CN118006741A - 一种基于taq酶和bst酶的等温扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于taq酶和bst酶的等温扩增方法，属于生物技术领域，其包括以下步骤：S1：设计引物和模板，以KPC‑2基因亚型和NDM‑1基因亚型为模板进行引物设计；S2：准备反应体系，S3：等温扩增反应，将反应混合物置于qPCR仪中，进行Taq酶和Bst酶的PCR扩增；S4：扩增信号分析，反应完成后，qPCR仪器记录反应过程中的荧光反应信号，以判断反应的效果；本发明解决了传统PCR技术在速度和操作复杂性方面的限制，提供了一种更快、更简单、成本更低的碳青霉烯酶耐药基因检测方法，适用于快速诊断和公共卫生监测。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于taq酶和bst酶的等温扩增方法。
背景技术
碳青霉烯类抗生素是一类广谱抗生素，属于β-内酰胺类抗生素的亚类。它们具有很强的抗菌活性，特别对于革兰阴性菌和某些革兰阳性菌具有较高的效果。碳青霉烯类抗生素被广泛用于治疗多种感染，包括呼吸道、泌尿道、皮肤和软组织等感染。碳青霉烯类抗生素的代表药物是头孢曲松(Ceftazidime)和头孢他啶(Cefepime)。它们在临床上常作为静脉给药的选择，用于治疗复杂的感染，如医院获得性肺炎、腹腔感染和血流感染等。碳青霉烯类抗生素通过抑制细菌细胞壁的合成，阻断了细菌的生长和繁殖。
碳青霉烯耐药是当今世界面临的严重问题之一。细菌通过产生碳青霉烯酶等机制对碳青霉烯类抗生素产生耐药性，并通过水平基因转移在细菌之间传播，导致耐药性快速扩散。这对临床治疗构成了严重挑战，限制了可用于治疗感染的药物选项，使感染难以有效控制，增加严重并发症、延长住院时间，并增加患者的死亡风险。在医疗环境中，碳青霉烯耐药细菌尤其具有危害，可以在医院内传播，引发医院获得性感染，增加医疗机构控制感染的难度。这种耐药性也成为全球公共卫生问题，威胁到人类健康。碳青霉烯类抗生素耐药性正在快速传播,导致临床上肠杆菌等产生碳青霉烯酶的细菌引起的感染无法用碳青霉烯类药物治疗。目前,临床上最常见的碳青霉烯酶类型是KPC、NDM和OXA-48等,主要来源于肺炎克雷伯菌和大肠杆菌。细菌培养、质谱分析、抗原检测以及分子检测等方法可以用于检测临床样本中的碳青霉烯酶或其编码基因。分子检测方法,如聚合酶链式反应和等温扩增技术,可以实现快速精准的耐药基因检测。快速确定耐药基因可以帮助临床进行早期干预和制定精确的用药方案,有助于采取有针对性的治疗措施,减缓抗菌素耐药性传播,降低多重耐药菌株感染的风险。
等温核酸扩增技术是一种在恒定温度下进行的核酸扩增方法,无需进行反复的热变性和退火过程。等温扩增技术的一个重要优势是其简化的操作流程。传统的PCR方法需要多个温度循环，包括高温的变性和退火阶段，而等温扩增技术能够在恒定温度下进行，省去了温度变化的步骤。这使得等温扩增更加快速、方便且易于自动化。目前常用的等温扩增方法包括NASBA、TMA，RPA和LAMP等温扩增技术，它们各自具有特定的优势和适用范围。其中，环介导等温扩增(LAMP)技术是一种备受关注的等温扩增方法，具有许多独特的特点和广泛的应用领域。LAMP技术是由多个引物和Bst DNA聚合酶介导的一种等温扩增方法。它的反应体系包括目标DNA序列、两对特异性引物(F3和B3)以及两对循环引物(F IP和BIP)，以及BstDNA聚合酶。这些引物分别包括外部引物(F3和B3)和内部引物(F IP和BIP)。LAMP反应的优点之一是其高度特异性。由于多条引物的作用，LAMP技术能够在等温条件下高效地扩增目标DNA序列，同时具有极低的非特异性扩增的可能性。另一个优点是LAMP反应的高效率和快速性。