CN116287427A - Raa-lfd检测鸭坦布苏病毒的引物和探针组合及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种RAA‑LFD检测鸭坦布苏病毒的引物和探针组合及其应用，属于禽病毒检测技术领域。所述引物和探针组合中的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示。采用本发明的引物和探针组合能够实现鸭坦布苏病毒的快速、灵敏、特异性检测，缩短了DTMUV的检测周期，提高了DTMUV的检测效率和准确性。

Description

RAA-LFD检测鸭坦布苏病毒的引物和探针组合及其应用

技术领域

本发明涉及禽病毒检测技术领域，具体涉及一种RAA-LFD检测鸭坦布苏病毒的引物和探针组合及其应用。

背景技术

鸭坦布苏病毒病(Duck Tembusu Virus Disease，DTVD)，是由鸭坦布苏病毒(DuckTembusu Virus，DTMUV)引起的一种以产蛋率下降、生长性能降低和雏鸭出现瘫痪为主要症状的传染性疾病，具有疾病产生迅速、传染范围大、传播速度快的流行特点，给我国的鸭产业造成了极大的损失，是目前较易发病感染的鸭病之一。DTMUV不但引起鸭、鹅等水禽发病，甚至从鸡、麻雀及等陆禽中也分离出该病毒，潜在危害巨大。

国内外对DTMUV的检测方法大体上可分为两类，一类为血清学检测方法，另一类为分子生物学检测方法。目前中华人民共和国海关总署发布SN/T5281-2020《禽坦布苏病毒检疫技术规范》中的行业标准包括临床诊断及实验室诊断，标准中的方法方便快捷，但受检疫人员临床检疫经验及实验室检测环境、人员操作等影响因素较多。中华人民共和国农业农村部NY/T3233-2018《鸭坦布苏病毒诊断技术》中认可方法包含血清学检测方法及分子生物学检测方法。血清中和试验，该方法费时费力，成本高，不适合大批量样品检测。ELISA试验操作简便对环境没有污染威胁，但重复性不好，受自身抗体等干扰，易出现假阳性，检测结果较容易受到外界环境的影响。PCR方法已广泛应用于病原的诊断，它具有快速、准确、敏感性高、特异性好等优点，但影响因素很多，容易有假阴性或假阳性结果的出现。荧光定量PCR检测技术具有比普通PCR更高的敏感性，且能在反应结束后即刻读取结果，而不需要将产物进行电泳来判断结果，但其依赖于标准曲线用于结果的测定。核酸标准物质是验证坦布苏病毒荧光定量PCR检测方法、检测试剂是否科学、可靠的关键，也是实验室质量控制的重要手段，因此核酸标准物质的研制可为精准化疫病防控提供技术保障，但是由于其所建立的标准质粒受环境影响较大。

重组酶介导等温核酸扩增技术(Recombinase-aided amplification，RAA)是一种新型恒温核酸快速扩增技术，是我国自主发明拥有专利的技术，现已广泛应用于动物学、植物学、微生物学、医学等众多领域中。RAA技术使用来自大肠杆菌的RecQ蛋白解旋模板核酸链。来自T4噬菌体的UvsX蛋白及T6噬菌体的UvsY蛋白替换模板引物之间的链，在重组酶Klenow(exo-)聚合酶作用下进行重组、核酸特异性扩增，目标基因可以是DNA、RNA、质粒DNA，所需要的反应温度在36℃～42℃之间，因此反应不需要特别昂贵的设备，反应时间在15～30min，即可实现核酸的指数级扩增。RAA试剂成本低廉，方便携带，反应时间短，可在偏远地区或基层检测机构使用。

