CN110684853A - 快速检测细菌的引物、试剂盒及其应用 - Google Patents

快速检测细菌的引物、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及快速检测细菌的引物、试剂盒及其应用，属于细菌检测技术领域。本发明提供了快速检测细菌的引物，所述检测用正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述正向引物中的简并碱基W＝A/T，所述反向引物中的简并碱基R＝A/G。本发明所述引物能够实现细菌的快速、广泛、高灵敏度、可定量的检测，应用于细菌检测领域，更适用于细胞以及干细胞产品临床研究和应用中。

Description

快速检测细菌的引物、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及细菌检测技术领域，具体涉及快速检测细菌的引物、试剂盒及其应用。
背景技术
细菌在自然界分布广泛、种类多、繁殖快、体积小，在临床研究和应用中容易造成细胞污染，危害极大。抗生素能够预防污染和感染，但并不能完全阻止细菌生长，因此对于细菌的实时检测在临床研究中尤为重要。
在《中国药典》中无菌检测的方法主要是培养法，培养法作为无菌检测的金标准检测方法，准确度高，但报告结果通常需要14d，对于生长缓慢的细菌培养时间更长。而临床使用的细胞对细胞的存活率和生长活性要求极高，长时间等待结果再用于临床会影响细胞疗效，尤其是干细胞临床的使用。《干细胞制剂质量控制和临床前研究指导原则》中要求干细胞检测的十大项，其中包括无菌试验，并指出放行检验项目应能在相对短的时间内，反映细胞制剂的质量及安全信息。因此探索能快速检测细菌的方法是临床研究亟待解决的问题。目前有用全自动微生物生化鉴定系统例如梅里埃等检测细菌，是根据生物孔中的生长变化和呈色反应得到结果，该方法操作简单，但仪器成本高，报告结果通常也需要5d。目前还有商业化的快速检测试纸片法，只需培养24h，但该方法易出现假阴性的结果。特异酶的使用、质谱技术、免疫传感器和免疫磁性分离技术特异性高，针对特定的细菌灵敏度高，但广泛性差，对于未知的细菌检测不适用。
发明内容
本发明的目的在于提供快速检测细菌的引物及试剂盒。本发明所述引物能够实现细菌的快速、广泛、高灵敏度、可定量的检测，可应用于细胞产品，尤其是干细胞产品的临床检测及研究中。
本发明提供了快速检测细菌的引物，所述检测用正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述正向引物中的简并碱基W＝A/T，所述反向引物中的简并碱基R＝A/G。
本发明还提供了一种快速检测细菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述引物和标准品。
优选的是，所述标准品包括含16S rDNA保守区部分序列的pUC57质粒，所述16SrDNA保守区部分序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的是，所述引物的使用浓度为100～400nM。
优选的是，所述试剂盒的Q-PCR反应条件为：95℃，10min；95℃，20s，58℃，30s，72℃，30s，40个循环；95℃，15s，60℃，1min，95℃，15s，60℃，15s。
优选的是，所述试剂盒的普通PCR的反应条件分为95℃，10min；95℃，20s，58℃，30s，72℃，30s，35个循环；72℃，5min。
本发明还提供了上述技术方案所述试剂盒在细菌检测中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述试剂盒在细胞中细菌检测的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述试剂盒在干细胞中细菌检测的应用。
本发明提供了快速检测细菌的引物。本发明提供的引物能利用核酸扩增技实现对细菌的检测。相比传统的细菌检测(至少需要14d)，本发明所述引物2～3h即可实现对细菌的检测。本发明所述引物能检测出含有上下游引物的所有菌种，包括大肠杆菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、链球菌、变性杆菌和肺炎克雷伯菌等。本发明所述引物能够实现细菌的快速、广泛、高灵敏度、可定量的检测，可应用于细胞产品，尤其是干细胞产品的临床检测及研究中。
附图说明
图1为本发明提供的标准曲线；
图2为本发明提供的普通PCR法检测菌种结果图；
图3为本发明提供的普通PCR法检测人源和鼠源细胞结果图。
具体实施方式
本发明提供了快速检测细菌的引物，所述检测用正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述正向引物中的简并碱基W＝A/T，所述反向引物中的简并碱基R＝A/G。
本发明对所述引物的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规引物人工合成方法即可，如由上海捷瑞生物工程有限公司合成。本发明所述正向引物具体核苷酸序列为：5’-CGAWGCAACGCGAAGAACC-3’；反向引物为：5’-CACCTTCCTCCRGTTTRT-3’。本发明通过BLAST和BioEdit软件对比分析细菌16S rDNA保守区部分序列，并依照该序列设计引物。本发明所述引物能检测含有上下游引物的所有菌种，包括多种常见细菌，大肠杆菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、链球菌、变性杆菌、肺炎克雷伯菌等；且与标准品TM相差不超过2℃，细菌之间TM相差不超过2℃。本发明所述引物特异性好，对非细菌种属如人免疫细胞、大鼠细胞基因序列检测结果为阴性。本发明所述引物可以根据实际情况检测多个菌种混合的细菌污染情况。
