection of drug-resistant bacteria in Mycoplasma pneumoniae .
  • the macrolide antibiotic-resistant mutant strain detection kit for Bordetella pertussis of the present invention comprises a primer consisting of any one of SEQ ID NOs: 5 to 11 and any one of SEQ ID NOs: 12 to 18.
  • Bordetella pertussis which comprises a primer and a reverse primer of a primer consisting of the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 19 to 25 and a forward primer consisting of the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 26 to 29.
  • the kit of the present invention preferably contains reagents necessary for a nucleic acid amplification reaction and / or a nucleic acid amplification product detection reaction.
  • Example 1 Detection of macrolide antibiotic-resistant mutant bacteria in Mycoplasma pneumoniae
  • crude extraction of the test nucleic acid was performed by a general method. Specimens in transport medium were used. 300 ⁇ l of suspended sample-containing medium was centrifuged at 4 ° C, 20000 g, 30 minutes, the sediment was suspended in Lysis Buffer supplemented with Proteinase K, and incubated with Thermal cycler at 55 ° C, 60 minutes ⁇ 100 ° C, 10 minutes ⁇ 4 ° C. ..
  • reverse primer (1) GCTACAGTAAAGCTTCACGGGGTCTC (SEQ ID NO: 1)
  • reverse primer (2) TTAAGCTACAGTAAAGCTTCACGGGGTCTTT
  • reverse primer (3) PCR reaction was carried out under optimized conditions using TTAAGCTACAGTAAAGCTTCACGGGGTCTTC (SEQ ID NO: 3) and HiDi DNA polymerase (registered trademark) (funakoshi).
  • Touchdown PCR was performed using a thermal cycler to reduce non-specific PCR amplification products under the following conditions and promote specific amplification.
  • the annealing step (3) was always carried out in 15 seconds, but the temperature was changed or maintained depending on the cycle.
  • the temperature of the first cycle starts at 72 ° C
  • the temperature of the second cycle is 71 ° C
  • the temperature of the third cycle is 70 ° C
  • the temperature is lowered by 1 ° C for each cycle. It was lowered by 1 ° C.
  • the 17th cycle was set to 56 ° C., and the 18th to 36th cycles thereafter were also performed at 56 ° C.
  • the amplified PCR product was electrophoresed on a 2% agarose gel at 135 V for 20 minutes, and the lane in which the specific amplified product (about 250 bp) was confirmed was positive (Fig. 1).
  • the primers used for purification are as follows (primer synthesis was outsourced to Eurofin Genomics Co., Ltd.): Forward (BpSC-F-T7) GATAATACGACTCACTATAGGGCATGAAGGGGTCGCAGAGAATCGG (SEQ ID NO: 30) Reverse (BpSC-A-Rev) CCGTCTAGCCGCGGGTAGATTGCATCATCA (SEQ ID NO: 31) Forward (BpSC-B-Fwd) AGACCCCATGAACCTTTACTGTAGCTTTGC (SEQ ID NO: 32) Reverse (BpSC-R-T3) 5'-GAAATTAACCCTCACTAAAGGGCCCAGCTCACGTACCTCTTTAAATGGCG-3' (SEQ ID NO: 33) And at the time of the above bridge For AA detection, a 70-base primer (BpSC-AA) (TTTGTGATGATGCAATCTACCCGCGGCTAGACGGAAAGACCCCATGAACCTTTACTGTAGCTTTGCATTG: SEQ ID
  • Touchdown PCR was performed using a thermal cycler to reduce non-specific PCR amplification products under the following conditions and promote specific amplification.
  • the annealing step (3) was always carried out in 15 seconds, but the temperature was changed or maintained depending on the cycle.
  • the temperature of the first cycle starts at 72 ° C
  • the temperature of the second cycle is 71 ° C
  • the temperature of the third cycle is 70 ° C
  • the temperature is lowered by 1 ° C for each cycle. It was lowered by 1 ° C.
  • the 17th cycle was set to 56 ° C., and the 18th to 36th cycles thereafter were also performed at 56 ° C.
  • the amplified PCR product was electrophoresed on a 2% agarose gel at 100 V for 30 minutes to confirm the presence or absence of a specific amplified product (0.33 kbp) (Fig. 2).
  • the description of FIG. 2 is as follows:
  • the M lane indicates a 100 bp ladder marker. Lanes 1-3 show a negative control (NTC, no template control).
  • Lanes 1, 4, 5 and 6 are a combination of a forward primer (BpFwd14: GCATGAAGGGGTCGCAGAGAATCGG (SEQ ID NO: 29)) and a reverse primer (BpAA10: AAGCTACAGTAAAGGTTCATGGGGTCTTT (SEQ ID NO: 6)) and are NTC / AA / AG / GA target products.
  • a forward primer BpFwd14: GCATGAAGGGGTCGCAGAGAATCGG (SEQ ID NO: 29)
  • BpAA10 AAGCTACAGTAAAGGTTCATGGGGTCTTT (SEQ ID NO: 6)
  • Lanes 2, 7, 8 and 9 are a combination of a forward primer (BpFwd14: GCATGAAGGGGTCGCAGAGAATCGG (SEQ ID NO: 29)) and a reverse primer (BpAG10: AAGCTACAGTAAAGGTTCATGGGGTCTC (SEQ ID NO: 13)) and are NTC / AA / AG / GA target products.
  • a forward primer BpFwd14: GCATGAAGGGGTCGCAGAGAATCGG (SEQ ID NO: 29)
  • BpAG10 AAGCTACAGTAAAGGTTCATGGGGTCTC (SEQ ID NO: 13)
  • Lanes 3, 10, 11 and 12 are a combination of a forward primer (BpFwd14: GCATGAAGGGGTCGCAGAGAATCGG (SEQ ID NO: 29)) and a reverse primer (BpGA10: AAGCTACAGTAAAGGTTCATGGGGTCTTC (SEQ ID NO: 20)) and are NTC / AA / AG / GA target products.
  • a forward primer BpFwd14: GCATGAAGGGGTCGCAGAGAATCGG (SEQ ID NO: 29)
  • BpGA10 AAGCTACAGTAAAGGTTCATGGGGTCTTC (SEQ ID NO: 20)
  • a primer consisting of any one of the base sequences of 5 to 11 and any one of the base sequences of SEQ ID NOs: 12, 13, 15 and 16 By using a primer set consisting of a primer consisting of, and a primer consisting of the base sequence of any one of SEQ ID NOs: 20, 22 and 23, and a primer set of a forward primer consisting of the base sequence of any one of SEQ ID NOs: 27 to 29. , The presence or absence of the specific amplification product (0.33 kbp) could be confirmed.
  • the present invention it is possible to detect macrolide antibiotic-resistant mutant bacteria.
  • the point mutation of Adenin at positions 2063 and 2064 in the 23SrRNA domain V region, which is important for drug resistance of Mycoplasma pneumoniae and the 2037 position of the 23SrRNA domain V region, which is important for drug resistance of Bordetella pertussis.
  • drug-resistant bacteria against macrolide antibiotics of Mycoplasma pneumoniae and Bordetella pertussis can be easily detected inexpensively, accurately and in a short time. it can.