重组酶介导扩增-侧向流层析技术(Recombinase-aid Amplification Lateralflow dipstic k，RAA-LFD)是在重组酶介导扩增技术(Recombinase-aid Amplification)的基础上，将反应下游引物5’端用生物素(biotin)进行标记，并在反应体系中加入一个长度46bp～52bp的nfo探针，该探针的5’端用6-羧基荧光素(FAM)标记，距离5’端超过30bp的位置用四氢呋喃(THF)残基标记，3’端被磷酸化阻断，距四氢呋喃「THF」残基15bp以上。反应后形成带有双标记产物，用包被生物素和FAM抗体的侧流试纸条(Lateral flow dipstick，LFD)实现现场快速检测。RAA-LFD具有较高的灵敏度，可实现结果可视化，且基本无额外购买其他任何辅助装备，仅需39℃恒温装置即可，极端条件下采用一个保温杯即可完成反应得出试验结果，适合病原体现场快速筛查，尤其适合实验设备简陋地区和应急情况，该技术目前已经在多种病原检测领域中获得广泛应用。

但目前还未见有利用RAA-LFD技术检测鸭坦布苏病毒的相关报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种RAA-LFD检测鸭坦布苏病毒的引物和探针组合及其应用。采用本发明的引物和探针组合能够实现鸭坦布苏病毒的快速、灵敏、特异性检测，缩短了DTMUV的检测周期，提高了DTMUV的检测效率和准确性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种RAA-LFD检测鸭坦布苏病毒的引物和探针组合，所述引物和探针组合中的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，探针序列如SEQ IDNO.3所示；

所述探针序列的修饰如下：

(1)探针的5’端连接有荧光基团FAM；

(2)探针的第25位碱基修饰[THF]；

(3)探针的3’端修饰C3-spacer。

上述引物和探针组合中，引物和探针的序列具体如下：

RAA-F：5’-GAAGAAAATGAACACATGGAAGACAAAAC-3’；(SEQ ID NO.1)

RAA-Biotin-R：5’-[Biotin]TGATCTGCATAATTGGAGTGTATATGTTCT-3’；(SEQ IDNO.2)

RAA-probe：5’-[FAM]AGATGGCTGGTGTGGTAGTCTGATT[THF]GGACATCGAGCTAGATCCA[C3-spacer]-3’；(SEQ ID NO.3)

本发明对探针进行了修饰处理，在探针中引入四氢呋喃(THF)修饰位点，四氢呋喃(THF)标记修饰核苷酸在DNA聚合酶作用下，可以几乎100％效率实现DNA链延伸。FAM是一种荧光基团，所述LFD试纸条的检测线上带有FAM荧光基团抗体，扩增产物上的FAM基团与检测线处的FAM抗体结合后，检测线上显示条带。C3间臂(C3spacer)为封闭基团，用于阻止探针自连后的扩增。

本发明的第二方面，提供上述引物和探针组合在制备检测鸭坦布苏病毒的试剂或试剂盒中的应用。

本发明的第三方面，提供一种检测鸭坦布苏病毒的试剂盒，所述试剂盒包含上述的引物和探针组合。

进一步的，所述试剂盒中还包括：RAA反应试剂和侧流层析试纸条。

优选的，所述RAA反应试剂包括：反应干粉、缓冲液VI、纯化水和乙酸镁。

本发明的第四方面，提供一种利用上述试剂盒检测鸭坦布苏病毒的方法，包括如下步骤：

提取待测样品DNA作为模板，利用试剂盒中的引物和探针组合进行RAA扩增，采用侧流层析试纸条对RAA扩增产物进行检测。

优选的，RAA扩增的反应体系为：反应干粉1管、缓冲液VI 25μL、上游引物2.1μL、下游引物2.1μL、探针0.6μL、纯化水16.7μL、乙酸镁2.5μL、样本1.0μL；反应体系中，上游引物和下游引物的终浓度均为10μM；探针的终浓度为3μM。

优选的，RAA扩增的条件为：39℃恒温反应30min。

优选的，采用侧流层析试纸条对RAA扩增产物进行检测的方法为：将RAA-LFD扩增产物滴加到侧流层析试纸条的检测区域内，然后将侧流层析试纸条插入到试纸条缓冲液中，观察结果。

反应干粉1管、缓冲液VI和试纸条缓冲液均为商业化试剂盒中的组分，购自杭州众测生物科技有限公司。

本发明的有益效果：

本发明从动物疫病防控的实际出发，建立了一种高效、敏感、准确的RAA-LFD检测方法用于DTMUV的快速检测。缩短了该病原的检测周期，提高了DTMUV的检测效率和准确性。

