CN101260399B - 抗柑橘溃疡病pthA-nls基因及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
抗柑橘溃疡病pthA-nls基因及其构建方法与应用。本发明利用柑橘溃疡病的致病基因pthA介导广谱抗性原理，构建了抗柑橘溃疡病的新基因pthA-nls。其构建方法包括以下步骤：(1)引物设计；(2)NLS序列的克隆；(3)PCR产物回收及酶切；(4)植物表达载体双酶切；(5)将pBI121酶切产物用T4DNA连接酶与相应的NLS序列的PCR酶切产物连接；(6)将连接产物转化大肠杆菌DH5α，获得阳性克隆基因pthA-nls。基因pthA-nls可进一步对柑橘的感病品种进行遗传转化，获得抗柑橘溃疡病的新种质。本发明之抗柑橘溃疡病pthA-nls基因为柑橘抗溃疡病育种提供了有效工具。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗柑橘溃疡病基因及其构建方法，尤其是涉及一种利用柑橘溃疡病的致病基因pthA构建的抗柑橘溃疡病基因及其构建方法。
背景技术
柑橘溃疡病(citrus bacterial canker disease)是由地毯黄单孢杆菌柑橘致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.citri)引起的一种细菌性病害。对柑橘苗木、产量及果品品质影响极大，严重危害着柑橘产业的健康发展。到目前为止，还没有能根除柑橘溃疡病菌的特效方法，柑橘品种资源中亦未发现完全抗病的品种，柑橘抗溃疡病育种多年，没有取得实质性进展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗柑橘溃疡病基因及其构建方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的。
研究表明，病原基因pthA是柑橘溃疡病亚洲型(A型)致病所必需的因子，pthA表现出致病性和无毒性双重功能，即在非寄主上引起超敏反应，在寄主上引起溃疡状症状。
本发明者利用柑橘溃疡病的致病基因pthA介导广谱抗性原理，构建了抗柑橘溃疡病的新基因pthA-nls，所述抗柑橘溃疡病基因pthA-nls具有本说明书第5-10页记载的序列表所示的序列。
其构建方法包括以下步骤：(1)引物设计，根据基因银行登记序列号为U28802的pthA基因序列设计溃疡病核定位信号的特异性引物：
| 引物名称 | 序列 | 引入酶切位点 | |
| 上游引物下游引物 | p1p2p3p4 | 5′-gactctagagttgcccagttatctcgccctga-3′5′-gaggatccgttgcccagttatctcgccctga-3′5′-gcctcgagcaaccatgcgagctcctcttcgttga-3′5′-cccggggcctcgagcaaccatgcgagctcctcttcgt-3′ | XbaIBamHISacISmaI |
引物可从上海生工生物工程技术公司购得；(2)NLS序列的克隆，以P1/P3、P1/P4、P2/P3或P2/P4为引物，以从湖南省柑橘溃疡病疫区分离的柑橘溃疡病菌为模板，利用公知的PCR方法扩增出NLS序列，PCR反应条件为：94℃4min；94℃30sec、58℃30sec、72℃1.5min，35个循环，最后72℃延伸10min；PCR试剂购自MBI公司；(3)PCR产物回收及酶切，PCR产物用1％～1.5％琼脂糖凝胶电泳后用Qiaquick Gel Extraction Ket DNA凝胶回收试剂盒(可从Qiagen公司购得)回收纯化，操作方法同说明书，纯化产物用15～25μl无菌水溶解；回收片段用XbaI和SacI双酶切，其中引物P1/P4扩增产物采用XbaI和SmaI双酶切；引物P2/P3扩增产物采用BamHI和SacI双酶切；引物P2/P4扩增产物采用BamHI和SacI双酶切；酶切反应体系为20μl：纯化产物15μl、两种酶各1.5μl、10×Buffer 2μl(Buffer为MBI公司配套提供)；酶切条件为37℃ 5～10h；酶切产物用1％～1.5％琼脂糖凝胶电泳后用Qiaquick Gel Extraction Ket DNA凝胶回收试剂盒(可从Qiagen公司购得)回收纯化，操作方法同试剂盒说明书；内切酶BamHI、SacI、SmaI、XbaI购自MBI公司；(4)植物表达载体双酶切，将pBI121(基因银行登记序列号：AF485783；可从北京博大泰克生物基因技术有限公司购得，全序列见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，质粒图谱见图1)质粒用XbaI和SacI双酶切(如连接扩增P1/P4产物则用XbaI和SmaI；连接P2/P3扩增产物用BamHI和SacI；连接P2/P4扩增产物用BamHI和SacI)；酶切反应体系和条件同步骤(3)；酶切产物用1％～1.5％琼脂糖凝胶电泳后用Qiaquick