在恒定的温度下，LAMP技术能够在相对较短的时间内实现高度特异性的核酸扩增，通常只需要30分钟到1小时即可获得结果。这与传统的PCR方法相比，显著缩短了反应时间。LAMP技术也存在一些缺点。首先，由于引物的多样性和复杂性，LAMP反应的引物设计和优化相对较为复杂，需要进行大量的实验验证。这增加了实验室操作的难度和时间成本。其次，LAMP反应产生的大量扩增产物往往呈现为特征性的结构，如螺旋状或螺旋环状，这可能导致结果解读的困难。此外，LAMP扩增技术在特定条件下，可能出现假阳性结果。这是由于LAMP反应的特殊特点所致，LAMP引物的多重作用和Bst DNA聚合酶的高酶活性，使得LAMP反应在一些情况下可能扩增非特异性的DNA序列。这种假阳性结果的出现可能是由于引物设计不当、起始DNA污染以及污染和交叉污染等原因引起的。
LAMP等温扩增技术在各个领域都有广泛的应用。其快速、灵敏和简便易行的特点使其在病原体检测、食品安全监测和环境监测等方面发挥着重要作用。特别是在快速疫情监测和早期诊断、食品生产和供应链中的病原体污染检测以及环境监测等领域，LAMP扩增已经取得了显著的成果。然而，尽管LAMP扩增在这些领域取得了成功，仍然存在一些需要改进的方面。首先，引物设计的特异性和灵敏度仍然是关键的挑战。更精确的引物设计方法和策略可以帮助避免假阳性结果，提高扩增的准确性和可靠性。此外，LAMP扩增的自动化和集成化也是未来需要努力改进的方向。自动化的LAMP扩增平台可以提高实验的标准化和可重复性，并且更适用于大规模样品处理。同时，LAMP扩增的成本和时间效率也是需要改进的方面。虽然LAMP扩增相对于传统PCR已经具有较快的扩增速度，但仍有进一步缩短扩增时间的需求。降低扩增成本对于促进LAMP技术的广泛应用也是非常重要的。
在微生物诊断领域，对碳青霉烯酶或其基因的检测有多种方法。以下是关于碳青霉烯酶耐药基因检测方法的四种常见方法的简要介绍。
首先，细菌培养法是一种传统的碳青霉烯酶耐药基因检测方法。该方法涉及将细菌分离并培养在含有碳青霉烯类抗生素的培养基上，然后对菌落进行鉴定和敏感性测试。通过观察菌落的生长和抗生素敏感性，可以间接推测细菌是否携带碳青霉烯酶耐药基因。其优点是可以提供有关细菌的详细信息，如菌种鉴定和抗生素敏感性。此外，它还可以为后续研究提供活性细菌菌株。
第二.质谱检测法是一种基于质谱技术的碳青霉烯酶耐药基因检测方法。它使用质谱仪分析样品中的碳青霉烯酶蛋白质，并根据蛋白质的质谱图谱来确定是否存在碳青霉烯酶耐药基因。其优点是具有高度的灵敏性和特异性，能够检测多种碳青霉烯酶耐药基因的存在。此外，它的操作相对简单，且时间较短。
第三，抗原检测法是一种基于抗原与抗体特异性结合的碳青霉烯酶耐药基因检测方法。通过使用特异性的抗体与样品中的碳青霉烯酶结合，可以检测到碳青霉烯酶的存在。其优点是可以快速的检测和操作流程简单。它可以用于快速筛查大量样品，并且有可能实现便携化。
第四，分子检测法是一种基于核酸扩增技术的碳青霉烯酶耐药基因检测方法。其中目前以PCR(聚合酶链式反应)技术为主。这些方法通过扩增和检测目标基因的核酸序列来确定碳青霉烯酶耐药基因的存在。分子检测法具有高度的灵敏性和特异性，能够准确检测碳青霉烯酶耐药基因的存在，并且可以提供详细的基因型信息。这些方法通常具有较短的检测时间，能够快速获得结果。
以上四类检测碳青霉烯酶或者碳青霉烯基因方法均有各自的缺点。细菌培养方法缺点是需要较长的时间来培养和鉴定细菌，通常需要数天到数周的时间。此外，一些细菌可能难以培养，导致假阴性结果。此外，细菌培养法对于检测低水平的碳青霉烯酶耐药基因存在限制。
质谱检测法的主要缺点是设备和设施成本较高，限制了其在一些实验室或医疗机构中的应用。此外，对于复杂样品的分析，可能需要额外的前处理步骤，增加了分析的复杂性。
