CN112280833A - 一种尿导管表面大肠埃希菌dna定量检测用引物组 - Google Patents
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Abstract
一种尿导管表面大肠埃希菌DNA定量检测用引物组，由外引物对F3/B3、内引物对FIP/BI和环引物对环F/环B组成；还涉及采用上述引物组的快速定量检测方法；还涉及包含上述引物组的快速定量检测试剂盒。本发明的检测方法和试剂盒操作简便、快速准确、易推广，具有较高的灵敏度，不需要昂贵仪器，能够在现场病原体及基层医院检测中使用，对尿导管表面大肠埃希菌的监测与控制具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，具体地涉及一种尿导管表面大肠埃希菌DNA快速定量检测用引物组。
本发明还涉及利用上述的引物组快速定量检测尿导管表面大肠埃希菌DNA的方法。
本发明还涉及利用上述引物组快速定量检测尿导管表面大肠埃希菌DNA的试剂盒。
背景技术
目前，尿导管表面大肠埃希菌(俗名大肠杆菌，革兰氏阴性短杆菌)DNA定量检测的传统方法的主要缺点包括对微生物实验室的要求，并且微生物培养周期长达48小时后才可进行鉴定和量化。PCR分析需要具有昂贵仪器的分子生物学实验室，其以热循环仪的形式提供PCR所需的温度曲线。此外，qPCR获得的数据必须使用复杂的计算机软件进行分析，并由经过培训的人员进行解释。
发明内容
本发明的目的是提供一种尿导管表面大肠埃希菌DNA定量检测用引物组。
本发明的又一目的是提供一种利用上述引物组快速定量检测尿导管表面大肠埃希菌DNA的方法。
本发明的再一目的是提供一种利用上述引物组快速定量检测尿导管表面大肠埃希菌DNA的试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供的尿导管表面大肠埃希菌DNA定量检测用引物组，每个引物组由外引物对F3/B3、内引物对FIP/BI和环引物对环F/环B组成，F3、B3、FIP、BI、环F、环B具体如下：
本发明提供的利用上述引物组快速定量检测尿导管表面大肠埃希菌DNA的方法，包括以下步骤：
1)提取DNA；
2)配制LAMP检测反应体系，反应体系包括引物F3、B3、FIP、BI、环F、环B；
3)将提取的DNA加入引物组和LAMP检测反应体系进行LAMP扩增反应，肉眼观察浊度，或利用实时浊度仪实时监测核酸扩增反应过程，以图文形式显示整个反应过程中各个反应的速率和时间。
所述的方法，其中，步骤1提取DNA，是将导尿管表面的擦拭棉签以分子级无DNA酶无菌水中洗涤两次，16,000×g离心5分钟，将沉淀重新悬浮并在分子级无DNA酶无菌水中洗涤两次，99℃加热15分钟，以16,000×g离心5分钟以沉淀细胞碎片，将上清液用作LAMP测定。
所述的方法，其中，步骤2的LAMP检测反应体系为：Bst DNA聚合酶4U、dNTPs200μM、甜菜碱0.8M、MgSO42mM、DNA荧光染料、缓冲液、蒸馏水。
所述的方法，其中，步骤3的LAMP扩增反应是将DNA抽提液2ul加入引物组8ul和LAMP检测反应体系15ul于65度扩增60分钟。
本发明提供的利用上述引物组快速定量检测尿导管表面大肠埃希菌DNA的试剂盒，所述试剂盒至少包括含有上述引物组上述LAMP检测反应体系。
所述的快速定量检测试剂盒，其中，LAMP检测反应体系为：Bst DNA聚合酶4U、dNTPs200μM、甜菜碱0.8M、MgSO42mM、DNA荧光染料、缓冲液、蒸馏水。
本发明的效益是，可以通过颜色变化肉眼判定结果从而达到可视化的要求，使得本发明在实际应用中更加简便、快捷，并且容易操作、适用于现场操作。
具体实施方式
以下对本发明作进一步的描述。
LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)是一种新的核酸扩增分子技术，其中一组四(或六)种不同的引物与靶基因上的六个(或八个)不同区域结合，使其具有高度特异性。该引物组由两个外部(F3和B3)引物，两个内部引物(前向内部引物(FIP)和向后内部引物(BIP))和环状引物(环向前和环向后)组成。通过使用具有高置换活性的BstDNA聚合酶，可以简单地在等温条件下进行LAMP反应，通过一般常用的浊度仪可实现床边实时定量监测病原菌。本发明通过大量临床实验，确定了尿路感染中最常见的大肠杆菌的最佳引物序列。
每个引物组由外引物对F3/B3、内引物对FIP/BI和环引物对环F/环B组成，F3、B3、FIP、BI、环F、环B具体如下：
本发明的具体操作步骤是：
1、提取DNA：
将导尿管表面的擦拭棉签以分子级无DNA酶无菌水中洗涤两次，16,000×g离心5分钟，将沉淀重新悬浮并在分子级无DNA酶无菌水中洗涤两次，然后99℃加热15分钟，然后以16,000×g离心5分钟以沉淀细胞碎片，将上清液用作LAMP测定。
2、检测过程：
DNA抽提液(2ul)加入引物组和LAMP检测反应体系(Master Mix 001试剂)15ul于65度扩增60分钟。肉眼观察浊度。或利用实时浊度仪实时监测核酸扩增反应过程，以直观的图文形式来显示整个反应过程中各个反应的速率和时间。
LAMP检测反应体系(Master Mix 001)：Bst DNA聚合酶(4U)、dNTPs(200μM)、甜菜碱(0.8M)MgSO4(2mM)、SYBR Green I(DNA染料)、loading buffer(蒸馏水)。
本发明在检测尿导管表面的大肠埃希菌时，可以通过颜色变化肉眼判定结果从而达到可视化的要求，使得本发明在实际应用中更加简便、快捷，并且容易操作、适用于现场操作。
Claims (7)
1.一种尿导管表面大肠埃希菌DNA定量检测用引物组，每个LAMP引物组由外引物对F3/B3、内引物对FIP/BI和环引物对环F/环B组成，F3、B3、FIP、BI、环F、环B具体如下：
2.利用权利要求1所述的引物组检测尿导管表面大肠埃希菌的方法，包括以下步骤：
1)提取DNA；
2)配制LAMP检测反应体系，反应体系包括引物F3、B3、FIP、BI、环F、环B；
3)将提取的DNA加入引物组和LAMP检测反应体系进行LAMP扩增反应，肉眼观察浊度，或利用实时浊度仪实时监测核酸扩增反应过程，以图文形式显示整个反应过程中各个反应的速率和时间。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤1提取DNA，是将导尿管表面的擦拭棉签以分子级无DNA酶无菌水中洗涤两次，16,000×g离心5分钟，将沉淀重新悬浮并在分子级无DNA酶无菌水中洗涤两次，99℃加热15分钟，以16,000×g离心5分钟以沉淀细胞碎片，将上清液用作LAMP测定。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤2的LAMP检测反应体系为：Bst DNA聚合酶4U、dNTPs200μM、甜菜碱0.8M、MgSO42mM、DNA荧光染料、缓冲液、蒸馏水。
5.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤3的LAMP扩增反应是将DNA抽提液2ul加入引物组8ul和LAMP检测反应体系15ul于65度扩增60分钟。
6.利用权利要求1所述的引物组检测尿导管表面大肠埃希菌的快速定量检测试剂盒，所述试剂盒至少包括含有权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的LAMP检测反应体系。
7.根据权利要求6所述的快速定量检测试剂盒，其中，LAMP检测反应体系为：Bst DNA聚合酶4U、dNTPs200μM、甜菜碱0.8M、MgSO42mM、DNA荧光染料、缓冲液、蒸馏水。
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