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Abstract

本発明は、マクロライド系抗生物質耐性変異菌の２３ＳｒＲＮＡドメインＶ領域のマクロライド系抗生物質が結合する２つのアデニンの点変異をＰＣＲ増幅による増幅反応を検出することを含む、マクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法に関する。

Description

マクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法
　本発明は、マクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法に関する。特に、本発明は、マクロライド系抗生物質耐性変異菌の２３ＳｒＲＮＡドメインＶ領域のマクロライド系抗生物質が結合する２つのアデニンの点変異をＰＣＲ増幅による増幅反応を検出することを含む、マクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法に関する。本発明は、特に、肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）の薬剤耐性菌の検出方法に関し、肺炎マイコプラズマの２３ＳｒＲＮＡドメインＶ領域の２０６３位と２０６４位のアデニンの点変異を検出することを含む、肺炎マイコプラズマの薬剤耐性菌の検出方法に関する。また、本発明は、特に、百日咳菌（Bordetella pertussis）のマクロライド耐性菌の検出方法に関し、百日咳菌の２３ＳｒＲＮＡのドメインＶ領域の２０３７位と２０３８位のアデニンの点変異を検出することを含む、百日咳菌のマクロライド耐性菌の検出方法にも関する。
　マクロライド系抗生物質は、肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、ヘリコバクター・ピロリ菌（Helicobacter pylori）、キャンピロバクター・ジェジュニ菌（Campylobacter jejuni）、クラミジア・トラコマチス菌（Chlamydia trachomatis）、Mycobacterium avium、Mycobacterium intracellulare等による感染症に対する治療において第一選択薬または主要選択薬として位置づけられている。
　マクロライド系抗生物質は２３ＳｒＲＮＡのドメインＶに結合することによりその機能を阻害し、タンパク質の合成を抑制して抗生物質として働く。このマクロライド系抗生物質がドメインＶに結合するうえで重要な部位が、塩基番号が大腸菌では２０５８位と２０５９位の隣接する２つのアデニンであり、これらの部位に塩基置換やメチル化の変異が生ずるとその立体構造に変化が生じ、マクロライド系抗生物質はドメインVに結合できなくなり、タンパク質合成を阻害できず、その菌は臨床的に問題となる程度のマクロライド系抗生物質に対する耐性を獲得することになる。したがって、これらの部位を検出でき、かつ、塩基置換が生じているか否かがわかれば、菌検出および薬剤耐性の判別ができる。
　マクロライド系抗生物質が結合する２３ＳｒＲＮＡのドメインＶの隣接する２つのアデニンは最も良く研究されている大腸菌においては２０５８位と２０５９位であるが、肺炎マイコプラズマ(標準株M129; NCBI ReferenceSequence:NC_000912.1)では２０６３位と２０６４位、百日咳菌(標準株 Tohama I; NCBI Reference Sequence:NC_002929.2)では２０３７位と２０３８位、ヘリコバクター・ピロリ菌(標準株 Helicobacter pylori 26695;NCBI Reference Sequence: NC_000915.1)では２１４６位と２１４７位(Accession番号U27270の配列を標準として２１４２位と２１４３位とする文献もある)、キャンピロバクター・ジェジュニ菌 (標準株Campylobacter jejuni subsp.jejuni;NCBI Reference Sequence:NC_002163.1)では２０７４位と２０７５位、クラミジア・トラコマチス菌 (標準株Chlamydia trachomatis D/UW-3/CX;NCBI Reference Sequence:NC_000117.1)では２０３８位と２０３９位、Mycobacterium avium(標準株Mycobacterium avium 104;NCBI Reference Sequence: NC_008595.1)では２２７９位と２２８０位、Mycobacterium intracellulare(標準株Mycobacterium intracellulare ATCC 13950; NCBI Reference Sequence:NC_016946.1)では２２６６位と２２６７位が、マクロライド系抗生物質が結合する２３ＳｒＲＮＡのドメインＶの隣接する２つのアデニンの位置と対応する。したがって、これらの部位を検出でき、かつ、塩基置換が生じているか否かがわかれば、菌検出および薬剤耐性の判別ができる。
　マクロライド系抗生物質耐性変異菌である肺炎マイコプラズマの薬剤耐性菌で最も重要な機構は、２３ＳｒＲＮＡの機能部位であるドメインＶ領域の２０６３位と２０６４位のアデニンの点変異である。従来の点突然変異の検出法は、（１）ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法、（２）シークエンス法、（３）Ｑｐｒｏｂｅ法が知られている。いずれの方法においても変異を含む塩基配列が用いられており、（１）ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法では、ＮｅｓｔｅｄＰＣＲ法により増幅した産物を制限酵素で処理後、その切断パターンを電気泳動により確認する。（２）シークエンス法では、ＰＣＲ法により増幅し、増幅産物のＤＮＡ塩基配列をＢＬＡＳＴを用いて、標準株の塩基配列と比較する。（３）Ｑｐｒｏｂｅ法では、ＰＣＲ法で増幅後、温度変化によりクエンチングプローブ（quenching probe）を変異部位に結合および解離させ、蛍光発光時のTm値の差を利用して変異有無を確認する。
　ＤＮＡポリメラーゼに特徴があるＰＣＲ法による肺炎マイコプラズマの薬剤耐性菌の従来の検出方法としては、特許文献１および非特許文献１が知られている。
　特許文献１は、肺炎マイコプラズマの２３ＳｒＲＮＡのＡ２０６３Ｇ変異（２０６３位のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）に置換された変異）を検出する方法に関し、３’末端を加硫したプライマーと、Ｑ５Ｈｉｇｈ－ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡポリメラーゼを使用する。Ｑ５Ｈｉｇｈ－ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡポリメラーゼは、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）によって導入された正確性と増幅性が高いＧＣ含有量に依存しないことを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ－である。
　非特許文献１は、肺炎マイコプラズマの２３ＳｒＲＮＡ遺伝子突然変異部位（主に２０６３、２０６４および２６１７位）をアッセイするために開発された、Ｈｉｇｈ－ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡポリメラーゼおよび３’ホスホロチオエート修飾特異的プライマーを用いた検出方法に関する。
　特許文献１および非特許文献１に記載のいずれのＨｉｇｈ－ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡポリメラーゼも、３’末端における１塩基の違いを有するプライマーを認識し、ミスマッチペアがある場合は増幅効率が著しく低下するＤＮＡポリメラーゼとは異なる。また、特許文献１および非特許文献１に記載のプライマーは特殊な修飾が必要となり、特許文献１および非特許文献１に記載の方法は、肺炎マイコプラズマの薬剤耐性菌を安価で簡便に検出するものとはいえない。
CN107254524A
Liu,Yan etal., ZhongguoRenshouGonghuanbingXuebao(2015),31(5), 479-484
　マクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出、特に、肺炎マイコプラズマまたは百日咳菌の薬剤耐性菌の検出においては菌検出および薬剤耐性判別を安価で正確にかつ短時間でできる方法が望まれている。肺炎マイコプラズマを診断するための標準的臨床検査法には、培養法、血清学的方法および遺伝子検査法がある。このうち、血清学的方法は、菌検出の感度が鈍く非特異的であり、なおかつ薬剤耐性の有無を判別することができないという問題点を有する。
　遺伝子検査法に関して、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法は、塩基配列増幅を２回、さらに制限酵素処理が必要であり、工程が多く煩雑であるという欠点がある。シークエンス法は、塩基配列をシークエンスおよび解析する時間と手間がかかるという欠点がある。Ｑｐｒｏｂｅ法は、蛍光色素で標識され、単独で蛍光を示しハイブリッド形成により蛍光が減少するプローブを用意する必要があり、また高価なリアルタイムＰＣＲ蛍光検出システムを必要とするという欠点がある。また、ターゲット部位が既知の変異以外の場合、正しく認識されない可能性がある。例えば、Ｑｐｒｏｂｅ法を用いて２３ＳｒＲＮＡの変異を検出する装置（全自動遺伝子解析装置ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）、本体価格1,600万円）および研究試薬（ジーンキューブ（登録商標）テストピロリ２３ＳｒＲＮＡ、９６キット／１５万円）が存在し高価である。
　本発明は以下からなる：
１．　３’末端における１塩基の違いを有するプライマーを認識し、ミスマッチペアがある場合は増幅効率が著しく低下するＤＮＡポリメラーゼを使用して、マクロライド系抗生物質耐性変異菌の２３ＳｒＲＮＡドメインＶ領域のマクロライド系抗生物質が結合する２つのアデニンの点変異をＰＣＲ増幅による増幅反応を検出することを含む、マクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法。
２．　マクロライド系抗生物質耐性変異菌が肺炎マイコプラズマの薬剤耐性菌であり、２３ＳｒＲＮＡドメインＶ領域のマクロライド系抗生物質が結合する２つのアデニンが肺炎マイコプラズマ(標準株M129; NCBI Reference Sequence:NC_000912.1)の２３ＳｒＲＮＡドメインＶ領域の２０６３位と２０６４位である、前項１に記載の方法。
３．　マクロライド系抗生物質耐性変異菌が百日咳菌の薬剤耐性菌であり、２３ＳｒＲＮＡドメインＶ領域のマクロライド系抗生物質が結合する２つのアデニンが百日咳菌(標準株 Tohama I;NCBI Reference Sequence:NC_002929.2)の２３ＳｒＲＮＡドメインＶ領域の２０３７位と２０３８位である、前項１に記載の方法。
４．　ＤＮＡポリメラーゼがＨｉＤｉ ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）である、前項１または２に記載の方法。
５．　ＰＣＲ増幅において、肺炎マイコプラズマの２３ＳｒＲＮＡ配列の２０６３位および２０６４位のアデニンの変異を検出するためのリバースプライマー：
・5’-GTAAAGCTTCACGGGGTCTC -3’に示される配列を3’側に含む２０～３５塩基長のプライマー、
・5’-TAAAGCTTCACGGGGTCTTT -3’に示される配列を3’側に含む２０～３５塩基長のプライマー、および
・5’-TAAAGCTTCACGGGGTCTTC -3’に示される配列を3’側に含む２０～３５塩基長のプライマー
を使用する、前項２または４に記載の方法。
６．　リバースプライマーが
・5’- GCTACAGTAAAGCTTCACGGGGTCTC-3’（配列番号１）に示される配列からなるプライマー、
・5’-TTAAGCTACAGTAAAGCTTCACGGGGTCTTT -3’（配列番号２）に示される配列からなるプライマー、および
・5’-TTAAGCTACAGTAAAGCTTCACGGGGTCTTC -3’（配列番号３）に示される配列からなるプライマー
である、前項５に記載の方法。
７．　ＰＣＲ増幅において、百日咳菌の２３ＳｒＲＮＡ配列の２０３７位と２０３８位のアデニンの変異を検出するためのリバースプライマー：
・配列番号５～１１のいずれか１つに示される配列を3’側に含む２０～３５塩基長のプライマー、
・配列番号１２～１８のいずれか１つに示される配列を3’側に含む２０～３５塩基長のプライマー、および
・配列番号１９～２５のいずれか１つに示される配列を3’側に含む２０～３５塩基長のプライマー
を使用する、前項３または４に記載の方法。
８．　リバースプライマーが、配列番号５～１１のいずれか１つの塩基配列からなるプライマー、配列番号１２～１８のいずれか１つの塩基配列からなるプライマー、および配列番号１９～２５のいずれか１つの塩基配列からなるプライマーである、前項７に記載の方法。
９．　サーマルサイクラーの条件が（１）９８℃、１分、１サイクル後、（２）９８℃、１０秒、（３）７２℃～５６℃、１５秒、（４）７２℃、３０秒の（２）～（４）からなるサイクルを合計３６サイクル行い、その後（５）７２℃、１分、１サイクルを行うものであって、（３）の工程は常に１５秒で行われるが、１サイクル目の温度は７２℃で開始し、１６サイクル目の５７℃まで毎サイクル１℃下げ、１７サイクル目～３６サイクル目を５６℃で行うものである、前項１～８のいずれか１項に記載の方法。
　本発明によれば、ＰＣＲ法を行える実験室環境において、マクロライド系抗生物質耐性変異菌を安価で正確に短時間で簡便に検出することができる。特に、本発明で使用する肺炎マイコプラズマ薬剤耐性菌検出用プライマーと３’末端における１塩基の違いを有するプライマーを認識し、ミスマッチペアがある場合は増幅効率が著しく低下するＤＮＡポリメラーゼにより、肺炎マイコプラズマのマクロライド系抗生物質に対する耐性遺伝子変異の弁別が可能であり、肺炎マイコプラズマのマクロライド系抗生物質に対する耐性変異菌の有無が判定できる。また、百日咳菌薬剤耐性菌検出用プライマーと３’末端における１塩基の違いを有するプライマーを認識し、ミスマッチペアがある場合は増幅効率が著しく低下するＤＮＡポリメラーゼにより、百日咳菌のマクロライド系抗生物質に対する耐性変異菌の有無が判定できる。
図１は２３ＳｒＲＮＡの変異を含む塩基配列と肺炎マイコプラズマ薬剤耐性菌検出用プライマーおよびＨｉＤｉ ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）を使用しＰＣＲを行った結果を示す。増幅されたＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで１３５Ｖ、２０分電気泳動したところ、２５０ｂｐに特異的増幅産物が確認された。（実施例１） 図２は２３ＳｒＲＮＡの変異を含む塩基配列と百日咳菌薬剤耐性菌検出用プライマーおよびＨｉＤｉ ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）を使用しＰＣＲを行った結果を示す。増幅されたＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで１００Ｖ、３０分電気泳動したところ、０．３３ｋｂｐに特異的増幅産物が確認された。（実施例２）
　以下、本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
　本発明は、３’末端における１塩基の違いを有するプライマーを認識し、ミスマッチペアがある場合は増幅効率が著しく低下するＤＮＡポリメラーゼを使用して、マクロライド系抗生物質耐性変異菌の２３ＳｒＲＮＡドメインＶ領域のマクロライド系抗生物質が結合する２つのアデニンの点変異をＰＣＲ増幅による増幅反応を検出することを含む、マクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法を提供する。
　一実施態様において、本発明は、ＨｉＤｉ ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）を使用して、肺炎マイコプラズマ(標準株M129; NCBI Reference Sequence:NC_000912.1)の２３ＳｒＲＮＡドメインＶ領域の２０６３位と２０６４位のアデニンの点変異を検出することを含む、肺炎マイコプラズマの薬剤耐性菌の検出方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、ＨｉＤｉ ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）を使用して、百日咳菌(標準株 Tohama I;NCBI Reference Sequence:NC_002929.2)の２３ＳｒＲＮＡドメインＶ領域の２０３７位と２０３８位のアデニンの点変異を検出することを含む、百日咳菌の薬剤耐性菌の検出方法を提供する。