抗原检测法的缺点是检测法的灵敏性受到限制，特别是对于低水平的碳青霉烯酶耐药基因。此外，抗原检测法通常只能提供存在与否的结果，而无法提供关于碳青霉烯酶的具体类型或亚型的详细信息。
分子检测成本相对抗原检测成本相对较高，需要专门的设备和软件分析。而且分子检测法在样品处理和实验操作方面相对复杂，需要较高的实验技术要求。此外，这些方法需要特定的设备和试剂，增加了检测的成本。另外，由于分子检测法是基于核酸序列的，所以可能存在污染和交叉反应的风险，需要严格的质量控制和验证。
环介导等温扩增(LAMP)是一种高效、快速的核酸扩增技术，它在单一恒定温度下运行，通常在60℃到65℃之间。与传统的PCR方法相比，LAMP具有独特的优势，它不需要昂贵的仪器设备，因此非常适合于资源有限的环境。此外，LAMP反应的特异性和灵敏度非常高，它利用四个不同的引物精确地识别六个不同区域的目标DNA序列，这大大减少了非特异性扩增的可能性。碳青霉烯酶是一种能够破坏广泛抗生素的酶，包括碳青霉烯类抗生素，这类抗生素通常被视为对抗多重耐药细菌感染的最后防线。因此，迅速准确地检测碳青霉烯酶基因的存在对于临床治疗和抗生素耐药性监测至关重要。在这个背景下，LAMP技术的应用显得尤为重要。
LAMP等温扩增技术在检测碳青霉烯酶耐药基因方面具有显著的优势。首先，它的高特异性保证了对特定耐药基因的准确识别，减少了假阳性的可能性。其次，LAMP的高灵敏度意味着即使在样本中碳青霉烯酶基因的含量很低时，也能被有效检测出来。此外，LAMP技术的快速性使得在临床紧急情况下能够迅速获得检测结果，这对于指导正确的抗生素使用和控制感染传播至关重要。
然而，使用LAMP技术检测碳青霉烯酶耐药基因也面临着一些挑战。首先是引物设计的复杂性。碳青霉烯酶基因的多样性和不断变化的耐药性模式要求引物必须高度特异性且能适应基因的变异。其次，样本中可能存在的抑制物质可以干扰LAMP反应，导致假阴性结果。为了克服这一挑战，可能需要更精确的样本净化和处理方法。最后，尽管LAMP是一个相对简单的方法，但实验室技术人员仍然需要适当的培训和经验，以确保测试的准确性和可靠性。
为此我们提出一种基于taq酶和bst酶的等温扩增方法。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种基于taq酶和bst酶的等温扩增方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于taq酶和bst酶的等温扩增方法，包括以下步骤：
S1：设计引物和模板，以KPC-2基因亚型和NDM-1基因亚型为模板进行引物设计；
S2：准备反应体系，反应体系的体积为25ul，包含：2.5ul 10x反应缓冲液，3.5-4.0ul 10mM dNTPs,2ul 100mM MgSO4,2ul 10x LAMP引物,1-1.5ul Bst 3.0，1-1.5ul taqpolymerase,1ul 25x SYBR，1ul模板，最后加双蒸水到25ul；
S3：等温扩增反应，将反应混合物置于qPCR仪中，进行Taq酶和Bst酶的PCR扩增；
S4：扩增信号分析，反应完成后，qPCR仪器记录反应过程中的荧光反应信号，以判断反应的效果。
优选地，所述S1中，引物与引物之间的吉布斯自由能在-10以上。
优选地，所述S2中，2ul 10x LAMP引物包括4μMF3/B3、4-6μM LF/LB和16μM FIP/BIP。
优选地，所述S2中，其中10x反应缓冲液包括300-400mM Tris-HCl、150-200mM(NH4)2SO4、200-300mM KCl、20mM MgSO4和1％Tween-20。
优选地，所述S2中，Bst 3.0的浓度为8000U/ml，所述taq polymerase的浓度为0.1U/ul。
优选地，所述S3中，具体包括以下步骤：
S311：初始PCR扩增，将反应混合物置于qPCR仪中，并设置72℃的初始阶段温度进行10分钟，以进行基于Taq酶的PCR扩增；