本发明还提供了快速检测细菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述引物和标准品。在本发明中，所述标准品包括含16S rDNA保守区部分序列的pUC57质粒，所述16SrDNA保守区部分序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：
ATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGG。
在本发明中，16S rDNA保守区部分序列的核苷酸序列优选由上海捷瑞生物工程有限公司合成。在本发明中，所述标准品优选用1×TE buffer稀释。本发明对所述试剂盒其它组分没有特殊限定，采用常规Q-PCR和常规PCR常用的其它PCR组分即可，如当进行Q-PCR检测时，优选从Promega公司购买，货号A6002与本发明所述引物和标准品配合使用；当进行普通PCR检测时，优选从天根公司购买，货号KT205的试剂盒与本发明所述引物和标准品配合使用。本发明优选利用标准品建立标准曲线，本发明能检测的DNA拷贝数范围在1.2×102～3×107copies。在本发明中，所述引物的使用浓度为100～400nM。引物浓度越高，扩增效率越好，但特异性稍差，需根据不同仪器和试剂调节最适浓度。在本发明中，所述试剂盒的Q-PCR反应条件为：95℃，10min；95℃，20s，58℃，30s，72℃，30s，40个循环；95℃，15s，60℃，1min，95℃，15s，60℃，15s。本发明使用Q-PCR反应的扩增效率为86％，R2为0.9971。在本发明中，所述试剂盒的普通PCR的反应条件分为95℃，10min；95℃，20s，58℃，30s，72℃，30s，35个循环；72℃，5min。在本发明中，所述普通PCR的反应体系优选为20μl，其中正向引物100～400nM，反向引物100～400nM。在本发明中，普通PCR中优选使用2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，120V，20min，DL2000为Marker。在本发明中，所述待检测样本优选进行预处理在进行检测，所述预处理的方法优选为直接100℃处理10min，不需抽提RNA和反转录过程。在本发明中，所述待检测样本优选为上清，用量小，1μl样本即可用于检测。
当采用Q-PCR方法进行检测时，QPCR检测样本CT值若>35或CT值<35但TM值与阳性标准品TM值相差>2℃，即为阴性；普通PCR法中在229bp处未出现条带即为阴性。
本发明还提供了上述技术方案所述试剂盒在细菌检测中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述试剂盒在细胞中无菌检测的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述试剂盒在干细胞中无菌检测的应用。
下面结合具体实施例对本发明所述的快速检测细菌的引物、试剂盒及其应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。实施例1
一、引物和标准品的准备
1、本发明正向引物：5`-CGAWGCAACGCGAAGAACC-3`；反向引物：5`-CACCTTCCTCCRGTTTRT-3`。由捷瑞公司合成，12000g离心1min，正反引物各加水溶解至浓度为100μM，取2μl加入18μl水中稀释至10μM，剩余引物放入-20℃保存。
2、本发明的标准品是含有16S rDNA保守区部分序列的pUC57质粒，由捷瑞公司合成。pUC57碱基数为2710bp。16S rDNA部分保守区序列为：ATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGG，碱基数为229bp。标准品用1×TEbuffer溶解，得到浓度为216.7ng/μl，计算出拷贝数为6.6×1010copies/μl。
二、标准曲线制备及灵敏限度检测
1、标准品稀释：取200μlPCR小管，其中加入1×TE buffer稀释标准品。标准品从原液开始10倍梯度稀释12个浓度。
2、QPCR体系配制：反应体系总体积为20μl，其中正向引物300nM，反向引物300nM，模板1μl。反应条件分为三个阶段，第一阶段为预变性阶段，95℃，10min；第二阶段为PCR反应阶段，95℃，20s，58℃，30s，72℃，30s，40cycle；第三阶段扩增产物熔解阶段，95℃，15s，60℃，1min，95℃，15s，60℃，15s。
3、根据表格中质粒不同拷贝数的CT值结果，得出标准曲线，如表1、图1所示，y＝-1.63ln(x)+43.032，R2＝0.9971，根据CT值在15-35范围内有参考意义，本发明能检测的DNA拷贝数范围在1.2×102-3×107copies。
表1不同拷贝数的CT值
Figure BDA0002093152660000051
本发明用含有16S rDNA保守区部分序列的pUC57质粒建立标准曲线，本发明能检测的DNA拷贝数范围在1.2×102-3×107copies。本发明使用QPCR反应的扩增效率为86％，R2为0.9971。
三、QPCR法和普通PCR法检测常见细菌及混合菌
1、样本预处理：将待检测样本直接100℃处理10min，12000g离心5min。样本包括大肠杆菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、链球菌、变性杆菌、肺炎克雷伯菌以及上述8种菌的混合。
