CN112567038A - 包含环状多核糖核苷酸的组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明总体上涉及环状多核糖核苷酸的药物组合物和制剂及其用途。

Description

包含环状多核糖核苷酸的组合物及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求以下的优先权并从中受益：2018年7月24日提交的美国临时申请号62/702,714；2019年3月25日提交的62/823,569；以及2019年6月19日提交的62/863,670，其每一个的全部内容通过引用并入本文。
背景
某些环状多核糖核苷酸(polyribonucleotide)普遍存在于人的组织和细胞中，包括健康个体的组织和细胞。
概述
本文所述的本发明包括包含环状多核糖核苷酸的组合物及其使用方法。
在一些方面，一种在细胞中结合靶的方法包括提供不能翻译的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含适体序列，其中所述适体序列具有结合所述靶的二级结构；并且将所述不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸与所述靶形成在递送后至少5天是可检测的复合物。在一些实施例中，靶选自由以下组成的组：核酸分子、小分子、蛋白、碳水化合物和脂质。在一些实施例中，靶是基因调控蛋白。在一些实施例中，基因调控蛋白是转录因子。在一些实施例中，核酸分子是DNA分子或RNA分子。在一些实施例中，复合物调节基因表达。在一些实施例中，复合物调节DNA分子的定向转录，DNA分子的表观遗传重塑或DNA分子的降解。在一些实施例中，复合物调节靶的降解、靶的易位或靶信号转导。在一些实施例中，基因表达与疾病或病症的发病机理有关。在一些实施例中，复合物在递送后至少7、8、9或10天是可检测的。在一些实施例中，不能翻译的环状多核糖核苷酸在递送后至少五天存在。在一些实施例中，不能翻译的环状多核糖核苷酸在递送后至少6、7、8、9或10天存在。在一些实施例中，不能翻译的环状多核糖核苷酸是未修饰的不能翻译的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，不能翻译的环状多核糖核苷酸具有准双链(quasi-double-stranded)二级结构。在一些实施例中，适体序列进一步具有结合靶的三级结构。在一些实施例中，细胞是真核细胞。在一些实施例中，真核细胞是人细胞。
在一些方面，在细胞中结合转录因子的方法包括提供不能翻译的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含与所述转录因子结合的适体序列；并且将所述不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸与所述转录因子形成复合物并调节基因表达。
在一些方面，在细胞中螯合转录因子的方法包括：提供不能翻译的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含与所述转录因子结合的适体序列；并且将所述不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸通过结合所述转录因子而螯合所述转录因子以在所述细胞中形成复合物。在一些实施例中，复合物形成后细胞活率降低。
在一些方面，使细胞对细胞毒性剂敏感的方法包括提供不能翻译的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含与转录因子结合的适体序列；并且将所述细胞毒性剂和所述不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸在所述细胞中与所述转录因子形成复合物；从而使所述细胞与缺少所述不能翻译的环状多核糖核苷酸的细胞相比对所述细胞毒性剂敏感。在一些实施例中，使细胞对细胞毒性剂敏感导致在递送所述细胞毒性剂和所述不能翻译的环状多核糖核苷酸后细胞活率降低。在一些实施例中，在递送细胞毒性剂和不能翻译的环状多核糖核苷酸后至少两天，降低的细胞活率是降低40％或更多。
在一些方面，在细胞中结合致病蛋白的方法包括：提供不能翻译的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含结合所述致病蛋白的适体序列；并且将所述不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸与所述致病蛋白形成复合物以降解所述致病蛋白。
在一些方面，结合细胞中核糖核酸分子的方法包括：提供不能翻译的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含与所述核糖核酸分子的序列互补的序列；并且将所述不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸与所述核糖核酸分子形成复合物。
在一些方面，在细胞中结合基因组脱氧核糖核酸分子的方法包括提供不能翻译的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含与所述基因组脱氧核糖核酸分子结合的适体序列；并且将所述不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸与所述基因组脱氧核糖核酸分子形成复合物并调节基因表达。
在一些方面，在细胞中结合小分子的方法包括提供不能翻译的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含与所述小分子结合的适体序列；并且将所述不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸与所述小分子形成复合物并调节细胞过程。在一些实施例中，小分子是分子量不超过900道尔顿并且调节细胞过程的有机化合物。在一些实施例中，小分子是药物。在一些实施例中，小分子是荧光团。在一些实施例中，小分子是代谢物。
在一些方面，组合物包含不能翻译的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含适体序列，其中所述适体序列具有结合靶的二级结构。
在一些方面，药物组合物包含不能翻译的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含适体序列，其中所述适体序列具有结合所述靶的二级结构；和药学上可接受的载剂或赋形剂。
在一些方面，细胞包含本文所述的不能翻译的环状多核糖核苷酸。
在一些方面，治疗有需要的受试者的方法包括施用如本文所述的组合物或如本文所述的药物组合物。
在一些方面，多核苷酸是编码如本文所述的不能翻译的环状多核糖核苷酸的多核苷酸。
在一些方面，方法是产生本文所述的不能翻译的环状多核糖核苷酸的方法。
在一些方面，药物组合物包含环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含结合靶的结合位点，所述靶例如是RNA、DNA、蛋白、细胞的膜等；和药学上可接受的载剂或赋形剂；其中所述靶和所述环状多核糖核苷酸形成复合物，并且其中所述靶不是微小RNA。在一些方面，药物组合物包含环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含：结合第一靶的第一结合位点，和结合第二靶的第二结合位点；和药学上可接受的载剂或赋形剂；其中所述第一结合位点不同于所述第二结合位点，并且其中所述第一靶和所述第二靶均为微小RNA。在一些实施例中，结合位点包含适体序列。在一些实施例中，第一结合位点包含第一适体序列，第二结合位点包含第二适体序列。在一些实施例中，适体序列具有结合靶的二级结构。在一些实施例中，第一适体序列具有结合第一靶的二级结构，并且第二适体序列具有结合第二靶的二级结构。在一些实施例中，结合位点是第一结合位点，而靶是第一靶。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸进一步包含与第二靶结合的第二结合位点。在一些实施例中，第一靶包含第一环状多核糖核苷酸(circRNA)结合基序。在一些实施例中，第二靶包含第二环状多核糖核苷酸(circRNA)结合基序。在一些实施例中，第一靶、第二靶和环状多核糖核苷酸形成复合物。在一些实施例中，第一和第二靶彼此相互作用。在一些实施例中，复合物调节细胞过程。在一些实施例中，第一靶和第二靶是相同的，并且第一结合位点和第二结合位点结合第一靶和第二靶上的不同结合位点。在一些实施例中，第一靶和第二靶是不同的。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸进一步包含结合第三或更多靶的一个或多个另外结合位点。在一些实施例中，一个或多个靶是相同的，并且一个或多个另外的结合位点结合一个或多个靶上的不同结合位点。在一些实施例中，复合物的形成调节细胞过程。在一些实施例中，当与第一靶或第二靶接触时，环状多核糖核苷酸调节与第一靶或第二靶相关的细胞过程。在一些实施例中，第一靶和第二靶在复合物中彼此相互作用。在一些实施例中，细胞过程与疾病或病症的发病机理有关。在一些实施例中，细胞过程不同于环状多核糖核酸的翻译。在一些实施例中，第一靶包含脱氧核糖核酸(DNA)分子，并且第二靶包含蛋白。在一些实施例中，复合物调节DNA分子的定向转录，DNA分子的表观遗传重塑或DNA分子的降解。在一些实施例中，其中第一靶包含第一蛋白，并且第二靶包含第二蛋白。在一些实施例中，其中复合物调节第一蛋白的降解、第一蛋白的易位、或信号转导，或调节天然蛋白功能，抑制或调节通过第一蛋白和第二蛋白之间的直接相互作用形成的复合物的形成。在一些实施例中，第一靶或第二靶是泛素连接酶。在一些实施例中，第一靶包含第一核糖核酸(RNA)分子，并且第二靶包含第二RNA分子。在一些实施例中，复合物调节第一RNA分子的降解。在一些实施例中，第一靶包含蛋白，并且第二靶包含RNA分子。在一些实施例中，复合物调节蛋白的易位或抑制通过蛋白和RNA分子之间的直接相互作用形成的复合物的形成。在一些实施例中，第一靶是受体，并且第二靶是受体的底物。在一些实施例中，复合物抑制受体的激活。
在一些方面，药物组合物包含环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含结合靶的结合位点；和药学上可接受的载剂或赋形剂；其中所述环状多核糖核苷酸是不能翻译或翻译有缺陷的，并且其中所述靶不是微小RNA。在一些方面，药物组合物包含环状多核糖核酸，所述环状多核糖核酸包含结合靶的结合位点，其中所述靶包含核糖核酸(RNA)结合基序；和药学上可接受的载剂或赋形剂；其中所述环状多核糖核苷酸是不能翻译或翻译有缺陷的，并且其中所述靶是微小RNA。在一些实施例中，结合位点包含具有结合靶的二级结构的适体序列。在一些实施例中，靶包含DNA分子。在一些实施例中，靶与环状多核糖核苷酸的结合调节DNA分子的转录干扰。在一些实施例中，靶包含蛋白。在一些实施例中，靶与环状多核糖核苷酸的结合调节蛋白与其他分子的相互作用。在一些实施例中，蛋白是受体，并且靶与环状多核糖核苷酸的结合激活受体。在一些实施例中，蛋白是第一酶，其中环状多核糖核苷酸进一步包含与第二酶结合的第二结合位点，并且其中第一酶和第二酶与环状多核糖核苷酸的结合调节第一酶和第二酶的酶促活性。在一些实施例中，蛋白是泛素连接酶。在一些实施例中，靶包含信使RNA(mRNA)分子。在一些实施例中，靶与环状多核糖核苷酸的结合调节mRNA分子的翻译的干扰。在一些实施例中，靶包含核糖体。在一些实施例中，靶与环状多核糖核苷酸的结合调节翻译过程的干扰。在一些实施例中，靶包含环状RNA分子。在一些实施例中，靶与环状多核糖核苷酸的结合螯合环状RNA分子。在一些实施例中，靶与环状多核糖核苷酸的结合螯合微小RNA分子。
在一些方面，药物组合物包含环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含：与细胞的膜(例如，细胞壁膜，细胞器膜等)结合的结合位点，其中所述细胞的所述膜包含核糖核酸(RNA)结合基序；和药学上可接受的载剂或赋形剂。在一些实施例中，结合位点包含具有结合细胞的膜(例如，细胞壁膜，细胞器膜等)的二级结构的适体序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸进一步包含与第二靶结合的第二结合位点，其中所述第二靶包含第二RNA结合基序。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸与细胞的膜和第二靶结合。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸进一步包含与第二细胞靶结合的第二结合位点，并且其中细胞靶和第二细胞靶与环状多核糖核苷酸的结合诱导细胞靶中的构象变化，从而诱导细胞靶的下游的信号转导。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸是不能翻译的或翻译有缺陷的。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸进一步包含至少一种选自下组的结构元件，该组由以下组成：a)加密原(encryptogen)；b)剪接元件；c)调控性序列；d)复制序列；e)准双链二级结构；f)准螺旋(quasi-helical)结构；以及g)表达序列。在一些实施例中，准螺旋结构包含至少一个双链RNA区段和至少一个非双链区段。在一些实施例中，准螺旋结构包含与重复序列连接的第一序列和第二序列。在一些实施例中，所述加密原包含剪接元件。在一些实施例中，环状多核糖核酸包含至少一种经修饰的核酸。在一些实施例中，至少一种经修饰的核酸选自由以下组成的组：2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1’,5’-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸和2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺。在一些实施例中，加密原包含至少一种经修饰的核酸。在一些实施例中，加密原包含蛋白结合位点。在一些实施例中，加密原包含免疫蛋白结合位点。在一些实施例中，环状多核糖核酸的免疫原性比缺少加密原的对应物低至少2倍，如通过RIG-I、TLR-3、TLR-7、TLR-8、MDA-5、LGP-2、OAS、OASL、PKR和IFN-β中的至少一个的表达、信号传导或激活所评估。在一些实施例中，环状多核糖核酸的大小为约20个碱基至约20kb。在一些实施例中，环状多核糖核酸通过线性多核苷酸的环化来合成。在一些实施例中，环状多核糖核酸基本上抗降解。
在一些方面，药物组合物包含环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含结合靶的结合位点，其中所述靶包含核糖核酸(RNA)结合基序；和药学上可接受的载剂或赋形剂，其中所述环状多核糖核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸和含有至少约5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个连续的未修饰核苷酸的第一部分。在一些方面，药物组合物包含环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含结合靶的结合位点，其中所述靶包含核糖核酸(RNA)结合基序；和药学上可接受的载剂或赋形剂，其中所述环状多核糖核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸和含有至少约5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个连续的核苷酸的第一部分，并且其中所述第一部分缺少假尿苷或5’-甲基胞苷。在一些实施例中，结合位点包含具有结合靶的二级结构的适体序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的免疫原性低于相应的未修饰的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核酸具有比相应的未修饰的环状多核糖核酸低至少约1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0倍的免疫原性，如通过由RIG-I、TLR-3、TLR-7、TLR-8、MDA-5、LGP-2、OAS、OASL、PKR和IFN-β组成的组中的至少一个的表达或信号传导或激活所评估。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的半衰期高于相应的未修饰的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的半衰期比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸高至少约1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0倍。在一些实施例中，通过以下来测量半衰期：将环状多核糖核苷酸或相应的未修饰的环状多核糖核苷酸引入细胞并且测量细胞内引入的环状多核糖核苷酸或相应的环状多核糖核苷酸的水平。在一些实施例中，至少一种经修饰的核苷酸选自由以下组成的组：N(6)甲基腺苷(m6A)、5’-甲基胞苷和假尿苷。在一些实施例中，至少一种经修饰的核酸选自由以下组成的组：2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1’,5’-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸和2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的核苷酸是经修饰的核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含由未修饰的核苷酸组成的结合位点，所述结合位点结合蛋白、DNA、RNA或细胞靶。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含由未修饰的核苷酸组成的内部核糖体进入位点(IRES)。在一些实施例中，结合位点由未修饰的核苷酸组成。在一些实施例中，结合位点包含由未修饰的核苷酸组成的IRES。在一些实施例中，第一部分包含结合蛋白、DNA、RNA或细胞靶的结合位点。在一些实施例中，第一部分包含IRES。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列和IRES，并且其中环状多核糖核苷酸在IRES之外包含5’-甲基胞苷、假尿苷或其组合。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列被配置为具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸更高的翻译效率。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸高至少约0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8或3倍的翻译效率。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列的翻译效率比具有包含经修饰的核苷酸的第一部分的相应环状多核糖核苷酸更高。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列的翻译效率比具有包含超过10％的经修饰的核苷酸的第一部分的相应环状多核糖核苷酸更高。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列具有比相应环状多核糖核苷酸(其具有包含经修饰的核苷酸的第一部分)高至少约1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、或10.0倍的翻译效率。在一些实施例中，翻译效率是在包含环状多核糖核苷酸或相应的环状多核糖核苷酸的细胞中或在体外翻译系统(例如，兔网状细胞裂解物中)中测量的。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸是公开的实施例中任一个的环状多核糖核苷酸。