　本明細書において、マクロライド系抗生物質が結合する２３ＳｒＲＮＡのドメインＶの隣接する２つのアデニン（例えば、大腸菌においては２０５８位または２０５９位、肺炎マイコプラズマにおいては２０６３位と２０６４位、百日咳菌においては２０３７位と２０３８位）において、例えば、大腸菌においては２０５８位のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）に置換された点変異をＧＡ、大腸菌においては２０５９位のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）に置換された点変異をＡＧ、大腸菌においては２０５８位および２０５９位のアデニン（Ａ）が無変異の場合ＡＡともいう。
　ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーの３’末端から、５’から３’の方向に娘ＤＮＡ分子を伸長する。ＤＮＡポリメラーゼの複製の忠実度は、重合の精度をいい、ＤＮＡポリメラーゼが、テンプレートに相補的なＤＮＡを合成する場合、正しいヌクレオチドと正しくないヌクレオチドとを区別する能力をいう。ＤＮＡポリメラーゼの複製の忠実度が高くなればなるほど、ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡ合成間の成長鎖にヌクレオチドを誤って取り込むことが少なくなる。
　増大した複製の忠実度を有するＤＮＡポリメラーゼには、例えば、ＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼやピロコッカスフリオサス（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。
　３’末端における１塩基の違いを有するプライマーを認識し、完全一致しない場合増幅率が著しく低下するＤＮＡポリメラーゼには、ＨｉＤｉ ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）が含まれる。
　３’末端における１塩基の違いを有するプライマーを認識し、完全一致しない場合増幅率が著しく低下するＤＮＡポリメラーゼとは、プライマーが鋳型となるＤＮＡとプライマー／鋳型複合体を形成するときに、プライマーの３’末端に位置する１塩基が鋳型ＤＮＡの対応する位置に存在する１塩基とグアニン（Ｇ）／シトシン（Ｃ）またはアデニン（Ａ）／チミン（Ｔ）の塩基対を認識するＤＮＡポリメラーゼであり、Ｇ／ＣまたはＡ／Ｔの塩基対を形成しない、すなわち、ミスマッチペアが生じる場合にＤＮＡポリメラーゼによる増幅率が低下することを意味する。
　ＨｉＤｉ ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）（High Discrimination TaqDNAPolymerase）は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片をもとに遺伝子改変された、高度に選択的なＤＮＡポリメラーゼの変異体である（M. Drum et al., PLoS One. 2014 May6;9(5):e96640）。例えば、対立遺伝子特異的ＰＣＲまたはメチル化特異的ＰＣＲにおいて、高い識別が要求されるアッセイのために選択され得る。多くのＤＮＡポリメラーゼはミスマッチプライマー／鋳型複合体を許容するが、ＨｉＤｉ ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）はそれらを効率的に識別し、完全にマッチしたプライマー対の場合にのみ特異的増幅産物を生成する。ＨｉＤｉ ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）は３’末端における１塩基の違いを有するプライマーを認識し、完全一致しない場合増幅率が著しく低下する。
　好ましい態様において、本発明のＤＮＡポリメラーゼはＨｉＤｉ ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）である。
　本明細書において「プライマー」は、ＤＮＡ分子の増幅または重合間にヌクレオチドモノマーの共有結合により伸長される、１本鎖オリゴヌクレオチドをいう。プライマーは好ましくは１５～４０塩基長、より好ましくは２０～３５塩基長である。例えば、プライマーの３’末端は遊離３’－ＯＨ基を提供して、そこにさらなるヌクレオチドが３’→５’ホスホジエステル結合を確立するＤＮＡポリメラーゼによって結合され得る。
　本明細書において、「肺炎マイコプラズマ薬剤耐性菌検出用プライマー」は肺炎マイコプラズマのマクロライド系抗生物質に対する薬剤耐性菌がコードする核酸分子を検出するために使用されるプライマーであり、肺炎マイコプラズマ(標準株M129; NCBI Reference Sequence:NC_000912.1)の２３ＳｒＲＮＡドメインＶ領域の２０６３位と２０６４位のアデニンの点変異を検出するために使用されるプライマーである。肺炎マイコプラズマ薬剤耐性菌検出用プライマーの一態様としては、好ましくは、5’- GTAAAGCTTCACGGGGTCTC -3’に示される配列を3’側に含む２０～３５塩基長のＡＧ検出用プライマー、5’- TAAAGCTTCACGGGGTCTTT -3’に示される配列を3’側に含む２０～３５塩基長のＡＡ検出用プライマー、および5’- TAAAGCTTCACGGGGTCTTC -3’に示される配列を3’側に含む２０～３５塩基長のＧＡ検出用プライマーと5’- CTGCCCAGTGCTGGAAGGTT-3’に示される配列を5’側に含む２０～４０塩基長のプライマー塩基配列からなるフォワードプライマーを含むセットである。より好ましくは、プライマーは配列番号１～３に示される塩基配列からなるリバースプライマーと配列番号４に示される塩基配列からなるフォワードプライマーを含むセットである。
　本明細書において、「百日咳菌薬剤耐性菌検出用プライマー」は百日咳菌のマクロライド系抗生物質に対する薬剤耐性菌がコードする核酸分子を検出するために使用されるプライマーであり、百日咳菌(標準株 Tohama I; NCBI Reference Sequence:NC_002929.2)の２３ＳｒＲＮＡドメインＶ領域の２０３７位と２０３８位のアデニンの点変異を検出するために使用されるプライマーである。百日咳菌薬剤耐性菌検出用プライマーの一態様としては、好ましくは、配列番号５～１１のいずれか１つのＡＡ検出用プライマー、配列番号１２～１８のいずれか１つのＡＧ検出用プライマー、および配列番号１９～２５のいずれか１つのＧＡ検出用プライマーを3'側に含む２０～３５塩基長のリバースプライマーと、配列番号２６～２９のいずれか１つの塩基配列を5'側に含む２０～４０塩基長のプライマー塩基配列からなるフォワードプライマーを含むセットである。より好ましくは、配列番号５～１１のいずれか１つの塩基配列からなるプライマー、配列番号１２～１８のいずれか１つの塩基配列からなるプライマー、および配列番号１９～２５のいずれか１つの塩基配列からなるプライマーのリバースプライマーと、配列番号２６～２９のいずれか１つの塩基配列からなるフォワードプライマーを含むセットである。さらにより好ましくは、５～１１のいずれか１つの塩基配列からなるプライマー、配列番号１２、１３、１５、１６のいずれか１つの塩基配列からなるプライマー、および配列番号２０、２２、２３のいずれか１つの塩基配列からなるプライマーのリバースプライマーと、配列番号２７～２９のいずれか１つの塩基配列からなるフォワードプライマーを含むセットである。最も好ましくは、配列番号６の塩基配列からなるプライマー、配列番号１３の塩基配列からなるプライマー、および配列番号２０の塩基配列からなるプライマーのリバースプライマーと、配列番号２９の塩基配列からなるフォワードプライマーを含むセットである。
　オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの５炭糖の３’位と近接ヌクレオチドの５炭糖の５’位との間がホスホジエステル結合により結合したヌクレオチドの共有結合配列を含む、合成分子または天然分子をいう。オリゴヌクレオチドはプライマーおよびプローブとして使用することができる。
