CN108728560A - 金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测引物、试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测引物、试剂盒及其检测方法。该引物包括锁式探针引物，以及RCA检测引物padF和padR；其中：锁式探针引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；RCA检测引物padF的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；RCA检测引物padR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明利用锁式探针能与模板DNA互补结合的特点，在金葡菌特异性基因片段序列上设计锁式探针，通过引物进行滚环扩增，建立金葡菌滚环扩增检测方法，可以缩短传统金葡菌检测的周期，同时确保检测的特异性和灵敏度。这对于提高重大群体疾病诊断率，早期的疾病诊断具有非常重要的意义。

Description

金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测引物、试剂盒及其检测 方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测引物、试剂盒及其检测方法。

背景技术

食源性感染和疾病到目前为止仍然是每一个人所关注的热点问题，这些疾病的产生大部分是由于摄入了被病原性微生物所污染的食品。食源性致病菌每年会造成1400万疾病案例，6万例院内治疗及1800人的死亡。葡萄球菌食物性中毒是最重要的食源性疾病之一，是世界范围内公共卫生的主要问题。据统计在1983年～1997年间，美国每年由葡萄球菌所引起的食物性中毒的案例数达到185001750例的院内治疗及2起死亡，造成了1.5亿美元的经济损失。在一些大型群体疾病爆发的案例中，金黄色葡萄球菌的检出率甚至达到了90％。然而，尽管缺乏相对全面的监测和调查，由金黄色葡萄球菌所引起的食物性中毒案例的数量也因为每个地区不同的饮食习惯有所差异。金黄色葡萄球菌在摄入人体之后会产生肠毒素(SEs)，这种毒素会导致病人呕吐及腹泻，是金黄色葡萄球菌引起食物中毒的主要原因。尽管由金黄色葡萄球菌所造成的污染可以通过加热食品的方式来避免，然而其能够在很广泛的温度(7～48.5℃)和pH范围内(4.2～9.3)生长，如此将有利于其造成污染及其在不同类型的食品之间传播。在食品中葡萄球菌的浓度达到10⁶～10⁸CFU/g时会引起食物中毒，对于一些对金黄色葡萄球菌敏感人群在葡萄球浓度达到10⁵CFU/g时由于其产生了足够的肠毒素导致了一些临床症状的产生。虽然目前监管机构已经严格限制了在一些开袋即食食品中不能存在金黄色葡萄球菌，在未加工的食品中所允许的浓度范围在10²～10³CFU/g。

金葡菌的常规检测诊断与鉴定的主要过程包括：菌悬液制备，选择性培养基分离纯化获取单菌落，目标菌落接种至液体培养基中，生化实验检测。常规的实验检测鉴定方法所需时间较长，由营养不足及物种之间的竞争会导致一些假阳性的结果出现，同时由于其较低的灵敏度已经引起了人们对于这种传统的鉴定方法的担忧。在过去的研究中，学者基于PCR或者RQ-PCR(real-time quantitative PCR)的方法用来快速检测与鉴定食源性病原微生物。但是，PCR方法对仪器设备(如PCR仪)要求高、投入大，给技术的基层推广造成了极大障碍。由于在反应的过程中容易发生错配现象及检出限较高，同时实时定量PCR所需要专业的技术人员等都对其应用推广造成了极大的障碍。

滚环扩增技术(RCA)是一种新型的核酸扩增技术。该技术模拟自然界微生物环状DNA的滚环复制过程，在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下由一条引物即可引发沿环形DNA模板的链置换合成，实现环状DNA模板的体外等温扩增。在此基础上增加一条与DNA模板序列一致的引物，RCA则可以实现模板的指数扩增。通过锁式探针与线性模板结合及连接酶连接成环的过程，RCA可以实现线性DNA或RNA模板的信号放大。该技术具有灵敏、特异、原理简单和操作简便的特点，已被用于环状DNA的扩增、基因测序、基因表达图谱制作等。但到目前为止，尚未有基于滚环扩增检测金黄色葡萄球菌方法，因此，建立一种针对金黄色葡萄球菌新型的具有独立知识产权的滚环扩增方法具有重要的意义。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测引物。

本发明的另一目的在于提供所述一种金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测试剂盒。

本发明的又一目的在于提供所述金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测试剂盒的应用。

本发明的再一目的在于提供一种金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测方法。其具有灵敏度高、特异性好、操作简便，结果准确可靠，检测成本低等检测特点。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测引物，包括锁式探针引物(padlock primer)，以及RCA检测引物padF和padR，其核苷酸序列如下所示：