在一些方面，治疗方法包括对患有疾病或病症的受试者施用前述公开的实施例中任一个的药物组合物。
在一些方面，制备药物组合物的方法包括产生所公开实施例中任一个的环状多核糖核苷酸。
在一些方面，将实施例中任一个的组合物配制在载剂例如膜或脂质双层中。
在一些方面，制备所公开实施例中任一个的环状多核糖核苷酸的方法包括将具有核酸序列的线性多核糖核苷酸环化为环状多核糖核苷酸。
在一些方面，工程化的细胞包含所公开实施例中任一个的组合物。
通过引用并入
本说明书中提到的所有公开、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度如同明确地和单独地指明将各篇公开、专利或者专利申请通过引用并入本文。
附图说明
本专利或申请文件包含至少一个彩色附图。应请求并且支付必要的费用后，具有一个或多个彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将由专利局提供。当结合附图阅读时，将更好地理解以下详细描述的本发明的实施例。出于说明本发明的目的，在附图中示出了本发明示例的实施例。然而，应当理解，本发明不限于附图中所示实施例的精确安排和手段。
图1示出了示例性环状多核糖核苷酸分子支架。
图2示出了示例性反式核酶环状多核糖核苷酸。
图3示出了通过环状多核糖核苷酸的蛋白表达的示意图。
图4示出了针对脂质例如膜的示例性环状多核糖核苷酸分子支架。
图5A示出了针对DNA的示例性环状多核糖核苷酸分子支架。
图5B示出了具有序列特异性DNA结合基序的示例性环状多核糖核苷酸分子支架。circRNA可以结合到DNA双链体的大沟从而基于第三条链的方向形成平行或反平行的三链体结构。示例性的平行三链体结构包括TA·U、CG·G和CG·C(DNA DNA·RNA)。示例性的反平行三链体结构包括TA·A、TA·U和CG·G(DNA DNA·RNA)。
图5C示出了示例性环状多核糖核苷酸分子支架，其具有对DHFR基因的增强子区域具有特异性的DNA结合基序，以干扰转录因子结合和/或mRNA转录。
图5D示出了示例性环状多核糖核苷酸分子支架，其具有对MEG3基因的增强子区域具有特异性的DNA结合基序，以干扰转录因子结合和/或mRNA转录。
图5E示出了示例性环状多核糖核苷酸分子支架，其具有对EPS基因的增强子区域具有特异性的DNA结合基序，以干扰转录因子结合和/或mRNA转录。
图6示出了针对RNA的示例性环状多核糖核苷酸分子支架。
图7A示出了针对靶RNA以螯合和/或降解靶RNA的示例性环状多核糖核苷酸分子支架。
图7B示出了针对RNA和靶向RNA的酶(例如，诱导RNA降解的脱帽酶)的示例性环状多核糖核苷酸分子支架。
图7C示出了针对RNA、DNA和蛋白(例如，驱动靶基因翻译)的示例性环状多核糖核苷酸分子支架。
图8示出了针对蛋白(例如，FUS/TDP43/ATXN2、PRPF8、GEMIN5、CUG BP1和LIN28A)的示例性环状多核糖核苷酸分子支架。
图9A、9B和9C显示，经修饰的环状RNA与细胞中的蛋白翻译机器结合。
图10A、10B和10C显示，与细胞中未修饰的环状RNA相比，如通过免疫相关基因(MDA5、OAS和IFN-β表达)的激活评估的，经修饰的环状RNA与免疫蛋白的结合降低。
图11显示，与未修饰的环状RNA相比，如通过细胞中RIG-I、MDA5、IFN-β和OAS表达评估的，杂交修饰的环状RNA具有降低的免疫原性。
图12表明，与线性适体相比，环状RNA适体表现出增加的细胞内递送和增强的与小分子靶的结合。
图13示出了含有蛋白结合基序的环状RNA与靶蛋白的结合。
图14表明小分子-环状RNA缀合物与小分子靶向的蛋白结合。
图15表明环状RNA-小分子缀合物与特定生物活性蛋白的相互作用。
图16示出了具有两个结合位点的circRNA，其可以充当支架，例如，以与酶(Enz)和靶底物(底物)形成复合物，从而促进酶对靶底物的修饰(M)。
图17显示了来自电泳迁移率变动测定(EMSA)的图像，其证明具有乱序结合适体序列的RNA没有显示出与NF-kB p50亚基的结合亲和力，而具有NF-kB结合适体序列的线性和环状RNA两者以相似亲和力结合至p50亚基。
图18显示，与其线性对应物相比，用带有NF-kB结合适体序列的环状RNA处理导致A549细胞的细胞活率降低。
图19显示，在第2天用线性RNA和阿霉素(dox)共同处理降低了细胞活率，在第1天和第2天用环状适体和dox共同处理导致dox抗性A549肺癌细胞系的更多细胞死亡。
图20是显示示例性环状RNA的示意图，所述环状RNA被递送到细胞中并标记细胞中的靶BRD4蛋白以通过泛素系统降解。
图21显示了蛋白印迹图像和定量图，其表明含有酞胺哌啶酮和JQ1小分子的环状RNA能够降解细胞中的BRD4。
图22显示了在将环状RNA(环状适体)或线性RNA(线性适体)递送至HeLa细胞培养物后的不同时间点，当与TO-1生物素结合时的适体荧光。荧光图像(上图)显示了在递送环状RNA(环状适体)或线性RNA(线性适体)后6小时、第1天和第10天与TO-1生物素结合时的适体荧光。图表(底部)显示了在递送环状RNA(环状适体)、线性RNA(线性适体)或仅TO-1生物素(对照)后6小时、第1天、第3天、第5天、第7天、第10天和第12天，HeLa细胞培养物中荧光细胞的百分比。
图23显示了与不具有结合适体基序的环状RNA、具有HuR RNA结合适体基序的环状RNA、以及具有RNA结合适体基序的环状RNA相比，HuR结合的具有HuR RNA结合适体基序的环状RNA和链霉亲和素拉下产生的具有RNA结合适体基序的RNA。
图24显示了与不具有结合适体基序的环状RNA、具有HuR DNA结合适体基序的环状RNA、以及具有DNA的环状RNA相比，HuR结合的具有HuR DNA结合适体基序的环状RNA和链霉亲和素拉下产生的具有DNA结合适体基序的RNA。
图25显示了与具有1X HuR结合基序、2X HuR结合基序和3X HuR结合基序的环状RNA相比，从没有HuR结合基序的环状RNA更低的分泌型蛋白表达。
具体实施方式
本发明总体上涉及环状多核糖核苷酸的药物组合物和制剂及其用途。
以下参考实例应用描述了几个方面以进行说明。应当理解，阐述了许多具体细节、关系和方法以提供对本文所述特征的全面理解。然而，相关领域的普通技术人员将容易认识到，可以在没有具体细节中的一个或多个或通过其他方法的情况下实践本文描述的特征。本文描述的特征不受动作或事件的示出顺序的限制，因为某些动作可以以不同的顺序发生和/或与其他动作或事件同时发生。此外，并不需要所有示出的动作或事件来实现根据本文描述的特征的方法。
本文使用的术语仅出于描述特定情况的目的，并非旨在进行限制。如本文所用，单数形式“一种”，“一个”和“所述”也旨在包括复数形式，除非上下文另外明确指出。此外，就在详细描述和/或权利要求中使用术语“包括(including，includes)”、“具有(having，has)”、“带有(with)”或其变体的程度而言，这些术语旨在以类似于术语“包含(comprising)”的方式是包括性的。
定义
如本文所用，术语“circRNA”或“环状RNA”或“环状多核糖核苷酸”指通过共价或非共价键形成环状结构的多核糖核苷酸。
如本文所用，术语“加密原”指环状多核糖核苷酸的核酸序列，所述核酸序列有助于减少、逃避和/或避免被免疫细胞检测到和/或减少针对环状多核糖核苷酸的免疫应答的诱导。
如本文所用，术语“表达序列”指编码产物，例如肽或多肽或调控核酸的核酸序列。
如本文所用，术语“免疫蛋白结合位点”指结合至免疫蛋白并有助于将环状多核糖核苷酸掩蔽为非外源的核苷酸序列。
如本文所用，术语“经修饰的核糖核苷酸”指具有至少一个针对糖、核碱基或核苷间键的修饰的核苷酸。
如本文所用，短语“准螺旋结构”指环状多核糖核苷酸的高阶结构，其中环状多核糖核苷酸的至少一部分折叠成螺旋结构。
如本文所用，短语“准双链二级结构”指环状多核糖核苷酸的高阶结构，其中环状多核糖核苷酸的至少一部分产生双链。
如本文所用，术语“调控性序列”指修饰表达产物的核酸序列。
如本文所用，术语“重复核苷酸序列”指一段DNA或整个基因组内的重复核酸序列。在一些实施例中，重复核苷酸序列包括聚CA序列或聚TG序列。在一些实施例中，重复核苷酸序列包括内含子Alu家族中的重复序列。
如本文所用，术语“复制元件”指可用于复制或者起始环状多核糖核苷酸转录的序列和/或基序。
如本文所用，术语“选择性翻译序列”指在环状多核糖核苷酸中选择性地起始或激活表达序列的翻译的核酸序列。
如本文所用，术语“选择性降解序列”指在环状多核糖核苷酸中起始表达序列的翻译的核酸序列。
如本文所用，术语“交错序列”指在翻译过程中诱导核糖体暂停的核苷酸序列。在一些实施例中，交错序列是具有强α-螺旋倾向的氨基酸的非保守序列，其后接共有序列-D(V/I)ExNPG P，其中x是任何氨基酸。
如本文所用，术语“基本上对……有抗性”指相较于参考物具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％抗性的物质。
如本文所用，术语“复合物”是指至少两个彼此具有亲和力的部分(例如，化学部分或生物化学部分)之间的缔合。例如，至少两个部分是靶(例如蛋白)和环状RNA分子。
“多肽”和“蛋白”可互换使用并且指通过共价键(例如酰胺键)连接的两个或更多个氨基酸的聚合物。本文所述的多肽可包括全长蛋白(例如，完全加工的蛋白)以及较短的氨基酸序列(例如，天然存在的蛋白的片段或合成的多肽片段)。多肽可以包括天然存在的氨基酸(例如，天然合成的肽中常见并且已知以一个字母缩写(A、R、N、C、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V)的二十种氨基酸之一)和非天然存在的氨基酸(例如，不是天然合成的肽中常见的二十种氨基酸之一的氨基酸)，包括合成的氨基酸、氨基酸类似物和氨基酸模拟物)。
如本文所用，术语“结合位点”指环状多核糖核苷酸的与另一实体例如化合物、蛋白、核酸等相互作用的区域。结合位点可包含适体序列。
如本文所用，术语“结合部分”指靶的可被结合位点结合的区域，例如，核酸(例如RNA、DNA、RNA-DNA杂交体)的区域、结构域、片段、表位或部分，化合物，小分子(例如，药物)，适体，多肽，蛋白，脂质，碳水化合物，抗体，病毒，病毒颗粒，膜，多组分复合物，细胞器，细胞，其他细胞部分，其任何片段，及其任何组合。
如本文所用，术语“适体序列”指与靶分子特异性结合的非天然存在或合成的寡核苷酸。典型地，适体是20至250个核苷酸。典型地，适体通过二级结构而非序列同源性结合至其靶。
如本文所用，术语“小分子”指分子量不超过900道尔顿的有机化合物。小分子能够调节细胞过程或是荧光团。
如本文所用，术语“缀合部分”指包含在缀合方法中使用的官能团的经修饰的核苷酸。
如本文所用，术语“线性对应物”指具有与环状多核糖核苷酸相同的核苷酸序列和核酸修饰并且具有两个自由末端的多核糖核苷酸(即，环状多核糖核苷酸的非环化形式)。在一些实施例中，线性对应物进一步包含5’帽。在一些实施例中，线性对应物进一步包含聚腺苷尾。在一些实施例中，线性对应物进一步包含3’UTR。在一些实施例中，线性对应物进一步包含5’UTR。
环状多核糖核苷酸
此处描述的环状多核糖核苷酸(circRNA)是通过共价或非共价键形成连续结构的多核糖核苷酸。
本文所述的本发明包括包含合成circRNA的组合物及其使用方法。由于环状结构，与相应的线性RNA相比，circRNA可以具有改善的稳定性、增加的半衰期、降低的免疫原性和/或改善的官能性(例如，本文所述的功能)。在一些实施例中，在将环状RNA递送至细胞后，环状RNA可检测持续至少5天。在一些实施例中，在递送环状RNA到细胞后，环状RNA可检测持续6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天或16天。可以使用本领域已知的任何技术来检测环状RNA。
在一些实施例中，circRNA结合一个或多个靶。在一些实施例中，circRNA是环状适体。在一个实施例中，circRNA包含与一个或多个靶结合的一个或多个结合位点。在一个实施例中，circ RNA包含适体序列。在一个实施例中，circRNA既结合DNA靶又结合蛋白靶，并且例如介导转录。在另一个实施例中，circRNA使蛋白复合物聚集在一起，例如介导翻译后修饰或信号转导。在另一个实施例中，circRNA结合两个或更多个不同的靶，例如蛋白，并且例如，将这些蛋白穿梭至细胞质，或介导一个或多个靶的降解。
在一些实施例中，circRNA结合DNA、RNA和蛋白中的至少一种，从而调控细胞过程(例如，改变蛋白表达，调节基因表达，调节细胞信号传导等)。在一些实施例中，合成的circRNA包括用于与靶或选择的DNA、RNA或蛋白的至少一个部分，例如结合部分相互作用的结合位点，从而与内源性对应物竞争结合。
在一些实施例中，环状RNA形成调控细胞过程(例如，改变蛋白表达，调节基因表达，调节细胞信号传导等)的复合物。在一些实施例中，环状RNA通过与靶(例如，转录因子)结合而使细胞对细胞毒性剂(例如，化学治疗剂)敏感，这导致细胞活率降低。例如，使细胞对细胞毒性剂敏感在细胞毒性剂和环状RNA递送后导致细胞活率降低。在一些实施例中，降低的细胞活率是降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％、或其中的任何百分比。
在一些实施例中，在将环状RNA递送至细胞后，复合物可检测持续至少5天。在一些实施例中，在将环状RNA递送至细胞后，复合物可检测持续6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天或16天。
在一个实施例中，合成的circRNA结合和/或螯合miRNA。在另一个实施例中，合成的circRNA结合和/或螯合蛋白。在另一个实施例中，合成的circRNA结合和/或螯合mRNA。在另一个实施例中，合成的circRNA结合和/或螯合核糖体。在另一个实施例中，合成的circRNA结合和/或螯合circRNA。在另一个实施例中，合成的circRNA结合和/或螯合长非编码RNA(lncRNA)或任何其他非编码RNA，例如miRNA、tRNA、rRNA、snoRNA、ncRNA、siRNA、长非编码RNA、shRNA。除了结合和/或螯合位点，circRNA还可以包括降解元件，其将导致结合和/或螯合的RNA和/或蛋白的降解。
在一个实施例中，circRNA包含lncRNA或lncRNA的序列，例如，circRNA包含天然存在的非环状lncRNA的序列或其片段。在一个实施例中，将lncRNA或lncRNA的序列环化，具有或不具有间隔子序列，以形成合成的circRNA。
在一个实施例中，circRNA具有核酶活性。在一个实施例中，circRNA可以用作核酶并切割致病性或内源性RNA、DNA、小分子或蛋白。在一个实施例中，circRNA具有酶活性。在一个实施例中，合成的circRNA能够特异性识别和切割RNA(例如，病毒RNA)。在另一个实施例中，circRNA能够特异性识别和切割蛋白。在另一个实施例中，circRNA能够特异性识别和降解小分子。
在一个实施例中，circRNA是牺牲型或自切割或可切割的circRNA。在一个实施例中，circRNA可以用于递送RNA，例如miRNA、tRNA、rRNA、snoRNA、ncRNA、siRNA、长非编码RNA、shRNA。在一个实施例中，合成的circRNA由被(1)可自切割的元件(例如锤头结构、剪接元件)、(2)切割募集位点(例如ADAR)、(3)可降解接头(例如丙三醇)、(4)化学接头和/或(5)间隔子序列隔开的微小RNA构成。在另一个实施例中，合成的circRNA由被(1)可自切割的元件(例如锤头结构、剪接元件)、(2)切割募集位点(例如ADAR)、(3)可降解接头(例如丙三醇)、(4)化学接头和/或(5)间隔子序列隔开的siRNA构成。
在一个实施例中，circRNA是具有转录/复制能力的circRNA。这种circRNA可以编码任何类型的RNA。在一个实施例中，合成的circRNA具有反义miRNA和转录元件。在一个实施例中，在转录后，从circRNA产生线性功能性miRNA。在一个实施例中，circRNA是不能翻译的环状多核糖核苷酸。
在一个实施例中，circRNA具有一种或多种上述属性以及翻译元件。
在一些实施例中，circRNA包含至少一个经修饰的核苷酸。在一些实施例中，circRNA包含至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的经修饰核苷酸。在一些实施例中，circRNA包含基本上所有(例如，大于80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％或约100％)的经修饰的核苷酸。在一些实施例中，circRNA包含经修饰的核苷酸和未修饰的连续核苷酸的一部分，其可以被称为杂交修饰的circRNA。未修饰的连续核苷酸的一部分可以是杂交修饰的circRNA中的配置为结合蛋白、DNA、RNA或细胞靶的未修饰的结合位点。未修饰的连续核苷酸的一部分可以是杂交修饰的circRNA中的未修饰的IRES。在其他实施例中，circRNA缺少经修饰的核苷酸，其可以被称为未修饰的circRNA。
靶
circRNA可包含至少一个靶结合位点，例如靶结合部分。circRNA可包含至少一个与靶结合的适体序列。在一些实施例中，circRNA包含针对一个或多个靶的一个或多个结合位点。靶包括但不限于核酸(例如RNA、DNA、RNA-DNA杂交体)、小分子(例如药物、荧光团、代谢产物)、适体、多肽、蛋白、脂质、碳水化合物、抗体、病毒、病毒颗粒、膜、多组分复合物、细胞器、细胞、其他细胞部分，其任何片段及其任何组合。(参见，例如，Fredriksson等人,(2002)Nat Biotech[自然生物技术]20:473-77；Gullberg等人,(2004)PNAS[美国国家科学院院刊],101:8420-24)。例如，靶是单链RNA、双链RNA、单链DNA、双链DNA、包含一个或多个双链区域和一个或多个单链区域的DNA或RNA、RNA-DNA杂交体、小分子、适体、多肽、蛋白、脂质、碳水化合物、抗体、抗体片段、抗体混合物、病毒颗粒、膜、多组分复合物、细胞、细胞部分、其任何片段或其任何组合。