　本明細書中で使用する「ヌクレオチド」は、塩基－糖－リン酸の組み合わせをいう。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシド３リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはそれらの誘導体）を含む。本明細書中で使用するヌクレオチドはまた、ジデオキシリボヌクレオシド３リン酸（ｄｄＮＴＰ）およびそれらの誘導体をいう。ジデオキシリボヌクレオシド３リン酸の例示される例は、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＴＴＰを含むが、それらに限定されない。本発明によれば、「ヌクレオチド」は、非標識であり得るか、または周知の技術により検出可能に標識され得る。検出可能な標識は、例えば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、および酵素標識を含む。
　肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）は、自己増殖に宿主細胞を必要とせず、一部の抗生物質が有効なことから細菌に分類される。一方、肺炎マイコプラズマは、細菌の特徴である細胞壁を有しておらず、そのため細菌感染症治療の第一選択として使われ細菌の細胞壁を障害して菌を殺す作用を有するβ－ラクタム系の抗生物質（ペニシリン系、セフェム系等）に耐性を示し、タンパク質合成阻害剤であるマクロライド系抗生物質（エリスロマイシン（ＥＭ）、クラリスロマイシン（ＣＡＭ）、アジスロマイシン（ＡＺＭ）等）が有効とされる。
　本明細書において、「マクロライド系抗生物質耐性変異菌」は、遺伝子変異によりマクロライド系抗生物質に耐性を獲得した細菌をいう。マクロライド系抗生物質耐性変異菌には、肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、ヘリコバクター・ピロリ菌（Helicobacter pylori）、キャンピロバクター・ジェジュニ菌（Campylobacter jejuni）、クラミジア・トラコマチス菌（Chlamydia trachomatis）、Mycobacterium avium、Mycobacterium intracellulareのマクロライド系抗生物質に対する薬剤耐性菌が含まれる。マクロライド系抗生物質耐性変異菌の発生は２３ＳｒＲＮＡ遺伝子変異と深い相関関係があることが明らかになっている。本明細書において「肺炎マイコプラズマ薬剤耐性菌」は、マクロライド系抗生物質に対して薬剤耐性をもつ肺炎マイコプラズマをいう。
　マクロライド系抗生物質が結合する２３ＳｒＲＮＡのドメインＶの隣接する２つのアデニンは最も良く研究されている大腸菌においては２０５８位と２０５９位であるが、肺炎マイコプラズマ(標準株M129; NCBI Reference Sequence:NC_000912.1)では２０６３位と２０６４位、百日咳菌(標準株 Tohama I; NCBI Reference Sequence:NC_002929.2)では２０３７位と２０３８位、ヘリコバクター・ピロリ菌(標準株 Helicobacter pylori 26695;NCBI Reference Sequence: NC_000915.1)では２１４６位と２１４７位(Accession番号U27270の配列を標準として２１４２位と２１４３位とする文献もある)、キャンピロバクター・ジェジュニ菌 (標準株Campylobacter jejunisubsp.jejuni;NCBI Reference Sequence:NC_002163.1)では２０７４位と２０７５位、クラミジア・トラコマチス菌 (標準株Chlamydia trachomatis D/UW-3/CX;NCBI Reference Sequence:NC_000117.1)では２０３８位と２０３９位、Mycobacterium avium(標準株Mycobacterium avium 104;NCBI Reference Sequence: NC_008595.1)では２２７９位と２２８０位、Mycobacterium intracellulare(標準株Mycobacterium intracellulare ATCC 13950; NCBI Reference Sequence:NC_016946.1)では２２６６位と２２６７位が、マクロライド系抗生物質が結合する２３ＳｒＲＮＡのドメインＶの隣接する２つのアデニンの位置と対応する。本発明で使用される肺炎マイコプラズマ薬剤耐性菌検出用プライマーまたは百日咳菌薬剤耐性菌検出用プライマーを上記マクロライド系抗生物質耐性変異菌の２３ＳｒＲＮＡのドメインＶの隣接する２つのアデニンの位置と対応するものに変更することで上記マクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出が可能となる。
　すなわち、本発明によれば、肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）または百日咳菌（Bordetella pertussis）以外にも、マクロライド系抗生物質が第一選択薬または主要選択薬として位置づけられているヘリコバクター・ピロリ菌（Helicobacter pylori）、キャンピロバクター・ジェジュニ菌（Campylobacter jejuni）、クラミジア・トラコマチス菌（Chlamydia trachomatis）、Mycobacterium avium、Mycobacterium intracellulareの２３ＳｒＲＮＡ遺伝子変異を調べることによりマクロライド系抗生物質耐性変異菌の有無を検出することができる。
　本明細書中で使用する「増幅」は、ＤＮＡポリメラーゼを使用してヌクレオチド配列のコピー数を増大するための任意のインビトロ法をいう。核酸増幅は、ヌクレオチドのＤＮＡ分子またはプライマーへの取り込みをもたらし、それによりＤＮＡテンプレートに相補的な新たなＤＮＡ分子を形成する。形成されたＤＮＡ分子およびそのテンプレートは、さらなるＤＮＡ分子を合成するためのテンプレートとして使用され得る。本明細書中で使用するように、１回の増幅反応は、多くの回数のＤＮＡ複製からなる。ＤＮＡ増幅反応は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。１回のＰＣＲは、通常、テンプレートＤＮＡ分子の熱変性、プライマーのアニーリング、プライマーの伸長工程を含む２０～１００回の「サイクル」のＤＮＡ分子の変性および合成からなり得る。ＤＮＡポリメラーゼの特性、ＰＣＲ緩衝液の種類、テンプレートＤＮＡの複雑性、プライマーの融解温度（Ｔｍ）等がＰＣＲの反応条件として挙げられる。
　ＰＣＲは通常サーマルサイクラーを使用して行われる。本明細書において、サーマルサイクラーの条件とは、サーマルサイクラーで使用されるＰＣＲの温度および時間の設定条件をいう。非特異的なＰＣＲ増幅産物を減らし、特異的な増幅を促進させるＴｏｕｃｈｄｏｗｎＰＣＲを行う一実施態様において、サーマルサイクラーの条件は（１）９８℃、１分、１サイクル後、（２）９８℃、１０秒、（３）７２℃～５６℃、１５秒、（４）７２℃、３０秒の（２）～（４）からなるサイクルを合計３６サイクル行い、その後（５）７２℃、１分、１サイクルを行うものであって、（３）の工程は常に１５秒で行われるが、１サイクル目の温度は７２℃で開始し、１６サイクル目の５７℃まで毎サイクル１℃下げ、１７サイクル目～３６サイクル目を５６℃で行われる。これに限定されない当業者に既知の条件でサーマルサイクラーの条件を設定することができる。例えば、ＴｏｕｃｈｄｏｗｎＰＣＲを行わない場合には、上記（３）の工程の温度は通常のＰＣＲで用いられる４０℃～７０℃の範囲、好ましくは５０℃～７０℃の範囲、最も好ましくは６０℃で一定にすることができる。当該工程は、温度が低いほど、意図しない配列も増幅されやすく、温度が高いほどアニールの効率が下がる、すなわち、増幅効率が低下する。
　ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸を使用して標的ＤＮＡテンプレートを増幅するプロセスである。このようなＰＣＲにおいて、２つのプライマー（一方のプライマーは、増幅されるＤＮＡ分子の第１鎖の３’末端に相補的であり、他方のプライマーは、増幅されるＤＮＡ分子の第２鎖の３’末端に相補的である）が、それらのそれぞれのＤＮＡ鎖にハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡポリメラーゼは、デオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下で、増幅されるＤＮＡ分子の、第１鎖に相補的な第３のＤＮＡ分子の合成および第２鎖に相補的な第４のＤＮＡ分子の合成を可能にする。この合成は、２つの２本鎖ＤＮＡ分子をもたらす。次いで、このような２本鎖ＤＮＡ分子は、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸を提供することにより、さらなるＤＮＡ分子の合成のためのＤＮＡテンプレートとして使用され得る。
