CN101812531A

CN101812531A - 一种检测大肠杆菌的试剂盒

Info

Publication number: CN101812531A
Application number: CN 201010164049
Authority: CN
Inventors: 孙国明
Original assignee: TRUEHIGH TECH Co Ltd
Current assignee: TRUEHIGH TECH Co Ltd
Priority date: 2010-05-06
Filing date: 2010-05-06
Publication date: 2010-08-25

Abstract

本发明涉及一种用纳米金颗粒检测大肠杆菌DNA经环介导等温核酸扩增技术扩增后产物DNA的试剂盒，属于生物检测技术领域。本发明结合环介导等温核酸扩增技术和生物纳米技术，提高生物分子检测的灵敏度，是一种操作简单、快速、准确、不需要专业仪器设备的方法，可以广泛应用于家庭诊断、临床诊断、传染病控制、环境监测、检验检疫，生物技术等领域的高灵敏度的大肠杆菌检测。本发明试剂盒包括两部分：(1)标记有可以识别大肠杆菌特定序列的分子探针的纳米金颗粒；(2)可以扩增待检测样品中的大肠杆菌DNA或先经过逆转录过程后再扩增待检测样品中的大肠杆菌RNA的环介导等温核酸扩增体系。

Description

一种检测大肠杆菌的试剂盒

一、技术领域

本发明涉及一种用纳米金颗粒检测大肠杆菌DNA经环介导等温核酸扩增技术扩增后产物DNA的试剂盒，属于生物检测技术领域。

二、背景技术

对基因(DNA)及其转录产物(RNA)的高灵敏性、高特异性、简单、快速的检测，对于疾病的早期诊断和治疗以及在在卫生防疫、环境监测、检验检疫等领域都具有十分重要的意义。以往在这方面较为准确灵敏的检测方法有荧光标记法、放射性标记等方法，这些方法都需要复杂的操作和特殊的设备，应用范围很窄。1993年PE公司的Dr.Kary B.Mullis发明了聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR。随后PCR技术大规模的应用于生物科研和临床治疗中，对DNA的检测进入了新的时代，Dr.Mullis为此还获得了1993年的诺贝尔化学奖。虽然PCR方法具有快速、灵敏、准确性高、操作较简单等优点，但由于其反应进行和产品DNA的检测需要特殊的仪器，PCR技术的使用一直被限定在专业的实验室和医院里。

2001年日本荣研化学株式会社研制出了一种新型DNA扩增方式，环介导等温核酸扩增技术(LAMP)可以在恒温条件下实现DNA的高效快速扩增，该方法反应条件简单，DNA扩增效率高，因此在核酸检测方面具有明显优势。但是对LAMP扩增制备的DNA产物使用常规的检测方法，如电泳法，荧光染料法等，均无法排除LAMP扩增所带来的假阳性问题，而且需要特殊的仪器，因此限制了LAMP技术的实际应用。

大肠细菌(E.coli)为埃希氏菌属(Escherichia)代表菌。一般多不致病，为人和动物肠道中的常居菌，在一定条件下可引起肠道外感染。某些血清型菌株的致病性强，引起腹泻，统称致病性大肠杆菌。该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55℃经60分钟或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活。在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久。对磺胺类、链霉素、氯霉素等敏感，但易耐药。目前针对大肠杆菌缺乏简单、快速、便于使用和成本低廉的检测方法。

三、发明内容

本发明的目的是提出一种用纳米金颗粒检测大肠杆菌DNA经环介导等温核酸扩增技术扩增后产物DNA的试剂盒，结合环介导等温核酸扩增技术和生物纳米技术，提高生物分子检测的灵敏度，是一种操作简单、快速、准确、成本低廉、不需要专业仪器设备的方法，可以广泛应用于家庭诊断、临床诊断、传染病控制、环境监测、检验检疫，生物技术等领域的高灵敏度的大肠杆菌检测。

本发明试剂盒包括两部分：

1.标记有可以识别大肠杆菌DNA特定序列的分子探针的纳米金颗粒；

2.可以扩增待检测样品中的大肠杆菌DNA或先经过逆转录过程后再扩增待检测样品中的大肠杆菌RNA的环介导等温核酸扩增体系。

该试剂盒的工作原理为：

1.纳米金颗粒标记有能识别大肠杆菌DNA特定序列的分子探针，分子探针被固定在纳米金颗粒的表面。

2.待检测样品中的大肠杆菌DNA分子或大肠杆菌RNA经环介导等温核酸扩增技术大量复制或先经逆转录过程后大量复制，大肠杆菌DNA的目标片段被放大10⁹倍，产生的扩增产物DNA具有多重重复序列。

3.混合纳米金颗粒和环介导等温核酸扩增体系，大肠杆菌经环介导等温核酸扩增技术以后的产物DNA与纳米金颗粒上能识别大肠杆菌DNA特定序列的分子探针杂交。

4.纳米金颗粒沿环介导等温核酸扩增技术产物DNA分子链形成聚集体(如附图所示)，进而引发纳米金颗粒聚集处(例如溶液中、固体表面等)的颜色变化，依据颜色变化可以判断待测样品是否具有大肠杆菌DNA或RNA。