2、QPCR反应体系和条件同二中2步骤。
3、普通PCR体系配制：反应体系总体积为20μl，其中正向引物300nM，反向引物300nM，样本量1μl。反应条件：第一阶段为预变性阶段，95℃，30s；第二阶段为PCR反应阶段，95℃，20s，58℃，30s，72℃，30s，35cycle；第三阶段扩增产物延伸，72℃，5min。电泳过程使用2％的琼脂糖凝胶，120V，20min。DL2000为Marker。
普通PCR法检测菌种结果如图2所示，从左往右依次是大肠杆菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、链球菌、变性杆菌、肺炎克雷伯菌、混合菌、阳性质粒(2.17ng/μl)、阴性对照、Marker。
本发明能通过普通PCR法检测含有上下游引物的所有菌种，包括多种常见细菌，大肠杆菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、链球菌、变性杆菌、肺炎克雷伯菌及几种混合菌。
表2、QPCR法检测不同菌种
Figure BDA0002093152660000061
Figure BDA0002093152660000071
由表2可知，本发明能通过荧光定量PCR法检测含有上下游引物的所有菌种，包括多种常见细菌，大肠杆菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、链球菌、变性杆菌、肺炎克雷伯菌及几种混合菌。
四、QPCR法和普通PCR法检测人源和鼠源细胞
人源和鼠源细胞的检测
取冻存的人免疫细胞、大鼠干细胞，用PBS清洗3遍后，用DNA抽提试剂盒抽提DNA，再取DNA用本发明检测，检测方法同二中2、三中3步骤。
普通PCR法检测人源和鼠源细胞结果图如图3所示，从左往右依次是阳性质粒(2.17ng/μl)、人源基因(96.6ng/μl)、鼠源基因(60.7ng/μl)、阴性对照、Marker。
本发明方法中16S rDNA部分保守区序列具有特异性，通过普通PCR法检测不出非细菌种属如人免疫细胞、大鼠细胞基因序列。
表3、QPCR法检测人源和鼠源细胞
基因 CT值
人源 37.0262
鼠源 Undetermined
阴性对照 38.2187
阳性对照 16.9201
由表3可知，本发明方法中16S rDNA部分保守区序列具有特异性，通过荧光定量PCR法检测不出非细菌种属如人免疫细胞、大鼠细胞基因序列。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海市东方医院（同济大学附属东方医院）
<120> 快速检测细菌的引物、试剂盒及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgawgcaacg cgaagaacc 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caccttcctc crgtttrt 18
<210> 3
<211> 229
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
attcgatgca acgcgaagaa ccttacctgg tcttgacatc cacagaactt tccagagatg 60
gattggtgcc ttcgggaact gtgagacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgttgt 120
gaaatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat cctttgttgc cagcggtccg 180
gccgggaact caaaggagac tgccagtgat aaactggagg aaggtgggg 229

Claims (9)

1.快速检测细菌的引物，其特征在于，所述检测用正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述正向引物中的简并碱基W＝A/T，所述反向引物中的简并碱基R＝A/G。
2.一种快速检测细菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物和标准品。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品包括含16S rDNA保守区部分序列的pUC57质粒，所述16S rDNA保守区部分序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物的使用浓度为100～400nM。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的Q-PCR反应条件为：95℃，10min；95℃，20s，58℃，30s，72℃，30s，40个循环；95℃，15s，60℃，1min，95℃，15s，60℃，15s。
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的普通PCR的反应条件分为95℃，10min；95℃，20s，58℃，30s，72℃，30s，35个循环；72℃，5min。
7.权利要求1～6任一项所述试剂盒在细菌检测中的应用。
8.权利要求1～6任一项所述试剂盒在细胞中细菌检测的应用。
9.权利要求1～6任一项所述试剂盒在干细胞中细菌检测的应用。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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