　本発明における被検核酸は、例えば、１本鎖でもよいし、２本鎖でもよい。２本鎖の場合は、例えば、被検核酸とプローブとをハイブリダイズさせてハイブリッド体を形成するために、加熱により前記２本鎖を１本鎖に解離させる工程を含むことが好ましい。
　「増幅反応を検出すること」には、ＰＣＲによる増幅産物をゲル中で電気泳動しゲル中の核酸を染色して核酸の塩基長に応じたバンドとして検出することを含む増幅産物として検出することや、リアルタイムＰＣＲにより蛍光プローブを検出することが含まれる。
リアルタイムＰＣＲの蛍光の検出方法には、二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光色素を使用するインターカレーター法、遺伝子産物に特異的に結合する蛍光プローブを使用する加水分解プローブ法、ＨｙｂＰｒｏｂｅ法等が知られている。
　インターカレーター法は、二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光色素をあらゆる配列に対して利用することができ汎用性が高い。
　加水分解プローブ法は、検出する目的のＰＣＲ増幅産物と相補的な塩基配列を含む加水分解プローブを使用する方法であり、加水分解プローブは標的核酸特異なオリゴヌクレオチドの５’末端に蛍光色素、３’末端にクエンチャーを標識したプローブであり、ＰＣＲ酵素の５’－３’エキソヌクレアーゼ活性で加水分解されることで、蛍光シグナルが発せられ、それを検出することで核酸の微量検出や定量を行うことができる。
　ＨｙｂＰｒｏｂｅ法は、検出する目的のＰＣＲ増幅産物と相補的な塩基配列を含む３’末端に蛍光色素で標識されたプローブと５’末端にライトサイクラー（登録商標）Ｒｅｄで標識しかつ３’末端をリン酸化したプローブの２つのプローブが近接してハイブリダイズすることにより蛍光物質間に蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）が起こり、蛍光シグナルが発せられ、それを検出することで核酸の検出や定量を行うことができる。
　本発明の肺炎マイコプラズマ薬剤耐性菌検出用プライマーをマクロライド系抗生物質が結合する２３ＳｒＲＮＡのドメインＶの隣接する２つのアデニンの変異を検出できるようにプローブを設計変更することができ、それによりリアルタイムＰＣＲの蛍光の検出方法により２３ＳｒＲＮＡ遺伝子変異を調べることによりマクロライド系抗生物質耐性変異菌の有無を検出することができる。
　被検核酸の種類としては、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡや、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ等があげられる。また、前記被検核酸は、例えば、肺炎マイコプラズマの培養試料、カテーテル洗浄液、生体試料等の試料に含まれる核酸があげられる。これらの試料はそのまま用いてもよいし、適当な溶液で希釈したものを用いてもよい。適当な溶液としては、水、生理食塩水、緩衝液、アルカリ性水溶液、酸性水溶液、核酸抽出試薬、界面活性剤、有機溶媒などが挙げられる。
　生体試料としては、特に制限されないが、例えば、膿、髄液、胸水、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、喀痰、気管支洗浄液、組織切片、血液（全血）などが挙げられる。試料の採取方法、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。
　本発明によれば、肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）の２３ＳｒＲＮＡ配列の２０６３位および２０６４位のアデニンを３’末端に配置した３種類のリバースプライマー（野生株、Ａ２０６３Ｇ、Ａ２０６４Ｇに対応するプライマー：配列番号１～３）を準備し、ＨｉＤｉ ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）を含む３’末端における１塩基の違いを有するプライマーを認識し、完全一致しない場合は増幅効率が著しく低下するＤＮＡポリメラーゼを使用して被験者から得られた被検核酸に対してＰＣＲ法を行うことで、点突然変異のうち最も多くを占めるＡ２０６３Ｇ（２０６３位のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）に置換された変異）、Ａ２０６４Ｇ（２０６４位のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）に置換された変異）を、単一のＰＣＲ条件で弁別することができる。
　本発明によれば、百日咳菌（Bordetella pertussis）の２３ＳｒＲＮＡ配列の２０３７位および２０３８位のアデニンを３’末端に配置した３種類のリバースプライマー（配列番号５～１１のいずれか１つの塩基配列からなるプライマー、配列番号１２～１８のいずれか１つの塩基配列からなるプライマー、および配列番号１９～２５のいずれか１つの塩基配列からなるプライマー）を準備し、ＨｉＤｉ ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）を含む３’末端における１塩基の違いを有するプライマーを認識し、完全一致しない場合は増幅効率が著しく低下するＤＮＡポリメラーゼを使用して被験者から得られた被検核酸に対してＰＣＲ法を行うことで、点突然変異のうち最も多くを占めるＡ２０３７Ｇ（２０３７位のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）に置換された変異）、Ａ２０３８Ｇ（２０３８位のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）に置換された変異）、２０３７位と２０３８位がそれぞれアデニン（Ａ）およびアデニン（Ａ）である無変異を、単一のＰＣＲ条件で弁別することができる。
　一実施態様において、本発明は、マクロライド系抗生物質耐性変異菌、特に、肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）または百日咳菌（Bordetella pertussis）の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子検出キットを提供する。本発明の肺炎マイコプラズマのマクロライド系抗生物質耐性変異菌検出キットは、配列番号１～３に示される塩基配列からなるリバースプライマーと配列番号４に示される塩基配列からなるフォワードプライマーを含むプライマーセットを含み、肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）の薬剤耐性菌検出に用いることが出来る。また、本発明の百日咳菌のマクロライド系抗生物質耐性変異菌検出キットは、配列番号５～１１のいずれか１つの塩基配列からなるプライマー、配列番号１２～１８のいずれか１つの塩基配列からなるプライマー、および配列番号１９～２５のいずれか１つの塩基配列からなるプライマーのリバースプライマーと、配列番号２６～２９のいずれか１つの塩基配列からなるフォワードプライマーを含むセットを含み、百日咳菌（Bordetella pertussis）の薬剤耐性菌検出に用いることが出来る。本発明のキットは、核酸増幅反応および／または核酸増幅産物検出反応に必要な試薬を適宜含むことが好ましい。
　以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例の記載によって限定して解釈されるものではない。当業者であれば、本明細書の記載に基づき、本発明の技術的範囲を逸脱せずに、多くの変形及び修飾を実施することができる。また、特に記載のない場合には、以下の実施例は、例えば、Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-ALaboratoryManual,ColdSpring Harbor Laboratory Press, New York,1989; Ausubel, F.M.etal.,Current ProtocolsinMolecularBiology,John Wiley&Sons,NewYork,N.Y,1995等に記載されている、当業者に公知の標準的な遺伝子工学及び分子生物学的技術に従い実施することが出来る。また、キットを使用する場合は、キットの説明書に従って行う。なお、本明細書中に引用された文献の記載内容は本明細書の開示、及び、内容の一部を構成するものである。
（実施例１　肺炎マイコプラズマのマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出）