在一些实施例中，靶是多肽、蛋白或其任何片段。例如，靶可以是纯化的多肽、分离的多肽、融合标记多肽、附着于或跨越细胞或病毒或病毒粒子的膜的多肽、细胞质蛋白、细胞内蛋白、细胞外蛋白、激酶、酪氨酸激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶、磷酸酶、芳香化酶、磷酸二酯酶、环化酶、解旋酶、蛋白酶、氧化还原酶、还原酶、转移酶、水解酶、切割酶、异构酶、糖基化酶、细胞外基质蛋白、连接酶、泛素连接酶、影响翻译后修饰的任何连接酶、离子转运蛋白、离子转运通道、离子转运孔、凋亡蛋白、细胞粘附蛋白、致病蛋白、异常表达的蛋白、转录因子、转录调节物、翻译蛋白、表观遗传因子、表观遗传调节物、染色质调节物、分子伴侣、分泌蛋白、配体、激素、细胞因子、趋化因子、核蛋白、受体、跨膜受体、受体酪氨酸激酶、G蛋白偶联受体、生长因子受体、核受体、激素受体、信号转导物、抗体、膜蛋白、整合膜蛋白、外周膜蛋白、细胞壁蛋白、球状蛋白、纤维蛋白、糖蛋白、脂蛋白、染色体蛋白、原癌基因、癌基因、抑癌基因、其任何片段或其任何组合。在一些实施例中，靶是异源多肽。在一些实施例中，靶是使用分子技术(例如转染)在细胞中过表达的蛋白。在一些实施例中，靶是重组多肽。例如，靶是在由细菌(例如，大肠杆菌)、酵母、哺乳动物或昆虫细胞(例如，生物过表达的蛋白)产生的样品中。在一些实施例中，靶是具有突变、插入、缺失或多态性的多肽。在一些实施例中，靶是细胞(例如，健康细胞或与疾病或病症相关的细胞)天然表达的多肽。在一些实施例中，靶是抗原，例如用于免疫生物体或在生物体中产生免疫应答，例如用于抗体产生的多肽。
在一些实施例中，靶是抗体。抗体可以特异性结合另一个分子的特定空间和极性组织。抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体或重组抗体，并且可以通过本领域熟知的技术制备，例如免疫宿主并且收集血清(多克隆)，或通过制备连续的杂交细胞系并收集分泌的蛋白(单克隆)，或通过克隆和表达核苷酸序列或其诱变形式，所述核苷酸序列或其诱变形式至少编码天然抗体的特异性结合所需的氨基酸序列。天然存在的抗体可以是包含通过二硫键相互连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的蛋白。每个重链可以由重链可变区(VH)和重链恒定区构成。重链恒定区可以包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。每个轻链可包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区。轻链恒定区可包含一个结构域CL。VH和VL区可以进一步再分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间插着更为保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL由从氨基末端至羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(C1 q))的结合。抗体可以是任何同种型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如lgG1、lgG2、lgG3、lgG4、lgA1和lgA2)、亚类或其经修饰的版本。抗体可包括完整的免疫球蛋白或其片段。抗体片段可以指抗体的保留特异性结合至结合部分(例如抗原)的能力的一个或多个片段。另外，还包括免疫球蛋白或其片段的聚集体、聚合物和缀合物，只要维持对特定分子的结合亲和力即可。抗体片段的实例包括Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，其是包含由二硫桥在铰链区连接的两个Fab片段的双价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单一臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的单结构域抗体(dAb)片段(Ward等人,(1989)Nature[自然]341:544-46)；以及分离的CDR和单链片段(scFv)，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人,(1988)Science[科学]242:423-26；和Huston等人,(1988)PNAS[美国国家科学院院刊]85:5879-83)。因此，抗体片段包括Fab、F(ab)2、scFv、Fv、dAb等。尽管两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过人工肽接头连接，所述人工肽接头使它们成为单个蛋白链。这样的单链抗体包括一个或多个抗原结合部分。抗体可以是多价抗体，例如二价、三价、四价、五价、六价、七价或八价抗体。抗体可以是多特异性抗体。例如，可以例如通过重组地结合任何两种或更多种抗原结合剂(例如，Fab、F(ab)2、scFv、Fv、IgG)来生成双特异性、三特异性、四特异性、五特异性、六特异性、七特异性或八特异性抗体。可以使用多特异性抗体使两个或更多个靶紧密接近，例如，降解机器和要降解的靶底物，或泛素连接酶和要泛素化的底物。这些抗体片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并能以与完整抗体相同的方式筛选所述片段的实用性。抗体可以是人的、人源化的、嵌合的、分离的、狗、猫、驴、绵羊、任何植物、动物或哺乳动物的。
在一些实施例中，靶是核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的聚合形式，例如DNA或RNA(例如mRNA)。DNA包括在线性DNA分子(例如，限制性片段)、病毒、质粒和染色体中发现的双链DNA。在一些实施例中，多核苷酸靶是单链、双链、小干扰RNA(siRNA)、信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、染色体、基因、非编码基因组序列、基因组DNA(例如，片段化的基因组DNA)、纯化的多核苷酸、分离的多核苷酸、杂交的多核苷酸、转录因子结合位点、线粒体DNA、核糖体RNA、真核多核苷酸、原核多核苷酸、合成的多核苷酸、连接的多核苷酸、重组多核苷酸、含有核酸类似物的多核苷酸、甲基化的多核苷酸、脱甲基化的多核苷酸、其任何片段、或其任何组合。在一些实施例中，靶是重组多核苷酸。在一些实施例中，靶是异源多核苷酸。例如，靶是由细菌(例如，大肠杆菌)、酵母、哺乳动物或昆虫细胞产生的多核苷酸(例如，与生物体异源的多核苷酸)。在一些实施例中，靶是具有突变、插入、缺失或多态性的多核苷酸。
在一些实施例中，靶是适体。适体是分离的核酸分子，其以高特异性和亲和力结合至结合部分或靶分子，例如蛋白。适体是保持一个或多个特定构型的三维结构，其提供化学接触以特异性结合其给定靶。尽管适体是基于核酸的分子，但适体与其他核酸分子(例如基因和mRNA)之间存在根本差异。在所述其他核酸分子中，核酸结构通过其线性碱基序列编码信息，因此该序列对信息存储的功能很重要。完全相反，基于靶分子的特异性结合的适体功能并不完全依赖于保守的线性碱基序列(非编码序列)，而是特定的二级/三级/四级结构。适体可能具有的任何编码潜能都是偶然的，并且不认为在适体与其同源靶的结合中起作用。适体与结合某些蛋白的天然存在的核酸序列不同。这些后者的序列是嵌入生物体基因组中的天然存在的序列，其与参与天然存在的核酸(例如核酸结合蛋白)的转录、翻译和运输的蛋白的特定亚组结合。另一方面，适体是非天然存在的核酸分子。尽管可以鉴定出结合核酸结合蛋白的适体，但在大多数情况下，这种适体与自然中由核酸结合蛋白识别的序列具有极少或没有序列同一性。更重要的是，适体可以结合几乎任何蛋白(不仅是结合核酸的蛋白)以及几乎任何目的伴侣，包括小分子、碳水化合物、肽等。对于大多数伴侣，甚至蛋白，与其结合的天然核酸序列不存在。对于确实具有这样的序列的那些伴侣，例如结合核酸的蛋白，由于与紧密结合的适体相比，自然界中使用的结合亲和力相对较低，因此此类序列将不同于适体。适体能够特异性结合至选择的伴侣并例如通过结合来调节伴侣的活性或结合相互作用，适体可以阻断其伴侣起功能的能力。与伴侣特异性结合的功能特性是适体的固有特性。适体可以是6-35kDa。适体可以是20至250个核苷酸。适体能以微摩尔至亚纳摩尔分子亲和力结合其伴侣，并且可以区分紧密相关的靶(例如，适体可以选择性地结合来自相同基因家族的相关蛋白)。在某些情况下，适体仅结合一个分子。在某些情况下，适体结合目的分子的家族成员。适体在某些情况下结合多个不同的分子。适体能够使用通常见到的分子间相互作用，例如氢键、静电互补性、疏水性接触和空间排阻来与特定伴侣结合。适体具有用作治疗和诊断的许多期望的特征，包括高特异性和亲和力、低免疫原性、生物学功效以及优异的药代动力学特性。适体可包含由共价连接的互补多核苷酸的杂交形成的分子茎和环结构(例如，发夹环结构)。茎包含杂交的多核苷酸，并且环是共价连接两个互补多核苷酸的区域。适体可以是包含适体序列的线性核糖核酸(例如，线性适体)或包含适体序列的环状多核糖核酸(例如，环状适体)。
在一些实施例中，靶是小分子。例如，小分子可以是大环分子、抑制剂、药物或化合物。在一些实施例中，小分子包含不超过五个氢键供体。在一些实施例中，小分子包含不超过十个氢键受体。在一些实施例中，小分子的分子量是500道尔顿或更小。在一些实施例中，小分子的分子量是约180至500道尔顿。在一些实施例中，小分子包含不大于五的辛醇-水分配系数lop P。在一些实施例中，小分子具有-0.4至5.6的分配系数log P。在一些实施例中，小分子的摩尔折射率是40至130。在一些实施例中，小分子包含约20至约70个原子。在一些实施例中，小分子的极性表面积是140埃2或更小。
在一些实施例中，靶是细胞。例如，靶是完整细胞，用化合物(例如，药物)处理的细胞、固定的细胞、裂解的细胞或其任何组合。在一些实施例中，靶是单个细胞。在一些实施例中，靶是多个细胞。
在一些实施例中，circRNA包含与单个靶或多个(例如，两个或更多个)靶的结合位点。在一个实施例中，单个circRNA包含针对单个靶的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同的结合位点。在一个实施例中，单个circRNA包含针对单个靶的2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个相同的结合位点。在一个实施例中，单个circRNA包含针对一个或多个不同靶的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同的结合位点。在一个实施例中，样品中有两个或更多个靶，例如靶的混合物或文库，并且样品包含circRNA，所述circRNA包含两个或更多个与所述两个或更多个靶结合的结合位点。
在一些实施例中，单个靶或多个(例如，两个或更多个)靶具有多个结合部分。在一个实施例中，单个靶可以具有2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个结合部分。在一个实施例中，样品中有两个或更多个靶，例如靶的混合物或文库，并且样品包含两个或更多个结合部分。在一些实施例中，单个靶或多个靶包含多个不同的结合部分。例如，多个可以包括至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、25,000或30,000个结合部分。
靶可包含多个结合部分，所述结合部分包含至少2个不同的结合部分。例如，结合部分可包含多个结合部分，所述多个结合部分包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000或25,000个不同的结合部分。
结合位点和结合部分
在一些情况下，circRNA包含一个结合位点。结合位点可包含适体序列。在一些情况下，circRNA包含至少两个结合位点。例如，circRNA可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个结合位点。在一些实施例中，本文描述的circRNA是结合一个或多个靶或一个或多个靶的一个或多个结合部分的分子支架。每个靶可以是但不限于不同或相同的核酸(例如，RNA、DNA、RNA-DNA杂交体)、小分子(例如、药物)、适体、多肽、蛋白、脂质、碳水化合物、抗体、病毒、病毒颗粒、膜、多组分复合物、细胞、细胞部分、其任何片段及其任何组合。在一些实施例中，一个或多个结合位点结合至相同靶。在一些实施例中，一个或多个结合位点结合至相同靶的一个或多个结合部分。在一些实施例中，一个或多个结合位点结合至一个或多个不同靶。在一些实施例中，一个或多个结合位点结合至不同靶的一个或多个结合部分。在一些实施例中，circRNA充当一种或多种结合一个或多个靶的支架。在一些实施例中，circRNA充当一个或多个靶的一个或多个结合部分的支架。在一些实施例中，circRNA通过与一个或多个一个或多个靶特异性结合来调节细胞过程。在一些实施例中，circRNA通过与一个或多个靶的一个或多个结合部分特异性结合来调节细胞过程。在一些实施例中，circRNA通过与一个或多个靶特异性结合来调节细胞过程。在一些实施例中，本文描述的circRNA包括针对一个或多个特定目的靶的结合位点。在一些实施例中，circRNA包括针对每个目的靶的多个结合位点或结合位点的组合。在一些实施例中，circRNA包括针对每个目的结合部分的多个结合位点或结合位点的组合。例如，circRNA可以包括针对多肽靶的一个或多个结合位点。在一些实施例中，circRNA包括针对多核苷酸靶例如DNA或RNA、mRNA靶、rRNA靶、tRNA靶或基因组DNA靶的一个或多个结合位点。
在一些情况下，circRNA包含针对单链DNA的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对双链DNA的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对抗体的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对病毒颗粒的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对小分子的结合位点。在一些情况下，circRNA包含在细胞内或细胞上结合的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对RNA-DNA杂交体的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对甲基化的多核苷酸的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对未甲基化的多核苷酸的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对适体的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对多肽的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对多肽、蛋白、蛋白片段、经标记的蛋白、抗体、抗体片段、小分子、病毒颗粒(例如，包含跨膜蛋白的病毒颗粒)或细胞的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对单链DNA上的结合部分的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对双链DNA上的结合部分的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对抗体上的结合部分的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对病毒颗粒上的结合部分的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对小分子上的结合部分的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对细胞内或细胞上的结合部分的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对RNA-DNA杂交体上的结合部分的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对甲基化的多核苷酸上的结合部分的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对未甲基化的多核苷酸上的结合部分的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对适体上的结合部分的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对多肽上结合部分的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对多肽、蛋白、蛋白片段、经标记的蛋白、抗体、抗体片段、小分子、病毒颗粒(例如，包含跨膜蛋白的病毒颗粒)或细胞上的结合部分的结合位点。
在一些情况下，结合位点与靶的包含至少两个酰胺键的部分结合。在一些情况下，结合位点不结合靶的包含磷酸二酯键的部分。在一些情况下，靶的一部分不是DNA或RNA。在一些情况下，结合部分包含至少两个酰胺键。在一些情况下，结合部分不包含磷酸二酯键。在一些情况下，结合部分不是DNA或RNA。
本文提供的circRNA可以包括针对结合复合物上的结合部分的一个或多个结合位点。本文提供的circRNA可以包括针对靶的一个或多个结合位点以形成复合物。例如，本文提供的circRNA可充当支架以在circRNA与靶之间形成复合物。在一些实施例中，circRNA与单个靶形成复合物。在一些实施例中，circRNA与两个靶形成复合物。在一些实施例中，circRNA与三个靶形成复合物。在一些实施例中，circRNA与四个靶形成复合物。在一些实施例中，circRNA与五个或更多个靶形成复合物。在一些实施例中，circRNA与两个或更多个靶的复合物形成复合物。在一些实施例中，circRNA与三个或更多靶的复合物形成复合物。在一些实施例中，两个或更多个circRNA与单个靶形成复合物。在一些实施例中，两个或更多个circRNA与两个或更多个靶形成复合物。在一些实施例中，第一circRNA与第一靶的第一结合部分和第二靶的第二不同结合部分形成复合物。在一些实施例中，第一circRNA与第一靶的第一结合部分形成复合物，并且第二circRNA与第二靶的第二结合部分形成复合物。