锁式探针引物(padlock primer):5’-CATTTTGCCGCTTGTTTCTTTGTCTGTGCAAAGATACGTTACACCGAATTCACCTCTACCGAGTTCACGACCGAGTTCGTAACGAGTTTCTGCATTCCGT-3’(SEQ ID NO.1)；

RCA检测引物(padF):5’-TCTTTGTCTGTGCAAAGATACGTT-3’(SEQ ID NO.2)；

RCA检测引物(padR):5’-AACTCGTTACGAACTCGGTC-3’(SEQ ID NO.3)。

一种金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测试剂盒，包括上述金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测引物。

所述的金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测引物中锁式探针引物的浓度为100mM，RCA检测引物padF和padR的浓度均为10mM。

所述的金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测试剂盒在检测金葡色葡萄球菌中的应用。

一种金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测方法，包括如下步骤：

(1)提取待检样品的细菌DNA作为模板DNA，并控制模板DNA水溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.8～2.0；

(2)锁式探针的环化连接：将步骤(1)中提取的细菌DNA与上述锁式探针引物进行环化连接，其环化连接的反应体系为25μL反应体系：DNA模板2.5μL，40U/μL Taq DNAligase buffer 2.5μL，100mM锁式探针引物2.5μL，无菌去离子水补充至25μL；

(3)未环化锁式探针的消化：步骤(2)中的环化连接反应完成后，立即将产物冰浴5min，然后再加入预混液，于37℃条件下水浴3h，再于80℃条件下水浴20min；其中，预混液的组成为：5U/μL核酸外切酶Ⅲ2.5μL，10×核酸外切酶Ⅲ缓冲液5μL，10U/μL核酸外切酶Ⅰ2.5μL，10×核酸外切酶Ⅰ缓冲液5μL，无菌去离子水10μL；

(4)RCA扩增：将步骤(3)中消化后的产物进行RCA扩增，先于58℃恒温条件下反应1h，然后在80℃条件下反应20min，反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳；若电泳结果出现梯形条带，则说明检测菌株为金黄色葡萄球菌，反之则不是金黄色葡萄球菌；其中，所述的RCA扩增的体系为25μL反应体系：步骤(3)中消化后的产物10μL，10×Bst DNA polymerasebuffer 2.5μl，10μmol/L RCA检测引物padR 2.5μL，10μmol/L RCA检测引物padF 2.5μL，10mmol/L dNTPs 2.5μL，8U/μL Bst DNA polymerase 0.625μL，ddH₂O补充至25μL。

步骤(2)中所述的锁式探针引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

步骤(2)中所述的环化连接的反应条件为：95℃5min,60℃60min,95℃15min灭活剩余连接酶。

步骤(4)中所述的RCA检测引物padF的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；RCA检测引物padR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

步骤(4)中所述的琼脂糖凝胶为浓度1.5％(w/v)的琼脂糖凝胶。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)与传统检测鉴定方法相比，本实验的灵敏度较高，较PCR检测方法灵敏度高100倍左右。特异性高，较好的解决了PCR检测过程中易出现的错配现象，避免出现假阳性的结果。可重复性高，可同时进行多个样品检测。同时本发明还公开了针对金葡菌特异性靶序列femA保守区域设计了一条锁式探针及RCA扩增引物，从而保证了检测结果的可靠性。

(2)本发明中所提供的针对金葡菌保守基因femA序列所设计的RCA检测鉴定体系，解决现有技术中的方法所需周期长，灵敏度低，成本高，现场应用困难等缺陷。

(3)本发明中建立金葡菌滚环扩增检测方法，可以缩短传统金葡菌检测的周期，同时确保检测的特异性和灵敏度。这对于提高重大群体疾病诊断率，早期的疾病诊断具有非常重要的意义。

附图说明

图1为实施例1中的金葡菌检测的琼脂凝胶电泳图；其中，泳道M：DS2000Marker，泳道1：金黄色葡萄球菌ATCC23235，泳道2：金黄色葡萄球菌ATCC6358，泳道3：金黄色葡萄球菌10071，泳道4：金黄色葡萄球菌100749，泳道NG：阴性对照。

图2为实施例2中建立的滚环扩增检测体系检测金黄色葡萄球菌特异性的琼脂凝胶电泳图；其中，泳道M:DS2000Marker，泳道1:阴性对照，泳道2～10：小肠耶尔森氏菌ATCC27853、副溶血性弧菌ATCC27969、大肠杆菌O157:H7ATCC43895、沙门氏菌ATCC14208、铜绿假单胞杆菌ATCC27853、大肠杆菌非O157、干酪乳杆菌LC-14617，短乳杆菌LB、耐酸乳杆菌LA-14526和金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC27664。