　被験者の咽頭拭い液を用いて、一般的な方法で被検核酸粗抽出を行った。輸送用培地に入った検体を使用した。懸濁した検体含有培地300μｌを4℃、20000g、30分間で遠心し、沈渣をProteinase K添加Lysis Bufferで懸濁し、Thermal cyclerで55℃、60分→100℃、10分→4℃でインキュベートした。肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）の２３ＳｒＲＮＡの野生型の２０６３位の塩基アデニン（Ａ）が塩基グアニン（Ｇ）に突然変異したＡ２０６３Ｇ、２０６４位の塩基アデニン（Ａ）が塩基グアニン（Ｇ）に突然変異したＡ２０６４Ｇを被検核酸から検出するために、
フォワード プライマー１種（1838-CTGCCCAGTGCTGGAAGGTTAAAGAAGGAGGTTAG-1872（配列番号４））およびリバースプライマー３種（リバースプライマー(1):GCTACAGTAAAGCTTCACGGGGTCTC（配列番号１）、リバースプライマー(2): TTAAGCTACAGTAAAGCTTCACGGGGTCTTT（配列番号２）、リバースプライマー(3):TTAAGCTACAGTAAAGCTTCACGGGGTCTTC（配列番号３））、ＨｉＤｉ ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）（funakoshi）を用い、最適化した条件でＰＣＲ反応を行った。すなわち、サーマルサイクラーを用いて以下の条件において非特異的なＰＣＲ増幅産物を減らし、特異的な増幅を促進させるＴｏｕｃｈｄｏｗｎＰＣＲを行った。（１）９８℃、１分、１サイクル後、（２）９８℃、１０秒、（３）７２℃～５６℃、１５秒、（４）７２℃、３０秒の（２）～（４）からなるサイクルを合計３６サイクル行い、その後（５）７２℃、１分、１サイクルを行い終了した。（３）のアニーリング工程は、常に１５秒で行われるが、サイクルによって温度を変更または維持した。つまり、１サイクル目の温度は７２℃で開始し、２サイクル目は７１℃、３サイクル目は７０℃・・・とサイクル毎に１℃下げ、１６サイクル目の５７℃まで同様にサイクル毎に１℃下げた。１７サイクル目は５６℃とし、以降１８～３６サイクル目も５６℃で行った。
　増幅されたＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで１３５Ｖ、２０分電気泳動し、特異的増幅産物（約２５０ｂｐ）が確認されたレーンを陽性とした（図１）。
（実施例２　百日咳菌のマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出）
　臨床検体から分離された百日咳菌（Bordetella pertussis）の菌株をQIAGEN社 QIAampDNA mini kitを用いて核酸抽出を行った。該核酸を精製し、百日咳菌の２３ＳｒＲＮＡ配列の塩基配列において変異が入る２つの塩基（２０３７位および２０３８位）の上流領域と下流領域を別個にＰＣＲで増幅した。これらのＰＣＲ増幅産物をタカラバイオ社Gel and PCR clean up kitを用いて精製し、２００３から２０７２の７０塩基に相当するプライマーで「橋渡し」してつなぎ合わせた。精製に用いたプライマーは、以下のとおりである（ユーロフィンジェノミクス株式会社にプライマー合成を委託）：
フォワード (BpSC-F-T7)
GATAATACGACTCACTATAGGGCATGAAGGGGTCGCAGAGAATCGG （配列番号３０）
リバース (BpSC-A-Rev)
CCGTCTAGCCGCGGGTAGATTGCATCATCA（配列番号３１）

フォワード (BpSC-B-Fwd)
AGACCCCATGAACCTTTACTGTAGCTTTGC（配列番号３２）
リバース (BpSC-R-T3)
5’-GAAATTAACCCTCACTAAAGGGCCCAGCTCACGTACCTCTTTAAATGGCG-3’ （配列番号３３）

そして、上記橋渡しの際に、
ＡＡ検出用では、２０３７位および２０３８位のいずれもアデニン（Ａ）である７０塩基プライマー（BpSC-AA）（TTTGTGATGATGCAATCTACCCGCGGCTAGACGGAAAGACCCCATGAACCTTTACTGTAGCTTTGCATTG：配列番号３４）を用いた。
ＡＧ検出用では、２０３７位および２０３８位がそれぞれアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）である７０塩基プライマー（BpSC-AG）（TTTGTGATGATGCAATCTACCCGCGGCTAGACGGAGAGACCCCATGAACCTTTACTGTAGCTTTGCATTG：配列番号３５）を用いた。
ＧＡ検出用では、２０３７位および２０３８位がそれぞれグアニン（Ｇ）およびアデニン（Ａ）である７０塩基プライマー（BpSC-GA）（TTTGTGATGATGCAATCTACCCGCGGCTAGACGGGAAGACCCCATGAACCTTTACTGTAGCTTTGCATTG：配列番号３６）を用いた。
このように調製して得られたＰＣＲ産物を再度精製した核酸標品を１０３ copy/μＬに調製し、被検核酸とした。
　百日咳菌（Bordetella pertussis）の２３ＳｒＲＮＡの２０３７位および２０３８位のアデニンの変異を被検核酸から検出するために、以下の検出用プライマー、およびＨｉＤｉ ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）（funakoshi）を用い、最適化した条件でＰＣＲ反応を行った。
　百日咳菌のＡＡ、ＡＧ、およびＧＡ検出用プライマー（ユーロフィンジェノミクス株式会社にプライマー合成を委託）は以下のとおりである。

フォワード プライマー　（４種）
BpFwd11　1730-　CATGAAGGGGTCGCAGAGAATCG　　 -1752（配列番号２６）
BpFwd12　1731-　 ATGAAGGGGTCGCAGAGAATCGG　　-1753（配列番号２７）
BpFwd13　1730-　CATGAAGGGGTCGCAGAGAATCGG　　-1753（配列番号２８）
BpFwd14　1729- GCATGAAGGGGTCGCAGAGAATCGG　　-1753（配列番号２９）

リバースプライマー
・ＡＡ検出用プライマー（２０３７位および２０３８位がアデニン（Ａ））
BpAA12　2067　5'-CAAAGCTACAGTAAAGGTTCATGGGGTCTTT-3'　2037　（配列番号５）
BpAA10　2065　　　 AAGCTACAGTAAAGGTTCATGGGGTCTTT 　　　　　（配列番号６）
BpAA08　2063　　　　 GCTACAGTAAAGGTTCATGGGGTCTTT 　　　　　（配列番号７）
BpAA06　2061　　　　　 TACAGTAAAGGTTCATGGGGTCTTT 　　　　　（配列番号８）
BpAA04　2059　　　　　　 CAGTAAAGGTTCATGGGGTCTTT 　　　　　（配列番号９）
BpAA02　2057　　　　　　　 GTAAAGGTTCATGGGGTCTTT　　　　　（配列番号１０）
BpAA00　2055　　　　　　　　 AAAGGTTCATGGGGTCTTT 　　　　　（配列番号１１）

・ＡＧ検出用プライマー（２０３８位変異）
BpAG12　2067　　　CAAAGCTACAGTAAAGGTTCATGGGGTCTC　　2038　（配列番号１２）
BpAG10　2065　　　　AAGCTACAGTAAAGGTTCATGGGGTCTC　　　　　（配列番号１３）
BpAG08　2063　　　　　GCTACAGTAAAGGTTCATGGGGTCTC　　　　　（配列番号１４）
BpAG06　2061　　　　　　TACAGTAAAGGTTCATGGGGTCTC　　　　　（配列番号１５）
BpAG04　2059　　　　　　　CAGTAAAGGTTCATGGGGTCTC　　　　　（配列番号１６）
BpAG02　2057　　　　　　　　GTAAAGGTTCATGGGGTCTC　　　　　（配列番号１７）
BpAG00　2055　　　　　　　　　AAAGGTTCATGGGGTCTC　　　　　（配列番号１８）

・ＧＡ検出用プライマー（２０３７位変異）
BpGA12　2067　　　CAAAGCTACAGTAAAGGTTCATGGGGTCTTC　　2037　（配列番号１９）
BpGA10　2065　　　　AAGCTACAGTAAAGGTTCATGGGGTCTTC　　　　　（配列番号２０）
BpGA08　2063　　　　　GCTACAGTAAAGGTTCATGGGGTCTTC　　　　　（配列番号２１）