Gel Extraction Ket DNA凝胶回收试剂盒(可从Qiagen公司购得)回收纯化，操作方法同试剂盒说明书；(5)连接，将pBI121酶切产物用T4 DNA连接酶(购自MBI公司)与相应的NLS序列的PCR酶切产物连接，连接反应体系为10μl：pBI121酶切产物4μl、NLS序列PCR酶切产物4μl、T4 DNA连接酶1μl、10×Buffer(MBI公司配套提供)1μl；16℃反应15～20h；(6)克隆，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，克隆操作方法见《分子克隆实验指南》(金冬雁等译，科学出版社，1996)。获得的阳性克隆基因即为本发明的新基因，命名为pthA-nls，其碱基对序列见本说明书第5-10页记载的序列表，pthA-nls质粒图谱见图2。
本发明将病原基因的NLS序列克隆到植物表达载体的XbaI和SacI位点(或BamHI/SacI或BamHI/SacI位点)，构建了新基因pthA-nls。新基因pthA-nls可进一步对柑橘的感病品种进行遗传转化，通过对转基因植株的筛选，可以获得抗柑橘溃疡病的新种质。
本发明为柑橘抗溃疡病育种提供了有效工具。
附图说明
图1为植物表达载体pBI121质粒图谱；
图2为pthA-nls质粒图谱。
具体实施方式
下面结合优选实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
(1)以从湖南省衡阳市南岳区柑橘溃疡病疫区分离的柑橘溃疡病菌为模板，以P1/P3为模板，利用PCR方法扩增出NLS序列，PCR反应条件为：94℃4min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1.5min，35个循环，最后72℃延伸10min；(2)PCR产物用1％～1.5％琼脂糖凝胶电泳后用Qiaquick Gel Extraction Ket DNA凝胶回收试剂盒(购自Qiagen公司)回收纯化，纯化产物用15～25μl无菌水溶解；回收片段用XbaI和SacI双酶切；酶切反应体系为20μl：纯化产物15μl、两种酶各1.5μl、10×Buffer 2μl；(3)植物表达载体pBI121双酶切，将pBI121质粒用XbaI和SacI双酶切反应体系和条件同步骤(2)，酶切产物用1％～1.5％琼脂糖凝胶电泳后用Qiaquick Gel Extraction Ket DNA凝胶回收试剂盒(购自Qiagen公司)回收纯化，操作方法同试剂盒说明书；(4)将pBI121酶切产物用T4 DNA连接酶与相应的NLS序列的PCR酶切产物连接，连接反应体系为10μl：pBI121酶切产物4μl、NLS序列PCR酶切产物4μl、T4 DNA连接酶lμl、10×Buffer 1μl；16℃反应15～20h；(5)将连接产物转化大肠杆菌DH5α，获得的阳性克隆基因即为本发明的新基因，命名为pthA-nls。
将pthA-nls基因通过公知的农杆菌介导法导入到柑橘感病品种甜橙中，转基因植株经离体接种柑橘溃疡病菌表现出很强的抗性。
实施例2
以从湖南省衡阳市南岳区柑橘溃疡病疫区分离的柑橘溃疡病菌为模板，以P1/P4为模板，利用PCR方法扩增出NLS序列，PCR产物用1％～1.5％琼脂糖凝胶电泳后回收纯化，纯化产物用15～25μl无菌水溶解；回收片断用XbaI和SmaI双酶切；酶切反应体系为20μl：纯化产物15μl、两种酶各1.5μl、10×Buffer 2μl；将pBI121质粒用XbaI和SmaI双酶切。酶切产物用1％～1.5％琼脂糖凝胶电泳后回收纯化。将pBI121酶切产物与NLS序列的PCR酶切产物用T4 DNA连接酶连接，连接反应体系为10μl：pBI121酶切产物4μl、NLS序列PCR酶切产物4μl、T4 DNA连接酶1μl、10×Buffer 1μl。16℃反应15～20h。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，获得的阳性克隆基因即为本发明的新基因，命名为pthA-nls。
将pthA-nls基因通过公知的农杆菌介导法导入到柑橘感病品种甜橙中，转基因植株经离体接种柑橘溃疡病菌表现出很强的抗性。
实施例3
以从湖南省衡阳市南岳区柑橘溃疡病疫区分离的柑橘溃疡病菌为模板，以P2/P3为模板，利用PCR方法扩增出NLS序列，PCR产物用1％～1.5％琼脂糖凝胶电泳后回收纯化，纯化产物用15～25μl无菌水溶解；回收片段用BamHI和SacI双酶切；酶切反应体系为20μl：纯化产物15μl、两种酶各1.5μl、10×Buffer 2μl；将pBI121质粒用BamHI和SacI双酶切。酶切产物用1％～1.5％琼脂糖凝胶电泳后回收纯化；将pBI121酶切产物与NLS序列的PCR酶切产物用T4 DNA连接酶连接，连接反应体系为10μl：pBI121酶切产物4μl、NLS序列PCR酶切产物4μl、T4 DNA连接酶1μl、10×Buffer 1μl。16℃反应15～20h；将连接产物转化大肠杆菌DH5α，获得的阳性克隆基因即为本发明的新基因，命名为pthA-nls。