在一些实施例中，circRNA可以包括针对以下的结合位点：一种或多种抗体-多肽复合物、多肽-多肽复合物、多肽-DNA复合物、多肽-RNA复合物、多肽-适体复合物、病毒颗粒-抗体复合物、病毒颗粒-多肽复合物、病毒颗粒-DNA复合物、病毒颗粒-RNA复合物、病毒颗粒-适体复合物、细胞-抗体复合物、细胞-多肽复合物、细胞-DNA复合物、细胞-RNA复合物、细胞-适体复合物、小分子-多肽复合物、小分子-DNA复合物、小分子-适体复合物、小分子-细胞复合物、小分子-病毒颗粒复合物及其组合。
在一些实施例中，circRNA可以包括针对以下的结合位点：一种或多种抗体-多肽复合物、多肽-多肽复合物、多肽-DNA复合物、多肽-RNA复合物、多肽-适体复合物、病毒颗粒-抗体复合物、病毒颗粒-多肽复合物、病毒颗粒-DNA复合物、病毒颗粒-RNA复合物、病毒颗粒-适体复合物、细胞-抗体复合物、细胞-多肽复合物、细胞-DNA复合物、细胞-RNA复合物、细胞-适体复合物、小分子-多肽复合物、小分子-DNA复合物、小分子-适体复合物、小分子-细胞复合物、小分子-病毒颗粒复合物及其组合上的一个或多个结合部分。
在一些情况下，结合位点与多肽、蛋白或其片段结合。在一些实施例中，结合位点与靶的多肽、蛋白或其片段的结构域、片段、表位、区域或一部分结合。例如，结合位点与分离的多肽、细胞的多肽、纯化的多肽或重组多肽的结构域、片段、表位、区域或部分结合。例如，结合位点与抗体或其片段的结构域、片段、表位、区域或一部分结合。例如，结合位点与转录因子的结构域、片段、表位、区域或一部分结合。例如，结合位点与受体的结构域、片段、表位、区域或一部分结合。例如，结合位点与跨膜受体的结构域、片段、表位、区域或一部分结合。结合位点可以与分离的、纯化的和/或重组的多肽的结构域、片段、表位、区域或一部分结合。结合位点可以与分析物混合物(例如裂解物)的结构域、片段、表位、区域或的一部分结合。例如，结合位点与来自多个细胞或来自单个细胞的裂解物中的结构域、片段、表位、区域或一部分结合。结合位点可以结合靶的结合部分。在一些情况下，结合部分在多肽、蛋白或其片段上。在一些实施例中，结合部分包含多肽、蛋白或其片段的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分包含分离的多肽、细胞的多肽、纯化的多肽或重组多肽的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分包含抗体或其片段的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分包含转录因子的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分包含受体的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分包含跨膜受体的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合部分可以在分离的、纯化的和/或重组的多肽的结构域、片段、表位、区域或一部分上或包含分离的、纯化的和/或重组的多肽的结构域、片段、表位、区域或一部分上。结合部分包括分析物(例如，裂解物)的混合物上的结合部分或分析物(例如，裂解物)的混合物的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分在来自多个细胞或来自单个细胞的裂解物的结构域、片段、表位、区域或一部分上或包含来自多个细胞或来自单个细胞的裂解物的结构域、片段、表位、区域或一部分。
在一些情况下，结合位点与化合物(例如小分子)的结构域、片段、表位、区域或一部分结合。例如，结合结合至药物的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合位点结合至化合物的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分结合至有机化合物的结构域、片段、表位、区域或一部分。在一些情况下，结合位点结合至分子量为900道尔顿或更小的小分子的结构域、片段、表位、区域或一部分。在一些情况下，结合位点结合至分子量为500道尔顿或更大的小分子的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点结合的小分子部分可以例如从天然或合成分子的文库获得，包括通过组合方式产生的化合物的文库，即化合物多样性组合文库。组合文库及其产生和筛选的方法是本领域已知的，并在以下中进行了描述：US 5,741,713；5,734,018；5,731,423；5,721,099；5,708,153；5,698,673；5,688,997；5,688,696；5,684,711；5,641,862；5,639,603；5,593,853；5,574,656；5,571,698；5,565,324；5,549,974；5,545,568；5,541,061；5,525,735；5,463,564；5,440,016；5,438,119；5,223,409，其公开内容通过引用并入本文。结合位点可以结合小分子的结合部分。在一些情况下，结合部分在小分子的结构域、片段、表位、区域或一部分上或包含小分子的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分在药物的结构域、片段、表位、区域或一部分上或包含药物的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分在化合物的结构域、片段、表位、区域或一部分上或包含化合物的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分在有机化合物的结构域、片段、表位、区域或一部分上或包含有机化合物的结构域、片段、表位、区域或一部分。在一些情况下，结合部分在分子量为900道尔顿或更小的小分子的结构域、片段、表位、区域或一部分上或包含分子量为900道尔顿或更小的小分子的结构域、片段、表位、区域或一部分。在一些情况下，结合部分在分子量为500道尔顿或更大的小分子的结构域、片段、表位、区域或一部分上或包含分子量为500道尔顿或更大的小分子的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合部分可以例如从天然或合成分子的文库获得，包括通过组合方式产生的化合物的文库，即化合物多样性组合文库。组合文库及其产生和筛选的方法是本领域已知的，并在以下中进行了描述：US 5,741,713；5,734,018；5,731,423；5,721,099；5,708,153；5,698,673；5,688,997；5,688,696；5,684,711；5,641,862；5,639,603；5,593,853；5,574,656；5,571,698；5,565,324；5,549,974；5,545,568；5,541,061；5,525,735；5,463,564；5,440,016；5,438,119；5,223,409，其公开内容通过引用并入本文。
结合位点可以结合特异性结合对的成员(例如配体)的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点可以结合单价(单表位)或多价(多表位)的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点可以结合靶的抗原部分或半抗原部分。结合位点可结合共享至少一个共同表位或决定簇位点的单个分子或多个分子的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点可以结合细胞(例如细菌细胞、植物细胞或动物细胞)的一部分的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点可以结合天然环境(例如组织)，培养的细胞或微生物(例如细菌、真菌、原生动物或病毒)或裂解的细胞中的靶。结合位点可以结合至靶的一部分，所述部分被修饰(例如，化学地修饰)以提供一个或多个另外的结合位点，例如但不限于染料(例如，荧光染料)、多肽修饰性部分(例如磷酸基团、碳水化合物基团等)、或多核苷酸修饰性部分(例如甲基)。结合位点可以结合特异性结合对的成员的结合部分。结合部分可以在特异性结合对的成员(例如配体)的结构域、片段、表位、区域或一部分上或包含特异性结合对的成员(例如配体)的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合部分可以在单价(单表位)或多价(多表位)的结构域、片段、表位、区域或一部分上或包含单价(单表位)或多价(多表位)的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合部分可以是抗原的或半抗原的。结合部分可以在共享至少一个共同表位或决定簇位点的单个分子或多个分子的结构域、片段、表位、区域或一部分上或包含共享至少一个共同表位或决定簇位点的单个分子或多个分子的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合部分可以在细胞(例如细菌细胞、植物细胞或动物细胞)的一部分的结构域、片段、表位、区域或一部分上或包含细胞(例如细菌细胞、植物细胞或动物细胞)的一部分的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合部分可以在天然环境(例如组织)、培养的细胞或微生物(例如细菌、真菌、原生动物或病毒)或裂解的细胞中。可以修饰(例如，化学地)结合部分，以提供一个或多个另外的结合位点，例如但不限于染料(例如，荧光染料)、多肽修饰性部分(例如磷酸基团、碳水化合物基团等)、或多核苷酸修饰性部分(例如甲基)。
在一些情况下，结合位点结合来自宿主的样品中发现的分子的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点可以结合来自宿主的样品中发现的分子的结合部分。在一些情况下，结合部分在来自宿主的样品中发现的分子的结构域、片段、表位、区域或部分上或包含来自宿主的样品中发现的分子的结构域、片段、表位、区域或部分。来自宿主的样品包括体液(例如尿液、血液、血浆、血清、唾液、精液、粪便、痰、脑脊髓液、眼泪、粘液等)。样品可以直接检查，也可以进行预处理以使结合部分更易于检测。样品包括一定数量的来自有生命物或先前有生命物的物质。样品可以是天然的、重组的、合成的或非天然存在的。结合位点可以结合上述任何，其从细胞天然或重组表达，在细胞裂解物中或细胞培养基中，是体外翻译的样品，或从样品(例如细胞裂解物)免疫沉淀。结合部分可以是上述任何，其从细胞天然或重组表达，在细胞裂解物中或细胞培养基中，是体外翻译的样品，或从样品(例如细胞裂解物)免疫沉淀。
在一些情况下，结合位点与在无细胞系统中或在体外表达的靶结合。例如，结合位点与细胞提取物中的靶结合。在一些情况下，结合位点与细胞提取物中的靶结合，所述细胞提取物具有DNA模板以及用于转录和翻译的试剂。结合位点可以与在无细胞系统中或在体外表达的靶的结合部分结合。在一些情况下，靶的结合部分在无细胞系统中或在体外表达。例如，靶的结合部分在细胞提取物中。在一些情况下，靶的结合部分在细胞提取物中，所述细胞提取物具有DNA模板以及用于转录和翻译的试剂。可以使用的细胞提取物的示例性来源包括小麦胚芽、大肠杆菌、兔网织红细胞、极端嗜热菌、杂交瘤、爪蟾卵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞(例如人细胞)。可用于表达靶多肽(例如，在阵列上产生靶多肽)的示例性无细胞方法包括蛋白原位阵列(PISA)、多重斑点技术(MIST)、自组装mRNA翻译、核酸可编程蛋白阵列(NAPPA)、纳米孔NAPPA、DNA阵列至蛋白阵列(DAPA)、无膜DAPA、纳米孔复制和μIP-微凹版印刷以及pMAC-蛋白微阵列复制(参见Kilb等人,Eng.Life Sci.[生命科学工程]2014,14,352-364)。
在一些情况下，结合位点与从DNA模板原位(例如，在阵列的固体基底上)合成的靶结合。结合位点可以与原位合成的靶的结合部分结合。在一些情况下，靶的结合部分是从DNA模板原位(例如，在阵列的固体基底上)合成的。在一些情况下，平行或在单个反应中从多个相应的DNA模板原位合成多个结合部分。用于原位靶多肽表达的示例性方法包括以下中描述的那些：Stevens,Structure[结构]8(9):R177-R185(2000)；Katzen等人,TrendsBiotechnol.[生物技术趋势]23(3):150-6.(2005)；He等人,Curr.Opin.Biotechnol.[生物技术当前观点]19(1):4-9.(2008)；Ramachandran等人,Science[科学]305(5680):86-90.(2004)；He等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究]29(15):E73-3(2001)；Angenendt等人,Mol.Cell Proteomics[分子与细胞蛋白组学]5(9):1658-66(2006)；Tao等人,NatBiotechnol[自然生物技术]24(10):1253-4(2006)；Angenendt等人,Anal.Chem.[分析化学]76(7):1844-9(2004)；Kinpara等人,J.Biochem.[生物化学杂志]136(2):149-54(2004)；Takulapalli等人,J.Proteome Res.[蛋白组学研究杂志]11(8):4382-91(2012)；He等人,Nat.Methods[自然方法]5(2):175-7(2008)；Chatterjee和J.LaBaer,Curr OpinBiotech[生物技术当前观点]17(4):334-336(2006)；He和Wang,Biomol Eng[生物分子工程]24(4):375-80(2007)；以及He和Taussig,J.Immunol.Methods[免疫学方法杂志]274(1-2):265-70(2003)。
在一些情况下，结合位点与包含至少6个核苷酸跨度(例如，至少8、9、10、12、15、20、25、30、40、50或100个核苷酸)的核酸靶结合。在一些情况下，结合位点与包含连续核苷酸段的蛋白靶结合。在一些情况下，结合位点与包含非连续核苷酸段的蛋白靶结合。在一些情况下，结合位点与包含突变或功能性突变的位点的核酸靶结合，所述突变或功能性突变包括核酸序列中核苷酸的缺失、添加、交换或截短。结合位点可以结合核酸靶的结合部分。在一些情况下，核酸靶的结合部分包含至少6个核苷酸的跨度，例如，至少8、9、10、12、15、20、25、30、40、50或100个核苷酸。在一些情况下，蛋白靶的结合部分包含连续核苷酸段。在一些情况下，蛋白靶的结合部分包含不连续核苷酸段。在一些情况下，核酸靶的结合部分包含突变或功能性突变的位点，所述突变或功能性突变包括核酸序列中核苷酸的缺失、添加、交换或截短。
在一些情况下，结合位点与包含至少6个氨基酸跨度(例如，至少8、9、10、12、15、20、25、30、40、50或100个氨基酸)的蛋白靶结合。在一些情况下，结合位点与包含连续氨基酸段的蛋白靶结合。在一些情况下，结合位点与包含非连续氨基酸段的蛋白靶结合。在一些情况下，结合位点与包含突变或功能性突变的位点的蛋白靶结合，所述突变或功能性突变包括多肽序列中氨基酸的缺失、添加、交换或截短。结合位点可以结合蛋白靶的结合部分。在一些情况下，蛋白靶的结合部分包含至少6个氨基酸的跨度，例如至少8、9、10、12、15、20、25、30、40、50或100个氨基酸。在一些情况下，蛋白靶的结合部分包含连续氨基酸段。在一些情况下，蛋白靶的结合部分包含不连续氨基酸段。在一些情况下，蛋白靶的结合部分包含突变或功能性突变的位点，所述突变或功能性突变包括多肽序列中氨基酸的缺失、添加、交换或截短。
在一些实施例中，结合位点结合膜结合蛋白的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点可以结合膜结合蛋白的结合部分。在一些实施例中，结合部分在膜结合蛋白的结构域、片段、表位、区域或一部分上或包含膜结合蛋白的结构域、片段、表位、区域或一部分。示例性的膜结合蛋白包括但不限于GPCR(例如肾上腺素能受体、血管紧张素受体、胆囊收缩素受体、毒蕈碱乙酰胆碱受体、神经降压素受体、甘丙肽受体、多巴胺受体、阿片受体、血清素受体、生长抑素受体等)、离子通道(例如、烟碱乙酰胆碱受体、钠通道、钾通道等)、非兴奋性和兴奋性通道、受体酪氨酸激酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶、生长因子和激素受体(例如表皮生长因子(EGF)受体)，等。结合位点可以结合膜结合蛋白的突体变或修饰变体的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点可以结合膜结合蛋白的突变体或修饰变体的结合部分。结合部分也可以在膜结合蛋白的突变体或修饰变体的结构域、片段、表位、区域或一部分上或包含膜结合蛋白的突变体或修饰变体的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，GPCR的一些单点或多点突变保留功能并在疾病中涉及(参见，例如，Stadel等人,(1997)Trends in Pharmacological Review[药理学趋势综述]18:430-37)。
结合位点结合至例如泛素连接酶的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点结合至例如泛素衔接子、蛋白酶体衔接子或蛋白酶体蛋白的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点结合至例如内吞、吞噬、溶酶体途径、自噬途径、巨自噬、微自噬、伴侣蛋白介导的自噬、多囊体途径、或其组合中涉及的蛋白的结构域、片段、表位、区域或一部分。在一些情况下，结合位点结合至结合部分。结合部分可包含例如泛素连接酶的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合部分可包含例如泛素衔接子、蛋白酶体衔接子或蛋白酶体蛋白的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合部分可包含例如内吞、吞噬、溶酶体途径、自噬途径、巨自噬、微自噬、伴侣蛋白介导的自噬、多囊体途径、或其组合中涉及的蛋白的结构域、片段、表位、区域或一部分。