S312：温度梯度降温，完成初始扩增后，逐渐降低反应混合物的温度；
S313：Bst酶扩增，在达到65℃后，维持此温度40分子，让Bst酶接管扩增过程；通过设定PCR仪的温度梯度降低功能来实现，设置每分钟降低1℃，直到达到65℃，为Bst酶的最佳活性温度。
优选地，所述S3中，具体包括以下步骤：
S321：初始PCR扩增，将反应混合物置于qPCR仪中，并设置温度按照68℃反应5分钟，65℃反应5分钟完成一个扩增周期后，再重复上述扩增循环5次，总计6个循环。
优选地，所述S3中，具体包括以下步骤：
S331：等温扩增反应设置，初始PCR扩增，将反应混合物置于qPCR仪中，并将qPCR仪设置温度为68℃，此温度既适用于Taq酶，也适用于Bst酶的活性；
S332：扩增反应进行，在68℃下进行混合酶扩增反应，总反应时间为60分钟。
本发明的有益效果：
1、速度更快：本发明的扩增反应时间大幅缩短至6分钟以内，相比传统qPCR方法更快，能够迅速提供检测结果，有利于及时进行临床干预；
2、操作简便：由于在恒定温度下进行，避免了qPCR中的温度循环，简化了操作流程，降低了对操作者技术水平的要求；
3、设备要求低：本发明不需要昂贵的qPCR仪器，降低了实验成本，使其在资源有限的环境中更具可行性；
4、适用性广：能够适用于不同类型的样本，包括那些qPCR方法可能难以处理的复杂样本；
5、环境友好：相比qPCR，本发明在能源消耗和环境影响方面更具优势。
本发明解决了传统PCR技术在速度和操作复杂性方面的限制，提供了一种更快、更简单、成本更低的碳青霉烯酶耐药基因检测方法，适用于快速诊断和公共卫生监测。
附图说明
图1为本发明中分阶段反应KPC和NDM的信号值示意图；
图2为本发明中循环反应KPC和NDM的信号值示意图；
图3为本发明中68℃等温反应KPC和NDM的信号值示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：温度梯度双酶等温扩增方法：这种方法利用Taq酶在较高温度下进行初始的PCR扩增，然后逐渐降低到适合Bst反应的温度，使Bst酶接管扩增过程。这种分区变化的温度梯度旨在优化两种酶的活性，从而实现更高效和精确的扩增。该过程实现检测2个(KPC和NDM)碳青霉烯酶耐药基因。
引物和模板：基于前期的实验数据和生物信息学研究，设计针对目标DNA序列的一套最优的引物。结合流行病学和生物信息学分析，确定以KPC-2基因亚型和NDM-1基因亚型为模板进行引物设计。引物设计以引物的退火温度和引物的DNA分子动力学为主要的参考因素。确保退火温度在55-63度之间，并且确保引物与引物之间的吉布斯自由能在-10以上。最终优选使用的KPC和NDM引物分别见表1和表2。本发明使用的模板为带有KPC-2基因和NDM-1基因的基因组DNA。
反应体系：本发明优化设计了一个兼容Taq酶和Bst酶的PCR反应混合物。最终优化体系是体积为25ul的反应体系，其中包含：2.5ul 10x反应缓冲液，3.5ul 10mM dNTPs,2ul100mM MgSO4,2ul 10x LAMP引物(4μM F3/B3,4μM LF/LB，16μM FIP/BIP),1ul Bst 3.0(8000U/ml)，1ul taq polymerase(0.1U/ul),1ul 25x SYBR，1ul模板，最后加双蒸水到25ul。其中10x反应缓冲液为400mM Tris-HCl，200mM(NH4)2SO4，200mM KCl，20mM MgSO4，1％Tween-20。
初始PCR扩增：将反应混合物置于qPCR仪中，并设置初始阶段的温度(72℃)进行10分钟，以进行基于Taq酶的PCR扩增。这里使用的taq酶为高保真taq酶，但这个酶并不需要要热启动。