将pthA-nls基因通过公知的农杆菌介导法导入到柑橘感病品种甜橙中，转基因植株经离体接种柑橘溃疡病菌表现出很强的抗性。
序列表
Claims (3)
1.一种抗柑橘溃疡病pthA-nls基因，其特征在于，由如下序列构成：
gccttggcct gcctcggcgg acgtcctgcg ctggatgcag tgaaaaaggg attgccgcac
gcgccggcct tgatcaaaag aaccaatcgc cgtattcccg aacgcacatc ccatcgcgtt
gccgaccacg cgcaagtggt tcgcgtgctg ggttttttcc agtgccactc ccacccagcg
caagcatttg atgacgccat gacgcagttc gggatgagca ggcacgggtt gttacagctc
tttcgcagag tgggcgtcac cgaactcgaa gcccgcagtg gaacgctccc cccagcctcg
cagcgttggg accgtatcct ccaggcatca gggatgAAAA GGGCCAAACC Gtcccctact
tcaactcaaa cgccggacca ggcgtctttg catgcattcg ccgattcgct ggagcgtgac
cttgatgcgc ccagcccaac gcacgaggga gatcagaggc gggcaagcag cCGTAAACG
GTCCCGATcgg atcgtgctgt caccggtccc tccgcacagc aatcgttcga ggtgcgcgt
tcccgaacagc gcgatgcgct gcatttgccc ctcagttggA GGGTAAAACG CCCGCGTac
cagtatcgggg gcggcctccc ggatcctggt acgcccacgg ctgccgacct ggcagcgtc
cagcaccgtga tgcgggaaca agatgaggac cccttcgcag gggcagcgga tgatttccc
ggcattc
2.一种构建包含如权利要求1所述pthA-nls基因的载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)引物设计，根据基因银行登记序列号为U28802的pthA基因序列设计溃疡病核定位信号的特异性引物：
；(2)NLS序列的克隆，以P1/P3、P1/P4、P2/P3或P2/P4为引物，以从湖南省柑橘溃疡病疫区分离的柑橘溃疡病菌为模板，利用公知的PCR方法扩增出NLS序列，PCR反应条件为：94℃4min；94℃30sec、58℃30sec、72℃1.5min，35个循环，最后72℃延伸10min；(3)PCR产物回收及酶切，PCR产物用1％～1.5％琼脂糖凝胶电泳后用Qiaquick Gel Extraction KetDNA凝胶回收试剂盒回收纯化，纯化产物用15～25μl无菌水溶解；回收片段用Xba I和Sac I双酶切，其中引物P1/P4扩增产物采用Xba I和Sma I双酶切；引物P2/P3扩增产物采用BamHI和Sac I双酶切；引物P2/P4扩增产物采用BamHI和Sac I双酶切；酶切反应体系为20μl：纯化产物15μl、两种酶各1.5μl、10×Buffer2μl；酶切条件为37℃5～10h；酶切产物用1％～1.5％琼脂糖凝胶电泳后用Qiaquick Gel Extraction Ket DNA凝胶回收试剂盒回收纯化；(4)植物表达载体双酶切，将基因银行登记序列号为AF485783的pBI121质粒用Xba I和Sac I双酶切，其中，如连接扩增P1/P4产物则用Xba I和Sma I酶切，连接P2/P3扩增产物用BamHI和Sac I酶切；连接P2/P4扩增产物用BamHI和Sac I酶切；酶切反应体系和条件同步骤(3)；酶切产物用1％～1.5％琼脂糖凝胶电泳后用Qiaquick Gel Extraction Ket DNA凝胶回收试剂盒回收纯化；(5)连接，将pBI121酶切产物用T4DNA连接酶与相应的NLS序列的PCR酶切产物连接，连接反应体系为10μl：pBI121酶切产物4μl、NLS序列PCR酶切产物4μl、T4DNA连接酶1μl、10×Buffer1μl；16℃反应15～20h；(6)克隆，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，获得阳性克隆载体。
3.如权利要求1所述的抗柑橘溃疡病pthA-nls基因在柑橘抗溃疡病育种中的应用。
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