CN105838825A - 检测大肠埃希菌的试剂盒、引物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速检测大肠埃希菌的试剂盒、引物和方法，所述试剂盒包括有序列组成如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的内引物、如SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的外引物、以及如SEQ ID No:5和SEQ ID No:6所示的环引物，以待测样本组织的基因组DNA作为模板，采用上述引物进行实时荧光环介导恒温PCR反应，收集荧光信号，即可快速检测大肠埃希菌。本发明的快速检测大肠埃希菌的方法特异性好，灵敏度高，重复性好，且操作要求低，简单快速，具有较好的发展意义和推广前景。

Description

检测大肠埃希菌的试剂盒、引物和方法
技术领域
本发明属于微生物的检测方法技术领域，更具体地，本发明涉及一种快速检测大肠埃希菌的试剂盒、引物和方法。
背景技术
大肠埃希菌又称大肠杆菌，属于肠杆菌类，是革兰氏阴性短杆菌，在自然界分布广泛，多寄生于人或动物的肠道里，一般为正常菌群。奶酪、肉和牛奶都可能通过圈养的动物和收获的食品而被大肠埃希菌污染。虽然大部分的大肠埃希菌对人体健康无害，但在一定条件下会引起肠道外感染；而且E.coliO157:H7、E.coli O104等血清型菌株致病性强，其产生的毒素可使人致病或致死，进而造成严重损失。
传统检测大肠埃希菌感染一般方法为先进行标本接种、分离菌株进行培养做进一步检测，此方法容易出现假阳性，操作步骤多，且耗时可达一周之长。
随着核酸扩增技术的发展，2000年由日本学者Notomi等首先提出针对靶基因的6个独立区域设计特异引物，在Bst DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的催化下，60～65℃恒温水浴30～60min将原有几个拷贝的靶核酸扩增到109水平的环介导等温扩增技术(Loop‐mediated isothermal amplification，LAMP)。有研究发现，增加设计的两条环引物提升反应速度，可比无环引物时快一倍，其检测灵敏度远高于PCR方法、耗时也大大减少。
目前有多种细菌及病毒均已建立了其LAMP检测的方法，并具有较高的应用价值，用LAMP法检测大肠埃希菌在国内外也早已有人进行了研究，但其应用领域不同，或者采用的是目测荧光显色等方法，对于医学临床应用仍有不足，没有可靠判读方法，容易受污染误检。因此，有必要研究一种能更好满足临床需求，实现检测结果的数据化和自动化，避免了人为判读的误差的检测方法。
发明内容
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种快速检测大肠埃希菌的引物、试剂盒和方法，该检测方法能更好满足临床需求，实现检测结果的数据化和自动化，避免了人为判读的误差，对于解决大肠埃希菌快速诊断的问题具有重大意义。
为了实现以上发明目的，本发明采取了以下技术方案：
一种检测大肠埃希菌的试剂盒，包括有序列组成为SEQ ID No:1和SEQ IDNo:2的内引物，序列组成为SEQ ID No:3和SEQ ID No:4的外引物，序列组成为SEQ ID No:5和SEQ ID No:6的环引物。
在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括有荧光染料I。
本发明还提供了一种检测大肠埃希菌的引物，包括有序列组成为SEQ IDNo:1和SEQ ID No:2的内引物，序列组成为SEQ ID No:3和SEQ ID No:4的外引物，序列组成为SEQ ID No:5和SEQ ID No:6的环引物。
本发明还提供了一种检测大肠埃希菌的方法，采用上述试剂盒，主要包括以下步骤：
1)提取待检测样品的基因组；
2)加样和加荧光染料后构成反应体系，进行环介导恒温扩增；
3)检测扩增产物。
在其中一些实施例中，反应体系中引物SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ IDNo:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5、SEQ ID No:6的浓度比为8:8:1:1:4:4。