结合位点结合至例如与疾病或病症相关的蛋白的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点结合至例如原癌基因的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点结合至例如癌基因的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点结合至例如肿瘤抑制基因的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点结合至例如炎性基因(例如细胞因子)的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点可以结合至结合部分。结合部分可包含例如与疾病或病症相关的蛋白的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合部分可包含例如原癌基因的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合部分可包含例如癌基因的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合部分可包含例如肿瘤抑制基因的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合部分可包含例如炎性基因(例如，细胞因子)的结构域、片段、表位、区域或一部分。
图1显示了具有序列特异性RNA结合基序、序列特异性DNA结合基序和蛋白特异性结合基序的环状多核糖核苷酸的实例。在一些实施例中，circRNA可以包括用于结合其他细胞内分子的其他结合基序。表1中列出了circRNA应用的非限制性实例。
表1
过程 MOA(实例)
定向转录 DNA-circRNA蛋白(pol，TF)
表观遗传重塑 DNA-circRNA蛋白(SWI/SNF)
转录干扰 circRNA-DNA
翻译干扰 circRNA-mRNA或核糖体
蛋白相互作用抑制剂 circRNA-蛋白
蛋白降解 蛋白-circRNA-蛋白(ubiq)
RNA降解 RNA-circRNA-RNA(RNA酶到RNA)
DNA降解 DNA-circRNA-蛋白(DNA到DNA酶)
人工受体 细胞表面-circRNA-底物
蛋白易位 蛋白-circRNA-蛋白/RNA
细胞融合 细胞表面-circRNA-细胞表面
复合物解装配 蛋白-circRNA-蛋白/RNA
受体抑制 蛋白-circRNA-底物
信号转导 蛋白-circRNA-蛋白(胱天蛋白酶)
多酶加速 多酶-circRNA
受体诱导 circRNA受体
RNA结合位点
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个RNA结合位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括RNA结合位点，所述RNA结合位点修饰内源基因和/或外源基因的表达。在一些实施例中，RNA结合位点调节宿主基因的表达。RNA结合位点可以包括与内源基因(例如，如本文所述的miRNA、siRNA、mRNA、lncRNA、RNA、DNA、反义RNA、gRNA的序列)杂交的序列、与外源核酸(例如病毒DNA或RNA)杂交的序列、与RNA杂交的序列、干扰基因转录的序列、干扰RNA翻译的序列、稳定RNA或使RNA不稳定(例如通过靶向降解)的序列、或调节DNA-或RNA-结合因子的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含与RNA结合的适体序列。适体序列可以结合至内源基因(例如，如本文所述的miRNA、siRNA、mRNA、lncRNA、RNA、DNA、反义RNA、gRNA的序列)、外源核酸(例如病毒DNA或RNA)、RNA、干扰基因转录的序列、干扰RNA翻译的序列、稳定RNA或使RNA不稳定(例如通过靶向降解)的序列、或调节DNA-或RNA-结合因子的序列。适体序列的二级结构可以结合至RNA。通过将适体序列与RNA结合，环状RNA可以与RNA形成复合物。
在一些实施例中，RNA结合位点可以是tRNA、lncRNA、lincRNA、miRNA、rRNA、snRNA、微小RNA、siRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scaRNA、Y RNA和hnRNA结合位点之一。RNA结合位点是本领域普通技术人员众所周知的。
某些RNA结合位点可以通过RNA干扰(RNAi)的生物学过程抑制基因表达。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含RNAi分子，所述RNAi分子具有RNA或RNA样结构，典型地具有15-50个碱基对(例如约18-25个碱基对)并且具有与细胞内表达的靶基因中的编码序列相同(互补)或几乎相同(基本上互补)的核碱基序列。RNAi分子包括但不限于：短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、部分双链体(meroduplex)和切丁酶(dicer)底物。
在一些实施例中，RNA结合位点包含siRNA或shRNA。siRNA和shRNA类似于内源性miRNA基因加工途径中的中间体。在一些实施例中，siRNA可以充当miRNA，并且反之亦然。像siRNA一样，微小RNA可以使用RISC来下调靶基因，但是与siRNA不同，大多数动物miRNA都不切割mRNA。相反，miRNA通过翻译抑制或聚A去除和mRNA降解降低蛋白输出。已知的miRNA结合位点位于mRNA 3’-UTR内；miRNA似乎靶向与从miRNA 5’端的第2-8个核苷酸几乎完全互补的位点。该区域称为种子区域。因为siRNA和miRNA是可互换的，所以外源siRNA可以下调具有与siRNA的种子互补性的mRNA。3’-UTR中的多个靶位点可以提供更强的下调。
微小RNA(或miRNA)是短非编码RNA，可与核酸分子的3’-UTR结合并通过降低核酸分子的稳定性或通过抑制翻译来下调基因表达。环状多核糖核苷酸可包含一种或多种miRNA靶序列、miRNA序列或miRNA种子。这样的序列可以对应于任何miRNA。
miRNA序列包含“种子”区，即成熟miRNA的第2-8位区域中的序列，该序列与miRNA靶序列具有沃森-克里克互补性。miRNA种子可以包含成熟miRNA的第2-8位或第2-7位。在一些实施例中，miRNA种子可以包含7个核苷酸(例如成熟miRNA的第2-8个核苷酸)，其中相应miRNA靶标中的种子互补位点侧接与miRNA第1位相对的腺嘌呤(A)。在一些实施例中，miRNA种子可以包含6个核苷酸(例如成熟miRNA的第2-7个核苷酸)，其中相应miRNA靶标中的种子互补位点侧接与miRNA第1位相对的腺嘌呤(A)。
miRNA种子的碱基可以与靶序列基本互补。通过将miRNA靶序列工程化至环状多核糖核苷酸中，环状多核糖核苷酸可以逃避或被宿主免疫系统检测到，可以调节降解或调节翻译。该过程将减少环状多核糖核苷酸递送时脱靶效应的危险。
环状多核糖核苷酸可包括与靶基因约5至约25个连续核苷酸相同的miRNA序列。在一些实施例中，miRNA序列靶向mRNA并从二核苷酸AA开始，包含约30％-70％、约30％-60％、约40％-60％或约45％-55％的GC含量，并且例如通过标准BLAST搜索测定，与要引入其中的哺乳动物基因组中的靶以外的任何核苷酸序列不具有高百分比同一性。
相反，可以将微小RNA结合位点工程化出(即从其去除)环状多核糖核苷酸，以调节特定组织中的蛋白表达。对多种组织中表达的调控可通过引入或去除或一个或几个miRNA结合位点来实现。
已知miRNA调控mRNA并因此调控蛋白表达的组织的实例包括但不限于肝脏(miR-122)、肌肉(miR-133、miR-206、miR-208)、内皮细胞(miR-17-92、miR-126)、骨髓细胞(miR-142-3p、miR-142-5p、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27)、脂肪组织(let-7、miR-30c)、心脏(miR-ld、miR-149)、肾脏(miR-192、miR-194、miR-204)和肺上皮细胞(let-7、miR-133、miR-126)。MiRNA还可以调控复杂的生物过程，例如血管生成(miR-132)。在本文所述的环状多核糖核苷酸中，可以去除或引入与此类过程有关的miRNA的结合位点，以使环状多核糖核苷酸的表达适应生物学相关的细胞类型或相关生物学过程的情况。在一些实施例中，miRNA结合位点包括例如miR-7。
通过理解miRNA在不同细胞类型中的表达模式，可以将本文所述的环状多核糖核苷酸工程化用于在特定细胞类型中或仅在特定生物学条件下的更有靶向性的表达。通过引入组织特异性miRNA结合位点，环状多核糖核苷酸可以设计用于组织中或在生物学条件下的最佳蛋白表达。
另外，可以将miRNA种子位点掺入环状多核糖核苷酸中以调节某些细胞中的表达，这导致生物学改善。这方面的一个实例是miR-142位点的掺入。将miR-142位点掺入本文所述的环状多核糖核苷酸中可调节造血细胞中的表达，还可减少或消除对环状多核糖核苷酸编码的蛋白的免疫应答。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少一种miRNA，例如2种、3种、4种、5种、6种或更多种。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含miRNA，所述miRNA与这些核苷酸序列中任一个或与跟靶序列互补的序列具有至少约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％核苷酸序列同一性。
已知miRNA序列的列表可在研究组织维护的数据库中找到，这些组织例如维康信托基金会桑格研究院(Wellcome Trust Sanger Institute)、宾夕法尼亚生物信息学中心(Penn Center for Bioinformatics)、斯隆凯特灵癌症中心(Memorial Sloan KetteringCancer Center)和欧洲分子生物学实验室(European Molecule Biology Laboratory)等。通过本领域已知的技术，RNAi分子可以是易于设计和生产的。此外，计算工具可用于确定有效和特定的序列基序。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含长非编码RNA。长非编码RNA(lncRNA)包括长度超过100个核苷酸的非蛋白编码转录物。较长的长度将lncRNA与小调节RNA(例如miRNA、siRNA和其他短RNA)区分开。通常，大多数(约78％)lncRNA的特征为组织特异性的。以与附近蛋白编码基因相反的方向转录的发散lncRNA(占哺乳动物基因组中总lncRNA的约20％大比例)可以调控附近基因的转录。
RNA结合位点的长度可以在约5至30个核苷酸之间，在约10至30个核苷酸之间或约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个核苷酸。RNA结合位点与目的靶的同一性程度可以是至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个大型基因间非编码RNA(lincRNA)结合位点。LincRNA构成了大部分的长非编码RNA。LincRNA是非编码转录物，且在一些实施例中，长度超过约200个核苷酸。在一些实施例中，lincRNA具有外显子-内含子-外显子结构，类似于蛋白编码基因，但是不包含开放阅读框并且不编码蛋白。与编码基因相比，LincRNA表达可以是严格组织特异性的。LincRNA典型地与其相邻基因共表达，其程度与成对的相邻蛋白编码基因相似。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含环化的lincRNA。
在一些实施例中，本文公开的环状多核糖核苷酸包括一个或多个lincRNA，例如FIRRE、LINC00969、PVT1、LINC01608、JPX、LINC01572、LINC00355、C1orf132、C3orf35、RP11-734、LINC01608、CC-499B15.5、CASC15、LINC00937和RP11-191。
已知lincRNA和lncRNA序列的列表可在研究组织(例如，基因组和整合生物学研究所(Institute of Genomics and Integrative Biology)、昆士兰大学迪亚曼蒂纳研究所(Diamantina Institute at the University of Queensland)、根特大学(GhentUniversity)和中山大学(Sun Yat-sen University))维护的数据库中找到。通过本领域已知的技术，LincRNA和lncRNA分子可以是易于设计和生产的。此外，计算工具可用于确定有效和特定的序列基序。
RNA结合位点可包含与内源基因或基因产物(例如mRNA)的全部或片段基本互补或完全互补的序列。互补序列可以与内含子和外显子之间的边界处的序列互补，从而防止特异性基因的新产生的核RNA转录物成熟为用于转录的mRNA。互补序列可以通过与基因的mRNA杂交并防止其翻译而对所述基因具有特异性。RNA结合位点可包含与内源基因或基因产物(例如DNA、RNA或其衍生物或杂交物)的全部或片段反义或基本上反义的序列。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含RNA结合位点，所述RNA结合位点具有RNA或RNA样结构，典型地在约5-5000个碱基对之间(取决于特定的RNA结构，例如miRNA 5-30bp，lncRNA 200-500bp)并且具有与细胞内表达的靶基因中的编码序列相同(互补)或几乎相同(基本上互补)的核碱基序列。
DNA结合位点
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含DNA结合位点，例如指导RNA(gRNA)的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含指导RNA或gRNA序列的互补序列。gRNA短合成RNA由与不完整的效应子部分结合所必需的“支架”序列和用于基因组靶标的用户定义的约20个核苷酸靶向序列组成。指导RNA序列可以具有17-24个核苷酸(例如19、20或21个核苷酸)的长度，并且与靶核酸序列互补。定制的gRNA生成器和算法可用于设计有效的指导RNA。还使用嵌合的“单指导RNA”(“sgRNA”)，一种模拟天然存在的crRNA-tracrRNA复合物并包含tracrRNA(用于结合核酸酶)和至少一个crRNA(以将核酸酶指导至编辑目标序列)的工程化(合成)单RNA分子，实现了基因编辑。经化学修饰的sgRNA可以在基因组编辑中有效。
gRNA可以识别特定的DNA序列(例如，与基因的启动子、增强子、沉默子或阻遏子相邻或在其内的序列)。
在一些实施例中，gRNA是用于基因编辑的CRISPR系统的一部分。对于基因编辑，可将环状多核糖核苷酸设计为包括一个或多个与所需的靶DNA序列相对应的指导RNA序列。gRNA序列可包括至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个核苷酸与Cas9或其他外切核酸酶相互作用以切割DNA，例如，Cpf1与gRNA序列的至少约16个核苷酸相互作用以进行可检测的DNA切割。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含可与DNA结合的适体序列。适体序列的二级结构可以结合至DNA。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸通过将适体序列与DNA结合而与DNA形成复合物。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括结合双链体DNA中的大沟的序列。在一个这样的情况下，由环状多核糖核苷酸和双链体DNA产生的三链体结构的特异性和稳定性是通过Hoogsteen氢键提供，其不同于双链DNA中经典沃森-克里克碱基配对中形成的那些氢键。在一种情况下，环状多核糖核苷酸通过大沟与靶双链体的富嘌呤链结合。
在一些实施例中，三链体形成发生在两个基序中，以环状多核糖核苷酸相对于靶双链体的富嘌呤链的取向辨别。在一些情况下，环状多核糖核苷酸中的多嘧啶序列段通过Hoogsteen氢键以平行方式(即，与双链体的富嘌呤链相同的5’至3’方向)结合至双链体DNA的多嘌呤序列段，而多嘌呤段(R)通过反向Hoogsteen氢键以反平行方式结合至双链体的嘌呤链。在反平行中，嘌呤基序包含G:G-C、A:A-T或T:A-T的三联体；而在平行中，嘧啶基序包含C+:G-C的典范三联体或T:A-T三联体(其中C+代表N3位置的质子化胞嘧啶)。环状多核糖核苷酸中的反平行GA和GT序列在中性pH下可形成稳定的三链体，而环状多核糖核苷酸中的平行CT序列可在酸性pH下结合。环状多核糖核苷酸中胞嘧啶上的N3可以被质子化。用5-甲基-C取代C可能允许在生理pH下结合环状多核糖核苷酸中的CT序列，因为5-甲基-C具有比胞嘧啶更高的pK。对于嘌呤和嘧啶基序，连续的至少10个碱基对的同型嘌呤-同型嘧啶序列段有助于环状多核糖核苷酸结合至双链体DNA，因为较短的三链体在生理条件下可能不稳定，并且序列中断会使三链体结构不稳定。在一些实施例中，针对三链体形成的DNA双链体靶在一条链中包括连续的嘌呤碱基。在一些实施例中，针对三链体形成的靶包括在DNA双链体的一条链中的同型嘌呤序列和在互补链中的同型嘧啶序列。
在一些实施例中，包含环状多核糖核苷酸的三链体是稳定的结构。在一些实施例中，包含环状多核糖核苷酸的三链体表现出增加的半衰期，例如增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更大，例如，持续至少约1小时至约30天，或至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更长时间或其间的任何时间。
蛋白结合位点
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个蛋白结合位点。在一些实施例中，蛋白结合位点包含适体序列。在一个实施例中，与由参考化合物(例如缺少蛋白结合位点的环状多核糖核苷酸，例如线性RNA)所触发的应答相比，环状多核糖核苷酸包括蛋白结合位点以减少来自宿主的免疫应答。
在一些实施例中，本文公开的环状多核糖核苷酸包括一个或多个蛋白结合位点，以结合蛋白，例如核糖体。通过将蛋白结合位点(例如核糖体结合位点)工程化至环状多核糖核苷酸中，环状多核糖核苷酸可以逃避或更少地被宿主的免疫系统检测到，具有经调节的降解或经调节的翻译。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少一个免疫蛋白结合位点，例如，以掩蔽环状多核糖核苷酸免于宿主免疫系统组分的作用，例如逃避CTL应答。在一些实施例中，免疫蛋白结合位点是结合至免疫蛋白并有助于掩蔽非内源的环状多核糖核苷酸。
核糖体与线性RNA接合的传统机制包括核糖体与RNA的加帽5’端的结合。从5’端，核糖体迁移到起始密码子，于是形成第一肽键。根据本发明，环状多核糖核苷酸的内部起始(即，不依赖帽)或翻译不需要游离端或加帽端。准确的说，核糖体结合至未加帽的内部位点，由此核糖体在起始密码子处开始多肽延长。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个RNA序列，该RNA序列包含核糖体结合位点，例如起始密码子。
在一些实施例中，本文公开的环状多核糖核苷酸包含与蛋白结合的蛋白结合序列。在一些实施例中，蛋白结合序列靶向环状多核糖核苷酸或将其定位至特定靶。在一些实施例中，蛋白结合序列特异性结合蛋白的精氨酸富集区。
