CN100404689C - 柑桔溃疡病菌实时荧光pcr检测引物、探针、固相化试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于柑桔溃疡病菌检测的寡核苷酸引物、柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测探针、固相化试剂盒及其检测方法，它是专门针对柑桔溃疡病而建立的一种快速检测方法，从制样到检出时间仅需3小时，而且监测灵敏度高、特异性强、稳定可靠。该方法不仅克服了现有的依据症状学的常规诊断方法时有误判、电镜观察法因菌体分布不均容易漏诊、单克隆抗体法因抗体制备难度大，且有非特异反应等不足；而且可以避免常规PCR的假阴性和假阳性。固相化试剂盒操作方便，使用简单；检测方法灵敏度高、特异性强、稳定可靠；适合于进出口柑桔鲜果的口岸检疫；柑桔种苗、接穗等无症带菌材料的调运检疫检验以及非疫区柑桔溃疡病的早期预警监测。
Description
技术领域
本发明涉及重大疫害生物柑桔溃疡病病原细菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri)的实时荧光PCR固相化试剂盒及其检疫检验技术；适合于口岸检疫、农业生产、植物保护等部门使用。属于生物工程技术领域。
技术背景
柑桔溃疡病是影响全球柑桔产业发展的重大细菌性病害，也是国内外重点检疫性病害。柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri)是国内外重要的检疫性有害生物；它为害数十种芸香科植物，包括柑桔属中的绝大多数商品化栽培品种，主要侵害柑桔的地上部分(叶片、枝条、皮刺、树干和果实)，虽然很少会直接杀死树木，但会导致落叶、落果、树势衰弱和果实溃疡性病斑。
病害主要通过带菌种苗、接穗、果实等柑桔材料的调运进行远距离传播；田间病害主要靠病菌随风夹雨扩散。带菌衣物、包装箱及采收工具也具一定的传播可能性。据报导，美国科学家已证实，通过车辆等农用运输工具能够传播溃疡病菌，不寻常的暴风雨如热带风暴等也可引起病害的远距离传播。
对于柑橘溃疡病菌的检验法有典型症状目测法、组织病理切片法、组织分离培养、致病性测定法等常规检测方法。其优点在于直观、简便易行。其中致病性测定法还可以测定活的病菌，因而可以真实地反映检疫性有害生物传播扩散的危险性。对于新发病点的确定，最终也需要通过致病性测定验证。但常规法的缺点在于检测周期长，经验不足者误判率高，不能对柑桔无症材料进行检测，难以满足植物检疫“快速、准确、经济”的基本要求。此外对柑橘溃疡病的检测还有噬菌体检验法、酶联免疫吸附法、斑点免疫吸附法等，存在过程复杂、灵敏度低、检测成本高、周期较长等问题。
继常规PCR检测技术之后，新兴的实时荧光定量PCR技术凭借其对初始模板量准确定量、灵敏度高、特异性强、闭管操作、简便迅速等优点，已经成为国内外分子生物学研究中的主流技术，它同样也在植物病原体的检测和诊断中逐渐得到了广泛的使用。近年来国内外陆续开始将实时荧光PCR应用于植物病害诊断检测。
实时定量荧光PCR是利用荧光信号伴随着PCR产物的增加而增强的原理，在PCR扩增过程中，连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。根据荧光信号基线的平均值和平均标准差，在99.7％的置信度时计算出大于平均值的荧光值即阈值，然后收集荧光信号增强到预定阈值时的PCR循环次数(即Ct值)。该参数和PCR反应体系中起始DNA模板量的对数值之间有严格的线性关系。利用阳性梯度稀释标准品的Ct值绘制成标准曲线，再根据检测样品的Ct值就可以准确地测定靶标病原菌的起始模板拷贝数。
实时荧光PCR根据其产生荧光的原理分为使用探针和不使用探针的两类方法。如特异性强的荧光标记探针法，可以有效避免常规PCR的假阳性问题；高灵敏度的SYBRGreen I荧光染料法可以通过熔解曲线分析验证特异性，即通过观察样品和各个对照品的熔解曲线峰值的分布情况来判断扩增曲线中荧光信号的增长是否是由靶序列的扩增引起的。
实时荧光PCR检测方法用于植物病原细菌的检测，无论在国内外都还是刚刚起步，目前尚无柑桔溃疡病菌的实时荧光PCR检测试剂盒问世，而且现有的试剂盒都必须低温保存和寄送；反应试剂需要自行配制；本专利在精心优化和反复测试的基础上，研制出的可以常温储运的预混冻干固相化试剂盒，具有开启即用，标准统一、简单方便等优点。可以满足口岸调运、农业生产、植保植检部门的科研与检验检疫的快速、准确、安全的基本要求。