在其中一些实施例中，所述SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQID No:4、SEQ ID No:5、SEQ ID No:6在反应体系中的浓度分别为1.6μmol/L、1.6μmol/L、0.2μmol/L、0.2μmol/L、0.8μmol/L、0.8μmol/L。
与现有技术相比，本发明具有以下显著效果：
1、本发明采用特殊的引物对，利用Rea-LAMP法(Real-Time FluorescenceLoop-Mediated Isothermal Amplification)测定大肠埃希菌和11株相关菌株，只有大肠埃希菌出现强阳性，其他均为阴性；利用倍比稀释法测定目的菌株，检测下限达到5×10-6ng/μL，远远高于普通PCR；重复测定3次样本，曲线重合程度高，出峰时间均约为8.5分种，变异系数CV小于5％，说明本发明的Rea-LAMP法测定大肠埃希菌具有较好的特异性、灵敏性、重复性；具有鉴定简单、实时监测等优点，有利于快速检测大肠埃希菌；
2、本发明的Rea-LAMP法在配制反应体系时便加入荧光物质，无需像大多传统的LAMP检测方法那样在反应结束后开盖加入荧光染料，故在整个扩增检测过程中都是闭管工作，可从源头上控制气溶胶污染；同时，由于荧光染料的预先加入，仪器可在预先设置好的每30秒检测一次荧光信号，从而做到实时监测；
3、传统的LAMP检测方法结果判读利用肉眼观察扩增产物的浊度，故存在较大的主观误差，而Rea-LAMP法利用荧光信号检测扩增产物，具有较高的准确性；
4、本发明的Rea-LAMP法使用的恒温荧光检测仪工作原理简单，提供LAMP反应体系需要的温度和人为设置每30秒的对扩增产物进行检测。
附图说明
图1为本发明试验例1中的环引物增强反应速度的验证结果图；
图2为本发明试验例2中的Rea-LAMP方法的引物特异性结果图；
图3为本发明试验例3中的Rea-LAMP方法的引物灵敏度结果图；
图4为本发明试验例4中的Rea-LAMP方法的重复性实验结果图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
以下实施例中所使用的菌株为ATCC标准菌株和广州医科大学附属第三医院检验科微生物室分离、VITEK2全自动微生物鉴定仪鉴定并于-70℃保存菌株。实验用菌株如下：大肠埃希菌ATCC25922、白色念珠菌GYSY14019003、化脓性链球菌GYSY20150321、肺炎克雷伯杆菌GYSY20150322、粪肠球菌GYSY20150323、金黄色葡萄球菌GYSY20150324、无乳链球菌GYSY20150352、热带念珠菌GYSY201503A4、嗜麦芽假单胞菌GYSY20140822、近平滑念珠菌GYSY14019001、马尔尼非青霉菌GYSY14019004、克柔念珠菌GYSY14019002。
以下实施例中所使用的仪器有：加样枪、微型离心机、振荡器、干式恒温金属浴、Thermo Scientific Nanodrop 2000微量分光光度计、超净工作台、迪澳恒温荧光检测仪Deaou-308C、VITEK 2全自动微生物鉴定仪。主要试剂有：血平板、迪澳DNA扩增试剂盒24测试/盒、天根细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)、天根酵母基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)、malB基因引物(由英潍捷基上海贸易有限公司合成)、超纯水等除了特殊说明外，均来源于市售。
实施例中的步骤除了特殊说明外，均为本领域常规操作步骤，以下实施例中所使用的原料，均来源于市售。
实施例1大肠埃希菌的快速检测方法
本实施例的大肠埃希菌的快速检测方法包括以下具体步骤：
(1)、细菌基因组DNA提取
将-70℃保存的大肠埃希菌和其余待测菌株接种于血平板，在37℃温箱培养18～24小时，取平板上的菌混于无菌生理盐水中制成2ml菌悬液，麦氏浊度为3～4。按照天根酵母基因组DNA提取试剂盒和细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作，提取相应细菌的DNA。
(2)、引物设计与合成