在一些实施例中，本文公开的环状多核糖核苷酸包括一个或多个蛋白结合位点，其各自结合靶蛋白，例如，充当使两个或多个蛋白紧密接近的支架。在一些实施例中，本文公开的环状多核苷酸包含两个蛋白结合位点，其各自结合靶蛋白，从而使靶蛋白紧密接近。在一些实施例中，本文公开的环状多核苷酸包含三个蛋白结合位点，其各自结合靶蛋白，从而使三个靶蛋白紧密接近。在一些实施例中，本文公开的环状多核苷酸包含四个蛋白结合位点，其各自结合靶蛋白，从而使四个靶蛋白紧密接近。在一些实施例中，本文公开的环状多核苷酸包含五个或更多个蛋白结合位点，其各自结合靶蛋白，从而使五个或更多个靶蛋白紧密接近。在一些实施例中，靶蛋白是相同的。在一些实施例中，靶蛋白是不同的。在一些实施例中，使靶蛋白紧密接近促进了蛋白复合物的形成。例如，本公开的环状多核糖核苷酸可以充当支架以促进包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个靶蛋白或更多的复合物的形成。在一些实施例中，使两个或更多个靶蛋白紧密接近促进两个或更多个靶蛋白的相互作用。在一些实施例中，使两个或更多个靶蛋白紧密接近调节、促进或抑制酶促反应。在一些实施例中，使两个或更多个靶蛋白紧密接近调节、促进或抑制信号转导途径。
在一些实施例中，蛋白结合位点包括但不限于与针对以下蛋白的结合位点，例如ACIN1、AGO、APOBEC3F、APOBEC3G、ATXN2、AUH、BCCIP、CAPRIN1、CELF2、CPSF1、CPSF2、CPSF6、CPSF7、CSTF2、CSTF2T、CTCF、DDX21、DDX3、DDX3X、DDX42、DGCR8、EIF3A、EIF4A3、EIF4G2、ELAVL1、ELAVL3、FAM120A、FBL、FIP1L1、FKBP4、FMR1、FUS、FXR1、FXR2、GNL3、GTF2F1、HNRNPA1、HNRNPA2B1、HNRNPC、HNRNPK、HNRNPL、HNRNPM、HNRNPU、HNRNPUL1、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、ILF3、KHDRBS1、LARP7、LIN28A、LIN28B、m6A、MBNL2、METTL3、MOV10、MSI1、MSI2、NONO、NONO-、NOP58、NPM1、NUDT21、p53、PCBP2、POLR2A、PRPF8、PTBP1、RBFOX1、RBFOX2、RBFOX3、RBM10、RBM22、RBM27、RBM47、RNPS1、SAFB2、SBDS、SF3A3、SF3B4、SIRT7、SLBP、SLTM、SMNDC1、SND1、SRRM4、SRSF1、SRSF3、SRSF7、SRSF9、TAF15、TARDBP、TIA1、TNRC6A、TOP3B、TRA2A、TRA2B、U2AF1、U2AF2、UNK、UPF1、WDR33、XRN2、YBX1、YTHDC1、YTHDF1、YTHDF2、YWHAG、ZC3H7B、PDK1、AKT1、以及任何其他结合RNA的蛋白。
在一些实施例中，蛋白结合位点是与蛋白结合的核酸序列，例如，可以与转录因子、增强子、阻遏物、聚合酶、核酸酶、组蛋白或结合DNA的任何其他蛋白结合的序列。在一些实施例中，蛋白结合位点是与蛋白结合的适体序列。在一些实施例中，适体序列的二级结构结合蛋白。在一些实施例中，环状RNA通过适体序列与蛋白的结合而与蛋白形成复合物。
在一些实施例中，环状RNA缀合至小分子或其部分，其中所述小分子或其部分结合至靶，例如蛋白。可以通过经修饰的核苷酸，例如通过点击化学，将小分子与环状RNA缀合。可以结合蛋白的小分子的实例包括但不限于4-羟基他莫昔芬(4-OHT)、AC220、阿法替尼、氨基吡唑类似物、AR拮抗剂、BI-7273、博舒替尼、色瑞替尼、氯烷烃、达沙替尼、弗瑞替尼、吉非替尼、HIF-1α-衍生的(R)-羟基脯氨酸、HJB97、基于羟基脯氨酸的配体、IACS-7e、依鲁替尼、依鲁替尼衍生物、JQ1、拉帕替尼、LCL161衍生物、来那度胺、nutlin小分子、OTX015、PDE4抑制剂、泊马度胺、ripk2抑制剂、RN486、Sirt2抑制剂3b、SNS-032、青灰因子、TBK1抑制剂、酞胺哌啶酮、酞胺哌啶酮衍生物、基于噻唑烷二酮的配体、VH032衍生物、VHL配体2、VHL-1、VL-269及其衍生物。
在一些实施例中，环状RNA缀合至一个以上的小分子，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个小分子。在一些实施例中，环状RNA缀合至一个以上不同的小分子，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同的小分子。在一些实施例中，与环状RNA缀合的多于一个的小分子被配置为募集其各自的靶蛋白接近，这可以导致靶蛋白之间的相互作用和/或其他分子和细胞变化。例如，环状RNA可以缀合至JQ1和酞胺哌啶酮两者或其衍生物，因此可以募集JQ1的靶蛋白(例如BET家族蛋白)和酞胺哌啶酮的靶蛋白(例如E3连接酶)。在一些情况下，与JQ1和酞胺哌啶酮缀合的环状RNA通过JQ1或其衍生物募集BET家族蛋白，通过由酞胺哌啶酮或其衍生物募集的E3连接酶用泛素标记BET家族蛋白，并且因此导致经标记的BET家族蛋白的降解。
其他结合位点
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含针对非RNA或非DNA靶的一个或多个结合位点。在一些实施例中，结合位点可以是小分子、适体、脂质、碳水化合物、病毒颗粒、膜、多组分复合物、细胞、细胞部分或其任何片段的结合位点中之一。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含针对脂质的一个或多个结合位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含针对碳水化合物的一个或多个结合位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含针对碳水化合物的一个或多个结合位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含针对膜的一个或多个结合位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含针对多组分复合物例如核糖体、核小体、转录机器等的一个或多个结合位点。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含适体序列。适体序列可结合至本文所述的任何靶(例如，核酸分子、小分子、蛋白、碳水化合物、脂质等)。适体序列具有可以结合靶的二级结构。在一些实施例中，适体序列具有可以结合靶的三级结构。在一些实施例中，适体序列具有可以结合靶的四级结构。环状多核糖核苷酸可以通过适体序列结合至靶以形成复合物。在一些实施例中，复合物可检测持续至少5天。在一些实施例中，复合物可检测持续至少2天、3天、4天、5天、6天、7天，8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天。
螯合
在一些实施例中，本文所述的circRNA螯合靶，例如DNA、RNA、蛋白和其他细胞组分，以调控细胞过程。具有针对目的靶的结合位点的circRNA可以与靶竞争结合内源性结合伴侣。在一些实施例中，本文描述的circRNA螯合miRNA。在一些实施例中，本文描述的circRNA螯合mRNA。在一些实施例中，本文所述的circRNA螯合蛋白。在一些实施例中，本文所述的circRNA螯合核糖体。在一些实施例中，本文描述的circRNA螯合其他circRNA。在一些实施例中，本文所述的circRNA螯合非编码RNA、lncRNA、miRNA、tRNA、rRNA、snoRNA、ncRNA、siRNA或shRNA。在一些实施例中，本文所述的circRNA包括降解元件，其降解被螯合的靶，例如DNA、RNA、蛋白或与circRNA结合的其他细胞组分。在表2中列出了circRNA螯合应用的非限制性实例。
表2
Figure BDA0002931593530000461
Figure BDA0002931593530000471
在一些实施例中，使用本文所述circRNA的任何方法都可以与翻译元件组合。本文所述的包含翻译元件的circRNA可以将RNA翻译成蛋白。图3示出了由circRNA促进的蛋白表达的示意图，所述circRNA包含序列特异性RNA结合基序、序列特异性DNA结合基序、蛋白特异性结合基序(蛋白1)和调控性RNA基序(RNA 1)。调控性RNA基序可以启动RNA转录和蛋白表达。
非翻译区
在一些实施例中，本文公开的circRNA可包含加密原。在一些实施例中，加密原包含非翻译区(UTR)。基因的UTR可以转录但不能翻译。在一些实施例中，UTR可以被包括在本文所述的表达序列的翻译起始序列的上游。在一些实施例中，UTR可以被包括在本文所述的表达序列的下游。在一些情况下，第一表达序列的一个UTR与第二表达序列的另一个UTR相同或连续或重叠。在一些实施例中，内含子是人内含子。在一些实施例中，内含子是全长人内含子，例如ZKSCAN1。
在一些实施例中，加密原增强了稳定性。在一些实施例中，UTR的调控特征可包含在加密原中，以增强环状多核糖核苷酸的稳定性。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含内嵌有一段或多段的腺苷和尿苷的UTR。AU富集签名可增加表达产物的转化率。
UTR AU富集元件(ARE)的引入、去除或修饰可用于调节环状多核糖核苷酸的稳定性或免疫原性。工程化特定的环状多核糖核苷酸时，可以将ARE的一个或多个拷贝引入以使环状多核糖核苷酸不稳定，并且ARE的这些拷贝可以减少翻译和/或减少表达产物的产量。同样，可以鉴定和去除ARE或对其进行突变以增加细胞内稳定性，从而增加翻译和所得蛋白的产量。
可以将来自任何基因的UTR掺入环状多核糖核苷酸的相应侧翼区中。此外，可以利用任何已知基因的多个野生型UTR。在一些实施例中，可以使用不是野生型基因的变体的人工UTR。这些UTR或其部分可以放置在与选择它们的转录物中相同的方向，或者可以改变方向或位置。因此，可以将5’-或3’-UTR反向、缩短、加长、或与一个或多个其他5’-UTR或3’-UTR制成嵌合体。如本文使用的，与UTR序列有关时，术语“改变的”是指UTR已经相对于参考序列以某种方式改变。例如，3’-或5’-UTR可以通过如上所传授的方向或位置的更改相对于野生型或天然UTR改变，或者可以通过额外核苷酸的纳入、核苷酸的缺失、核苷酸的交换或转座来改变。这些产生“改变的”UTR的任何更改(无论是3’还是5’)都包含变体UTR。
在一些实施例中，可以使用双UTR、三UTR或四UTR，如5’-或3’-UTR。如本文使用的，“双”UTR是其中相同UTR的两个拷贝被串联或基本上串联地编码的一种情况。例如，在本发明的一些实施例中可以使用双β-珠蛋白3’-UTR。
加密原
如本文所述，环状多核糖核苷酸可以包含加密原以减少、逃避或避免细胞先天免疫应答。在一些实施例中，与由参考化合物(例如对应于所述环状多核糖核苷酸的线性多核苷酸或缺少加密原的环状多核糖核苷酸)引发的应答相比，本文提供的环状多核糖核苷酸导致宿主的免疫应答减少。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的免疫原性比缺少加密原的对应物的免疫原性小。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在哺乳动物例如人中是非免疫原性的。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸能够在哺乳动物细胞例如人细胞中复制。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括序列或表达产物。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有的半衰期至少是线性对应物(例如，线性表达序列或线性环状多核糖核苷酸)的半衰期。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有的半衰期相对于线性对应物的半衰期增加。在一些实施例中，半衰期增加了约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更长。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞中的半衰期或持续性为至少约1小时至约30天，或至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更长时间或其间的任何时间。在某些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞中的半衰期或持续性为不超过约10分钟至约7天、或不超过约1小时、2小时，3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、4天、5天、6天、7天或其间的任何时间。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸例如瞬时地或长期地调节细胞功能。在某些实施例中，细胞功能发生稳定地改变，例如调节持续至少约1小时至约30天，或至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更长时间或其间的任何时间。在某些实施例中，细胞功能发生瞬时地改变，例如调节持续存在不超过约30分钟至约7天、或不超过约1小时、2小时，3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、4天、5天、6天、7天或其间的任何时间。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸是至少约20个碱基对、至少约30个碱基对、至少约40个碱基对、至少约50个碱基对、至少约75个碱基对、至少约100个碱基对、至少约200个碱基对、至少约300个碱基对、至少约400个碱基对、至少约500个碱基对或至少约1,000个碱基对。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以具有足够的大小以容纳核糖体的结合位点。本领域技术人员可以理解，环状多核糖核苷酸的最大大小可以与产生环状多核糖核苷酸和/或使用环状多核糖核苷酸的技术限制内的一样大。不受理论的束缚，有可能RNA的多个区段可以从DNA产生并且其5’游离端和3’游离端退火以产生一“串”RNA，当只留有一个5’游离端和一个3’游离端时，该“串”RNA最终可能会被环化。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的最大尺寸可能受包装RNA并将其递送至靶标的能力所限制。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的大小是足以编码有用多肽的长度，并且因此，小于约20,000个碱基对、小于约15,000个碱基对、小于约10,000个碱基对、小于约7,500个碱基对、或小于约5,000个碱基对、小于约4,000个碱基对、小于约3,000个碱基对、小于约2,000个碱基对、小于约1,000个碱基对、小于约500个碱基对、小于约400个碱基对、小于约300个碱基对、小于约200个碱基对、小于约100个碱基对的长度可以是有用的。
切割序列
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一个切割序列。在一些实施例中，切割序列与表达序列相邻。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括切割序列，例如在牺牲型circRNA或可切割的circRNA或自切割的circRNA中。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含两个或更多个切割序列，导致将环状多核糖核苷酸分离成多个产物，例如miRNA、线性RNA、较小的环状多核糖核苷酸等。
在一些实施例中，切割序列包括核酶RNA序列。核酶(来自核糖核酸酶，也称为RNA酶或催化性RNA)是催化化学反应的RNA分子。许多天然核酶催化其自身的磷酸二酯键之一的水解，或催化其他RNA中的键的水解，但也发现天然核酶催化核糖体的氨基转移酶活性。催化性RNA可以通过体外方法“进化”。类似于上文讨论的核糖开关活性，核酶及其反应产物可以调控基因表达。在一些实施例中，将催化性RNA或核酶置于较大的非编码RNA中，这使得核酶以许多拷贝存在于细胞内，用于大体积分子的化学转化的目的。在一些实施例中，适体和核酶都可以在相同的非编码RNA中编码。
牺牲型顺序
在一些实施例中，本文所述的circRNA包括牺牲型circRNA或可切割的circRNA或自切割的circRNA。circRNA可以递送细胞组分，包括，例如，RNA、lncRNA、lincRNA、miRNA、tRNA、rRNA、snoRNA、ncRNA、siRNA或shRNA。在一些实施例中，circRNA包括被以下隔开的miRNA：(i)可自切割的元件；(ii)切割募集位点；(iii)可降解接头；(iv)化学接头；和/或(v)间隔子序列。在一些实施例中，circRNA包括被以下隔开的siRNA：(i)可自切割的元件；(ii)切割募集位点(例如ADAR)；(iii)可降解接头(例如丙三醇)；(iv)化学接头；和/或(v)间隔子序列。可自切割的元件的非限制性实例包括锤头结构、剪接元件、发夹、丁型肝炎病毒(HDV)、Varkud卫星(VS)和glmS核酶。表4中列出了circRNA牺牲型应用的非限制性实例。
表3
Figure BDA0002931593530000511
表达序列
肽或多肽
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含编码肽或多肽的序列。
多肽可以是直链或支链的。多肽的长度是约5至约4000个氨基酸、约15至约3500个氨基酸、约20至约3000个氨基酸、约25至约2500个氨基酸、约50至约2000个氨基酸或其间的任何范围。在一些实施例中，多肽的长度小于约4000个氨基酸、小于约3500个氨基酸、小于约3000个氨基酸、小于约2500个氨基酸、或小于约2000个氨基酸、小于约1500个氨基酸、小于约1000个氨基酸、小于约900个氨基酸、小于约800个氨基酸、小于约700个氨基酸、小于约600个氨基酸、小于约500个氨基酸、小于约400个氨基酸、小于约300个氨基酸或更少可以是有用的。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个RNA序列，其中每一个都可以可编码多肽。多肽可以大量产生。这样，多肽可以是可产生的任何蛋白分子。多肽可以是可从细胞分泌或定位于细胞的细胞质、细胞核或膜区室的多肽。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括编码蛋白例如治疗性蛋白的序列。治疗性蛋白的一些实例可以包括但不限于蛋白替代、蛋白补充、疫苗、抗原(例如肿瘤抗原、病毒和细菌)、激素、细胞因子、抗体、免疫疗法(例如癌症)、细胞重编程/转分化因子、转录因子、嵌合抗原受体、转座酶或核酸酶、免疫效应子(例如，影响对免疫应答/信号的易感性)、经调控的死亡效应子蛋白(例如，细胞凋亡或坏死的诱导物)、肿瘤的非溶解性抑制剂(例如癌蛋白抑制剂)、表观遗传修饰剂、表观遗传酶、转录因子、DNA或蛋白修饰酶、DNA嵌入剂、外排泵抑制剂、核受体激活剂或抑制剂、蛋白酶体抑制剂、酶竞争性抑制剂、蛋白合成效应剂或抑制剂、核酸酶、蛋白片段或结构域、配体或受体、以及CRISPR系统或其组分。