图3为实施例3中不同浓度DNA在滚环扩增检测琼脂凝胶电泳图；其中，泳道M：DS2000Marker，泳道1：10ng/μL，泳道2：1ng/μL，泳道3：100pg/μl，泳道4：10pg/μL，泳道5：1pg/μL，泳道6：100fg/μL，泳道7：10fg/μL。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所使用的各原料以及试剂，除特别指出的以外，均可由市售获得。

实施例1基于滚环扩增技术检测金黄色葡萄球菌的微生物检测方法

基于滚环扩增技术检测病原微生物的检测方法，本实施例以金黄色葡萄球菌为例，其使用试剂如下：

浓度为100mM锁式探针引物(padlock primer)，浓度为10mM RCA检测引物(padF/padR)，引物序列如下(5’-3’)：

锁式探针(padlock primer):

CATTTTGCCGCTTGTTTCTTTGTCTGTGCAAAGATACGTTACACCGAATTCACCTCTACCGAGTTCACGACCGAGTTCGTAACGAGTTTCTGCATTCCGT(SEQ ID NO.1)；

RCA检测引物(padF):TCTTTGTCTGTGCAAAGATACGTT(SEQ ID NO.2)；

RCA检测引物(padR):AACTCGTTACGAACTCGGTC(SEQ ID NO.3)。

利用上述设计引物检测金黄色葡萄球菌，包括如下步骤：

(1)提取待检样品的细菌DNA作为模板DNA：本实施例同时设置实验组和空白对照组，其中实验组为四株金黄色葡萄球菌(ATCC23235，ATCC6358，10071^[1]，100749^[1])；采用DNA提取试剂盒(广东东盛生物科技有限公司)提取各组细菌DNA，按照试剂盒说明书操作，实验组所得细菌DNA水溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀的值(260nm和280nm下吸光光度比值)为1.8。

(2)锁式探针的环化连接：以提取的金葡菌的DNA为模板，分别与锁式探针进行环化连接。25μL的反应体系为:DNA模板2.5μL，40U/μL Taq DNA ligase buffer 2.5μL，100mM锁式探针2.5μL，无菌去离子水补充至25μL。反应条件为：95℃5min，60℃60min，95℃15min灭活剩余连接酶。反应完成后，立即将产物冰浴5min用于之后实验。

(3)未环化锁式探针的消化：预先制配25μL混合液，混合液组成为：5U/μL核酸外切酶Ⅲ(购于Thermo Fisher Scientific)2.5μL，10×核酸外切酶Ⅲ缓冲液(购于ThermoFisher Scientific)5μL，10U/μL核酸外切酶Ⅰ(购于Thermo Fisher Scientific)2.5μL，10×核酸外切酶Ⅰ缓冲液(购于Thermo Fisher Scientific)5μL，无菌去离子水10μL。向环化连接后的产物中加入该25μL预混液后，37℃水浴3h消化未环化的锁式探针，再于80℃水浴20min，灭活核酸外切酶。

(4)RCA扩增：以锁式探针连接环化、消化后的产物为模板，反应体系为25μL(连接环化产物10μL，10×Bst DNA polymerase buffer 2.5μL，10μmol/L padR(上述RCA检测引物padR)2.5μL，10μmol/L padF(上述RCA检测引物padF)2.5μL，10mmol/L dNTPs 2.5μL，8U/μL Bst DNA polymarse(Bst DNA聚合酶，NEB公司)0.625μL，ddH₂O补充体积至25μL)。58℃恒温条件下反应1h，80℃20min。反应结束后取样进行电泳，琼脂糖凝胶为浓度1.5％(w/v)的琼脂糖凝胶。

结果如图1所示，结果显示，加入金葡菌DNA的实验组呈现梯形条带，阴性组无扩增条带，与预期结果一致。

实施例2基于滚环扩增检测金黄色葡萄球菌特异性试验

将金葡菌(金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC23235)与非金黄色葡萄球菌(小肠耶尔森氏菌ATCC27853、副溶血性弧菌ATCC27969、大肠杆菌O157:H7ATCC43895、沙门氏菌ATCC14208、铜绿假单胞杆菌ATCC27853、大肠杆菌非O157^[2]、干酪乳杆菌LC-14617^[3]、耐酸乳杆菌LA-14526^[4])的基因组DNA按照上述反应体系和条件建立滚环扩增检测方法，进行特异性试验。设置金葡菌基因组为阳性对照，超纯水为阴性对照，结果如图2所示。结果表明，只有金黄色葡萄球菌基因组出现阳性反应，其余均呈现阴性反应。