发明内容
本发明旨在克服上述现有技术的不足，提出快速、可靠、灵敏度高、特异性强的柑桔溃疡病菌的引物、探针、固相化试剂盒及实时荧光PCR检测方法。
实现上述目的的技术方案：
用于柑桔溃疡病菌检测的寡核苷酸引物，包括：
寡核苷酸引物对：5’-CGG CAG ATT GGA AGT CA-3’
5’-TCC AGC ACA TAC GGG TC-3’(序列号：NO.1)；
寡核苷酸引物对：5’-GTT CGG CGT CAA CAA C-3’
5’-CGG TAG GCG ACT CAT TT-3’(序列号：NO.2)；
寡核苷酸引物对：5’-GAG TCG CCT ACC GAG AAA TCC-3’
5’-ACC ACG GCA GGG TGA AGA C-3’(序列号：NO.3)；
寡核苷酸引物对：5’-CGT CAA CAA CCT GGA GAG CA-3’
5’-GGT AGG CGA CTC ATT TCC CA-3’(序列号：NO.4)。
本发明提供的一种用于柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测的寡核苷酸探针，其特异性探针序列是在5’-CCA GAC AGT GTC TCG GAA ATT CGA CCT CTC CGA AC-3’两端向上游或下游位移3-6个碱基的区域内形成的核苷酸序列(探针编号：NO.1)。其优化的探针序列是5’-AGT GTC TCG GAA ATT CGA CCT CTC CGA AC-3’。
本发明提供的另一种用于柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测的寡核苷酸探针，其特异性探针序列是在5’-AGC ATG CGA CGT TTC TAC CTC TCA TAC TCC CAG CC-3’两端向上游或下游位移3-6个碱基的区域内形成的核苷酸序列(探针编号：NO.4)；其优化的探针序列是5’-CGA CGT TTC TAC CTC TCA TAC TCC CAG CC-3’。
用于柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测的荧光标记寡核苷酸探针，荧光报告基团FAM标记在5’端，而荧光淬灭基团TAMRA标记在3’端。在3’端荧光淬灭基团可以用自身不发光的Eclipse所代替。
用于柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测的试剂盒，包括样品提取试剂、核酸扩增固相化试剂、无害化定量标准品、健康植株阴性对照。其中使用SYBR Green I实时荧光PCR检测方法的试剂盒所使用的引物为NO.1或NO.2寡核苷酸引物对，而使用荧光标记探针实时荧光PCR检测方法的试剂盒所使用的引物为NO.3和NO.4寡核苷酸引物对，所使用的探针序列是在5’-CCA GAC AGT GTC TCG GAA ATT CGA CCT CTC CGA AC-3’两端向上游或下游位移3-6个碱基的区域内形成的核苷酸序列或者探针序列是在5’-AGC ATG CGA CGT TTC TAC CTC TCA TAC TCC CAG CC-3’两端向上游或下游位移3-6个碱基的区域内形成的核苷酸序列的荧光标记探针。
柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测体系构建，包括以下步骤：(1)先对柑桔溃疡病菌及其近似种或相关种进行序列比较分析，找出柑桔溃疡病菌不同于其它近似种或相关种的特有的碱基序列；(2)按照SYBR Green荧光染料法和荧光标记探针法中引物和探针的设计原理和设计方法，根据病菌的特异性核酸片段，设计柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测的引物和探针；(3)对所设计的引物和探针进行筛选及反应体系和反应条件的优化，筛选出特异性引物和探针，并优化出合适的反应体系和反应条件。(4)加入权利要求1中的引物和权利要求2或4中所述的探针(SYBR Green仅需要加入引物和荧光染料即可)。(5)加入无害化阳性标准品。进行柑桔溃疡病菌实时荧光PCR反应。(6)进行实时荧光PCR反应之前，先使用试剂盒中提供的样品提取试剂从柑桔组织表面浸泡过滤富积的样品，之后再将其作为模板进入步骤(4)。
柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)先对柑桔溃疡病菌及其近似种或相关种进行序列比较分析，找出柑桔溃疡病菌不同于其它相关种的特有的碱基序列；