四、附图说明

标记有分子探针的纳米金颗粒与大肠杆菌DNA经环介导等温核酸扩增技术以后的产物DNA杂交示意图，纳米金颗粒沿环介导等温核酸扩增技术产物DNA分子链形成聚集体。

五、具体实施方式

本发明试剂盒包括2管溶液，一管中是标记有可以识别大肠杆菌DNA特定序列的分子探针的纳米金颗粒溶液50μl，一管中是250μl可以扩增待检测样品中的大肠杆菌DNA或先经过逆转录过程后再扩增待检测样品中的大肠杆菌RNA的环介导等温核酸扩增体系。

纳米金颗粒溶液中含有直径为20nm的纳米金颗粒，浓度为1.2nM，纳米金颗粒表面标记有巯基修饰的DNA探针。

环介导等温核酸扩增体系成分如下：0.2μM F3和B3引物，1.6μM FIP和BIP引物，0.8μM LoopF和LoopB引物，0.4M betaine(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，10mM MgSO4，1.4mM dNTPs，1×ThermoPol reaction buffer(New England Biolabs，Ipswich，MA)，80U Bst DNApolymerase(New England Biolabs)，6.25U AMV逆转录酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)。

巯基修饰的DNA探针序列

5′-TGTAACGAAAGCCTGGAAAAAAAA-SH-3′

引物序列

大肠杆菌的F3引物

5′-GCCATCTCCTGATGACGG-3′

大肠杆菌的B3引物

5′-ATTTACCGCAGCCAGACG-3′

大肠杆菌的BIP引物

5′-CTGGGGCGAGGTCGTGGTATTCCGAACAAACACCACGAATT-3′

大肠杆菌的FIP引物

5′-CATTTTGCAGCTGTACGCTCGCAGCCCATCATGAATGTTGCT-3′

大肠杆菌的LoopF引物

5′-CTTTGTAACAACCTGTCATCGACA-3′

大肠杆菌的LoopB引物

5′-ATCAATCTCGATATCCATGAAGGTG-3′

操作过程如下

1.向装有环介导等温核酸扩增体系的管中加入10μl提取的核酸或者血液样品。

2.将装有混合物的管放入60℃的水浴中30分钟。

3.再向步骤2中的管中加入纳米金颗粒溶液，此时混合后的溶液为红色。

4.60℃水浴反应15分钟。

5.观察反应后管中溶液的颜色，溶液保持红色不变则不含有大肠杆菌感染特异性的RNA或大肠杆菌DNA；如果溶液变为浅紫色，则判定样本中含有大肠杆菌染特异性的RNA或大肠杆菌DNA。

序列表

<110>天津朝海科技有限公司

<120>一种检测大肠杆菌的试剂盒

<130>Demo

<160>7

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>1

tgtaacgaaa gcctggaaaa aaaa 24

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>2

gccatctcct gatgacgg 18

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>3

atttaccgca gccagacg 18

<210>4

<211>41

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>4

ctggggcgag gtcgtggtat tccgaacaaa caccacgaat t 41

<210>5

<211>42

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>5

cattttgcag ctgtacgctc gcagcccatc atgaatgttg ct 42

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>6

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<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>7

atcaatctcg atatccatga aggtg 25

Claims

1.一种用纳米金颗粒检测大肠杆菌DNA经环介导等温核酸扩增技术扩增后产物DNA的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括以下部分：(1)标记有可以识别大肠杆菌DNA特定序列的分子探针的纳米金颗粒；(2)可以扩增待检测样品中的大肠杆菌DNA或先经过逆转录过程后再扩增待检测样品中的大肠杆菌RNA的环介导等温核酸扩增体系。

2.根据权利要求1，该试剂盒的工作原理为(1)用环介导等温核酸扩增技术扩增待检测样品中的大肠杆菌DNA或先经过逆转录过程后用环介导等温核酸扩增技术扩增待检测样品中的大肠杆菌RNA；(2)纳米金颗粒探针与环介导等温核酸扩增技术产物DNA杂交；(3)杂交引发纳米金颗粒聚集，导致纳米金颗粒聚集处颜色改变，以此判断待检测样品是否含有大肠杆菌DNA或RNA

3.根据权利要求1，纳米金颗粒探针包括两个部分，一是纳米尺度的金颗粒，另一部分是固定在纳米金颗粒表面的分子探针，该探针可以识别大肠杆菌DNA的特定序列。

4.根据权利要求2，待检测样品中环介导等温核酸扩增技术的扩增对象可以大肠杆菌DNA、RNA或DNA和RNA的混合物。

5.根据权利要求2，纳米金颗粒探针和环介导等温核酸扩增技术产物DNA杂交可以和环介导等温核酸扩增反应在相同反应条件下、相同反应容器中同时进行。

6.根据权利要求2，纳米金颗粒探针和环介导等温核酸扩增技术产物DNA杂交可以发生在溶液中或者固体表面。

7.根据权利要求2，纳米金颗粒探针与环介导等温核酸扩增技术产物DNA杂交引发溶液或固体表面颜色改变，这种变化可由肉眼直接判断，也可利用分光光度计等光学仪器检测。

8.根据权利要求3，分子探针是指可以识别环介导等温核酸扩增技术产物DNA的功能分子，这些分子包括DNA，RNA，PNA，蛋白质，化学分子。

9.根据权利要求4，相同反应条件包括但不限于：溶液组成，成分浓度，PH值，温度，反应时间等。