实施例3滚环扩增检测金黄色葡萄球菌的敏感性试验

将金黄色葡萄球菌ATCC27664的基因组进行10倍浓度梯度稀释，分别为10ng/μL，1ng/μL，100pg/μL,10pg/μL，1pg/μL，100fg/μL，10fg/μL同时设置阴性对照(去离子水)，按照上述反应体系构建滚环扩增检测方法，以确定检测方法的敏感性，结果如3所示。结果表明，建立的金黄色葡萄球菌滚环扩增检测方法可检测样品中1pg/μl反应的金黄色葡萄球菌DNA。

结论：反复重复实验三次，所得检测结果相同，实验组和阳性对照组均有电泳条带产生，阴性对照物电泳条带产生，与预期结果一致。同PCR所测灵敏度相比，RCA扩增获得产物检测的灵敏度更高，说明本实验设计达到预期目的。同时，多次重复实验获得结果一致，说明该体系具有良好的重复性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

参考文献

[1]刘晓晨.金黄色葡萄球菌生物被膜相关基因型及其分子进化规律的研究[D].华南理工大学,2015.

[2]周蓉.低温储藏对肠出血大肠杆菌VBNC状态的诱导及毒素表达量的影响研究[D].华南理工大学,2015.

[3]Junyan Liu,Lin Li,Bing Li,Brian M.Peters,Yang Deng*,Zhenbo Xu*,Mark E.Shirtliff.The viable but nonculturable state induction and genomicanalyses of Lactobacillus casei BM-LC14617,a beer-spoilagebacterium.MicrobiologyOpen.2017；e506.

[4]Junyan Liu,Lin Li,Brian M.Peters,Bing Li,Dingqiang Chen**,ZhenboXu*,Mark E.Shirtliff.Complete genome sequence and bioinformatics analysesofBacillus thuringiensis strain BM-BT15426.Microbial Pathogenesis.108:55-60,2017.

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测引物、试剂盒及其检测方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 锁式探针引物

<400> 1

cattttgccg cttgtttctt tgtctgtgca aagatacgtt acaccgaatt cacctctacc 60

gagttcacga ccgagttcgt aacgagtttc tgcattccgt 100

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> RCA检测引物padF

<400> 2

tctttgtctg tgcaaagata cgtt 24

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> RCA检测引物padR

<400> 3

aactcgttac gaactcggtc 20

Claims (6)

1.一种金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测引物，其特征在于：包括锁式探针引物(padlock primer)，以及RCA检测引物padF和padR；其中：

锁式探针引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

RCA检测引物padF的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

RCA检测引物padR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测引物。

3.根据权利要求2所述的金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测试剂盒，其特征在于：

所述的金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测引物中锁式探针引物的浓度为100mM，RCA检测引物padF和padR的浓度均为10mM。

4.权利要求2或3所述的金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测试剂盒在检测金葡色葡萄球菌中的应用。

5.一种金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)提取待检样品的细菌DNA作为模板DNA；

(2)锁式探针的环化连接：将步骤(1)中提取的细菌DNA与锁式探针引物进行环化连接，其环化连接的反应体系为25μL反应体系：DNA模板2.5μL，40U/μL Taq DNA ligase buffer2.5μL，100mM锁式探针引物2.5μL，无菌去离子水补充至25μL；

(3)未环化锁式探针的消化：步骤(2)中的环化连接反应完成后，立即将产物冰浴5min，然后再加入预混液，于37℃条件下水浴3h，再于80℃条件下水浴20min；其中，预混液的组成为：5U/μL核酸外切酶Ⅲ2.5μL，10×核酸外切酶Ⅲ缓冲液5μL，10U/μL核酸外切酶Ⅰ2.5μL，10×核酸外切酶Ⅰ缓冲液5μL，无菌去离子水10μL；

(4)RCA扩增：将步骤(3)中消化后的产物进行RCA扩增，先于58℃恒温条件下反应1h，然后在80℃条件下反应20min，反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳；若电泳结果出现梯形条带，则说明检测菌株为金黄色葡萄球菌，反之则不是金黄色葡萄球菌；其中，所述的RCA扩增的体系为25μL反应体系：步骤(3)中消化后的产物10μL，10×Bst DNA polymerase buffer2.5μl，10μmol/L RCA检测引物padR 2.5μL，10μmol/L RCA检测引物padF 2.5μL，10mmol/LdNTPs 2.5μL，8U/μL Bst DNA polymerase 0.625μL，ddH₂O补充至25μL；

步骤(2)中所述的锁式探针引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

步骤(4)中所述的RCA检测引物padF的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；RCA检测引物padR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

6.根据权利要求5所述的金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的环化连接的反应条件为：95℃5min,60℃60min,95℃15min。