(2)根据SYBR Green荧光染料法和荧光标记探针法中引物和探针的设计原理和设计方法，设计柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测的引物和探针；
(3)对所设计的探针进行筛选及反应体系和反应条件的优化，筛选出优化的特异性探针，并优化出合适的反应体系和反应条件。
(4)加入权利要求1中的引物和权利要求2或4中所述的探针(SYBR Green仅需要加入引物和荧光染料即可)进行柑桔溃疡病菌实时荧光PCR反应。
进入步骤(4)进行实时荧光PCR反应之前，先使用试剂盒中提供的样品制备试剂从植物样品中浸泡过滤富集样品携带的柑橘溃疡病菌，之后再作为模板进入步骤(4)。
采用上述技术方案，本发明突出的技术进步在于：
1、本发明利用柑桔溃疡病菌已知全基因组中的保守基因序列设计适合于病原菌实时荧光PCR快速检测的引物对和荧光探针，特异性强。
2、本发明可以对柑桔溃疡病菌直接进行实时荧光PCR检测，灵敏度高、可以检测无症带菌样品。
3、本发明采用滤膜富集过滤制样技术，排除了样品PCR抑制因子的影响，缩短了制样时间，检测全过程只需要3小时，有效地避免了常规PCR检测的假阴性问题。
4、根据病原菌特异性DNA序列片断，研制出无害化重组子阳性对照，避免了活体阳性对照可能造成的疫情扩散和污染。
5、可以常温储运的预混冻干固相化试剂盒，具有开启即用，标准统一、简单方便等优点。
综上所述，采用本发明，能满足大宗带菌柑桔鲜果和种苗接穗等繁殖材料出入境检疫检验，非疫区果园HLB早期预警监测以及不同柑桔溃疡病菌的分子鉴别等需求，其意义十分重大。
具体实施方式
实施例一：
一种用于柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri)SYBR Green I实时荧光PCR检测的引物序列及试剂盒，用于柑桔溃疡病菌的特异性检测，其组成为：样品提取试剂：TES缓冲液100mL；70％乙醇100mL；核酸洗脱液10mL。核酸扩增固相化试剂：是利用大分子稳定剂经真空冷冻干燥制备而成的可以常温贮运的PCR扩增固相化混合物冻干胶珠，其成分中含有如下试剂：
组分 终浓度
PCR缓冲液 1X；
MgCl2 23mmol/L；
dNTPs 0.2mmol/L；
引物对 各0.5umol/Lol/L；
Taq聚合酶 1Unit/25uL；
生物大分子稳定剂 加至23uL/管；
SYBR Green I荧光染料 10umol/Lol/L；
所使用的引物对：5’-CGG CAG ATT GGA AGT CA-3’
5’-TCC AGC ACA TAC GGG TC-3’(序列号：NO.1)。
无害化定量标准品：基于柑桔溃疡病菌特有核酸序列设计的无害化重组阳性对照；其中柑桔溃疡病菌重组子阳性对照冻干品，健康柑桔植株阴性对照冻干品.
检测用品：自封式塑料袋；过滤用具(包括复合滤膜的过滤器)；1.5ml塑料微量离心管。
实施例二：
一种用于柑桔溃疡病(Xanthomonas axonopodis pv.citri)SYBR Green I实时荧光PCR检测的引物序列及固相化试剂盒，用于柑桔溃疡病菌亚洲菌系的特异性检测，其组成包括：样品提取试剂；核酸扩增的固相化试剂；无害化定量标准品：柑桔溃疡病菌重组子阳性对照冻干品，柑桔健康植株DNA冻干品。
其中引物序列为：5’-GTT CGG CGT CAA CAA C-3’
5’-CGG TAG GCG ACT CAT TT-3’(序列号：NO.2)。
所述样品提取试剂、核酸扩增的固相化试剂、无害化定量标准品以及检测用品与实施例一相同。
实施例三：
一种用于柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri)荧光标记探针PCR检测的引物、探针序列及固相化试剂盒，用于柑桔溃疡病菌的快速检测，其组成包括：样品提取试剂：TES缓冲液100mL；70％乙醇100mL；核酸洗脱液10mL。核酸扩增固相化试剂：是利用大分子稳定剂经真空冷冻干燥制备而成的可以常温贮运的PCR扩增固相化混合物冻干胶珠，其成分中含有如下试剂：
组分 终浓度
PCR缓冲液 1X；
MgCl2 23mmol/L；
dNTPs 0.2mmol/L；
引物对 各0.5umol/Lol/L；
探针 0.2umol/Lol/L；
Taq聚合酶 1Unit/25uL；
生物大分子稳定剂 加至23uL；