附图说明

图1：RAA-LFD体系优化；A：1-4：探针浓度1～4μM；5：阴性对照；B：1-4：引物浓度8～11μM；5：阴性对照；C：1-4：反应时间20～35min；5：阴性对照。

图2：RAA-LFD特异性考察结果；图中，1：阴性对照；2：DTMUV；3-8：H9N2；ALV；NDV；DHV；REOV；IBDV。

图3：RAA-LFD灵敏性考察结果；图中，1：阴性对照；2-9：10⁰-10⁷copies/μL质粒标准品。

图4：RAA-LFD重复性考察结果；图中，1：阴性对照；2-4：10copies/μL质粒标准品。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明实施例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件，如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；或者按照制造厂商建议的条件。

实施例1：鸭坦布苏病毒标准阳性质粒的建立

生工生物工程(上海)有限公司合成目的基因片段，克隆至pBlueScript SK(+)载体，命名为pBlue-NS5。用质粒小提试剂盒提取pBlue-NS5质粒。用超微量核酸蛋白浓度分析仪测定提取质粒的浓度，计算出质粒拷贝数。将质粒稀释成拷贝数浓度分别为10⁶copy/μL、10⁵copy/μL、10⁴copy/μL、10³copy/μL、10²copy/μL、10¹copy/μL，作为鸭坦布苏病毒标准阳性质粒。

所合成的目的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体如下：TGTGGAACAGGGTGTGGATTGAAGAAAATGAACACATGGAAGACAAAACCCCAGTGACTTCATGGAACGAAGTGCCATACCTTGGAAAGAGGGAAGATGGCTGGTGTGGTAGTCTGATTGGACATCGAGCTAGATCCACCTGGGCCGAGAACATATACACCCCAATTATGCAGATCAGAGCTCTCATTGGCCCTGAGCACTATGTGGATTACATGCCAACTCTAAACAGGTTCAA。

实施例2：鸭坦布苏病毒RAA-LFD检测方法的建立与优化

1.RAA引物与探针的设计

RAA扩增的关键在于扩增引物和探针的设计。不同于常规的PCR检测，有关RAA引物和探针设计的相关数据较少，目前尚无用于设计的软件或成熟的原则。

为设计能够用于鸭坦布苏病毒检测的RAA引物与探针，本发明选择鸭坦布苏病毒的非结构蛋白NS5基因的保守序列(gaagaaaatgaacacatggaagacaaaaccccagtgacttcatggaacgaagtgccataccttggaaagagggaagatggctggtgtggtagtctgattggacatcgagctagatccacctgggccgagaacatatacaccccaattatgcagatca，如SEQ ID NO.5所示)作为RAA引物与探针设计的靶标区域，设计了4条上游引物、4条下游引物和1条探针(表1)。

表1：引物及探针

以实施例1构建的鸭坦布苏病毒标准阳性质粒为模板；同时为每一组引物探针组合均设置一组阴性对照，阴性对照不加模板，模板体积用水补足。

比较不同引物探针组合的扩增效率和假阳性率，结果如表2所示。

表2：引物探针组合的筛选

组合	扩增效率	假阳性率
			RAA-F1+RAA-R1+probe	++	-
RAA-F2+RAA-R2+probe	+	+
			RAA-F3+RAA-R3+probe	++++	-
RAA-F4+RAA-R4+probe	++	-

注：“+”的数量越多，表示相应的扩增效率或假阳性率的值越高；“-”表示结果为阴性。

从表2的扩增效率和假阳性率的结果可知：RAA-F3+RAA-R3+probe组合的效果最优，用于后续RAA检测体系的优化。

2.RAA-LFD检测体系的优化

在优化设计得到RAA引物与探针之后，本发明进一步对RAA-LFD检测体系进行了优化，具体为：

探索确定RAA-LFD最佳反应体系。体系组成为：RT-RAA核酸扩增试盒(探针法)：反应干粉1管、缓冲液Ⅵ25μL、纯化水16.7μL、乙酸镁2.5μL、样本1.0μL，上下游引物终浓度分别为8μmol/L、9μmol/L、10μmol/L、11μmol/L，探针终浓度为分别为1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L，反应扩增时间分别为20min、25min、30min、35min。反应条件为39℃。