根据大肠埃希菌的malB基因序列的6个区域，利用LAMP引物设计软件Primer Explorer version3设计出6条特异性引物。引物序列由英潍捷基上海贸易有限公司合成(见表1)。
表1 Rea-LAMP检测体系引物
(3)、Rea-LAMP反应体系及配制
按照迪澳DNA扩增试剂说明书配制LAMP反应体系，先后加入12.5μL反应液RM(2×)、8μL ddH2O、1μL Bst聚合酶、0.5μL荧光染料Ⅰ、1μL引物工作液和2μL DNA模板(阴性对照时DNA模板用ddH2O代替)，总体积为25μL。并且在加入DNA模板前先加入20μL密封液。反应体系如表2。
表2 Rea-LAMP的反应体系
其中，引物工作液由FIP、BIP、F3、B3、LooF、LooB按照浓度比8:8:1:1:4:4混合配制，使上述引物加入25μL体系后浓度分别达到浓度分别为1.6UM、1.6UM、0.2UM、0.2UM、0.8UM、0.8UM。
(4)、Rea-LAMP反应
反应过程在迪澳恒温荧光检测仪Deaou-308C中进行，反应温度为63℃，反应时间为60～90min。从仪器导出数据后用2010Excel归一化处理数据，使曲线经过4min时的最低点，但不改变曲线形状和趋势，再用GraphPad Prism 5软件制作曲线图。每次试验均设置用ddH2O代替DNA模板的阴性对照。
(5)、反应结果
提取细菌DNA后用Thermo Scientific Nanodrop 2000微量分光光度计监测其浓度，大肠埃希菌、白色念珠菌、化脓性链球菌、肺炎克雷伯杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、热带念珠菌、嗜麦芽假单胞菌、近平滑念珠菌、马尔尼非青霉菌、克柔念珠菌等12种细菌DNA浓度分别为50.0ng/ul、32.3ng/ul、79.1ng/ul、64.5ng/ul、81.1ng/ul、83.0ng/ul、97.6ng/ul、11.3ng/ul、454.6ng/ul、18.4ng/ul、26.0ng/ul、11.4ng/ul。
通过荧光强度及观察曲线形状判断，若荧光强度先增强，然后再进入平台或略下降，扩增曲线呈“S”型曲线延伸变化则判断为阳性结果，否则判断为阴性结果。
试验例1实施例1的Rea-LAMP反应环引物增强反应速度的验证
先根据引物干粉的摩尔总量用ddH2O溶解干粉，配制母液，内引物和环引物的母液浓度为200pmol/μL，外环引物的母液浓度为100pmol/μL。然后配制两种引物工作液，S1是加环引物的工作液，由FIP、BIP、F3、B3、LooF、LooB按照浓度比8:8:1:1:4:4混合配制；S2是不加环引物的工作液，由FIP、BIP、F3、B3、H2O按照浓度比8:8:1:1:8混合配制。把这两种工作液分别加入Rea-LAMP体系，对大肠埃希菌的mal B基因进行扩增，同时分别设置用ddH2O代替DNA模板的阴性对照，设置本阴性对照可排查引物二聚体对基因扩增的影响。观察扩增曲线，比较加、不加环引物对mal B基因扩增的影响。
结果见图1，可观察到加环引物(S1Positive control)的扩增出峰时间约为15min，不加环引物(S2Positive control)的出峰时间约为30min，两个阴性对照(S1Negative control和S2Negative control)均无起峰。由此可以得出结论：加环引物对大肠埃希菌mal B基因的扩增效率比不加环引物对大肠埃希菌mal B基因的扩增效率高一倍，两个阴性对照均无起峰，说明没有出现引物二聚体引起的假阳性扩增，阳性结果可靠。
试验例2实施例1的Rea-LAMP反应的引物特异性
按实施例1的方法提取大肠埃希菌及其他常见病原菌(白色念珠菌、化脓性链球菌、肺炎克雷伯杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、热带念珠菌、嗜麦芽假单胞菌、近平滑念珠菌、马尔尼非青霉菌、克柔念珠菌)的基因组DNA。用实施例1的引物工作液，按照Rea-LAMP的反应条件进行扩增，分析检测信号，评价该引物的特异性。