所使用的引物对为：5’-GAG TCG CCT ACC GAG AAA TCC-3’
5’-ACC ACG GCA GGG TGA AGA C-3’(序列号：NO.3)；
所使用的荧光标记探针序列为：5’-AGT GTC TCG GAA ATT CGA CCT CTC CGAAC-3’(探针编号：NO.3)。
无害化定量标准品：基于柑桔溃疡病菌特有核酸序列设计的无害化重组阳性对照；其中柑桔溃疡病菌重组子阳性对照冻干品，健康柑桔植株阴性对照冻干品。
检测用品：自封式塑料袋；过滤用具(包括复合滤膜的过滤器)；1.5ml塑料微量离心管。
实施例四：
一种用于柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri)荧光标记探针实时荧光PCR检测的引物、探针序列及固相化试剂盒，用于柑桔溃疡病菌的特异性检测，其组成包括：
样品提取试剂、核酸扩增固相化试剂、无害化定量标准品：柑桔溃疡病菌重组子阳性对照冻干品、健康柑桔植株阴性对照冻干品。
其中引物序列为：5’-CGT CAA CAA CCT GGA GAG CA-3’
5’-GGT AGG CGA CTC ATT TCC CA-3’(序列号：NO.4)。
荧光标记探针序列为：5’-CGA CGT TTC TAC CTC TCA TAC TCC CAG CC-3’(探针编号：NO.6)。
所述样品提取试剂、核酸扩增的固相化试剂、无害化定量标准品以及检测用品与实施例三相同。
样品预处理步骤为：
①清理工作台：用医用酒精擦工作台和手以达到灭菌的效果；
②随机的选取柑桔叶片，加入无菌水10ml塑料袋中，浸泡15分钟，然后装入50mL离心管；8000xg离心后用滤膜过滤；
③从滤膜上洗下菌体，将滤膜浸入100uL洗脱液，剧烈振荡，洗脱的菌液即为后续PCR待测模板。
核酸检测步骤为：
①将实时荧光PCR仪开机设置备用。
②向装有固相化冻干PCR反应混合试剂的八联管中加入23uL恢复液。
③加入2uL待测样品液或待测模板，将试剂盒提供的健康柑桔植株阴性对照加入阴性对照管中，阳性对照管视情况加入无害化阳性对照标准品(一般检测)或者标准品的10x梯度稀释液(定量检测)，对照样品的用量均为每管2uL。
④混合均匀之后即可直接进行PCR反应；SYBR Greeno I染料法须在PCR反应之后做熔解曲线分析，以验证检测的特异性。
⑤待PCR扩增完成、依据扩增数据，分析检测结果。
检测反应的体系中各组分分别为：
(1)SYBR Green I荧光染料法固相化实时荧光PCR体系为实时荧光混合液15uL(含1x PCR缓冲液、3mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTPs、1Unit Taq酶、0.5umol/Lol/L引物对各一和荧光染料10umol/Lol/L)，加大分子稳定剂至23uL，混匀，在-40℃冰箱速冻30分钟，置于真空冷冻干燥装置内冻干至透明胶状物。密封包装常温下保存。使用前加入23ul恢复液，与2uL待测样品混合均匀后，进行PCR扩增。
(2)荧光标记探针法固相化实时荧光PCR体系为核酸扩增混合液15uL(含1x PCR缓冲液、3mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTPs、1Unit Taq酶、0.5umol/Lol/L引物对各一和0.2mmol/L探针)，加入大分子稳定剂至23uL，混匀预冻，置于真空冷冻干燥装置内冻干至透明胶状物。密封包装常温下保存。使用前加入23ul恢复液，与2uL待测样品混合均匀后，按照要求设置对照样品管，进行PCR扩增。
检测反应条件为：
(1)SYBR Green I荧光染料法：95℃，1min；然后40个循环，每个循环为95℃，15s，59℃，15s，72℃，45s，在每个循环的延伸阶段(72℃)收集荧光；最后72℃，7min。做熔解曲线的反应条件为：95℃，1min；55℃，1min；从55℃开始每升高0.5℃保持10s，连续升高80次(到95℃为止)。
(2)荧光标记探针法：95℃，1min；然后40个循环，每个循环为95℃，5s，59℃，30s，在每个循环的退火/延伸阶段(59℃)收集荧光。
结果判定标准是：
(1)使用荧光标记探针法的反应
若定量PCR仪检测到以柑桔溃疡病菌特异性片段重组子为模板的阳性对照报告荧光有明显信号增长；阴性对照和空白对照的报告荧光没有荧光信号增长，而样品的检测结果是报告荧光信号有明显增长，则表示所检测的样品中含有柑桔溃疡病菌；若定量PCR仪检测到以柑桔溃疡病菌特异性片段重组子为模板的阳性对照报告荧光有明显信号增长，阴性对照和空白对照的报告荧光没有荧光信号增长，而样品的检测结果是报告荧光信号没有明显增长，则表示所检测的样品中不含有柑桔溃疡病菌。