温度梯度降温：完成初始扩增后，逐渐降低反应混合物的温度。这一步骤可以通过设定PCR仪的温度梯度降低功能来实现，设置每分钟降低1℃，直到达到65℃，为Bst酶的最佳活性温度。
Bst酶扩增：在达到65℃后，维持此温度40分子，让Bst酶接管扩增过程。
扩增信号分析：反应完成后，qPCR仪器记录反应过程中的荧光反应信号，以判断反应的效果。这种反应，KPC的起峰时间大概在15分钟左右，NDM的起峰时间大概在19分钟左右，如图1所示，A(KPC)和B(NDM)检测曲线。展示了三次重复实验的实时荧光单位(RFU)变化，随时间(分钟)变化的趋势。
表1：KPC引物列表
表2：NDM引物列表
实施案例2：基于taq酶和Bst酶的双酶循环性温度变化扩增方法。首先使用Taq酶在较高温度下进行扩增，然后迅速降温至Bst酶的最佳工作温度进行等温扩增。
引物和模板：引物与模板和上一个案例一样。
反应体系：本案例最终优化体系是体积为25ul的反应体系，其中包含：2.5ul 10x反应缓冲液(同上一案例)，4ul 10mM dNTPs,2ul 100mM MgSO4,2ul 10x LAMP引物(4μMF3/B3,4μM LF/LB，16μM FIP/BIP),1.5ul Bst 3.0(8000U/ml)，1.5ul taq polymerase(0.1U/ul),1ul 25x SYBR，1ul模板，最后加双蒸水到25ul。
循环温度变化：温度按照68℃(5分钟)，65℃(5分钟)完成一个扩增周期后，再重复上述扩增循环5次，总计6个循环。
扩增产物分析：在完成所需循环次数后，通过qPCR仪器记录的荧光信号分析数据。这种反应，KPC和NDM的起峰时间均在14分钟左右.相较于上一案例的阶段扩增的方法，这个方法的起峰时间更短如图2所示，A(KPC)和B(NDM)检测曲线。展示了三次重复实验的实时荧光单位(RFU)变化，随时间(分钟)变化的趋势。
实施案例3：基于taq酶和Bst酶的等温扩增反应方法。在这个反应中我们仅使用一个温度进行反应。
引物和模板：引物与模板和上一个案例一样。
反应体系：基于同一温度的反应，本发明优化了反应体系，体积为25ul的反应体系包含：2.5ul 10x反应缓冲液，4ul 10mM dNTPs,2ul 100mM MgSO4,2ul 10x LAMP引物(4μMF3/B3,6μM LF/LB，16μM FIP/BIP),1ul Bst 3.0(8000U/ml)，1.5ul taq polymerase(0.1U/ul),1ul 25x SYBR，1ul模板，最后加双蒸水到25ul。其中10x反应缓冲液为300mMTris-HCl，150mM(NH4)2SO4，300mM KCl，20mM MgSO4，1％Tween-20。
等温扩增反应设置：将qPCR仪设置温度为68℃。此温度既适用于Taq酶，也适用于Bst酶的活性。
扩增反应进行：在68℃下进行混合酶扩增反应，总反应时间为60分钟。
扩增产物分析：在完成所需循环次数后，通过qPCR仪器记录的荧光信号分析数据。这种反应，KPC的起峰时间均在6分钟左右，NDM的起峰时间均在9分钟左右。相较于前面两个案例的方法，这个方法的起峰时间是最短的，如图3所示，A(KPC)和B(NDM)检测曲线。展示了三次重复实验的实时荧光单位(RFU)变化，随时间(分钟)变化的趋势。
本发明主要关键点在于结合使用Taq酶和Bst酶的等温扩增方法，这一独特的组合使得碳青霉烯酶耐药基因的检测更加高效和准确。该技术的核心在于在一个固定温度(如68℃)下实现快速且高效的扩增反应，大幅缩短了检测时间至6分钟以内。此外，本发明还优化了反应流程和反应体系，使得碳青霉烯酶耐药基因的检测变得快速和稳定。
欲保护的技术点包括：
1)特异性引物，用于目标碳青霉烯酶耐药基因的高效检测，包括表1到表2的SEQID NO.1到SEQ ID NO.12；