结果见图2，可以看出，30min内本发明引物只对大肠埃希菌特异性扩增出峰，而对其他常见病原菌(白色念珠菌、化脓性链球菌、肺炎克雷伯杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、热带念珠菌、嗜麦芽假单胞菌、近平滑念珠菌、马尔尼非青霉菌、克柔念珠菌)无特异性扩增出峰。在约50min后对金黄色葡萄球菌开始出现非特异性扩增起峰，说明该引物特异性有缺陷，延长扩增时间可能会有非特异性反应，使得检测结果出现假阳性，因此需要结合起峰时间进行判断结果，减少假阳性。
试验例3实施例1的Rea-LAMP反应的引物灵敏性
用天根细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取大肠埃希菌基因组DNA，再用Thermo Scientific Nanodrop 2000微量分光光度计测量DNA模板浓度。取5μL DNA原液用ddH2O进行10倍梯度稀释8次，得到9个不同浓度的DNA模板，加入Rea-LAMP体系中反应，观察扩增曲线，检测本发明的引物对大肠埃希菌的检测灵敏度。
用微量分光光度计测得所提取大肠埃希菌DNA模板浓度为50ng/μL，10倍稀释8次得到8个不同浓度的DNA模板，浓度依次为50×10-1ng/μL、50×10-2ng/μL、50×10-3ng/μL、50×10-4ng/μL、50×10-5ng/μL、50×10-6ng/μL、50×10-7ng/μL、50×10-8ng/μL。50×100ng/μL为原始DNA模板浓度。从图3可看出，DNA模板浓度大于或等于50×10-6ng/μL时，Rea-LAMP体系扩增出峰时间均在30min前，出峰时间大致相近。DNA模板浓度等于50×10-7ng/μL时，扩增出峰时间约为70min，相比高浓度模板扩增出峰时间慢40min。DNA模板浓度等于50×10-7ng/μL时未出现扩增起峰。阴性对照未出现阳性扩增曲线。说明本发明检测大肠埃希菌DNA的灵敏度可达到5×10-6ng/μL，但浓度为5×10-6ng/μL时扩增起峰的时间大大增长，容易错检。浓度为5×10-5ng/μL及以上时均可在30min内形成有峰的曲线，扩增效果好。
试验例4实施例1的Rea-LAMP反应的重复性实验
用本发明的引物工作液的Rea-LAMP体系对阳性菌株进行3次重复试验，重复性试验所用DNA模板为同一模板，观察分析扩增曲线，验证所建立的Rea-LAMP体系和引物的稳定性。
结果见图4，可以看出，3次重复试验几乎同时出峰，曲线相互吻合程度高，说明此Rea-LAMP体系检测大肠埃希菌的重复性好。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种检测大肠埃希菌的试剂盒，其特征在于，包括有序列组成为SEQ IDNo:1和SEQ ID No:2的内引物，序列组成为SEQ ID No:3和SEQ ID No:4的外引物，序列组成为SEQ ID No:5和SEQ ID No:6的环引物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括有荧光染料I。
3.一种检测大肠埃希菌的引物，其特征在于，包括有序列组成为SEQ IDNo:1和SEQ ID No:2的内引物，序列组成为SEQ ID No:3和SEQ ID No:4的外引物，序列组成为SEQ ID No:5和SEQ ID No:6的环引物。
4.一种检测大肠埃希菌的方法，其特征在于，采用权利要求1-2任一项所述的试剂盒，主要包括以下步骤：
1)提取待检测样品的基因组；
2)加样和加荧光染料后构成反应体系，进行环介导恒温扩增；
3)检测扩增产物。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述反应体系中SEQ IDNo:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5、SEQ ID No:6的浓度比为8:8:1:1:4:4。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述SEQ ID No:1、SEQID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5、SEQ ID No:6在反应体系中的浓度分别为1.6μmol/L、1.6μmol/L、0.2μmol/L、0.2μmol/L、0.8μmol/L、0.8μmol/L。
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