根据反应体系优化结果(图1)及节约成本等各方面进行考虑，以构建的阳性质粒标准品10⁵copies/μL为模版，最终反应体系为：反应干粉1管、缓冲液Ⅵ25μL、上游引物2.1μL、下游引物2.1μL、探针0.6μL、纯化水16.7μL、乙酸镁2.5μL、样本1.0μL，引物浓度为10μM，探针浓度3μM，反应总体系为50μL。

扩增体系配置完成后，充分振荡混匀，离心完毕后将反应管于39℃恒温水浴锅中放置30min。取出反应管，取8-10μL样品混合液滴入试纸条检测区域内，向微孔板中滴入约100-150μL试纸条缓冲液。

实施例2：RAA-LFD检测方法的方法学考察

1、特异性考察：

分别以本实验室保存的H9N2、ALV、NDV、DHV、REOV、IBDV的质粒或cDNA为模板，与阳性标准质粒的10copies/μL质粒模板进行扩增比对。

结果如图2所示，除DTMUV质粒于检测区有明显红色条带外，其余样品检测区均无红色条带且质控线有条带，表明试验成立，与其他病毒无交叉反应，说明RAA-LFD检测方法拥有良好的特异性。

2.灵敏度考察：

以构建的DTMUV阳性质粒标准品10⁰copies/μL-10⁷copies/μL浓度梯度为模版，同时设置水对照，在RAA-LFD鉴别方法最佳条件下进行扩增反应，结果如图3所示。所有试纸条均有质控线，证明试纸条检测结果有效，从10⁰copies/μL-10⁷copies/μL检测线随浓度模版的增大而颜色逐渐变深的现象。因此，DTMUV病毒的RAA-LFD鉴别方法检测下限均为10copies/μL的质粒标准品。

3.重复性考察：

选取3份10copies/μL的质粒，使用RAA-LFD检测方法进行重复性试验，同时设立空白双蒸水作为阴性对照，结果显示RAA-LFD检测方法能够稳定检出10copies/μL的病毒量，结果如图4所示。结果显示，所有试纸条质量控线均能正常显色且阴性对照成立，检测结果有效，3个不同梯度的阳性模版均能稳定显示检测线，可以稳定检出，证实该方法具有良好的重复性。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种RAA-LFD检测鸭坦布苏病毒的引物和探针组合，所述引物和探针组合中的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示；

所述探针序列的修饰如下：

(1)探针的5’端连接有荧光基团FAM；

(2)探针的第25位碱基修饰[THF]；

(3)探针的3’端修饰C3-spacer。

2.权利要求1所述的引物和探针组合在制备检测鸭坦布苏病毒的试剂或试剂盒中的应用。

3.一种检测鸭坦布苏病毒的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物和探针组合。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：RAA反应试剂和侧流层析试纸条。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述RAA反应试剂包括：反应干粉、缓冲液VI、纯化水和乙酸镁。

6.一种利用权利要求3-5任一项所述的试剂盒检测鸭坦布苏病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

提取待测样品DNA作为模板，利用试剂盒中的引物和探针组合进行RAA扩增，采用侧流层析试纸条对RAA扩增产物进行检测。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，RAA扩增的反应体系为：反应干粉1管、缓冲液VI 25μL、上游引物2.1μL、下游引物2.1μL、探针0.6μL、纯化水16.7μL、乙酸镁2.5μL、样本1.0μL；反应体系中，上游引物和下游引物的终浓度均为10μM；探针的终浓度为3μM。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，RAA扩增的条件为：39℃恒温反应30min。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，采用侧流层析试纸条对RAA扩增产物进行检测的方法为：将RAA-LFD扩增产物滴加到侧流层析试纸条的检测区域内，然后将侧流层析试纸条插入到试纸条缓冲液中，观察结果。

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