2)Taq酶和Bst酶在固定温度(65℃，66℃，67℃，68℃，69℃，70℃)下的结合使用，实现快速等温扩增；
3)优化的反应条件和体系，确保检测过程的稳定性和准确性；
4)该方法的通用性，可用于加速其他靶基因的LAMP等温检测。
本发明解决了传统PCR技术在速度和操作复杂性方面的限制，提供了一种更快、更简单、成本更低的碳青霉烯酶耐药基因检测方法，适用于快速诊断和公共卫生监测。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (8)
1.一种基于taq酶和bst酶的等温扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：设计引物和模板，以KPC-2基因亚型和NDM-1基因亚型为模板进行引物设计；
S2：准备反应体系，反应体系的体积为25ul，包含：2.5ul 10x反应缓冲液，3.5-4.0ul10mM dNTPs,2ul 100mM MgSO4,2ul10x LAMP引物,1-1.5ul Bst 3.0，1-1.5ul taqpolymerase,1ul 25x SYBR，1ul模板，最后加双蒸水到25ul；
S3：等温扩增反应，将反应混合物置于qPCR仪中，进行Taq酶和Bst酶的PCR扩增；
S4：扩增信号分析，反应完成后，qPCR仪器记录反应过程中的荧光反应信号，以判断反应的效果。
2.根据权利要求1所述的一种基于taq酶和bst酶的等温扩增方法，其特征在于，所述S1中，引物与引物之间的吉布斯自由能在-10以上。
3.根据权利要求1所述的一种基于taq酶和bst酶的等温扩增方法，其特征在于，所述S2中，2ul 10x LAMP引物包括4μM F3/B3、4-6μM LF/LB和16μM FIP/BIP。
4.根据权利要求1所述的一种基于taq酶和bst酶的等温扩增方法，其特征在于，所述S2中，其中10x反应缓冲液包括300-400mM Tris-HCl、150-200mM(NH4)2SO4、200-300mM KCl、20mM MgSO4和1％Tween-20。
5.根据权利要求1所述的一种基于taq酶和bst酶的等温扩增方法，其特征在于，所述S2中，Bst 3.0的浓度为8000U/ml，所述taq polymerase的浓度为0.1U/ul。
6.根据权利要求1所述的一种基于taq酶和bst酶的等温扩增方法，其特征在于，所述S3中，具体包括以下步骤：
S311：初始PCR扩增，将反应混合物置于qPCR仪中，并设置72°C的初始阶段温度进行10分钟，以进行基于Taq酶的PCR扩增；
S312：温度梯度降温，完成初始扩增后，逐渐降低反应混合物的温度；
S313：Bst酶扩增，在达到65℃后，维持此温度40分子，让Bst酶接管扩增过程；通过设定PCR仪的温度梯度降低功能来实现，设置每分钟降低1℃，直到达到65℃，为Bst酶的最佳活性温度。
7.根据权利要求1所述的一种基于taq酶和bst酶的等温扩增方法，其特征在于，所述S3中，具体包括以下步骤：
S321：初始PCR扩增，将反应混合物置于qPCR仪中，并设置温度按照68℃反应5分钟，65℃反应5分钟完成一个扩增周期后，再重复上述扩增循环5次，总计6个循环。
8.根据权利要求1所述的一种基于taq酶和bst酶的等温扩增方法，其特征在于，所述S3中，具体包括以下步骤：
S331：等温扩增反应设置，初始PCR扩增，将反应混合物置于qPCR仪中，并将qPCR仪设置温度为68℃，此温度既适用于Taq酶，也适用于Bst酶的活性；
S332：扩增反应进行，在68℃下进行混合酶扩增反应，总反应时间为60分钟。
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