BpGA06　2061　　　　　　TACAGTAAAGGTTCATGGGGTCTTC　　　　　（配列番号２２）
BpGA04　2059　　　　　　　CAGTAAAGGTTCATGGGGTCTTC　　　　　（配列番号２３）
BpGA02　2057　　　　　　　　GTAAAGGTTCATGGGGTCTTC　　　　　（配列番号２４）
BpGA00　2055　　　　　　　　　AAAGGTTCATGGGGTCTTC　　　　　（配列番号２５）
　すなわち、サーマルサイクラーを用いて以下の条件において非特異的なＰＣＲ増幅産物を減らし、特異的な増幅を促進させるＴｏｕｃｈｄｏｗｎＰＣＲを行った。（１）９８℃、１分、１サイクル後、（２）９８℃、１０秒、（３）７２℃～５６℃、１５秒、（４）７２℃、３０秒の（２）～（４）からなるサイクルを合計３６サイクル行い、その後（５）７２℃、１分、１サイクルを行い終了した。（３）のアニーリング工程は、常に１５秒で行われるが、サイクルによって温度を変更または維持した。つまり、１サイクル目の温度は７２℃で開始し、２サイクル目は７１℃、３サイクル目は７０℃・・・とサイクル毎に１℃下げ、１６サイクル目の５７℃まで同様にサイクル毎に１℃下げた。１７サイクル目は５６℃とし、以降１８～３６サイクル目も５６℃で行った。
　増幅されたＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで１００Ｖ、３０分電気泳動し、特異的増幅産物（０．３３ｋｂｐ）の有無を確認した（図２）。
　図２の説明は以下のとおりである：
　Ｍのレーンは１００ｂｐラダーマーカーを示す。
　レーン１～３は陰性対照(NTC, no template control: 鋳型なし)を示す。
　レーン１、４、５、６は、フォワードプライマー（BpFwd14:GCATGAAGGGGTCGCAGAGAATCGG（配列番号２９））とリバースプライマー（BpAA10:AAGCTACAGTAAAGGTTCATGGGGTCTTT（配列番号６））の組み合わせで、NTC/AA/AG/GAの対象標品を鋳型にPCR増幅を行った結果であり、AA配列のみに増幅産物（０．３３ｋｂｐ）が確認された。
　レーン２、７、８、９は、フォワードプライマー（BpFwd14:GCATGAAGGGGTCGCAGAGAATCGG（配列番号２９））とリバースプライマー（BpAG10：AAGCTACAGTAAAGGTTCATGGGGTCTC（配列番号１３））の組み合わせで、NTC/AA/AG/GAの対象標品を鋳型にPCR増幅を行った結果であり、AG配列のみに増幅産物（０．３３ｋｂｐ）が確認された。
　レーン３、１０、１１、１２は、フォワードプライマー（BpFwd14:GCATGAAGGGGTCGCAGAGAATCGG（配列番号２９））とリバースプライマー（BpGA10:AAGCTACAGTAAAGGTTCATGGGGTCTTC（配列番号２０））の組み合わせで、NTC/AA/AG/GAの対象標品を鋳型にPCR増幅を行った結果であり、GA配列のみに増幅産物（０．３３ｋｂｐ）が確認された。
　ここに結果は示さないが、図２で使用したプライマーセット以外にも、５～１１のいずれか１つの塩基配列からなるプライマー、配列番号１２、１３、１５、１６のいずれか１つの塩基配列からなるプライマー、および配列番号２０、２２、２３のいずれか１つの塩基配列からなるプライマーのリバースプライマーと、配列番号２７～２９のいずれか１つの塩基配列からなるフォワードプライマーのプライマーセットを使用することにより、特異的増幅産物（０．３３ｋｂｐ）の有無を確認することができた。
　本発明によれば、マクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出が可能となる。特に、肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）の薬剤耐性に重要な２３ＳｒＲＮＡドメインＶ領域の２０６３位と２０６４位のアデニンの点変異および百日咳菌（Bordetella pertussis）の薬剤耐性に重要な２３ＳｒＲＮＡドメインＶ領域の２０３７位と２０３８位のアデニンの点変異を検出することにより、肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）および百日咳菌（Bordetella pertussis）のマクロライド系抗生物質に対する薬剤耐性菌を安価で正確に短時間で簡便に検出することができる。

Claims (9)

  1. 　３’末端における１塩基の違いを有するプライマーを認識し、ミスマッチペアがある場合は増幅効率が著しく低下するＤＮＡポリメラーゼを使用して、マクロライド系抗生物質耐性変異菌の２３ＳｒＲＮＡドメインＶ領域のマクロライド系抗生物質が結合する２つのアデニンの点変異をＰＣＲ増幅による増幅反応を検出することを含む、マクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法。
  2. 　マクロライド系抗生物質耐性変異菌が肺炎マイコプラズマの薬剤耐性菌であり、２３ＳｒＲＮＡドメインＶ領域のマクロライド系抗生物質が結合する２つのアデニンが肺炎マイコプラズマ(標準株M129; NCBI Reference Sequence:NC_000912.1)の２３ＳｒＲＮＡドメインＶ領域の２０６３位と２０６４位である、請求項１に記載の方法。
  3. 　マクロライド系抗生物質耐性変異菌が百日咳菌の薬剤耐性菌であり、２３ＳｒＲＮＡドメインＶ領域のマクロライド系抗生物質が結合する２つのアデニンが百日咳菌(標準株 Tohama I;NCBI Reference Sequence:NC_002929.2)の２３ＳｒＲＮＡドメインＶ領域の２０３７位と２０３８位である、請求項１に記載の方法。
  4. 　ＤＮＡポリメラーゼがＨｉＤｉ ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）である、請求項１または２に記載の方法。
  5. 　ＰＣＲ増幅において、肺炎マイコプラズマの２３ＳｒＲＮＡ配列の２０６３位および２０６４位のアデニンの変異を検出するためのリバースプライマー：
    ・5’-GTAAAGCTTCACGGGGTCTC -3’に示される配列を3’側に含む２０～３５塩基長のプライマー、
    ・5’-TAAAGCTTCACGGGGTCTTT -3’に示される配列を3’側に含む２０～３５塩基長のプライマー、および
    ・5’-TAAAGCTTCACGGGGTCTTC -3’に示される配列を3’側に含む２０～３５塩基長のプライマー
    を使用する、請求項２または４に記載の方法。
  6. 　リバースプライマーが
    ・5’- GCTACAGTAAAGCTTCACGGGGTCTC-3’（配列番号１）に示される配列からなるプライマー、
    ・5’-TTAAGCTACAGTAAAGCTTCACGGGGTCTTT -3’（配列番号２）に示される配列からなるプライマー、および
    ・5’-TTAAGCTACAGTAAAGCTTCACGGGGTCTTC -3’（配列番号３）に示される配列からなるプライマー
    である、請求項５に記載の方法。
  7. 　ＰＣＲ増幅において、百日咳菌の２３ＳｒＲＮＡ配列の２０３７位と２０３８位のアデニンの変異を検出するためのリバースプライマー：
    ・配列番号５～１１のいずれか１つに示される配列を3’側に含む２０～３５塩基長のプライマー、
    ・配列番号１２～１８のいずれか１つに示される配列を3’側に含む２０～３５塩基長のプライマー、および
    ・配列番号１９～２５のいずれか１つに示される配列を3’側に含む２０～３５塩基長のプライマー
    を使用する、請求項３または４に記載の方法。
  8. 　リバースプライマーが、配列番号５～１１のいずれか１つの塩基配列からなるプライマー、配列番号１２～１８のいずれか１つの塩基配列からなるプライマー、および配列番号１９～２５のいずれか１つの塩基配列からなるプライマーである、請求項７に記載の方法。
  9. 　サーマルサイクラーの条件が（１）９８℃、１分、１サイクル後、（２）９８℃、１０秒、（３）７２℃～５６℃、１５秒、（４）７２℃、３０秒の（２）～（４）からなるサイクルを合計３６サイクル行い、その後（５）７２℃、１分、１サイクルを行うものであって、（３）の工程は常に１５秒で行われるが、１サイクル目の温度は７２℃で開始し、１６サイクル目の５７℃まで毎サイクル１℃下げ、１７サイクル目～３６サイクル目を５６℃で行うものである、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
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