(2)使用SYBR Green I荧光染料法的反应
若出现以下两种情况之一则表示所检测的样品中含有柑桔溃疡病菌：
①定量PCR仪检测到以柑桔溃疡病菌特异性片段重组子为模板的阳性对照报告荧光有明显信号增长，阴性对照和空白对照的报告荧光没有荧光信号增长，而样品的检测结果是报告荧光信号有明显增长，并且在随后进行的熔解曲线分析中，样品具有和阳性对照一样的主峰；
②阳性对照报告荧光有明显信号增长，阴性对照和空白对照的报告荧光有轻微的荧光信号增长，而样品的检测结果是报告荧光信号有明显增长，并且在随后进行的熔解曲线分析中，样品具有一个和阳性对照相同的主峰以及一个与阴性对照相同的侧峰；
若出现以下两种情况之一则表示所检测的样品中不含有柑桔溃疡病菌：
①定量PCR仪检测到以柑桔溃疡病菌特异性片段重组子为模板的阳性对照报告荧光有明显信号增长，阴性对照和空白对照的报告荧光没有荧光信号增长，而样品的检测结果是报告荧光信号没有增长；
②阳性对照报告荧光有明显信号增长，阴性对照和空白对照的报告荧光有轻微的荧光信号增长，而样品的检测结果是报告荧光信号也有轻微增长，并且在随后进行的熔解曲线分析中，样品具有一个与阴性对照相同的侧峰。
用于柑桔溃疡病菌检测的寡核苷酸引物与探针包括：
寡核苷酸引物对序列号：NO.1：
5’-CGG CAG ATT GGA AGT CA-3’
5’-TCC AGC ACA TAC GGG TC-3’
寡核苷酸引物对序列号：NO.2：
5’-GTT CGG CGT CAA CAA C-3’
5’-CGG TAG GCG ACT CAT TT-3
寡核苷酸引物对序列号：NO.3：
5’-GAG TCG CCT ACC GAG AAA TCC-3’
5’-ACC ACG GCA GGG TGA AGA C-3’
寡核苷酸引物对序列号：NO.4：
5’-CGT CAA CAA CCT GGA GAG CA-3’
5’-GGT AGG CGA CTC ATT TCC CA-3’
最长的探针序列编号NO.1：
5’-CCA GAC AGT GTC TCG GAA ATT CGA CCT CTC CG-3
最短的探针序列编号NO.2：
5’-CCA GAC AGT GTC TCG GAA ATT CGA CCT-3’
优化的探针序列编号NO.3：
5’-AGT GTC TCG GAA ATT CGA CCT CTC CGA AC-3’
最长的探针序列编号NO.4：
5’-AGC ATG CGA CGT TTC TAC CTC TCA TAC TCC CA-3’
最短探针序列编号NO.5：
5’-GTT TCT ACC TCT CAT ACT CCC AGC CC-3’，
优化的探针序列编号NO.6
5’-CGA CGT TTC TAC CTC TCA TAC TCC CAG CC-3’
序列表
<110>重庆大学
重庆大学生物技术发展有限公司
四川渝高科技有限责任公司
<120>柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测引物、探针、固相化试剂盒及其检测方法
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Claims (3)
1.一种用于柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测的寡核苷酸引物，其特征在于，所述引物为：5’-GAG TCG CCT ACC GAG AAA TCC-3’
5’-ACC ACG GCA GGG TGA AGA C-3’。
2.一种用于柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测的寡核苷酸探针，其特征是，优化的探针序列是5’-AGT GTC TCG GAA ATT CGA CCT CTC CGAAC-3’。
3.根据权利要求2所述用于柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测的荧光标记寡核苷酸探针，其特征在于：荧光报告基团标记在5’端，而荧光淬灭基团标记在3’端。
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