调控性序列
在一些实施例中，调控性序列是启动子。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与至少一种表达序列相邻的至少一种启动子。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与每个表达序列相邻的启动子。在一些实施例中，启动子存在于每个表达序列的一侧或两侧，导致例如一种或多种肽和/或一种或多种多肽的表达产物的隔开。
环状多核糖核苷酸可以调节基因编码的RNA的表达。因为多个基因可能彼此共享一定程度的序列同源性，所以在可以设计环状多核糖核苷酸以靶向具有充分序列同源性的一类基因。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以含有与在不同基因靶标中共享的序列或对于特异性基因靶标而言是独特的序列具有互补性的序列。在一些实施例中，可以设计环状多核糖核苷酸以靶向在若干基因之间具有同源性的RNA序列的保守区，由此靶向一个基因家族中的若干基因。在一些实施例中，可以将环状多核糖核苷酸设计为靶向单一基因的特定RNA序列所特有的序列。
在一些实施例中，表达序列的长度小于5000bp(例如，小于约5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp、50bp、40bp、30bp、20bp、10bp或更小)。在一些实施例中，表达序列独立地或额外地具有大于10bp的长度(例如，至少约10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb、3kb、3.1kb、3.2kb、3.3kb、3.4kb、3.5kb、3.6kb、3.7kb、3.8kb、3.9kb、4kb、4.1kb、4.2kb、4.3kb、4.4kb、4.5kb、4.6kb、4.7kb、4.8kb、4.9kb、5kb或更大)。
在一些实施例中，表达序列包含本文所述的一种或多种特征，例如，编码一种或多种肽或蛋白的序列、一种或多种调控性核酸、一种或多种非编码RNA以及其他表达序列。
内部核糖体进入位点(IRES)
在一些实施例中，本文所述的环状多核糖核苷酸包含内部核糖体进入位点(IRES)元件。合适的IRES元件可以包含能够接合真核核糖体的RNA序列。在一些实施例中，IRES元件是至少约50个碱基对、至少约100个碱基对、至少约200个碱基对、至少约250个碱基对、至少约350个碱基对或至少约500个碱基对。在一些实施例中，IRES元件衍生自生物体的DNA，该生物体包括但不限于病毒、哺乳动物和果蝇。病毒DNA可以衍生自例如小核糖核酸病毒cDNA、脑心肌炎病毒(EMCV)cDNA和脊髓灰质炎病毒cDNA。在一些实施例中，从其衍生IRES元件的果蝇DNA可包括例如来自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的触角足(Antennapedia)基因。
在一些实施例中，本文所述的环状多核糖核苷酸包括侧接至少一个(例如2、3、4、5或更多个)表达序列的至少一个IRES。在一些实施例中，IRES可以侧接在至少一个(例如2、3、4、5或更多个)表达序列的两侧。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在每个表达序列的一侧或两侧上可以包括一个或多个IRES序列，导致所得一个或多个肽和/或一个或多个多肽的隔开。
翻译起始序列
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸编码多肽并且可以包含翻译起始序列，例如起始密码子。在一些实施例中，翻译起始序列包括科扎克或夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的翻译起始序列，例如科扎克序列。在一些实施例中，翻译起始序列(例如科扎克序列)存在于每个表达序列的一侧或两侧，导致表达产物的隔开。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的至少一个翻译起始序列。
天然5’-UTR可以具有在翻译起始中起作用的功能。天然的5’-UTR可以包含类似科扎克序列的签名，所述签名参与核糖体启动多种基因的翻译的过程中。科扎克序列具有共有CCR(A/G)CCAUGG，其中R是起始密码子(AUG)的三个碱基上游的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，后接另一个“G”。5’-UTR也可以形成参与延长因子结合的二级结构。
环状多核糖核苷酸可以包括多于1个起始密码子，诸如但不限于至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少50个、至少60个或多于60个起始密码子。翻译可以在第一个起始密码子上起始或可以在第一个起始密码子的下游起始。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以起始于不是第一起始密码子的密码子，例如AUG。环状多核糖核苷酸的翻译可以起始于替代的翻译起始序列，例如但不限于ACG、AGG、AAG、CTG/CUG、GTG/GUG、ATA/AUA、ATT/AUU、TTG/UUG。在一些实施例中，翻译在选择性条件例如应激诱导的条件下在替代的翻译起始序列处开始。作为一个非限制性实例，环状多核糖核苷酸的翻译可以在替代的翻译起始序列，如ACG处开始。作为另一个非限制性实例，环状多核糖核苷酸翻译可以在替代的翻译起始序列CTG/CUG处开始。作为又另一个非限制性实例，环状多核糖核苷酸翻译可以在替代的翻译起始序列GTG/GUG处开始。作为又另一个非限制性实例，环状多核糖核苷酸可以在重复相关的非AUG(RAN)序列，诸如包括短段的重复RNA例如CGG、GGGGCC、CAG、CTG的替代的翻译起始序列处开始翻译。
与起始翻译的密码子侧接的核苷酸可影响环状多核糖核苷酸的翻译效率、长度和/或结构。掩蔽侧接起始翻译的密码子的任何核苷酸可用于改变环状多核糖核苷酸的翻译起始位置、翻译效率、长度和/或结构。
在一个实施例中，可以在起始密码子或替代的起始密码子附近使用掩蔽剂，以掩蔽或隐藏密码子，以降低在被掩蔽的起始密码子或替代的起始密码子处起始翻译的可能性。掩蔽剂的非限制性实例包括反义锁核酸(LNA)寡核苷酸和外显子接合复合体(EJC)。在一些实施例中，掩蔽剂可用于掩蔽环状多核糖核苷酸的起始密码子，以增加翻译将在替代的起始密码子处起始的可能性。
在一些实施例中，翻译在选择性条件下起始，诸如但不限于在存在GRSF-1时对病毒诱导的选择，并且环状多核糖核苷酸包括GRSF-1结合位点。
在一些实施例中，翻译是通过用Rocaglates处理真核起始因子4A(eIF4A)来起始的。可以通过阻断43S扫描来抑制翻译，从而导致过早的上游翻译起始并减少带有RocA-eIF4A靶序列的转录物的蛋白表达。
终止序列
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个表达序列，并且每个表达序列可以具有终止序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个表达序列，并且表达序列缺少终止序列，使得环状多核糖核苷酸被连续翻译。由于缺少核糖体停滞或脱落，终止序列的排除可能导致表达产物例如肽或多肽的滚环翻译或连续产生。在此类实施例中，滚环翻译通过每个表达序列产生连续表达产物。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含交错序列。为了避免产生连续表达产物，例如肽或多肽，同时保持滚环翻译，可以包括交错序列以在翻译期间诱导核糖体暂停。交错序列可以包括2A样或CHYSEL(顺式作用的水解酶元件)序列。在一些实施例中，交错元件编码具有C末端共有序列为X1X2X3EX5NPGP的序列，其中X1不存在或是G或H，X2不存在或是D或G，X3是D或V或I或S或M，并且X5是任何氨基酸。在一些实施例中，该序列包含具有丰富α-螺旋含量的氨基酸的非保守序列，其后是共有序列-D(V/I)ExNPG P，其中x＝任何氨基酸。交错元件的一些非限制性实例包括GDVESNPGP、GDIEENPGP、VEPNPGP、IETNPGP、GDIESNPGP、GDVELNPGP、GDIETNPGP、GDVENPGP、GDVEENPGP、GDVEQNPGP、IESNPGP、GDIELNPGP、HDIETNPGP、HDVETNPGP、HDVEMNPGP、GDMESNPGP、GDVETNPGP、GDIEQNPGP和DSEFNPGP。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在一个或多个表达序列的端部包括终止序列。在一些实施例中，一个或多个表达序列缺少终止序列。通常，终止序列包括发出翻译终止信号的框内核苷酸三联体，例如UAA、UGA、UAG。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸中的一种或多种终止序列是阅读框移位的终止序列，诸如但不限于，可以终止翻译的脱框(off-frame)或-1和+1移位的阅读框(例如，隐藏的终止)。阅读框移位的终止序列包括出现在表达序列的第二阅读框和第三阅读框中的核苷酸三联体，TAA、TAG和TGA。阅读框移位的终止序列可能对防止通常对细胞有害的mRNA误读很重要。
在一些实施例中，本文所述的交错序列可以在本文所述的共有序列的G和P之间终止翻译和/或切割表达产物。作为一个非限制性实例，环状多核糖核苷酸包括至少一个交错序列以终止翻译和/或切割表达产物。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与至少一个表达序列相邻的交错序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括在每个表达序列后的交错序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括存在于每个表达序列的一侧或两侧的交错序列，导致由每个表达序列翻译一种或多种个体肽和/或多肽。
聚A序列
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括聚A序列。在一些实施例中，聚A序列的长度大于10个核苷酸。在一些实施例中，聚A序列的长度大于15个核苷酸(例如，至少或大于约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500和3,000个核苷酸)。在一些实施例中，聚A序列是约10个至约3,000个核苷酸(例如，30至50、30至100、30至250、30至500、30至750、30至1,000、30至1,500、30至2,000、30至2,500、50至100、50至250、50至500、50至750、50至1,000、50至1,500、50至2,000、50至2,500、50至3,000、100至500、100至750、100至1,000、100至1,500、100至2,000、100至2,500、100至3,000、500至750、500至1,000、500至1,500、500至2,000、500至2,500、500至3,000、1,000至1,500、1,000至2,000、1,000至2,500、1,000至3,000、1,500至2,000、1,500至2,500、1,500至3,000、2,000至3,000、2,000至2,500和2,500至3,000)。
在一个实施例中，相对于整个环状多核糖核苷酸的长度设计聚A序列。所述设计可以基于编码区的长度、特定特征或区域(如第一或侧翼区)的长度，或者基于环状多核糖核苷酸表达的最终产物的长度。在本文中，聚A序列的长度可以比环状多核糖核苷酸或其特征长10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。还可将聚A序列设计为环状多核糖核苷酸的一部分。在本文中，聚A序列可以是构建体的总长度的或构建体总长度减去聚A序列后的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。进一步，工程化的结合位点和环状多核糖核苷酸与聚A结合蛋白的缀合可以增强表达。
在一些实施例中，将环状多核糖核苷酸设计为包括聚A-G四分体(quartet)。G-四分体是四个鸟嘌呤核苷酸的环状氢键阵列，可以由DNA和RNA中的富含G的序列形成。在一些实施例中，G-四分体可被掺入聚A序列的端部。可以测定所得的环状多核糖核苷酸构建体的稳定性、蛋白产量和/或其他参数，包括在不同时间点的半衰期。在一些实施例中，聚A-G四分体产生的蛋白产量可以等于单独使用120个核苷酸的聚A序列所得的蛋白产量的至少75％。
核糖开关
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一种或多种核糖开关。
核糖开关可以是环状多核糖核苷酸的一部分，可以直接结合小的靶分子，并且其与靶的结合影响RNA翻译以及表达产物的稳定性和活性。因此，取决于靶分子的存在或不存在，包括核糖开关的环状多核糖核苷酸可以调控环状多核糖核苷酸的活性。在一些实施例中，核糖开关具有适体样亲和力区域用于单独的分子。包含在非编码核酸中的任何适体都可以用于从大体积中螯合分子。在一些实施例中，“(核糖)开关”活性可用于事件的下游报告。
在一些实施例中，核糖开关通过以下来调节基因表达：转录终止、翻译起始抑制、mRNA自切割、以及在真核生物中剪接途径的改变。核糖开关可通过触发分子的结合或去除来控制基因表达。因此，使包括核糖开关的环状多核糖核苷酸经受激活、失活或阻断核糖开关的条件可以改变基因表达。例如，基因表达可以由于转录终止或核糖体与RNA结合的阻断而改变。取决于核糖开关的性质，触发分子或其类似物的结合可以减少/阻止或促进/增加RNA分子的表达。
在一些实施例中，核糖开关是钴胺素核糖开关(也称B12-元件)，所述核糖开关结合腺苷钴胺素(维生素B12的辅酶形式)以调控钴胺素和类似代谢物的生物合成和转运。
在一些实施例中，核糖开关是环二-GMP核糖开关，所述核糖开关结合环二-GMP以调控多种基因。环二-GMP核糖开关有两种非结构相关的类别：环二GMP-I和环二GMP-II。
在一些实施例中，核糖开关是FMN核糖开关(也称RFN元件)，所述核糖开关结合黄素单核苷酸(FMN)以调控核黄素的生物合成和转运。
在一些实施例中，核糖开关是glmS核糖开关，当存在足够浓度的葡萄糖胺-6-磷酸酯时，所述核糖开关自切割。
在一些实施例中，核糖开关是谷氨酰胺核糖开关，所述核糖开关结合谷氨酰胺以调控涉及谷氨酰胺和氮代谢的基因。谷氨酰胺核糖开关还结合未知功能的短肽。这样的核糖开关分为两个结构上相关的类别：glnA RNA基序和下游肽基序。
在一些实施例中，核糖开关是甘氨酸核糖开关，所述核糖开关结合甘氨酸以调控甘氨酸代谢基因。甘氨酸核糖开关在同一mRNA中包含两个相邻的适体结构域，并且是已知唯一显示出协同结合的天然RNA。
在一些实施例中，核糖开关是赖氨酸核糖开关(也称L-盒)，所述核糖开关结合赖氨酸以调控赖氨酸的生物合成、分解代谢和转运。
在一些实施例中，核糖开关是前Q1核糖开关，该核糖开关结合前Q核苷以调控参与该前体的合成或转运至Q核苷的基因。前Q1核糖开关的两个不同类别是前Q1-I核糖开关和前Q1-II核糖开关。在天然存在的核糖开关中，前Q1-I核糖开关的结合结构域异常小。前Q1-II核糖开关仅在链球菌和乳球菌属的某些物种中发现，具有完全不同的结构，并且比前Q1-I核糖开关更大。
在一些实施例中，核糖开关是嘌呤核糖开关，所述核糖开关结合嘌呤以调控嘌呤的代谢和转运。嘌呤核糖开关的不同形式结合鸟嘌呤或腺嘌呤。鸟嘌呤或腺嘌呤的特异性取决于与核糖开关中Y74位处单个嘧啶的沃森-克里克相互作用。在鸟嘌呤核糖开关中，单个嘧啶是胞嘧啶(即，C74)。在腺嘌呤核糖开关中，单个嘧啶是尿嘧啶(即，U74)。嘌呤核糖开关的同源类型可以结合脱氧鸟苷，但比单核苷酸突变具有更显著的差异。
在一些实施例中，核糖开关是S-腺苷高半胱氨酸(SAH)核糖开关，所述核糖开关结合SAH以调控参与回收从甲基化反应中的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)产生的SAH的基因。
在一些实施例中，核糖开关是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)核糖开关，所述核糖开关结合SAM以调控甲硫氨酸和SAM的生物合成和运输。有三种不同的SAM核糖开关：SAM-I(最初称为S-盒)、SAM-II和SMK盒。SAM-I在细菌中广泛存在。SAM-II仅在α-变形菌门、β-变形菌门和少数γ-变形菌门中发现。在乳酸杆菌目中发现了SMK盒核糖开关。核糖开关的这三个变体没有明显的序列或结构相似性。第四种变体SAM-IV似乎具有与SAM-I类似的配体结合核心，但是在不同的支架的情况下。
在一些实施例中，核糖开关是SAM-SAH核糖开关，所述核糖开关以相似的亲和力结合SAM和SAH。
在一些实施例中，核糖开关是四氢叶酸核糖开关，所述核糖开关结合四氢叶酸以调控合成并转运基因。
在一些实施例中，核糖开关是茶碱结合核糖开关或结合焦磷酸胸腺嘧啶的核糖开关。
在一些实施例中，核糖开关是来自腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobactertengcongensis)的glmS催化性核糖开关，所述核糖开关感测葡糖胺6-磷酸酯。
在一些实施例中，核糖开关是硫胺素焦磷酸盐(TPP)核糖开关(也称Thi-盒)，所述核糖开关结合TPP以调控硫胺素的生物合成和转运，以及类似代谢物的转运。在真核生物中发现TPP核糖开关。
在一些实施例中，核糖开关是Moco核糖开关，所述核糖开关结合钼辅助因子，以调控参与该辅酶的生物合成和转运的基因，以及使用钼或其衍生物作为辅因子的酶。
在一些实施例中，核糖开关是在创伤弧菌的腺嘌呤脱氨酶(add)编码基因的5’-UTR中发现的腺嘌呤感测add-A核糖开关。
适体酶
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含适体酶。适体酶是用于条件性表达的开关，在该条件性表达中适体区域用作变构控制元件并偶联至催化RNA区域(如下所述的“核酶”)。在一些实施例中，适体酶在细胞类型特异性翻译中具有活性。在一些实施例中，适体酶在细胞状态特异性翻译(例如，病毒感染的细胞或存在病毒核酸或病毒蛋白)下具有活性。
核酶是催化化学反应的RNA分子。许多天然核酶可以催化核酶本身的磷酸二酯键水解或其他RNA中的磷酸二酯键水解。天然核酶也可以催化核糖体的氨基转移酶活性。催化性RNA可以通过体外方法“进化”。核酶和核酶的反应产物可以调控基因表达。在一些实施例中，将催化性RNA或核酶置于较大的非编码RNA中，这使得核酶以许多拷贝存在于细胞内，用于大体积分子的化学转化。在一些实施例中，适体和核酶都可以在相同的非编码RNA中编码。
核酶的一些非限制性实例包括锤头核酶、VL核酶、铅酶、和发夹核酶。
在一些实施例中，适体酶是可以切割RNA序列并且可以由于结合配体或调节子而被调控的核酶。核酶可以是自切割核酶。这样，这些核酶可以组合核酶和适体的特性。
在一些实施例中，适体酶包括在本文所述的环状多核糖核苷酸的非翻译区中。在不存在配体/调节子的情况下，适体酶是无活性的，这可以允许转基因表达。可以通过添加配体来关闭或下调表达。应答于特定调节子的存在而被下调的适体酶可用于需要应答调节子的基因表达上调的控制系统中。
适体酶也可以用于开发环状多核糖核苷酸表达自我调控的系统。例如，本文所述的环状多核糖核苷酸的蛋白产物，即特定小分子的合成中的决定速率的酶，可以被修饰成包括适体酶，所述适体酶被选择为在所述小分子存在下具有增加的催化活性，以提供针对分子合成的自动调控反馈回路。替代性地，适体酶活性可以被选择为感测环状多核糖核苷酸或任何其他细胞大分子的蛋白产物积累。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括适体序列。适体的非限制性实例包括结合溶菌酶的RNA适体、Toggle-25t(包含2’氟嘧啶核苷酸的RNA适体，其以高特异性和亲和力结合凝血酶)、结合人免疫缺陷病毒反式作用应答元件(HIV TAR)的RNATat、结合血红素的RNA适体、结合干扰素γ的RNA适体、结合血管内皮生长因子(VEGF)的RNA适体、结合前列腺特异性抗原(PSA)的RNA适体、结合多巴胺的RNA适体和结合热休克因子1(HSF1)的RNA适体。
在一些实施例中，本文所述的circRNA可用于RNA的转录和复制。例如，circRNA可用于编码非编码RNA、lncRNA、miRNA、tRNA、rRNA、snoRNA、ncRNA、siRNA或shRNA。在一些实施例中，circRNA可以包括反义miRNA和转录元件。转录后，此类circRNA可以产生功能性的线性miRNA。circRNA表达和调节应用的非限制性实例列于表5中。
表4
过程 MOA(实例)
抑制与翻译的组合疗法 抑制一种蛋白并补充另一种(或相同蛋白)
复制元件
环状多核糖核苷酸可编码可用于复制的序列和/或基序。环状多核糖核苷酸的复制可以通过生成互补的环状多核糖核苷酸来进行。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括起始转录的基序，其中转录由环状多核糖核苷酸编码的内源性细胞机制(DNA依赖性RNA聚合酶)或RNA依赖性RNA聚合酶驱动。滚环转录事件的产物可以被核酶切割，以生成单位长度的互补或增殖环状多核糖核苷酸。核酶可由环状多核糖核苷酸、其互补序列或由反式RNA序列编码。在一些实施例中，编码的核酶可以包括调控(抑制或促进)核酶的活性以控制circRNA增殖的序列或基序。在一些实施例中，单位长度序列可以通过细胞RNA连接酶连接成环状形式。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括有助于自扩增的复制元件。这样的复制元件的实例包括HDV复制结构域和具有复制能力的环状RNA有义和/或反义核酶，例如反基因组5’-CGGGUCGGCAUGGCAUCUCCACCUCCUCGCGGUCCGACCUGGGCAUCCGAAGGAGGACGCACGUCCACUCGGAUGGCUAAGGGAGAGCCA-3’(SEQ ID NO:1)和基因组5’-UGGCCGGCAUGGUCCCAGCCUCCUCGCUGGCGCCGGCUGGGCAACAUUCCGAGGGGACCGUCCCCUCGGUAAUGGCGAAUGGGACCCA-3’(SEQ ID NO:2)。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一个如本文所述的切割序列以帮助复制。环状多核糖核苷酸中的切割序列可以将环状多核糖核苷酸复制所得的长转录物切割至特定长度，其后可以环化以形成环状多核糖核苷酸的互补物。
在另一个实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少一个核酶序列，以将环状多核糖核苷酸复制所得的长转录物切割至特定长度，其中另一种编码的核酶在核酶序列处切割转录物。环化形成环状多核糖核苷酸的互补物。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸基本上对例如核酸外切酶的降解有抗性。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞内复制。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞内的复制速率为约10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％、95％-99％之间或其之间的任何百分比。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞内复制并传递给子细胞。在一些实施例中，细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％的效率将至少一种环状多核糖核苷酸传递至子细胞。在一些实施例中，正经历减数分裂的细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％的效率将环状多核糖核苷酸传递至子细胞。在一些实施例中，正经历有丝分裂的细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％的效率将环状多核糖核苷酸传递至子细胞。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在宿主细胞内复制。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸能够在哺乳动物细胞例如人细胞中复制。
尽管在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在宿主细胞中复制，但是环状多核糖核苷酸未整合到宿主的基因组中，例如未与宿主的染色体整合。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有例如与宿主的染色体的可忽略的重组频率。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸与例如宿主的染色体的重组频率例如小于约1.0cM/Mb、0.9cM/Mb、0.8cM/Mb、0.7cM/Mb、0.6cM/Mb、0.5cM/Mb、0.4cM/Mb、0.3cM/Mb、0.2cM/Mb、0.1cM/Mb或更低。
其他序列
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸还包括另一种核酸序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可包括DNA、RNA或人工核酸序列。其他序列可以包括但不限于基因组DNA，cDNA或编码tRNA、mRNA、rRNA、miRNA、gRNA、siRNA或其他RNAi分子的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括编码siRNA的序列以靶向与环状多核糖核苷酸相同的基因表达产物的不同的一个或多个基因座。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括编码siRNA的序列以靶向与环状多核糖核苷酸不同的基因表达产物。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5’-UTR。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少3’-UTR。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚A序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少终止序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少内部核糖体进入位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少核酸外切酶的降解易感性。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少与帽结合蛋白的结合。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5’帽。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含以下序列中的一个或多个：编码一个或多个miRNA的序列、编码一个或多个复制蛋白的序列、编码外源基因的序列、编码治疗剂的序列、调控性序列(例如启动子、增强子)、编码一个或多个靶向内源基因(siRNA、lncRNA、shRNA)的调控性序列的序列和编码治疗性mRNA或蛋白的序列。
其他序列的长度可以是约2nt至约5000nt、约10nt至约100nt、约50nt至约150nt、约100nt至约200nt、约150nt至约250nt、约200至约300nt、约250nt至约350nt、约300nt至约500nt、约10nt至约1000nt、约50nt至约1000nt、约100nt至约1000nt、约1000nt至约2000nt、约2000nt至约3000nt、约3000nt至约4000nt、约4000nt至约5000nt或其间的任何范围。
作为其环化的结果，环状多核糖核苷酸可能包含某些使其区别于线性RNA的特征。例如，与线性RNA相比，环状多核糖核苷酸不易被核酸外切酶降解。这样，环状多核糖核苷酸比线性RNA更稳定，尤其是在核酸外切酶存在下孵育时。与线性RNA相比，环状多核糖核苷酸的稳定性提高，使得环状多核糖核苷酸作为生产多肽的细胞转化试剂更加有用，并且与线性RNA相比，存储更容易且时间更长。可以使用本领域标准的方法测试用核酸外切酶处理的环状多核糖核苷酸的稳定性，该方法确定是否已经发生RNA降解(例如，通过凝胶电泳)。
此外，与线性RNA不同，当环状多核糖核苷酸与磷酸酶如小牛肠磷酸酶一起孵育时，环状多核糖核苷酸较不易去磷酸化。
核苷酸间隔子序列
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含间隔子序列。
间隔子可以是具有低GC含量的核酸分子，例如跨间隔子全长，或跨间隔子的至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％连续核酸残基，低于65％、60％、55％、50％、55％、50％、45％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。在一些实施例中，间隔子基本上没有二级结构，如小于40kcal/mol，小于-39、-38、-37、-36、-35、-34、-33、-32、-31、-30、-29、-28、-27、-26、-25、-24、-23、-22、-20、-19、-18、-17、-16、-15、-14、-13、-12、-11、-10、-9、-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2或-1kcal/mol。间隔子可以包括核酸，如DNA或RNA。
间隔子序列可以编码RNA序列，并且优选地为蛋白或肽序列，包括分泌信号肽。
间隔子序列可以是非编码的。如果间隔子是非编码序列，可以在相邻序列的编码序列中提供起始密码子。在一些实施例中，设想编码序列的第一核酸残基可以是起始密码子例如AUG的A残基。如果间隔子编码RNA或蛋白或肽序列，可以在间隔子序列中提供起始密码子。
在一些实施例中，间隔子可操作地连接至本文所述的另一序列。
非核酸接头
本文所述的环状多核糖核苷酸还可包含非核酸接头。在一些实施例中，本文所述的环状多核糖核苷酸在本文所述的一个或多个序列或元件之间具有非核酸接头。在一些实施例中，本文所述的一个或多个序列或元件与接头连接。非核酸接头可以是化学键，例如一个或多个共价键或非共价键。在一些实施例中，非核酸接头是肽接头或蛋白接头。这样的接头可以在2-30个氨基酸之间，或更长。接头包括本文所述的任何柔性、刚性或可切割的接头。
最常用的柔性接头具有的序列主要由Gly和Ser残基(“GS”接头)段组成。柔性接头可以有用于连接需要一定程度的移动或相互作用的结构域，并且可以包括小的、非极性的(例如Gly)或极性的(例如Ser或Thr)氨基酸。Ser或Thr的掺入还可以通过与水分子形成氢键来维持接头在水溶液中的稳定性，且因此减少了接头与蛋白部分之间的不利相互作用。
刚性接头有用于保持各结构域之间的固定距离并维持它们的独立功能。当结构域的空间分离对于保持融合中一种或多种组分的稳定性或生物活性至关重要时，刚性接头也可以是有用的。刚性接头可以具有α螺旋结构或富含脯氨酸的序列(Pro-rich sequence)、(XP)n，其中X表示任何氨基酸，优选Ala、Lys或Glu。
可切割接头可以在体内释放游离的功能性结构域。在一些实施例中，接头可以在特异性条件下(例如在还原剂或蛋白酶的存在下)切割。体内可切割接头可利用二硫键的可逆性质。一个实例包括两个Cys残基之间的凝血酶敏感性序列(例如，PRS)。CPRSC的体外凝血酶处理导致凝血酶敏感性序列的切割，而可逆的二硫键保持完整。融合蛋白中接头的体内切割也可以通过蛋白酶进行，该蛋白酶在病理条件下(例如癌症或炎症)在体内、在特定细胞或组织中、或在受限的某些细胞区室内表达。许多蛋白酶的特异性在受限的区室中提供了对接头的缓慢切割。
连接分子的实例包括疏水接头，如带负电荷的磺酸根基团；脂质，例如聚(-CH2-脂质，例如聚(-CHe g聚乙二醇(PEG)基团，其不饱和变体，其羟基化变体，其酰胺化或其他含N的变体，非碳接头；碳水化合物接头；磷酸二酯接头，或能够共价连接两个或更多个多肽的其他分子。也可以包括非共价接头(如多肽与之连接的疏水性脂质小球)例如通过多肽的疏水区域或多肽的疏水延伸，如富含亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、或者也可能是丙氨酸、苯丙氨酸、或甚至酪氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸的一系列残基或其他疏水残基。多肽可以使用基于电荷的化学连接，使得多肽的带正电荷的部分与另一种多肽或核酸的带负电荷的部分连接。
环化
在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可以被环化或连环化。在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可以在配制和/或递送之前被体外环化。在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可以在细胞内环化。
细胞外环化
在一些实施例中，使用化学方法环化或连环化线性环状多核糖核苷酸以形成环状多核糖核苷酸。在一些化学方法中，核酸的5’-端和3’-端(例如，线性环状多核糖核苷酸)包括化学反应性基团，当基团彼此靠近时，可在分子的3’-端和5’-端之间形成新的共价键。5’-端可以含有NHS酯反应性基团，且3’-端可以含有3’-氨基末端的核苷酸，使得在有机溶剂中，线性RNA分子3’-端上的3’-氨基末端的核苷酸将在5’-NHS-酯部分上经历亲核攻击，形成新的5’-或3’-酰胺键。
在一些实施例中，DNA或RNA连接酶可用于将5’-磷酸化的核酸分子(例如，线性环状多核糖核苷酸)酶促连接至核酸(例如，线性核酸)的3’-羟基，形成新的磷酸二酯键。在示例性反应中，根据制造商的方案，将线性环状多核糖核苷酸与1-10单位的T4 RNA连接酶在37℃下孵育1小时。连接反应可以在存在线性核酸时发生，该线性核酸能够与并列的5’-和3’-区域碱基配对，以辅助酶促连接反应。
在一些实施例中，DNA或RNA连接酶可用于环状多核苷酸的合成。作为一个非限制性实例，连接酶可以是circ连接酶或环状连接酶。
在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸的5’-或3’-端可编码连接酶核酶序列，使得在体外转录期间，所得线性环状多核糖核苷酸包括活性核酶序列，该活性核酶序列能够连接线性环状多核糖核苷酸的5’-端至线性环状多核糖核苷酸的3’-端。连接酶核酶可以衍生自第I组内含子、丁型肝炎病毒、发夹核酶，或者可以通过SELEX(通过指数富集进行的配体系统进化)进行选择。核酶连接酶反应在0℃与37℃之间的温度下可能需要1小时至24小时。
在一些实施例中，可通过使用至少一个非核酸部分将线性环状多核糖核苷酸环化或连环化。在一方面，至少一个非核酸部分可与线性环状多核糖核苷酸的5’末端附近和/或3’末端附近的区域或特征反应，以环化或连环化线性环状多核糖核苷酸。在另一方面，至少一个非核酸部分可以位于或连接至或邻近线性环状多核糖核苷酸的5’末端和/或3’末端。设想的非核酸部分可以是同源或异源的。作为一个非限制性实例，非核酸部分可以是键，如疏水键、离子键、可生物降解的键和/或可切割的键。作为另一个非限制性实例，非核酸部分是连接部分。作为又另一个非限制性实例，非核酸部分可以是寡核苷酸或肽部分，如本文所述的适体或非核酸接头。
在一个实施例中，线性环状多核糖核苷酸可由于非核酸部分而被环化或连环化，造成位于、邻近或连接至环状多核糖核苷酸的5’-和3’-端的原子、分子表面之间的吸引。作为一个非限制性实例，可通过分子间作用力或分子内作用力将一个或多个线性环状多核糖核苷酸环化或连环化。分子间作用力的非限制性实例包括偶极-偶极力、偶极诱导偶极力、诱导偶极诱导偶极力、范德华力和色散力。分子内作用力的非限制性实例包括共价键、金属键、离子键、共振键、抓氢键(agnostic bond)、偶极键、缀合、超缀合和反向键。
在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可在5’末端附近和3’末端附近包含核酶RNA序列。当序列暴露于核酶的其余部分时，核酶RNA序列可以共价地连接至肽。在一方面，肽共价地连接至5’末端和3’末端附近的核酶RNA序列可以彼此联系，引起线性环状多核糖核苷酸环化或连环化。在另一方面，肽共价地连接至核酶RNA序列5’末端和3’末端附近可以引起线性初级构建体或线性mRNA在使用本领域已知的方法(诸如但不限于蛋白连接)进行连接后环化或连环化。
在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可包括被转化为5’单磷酸的核酸的5’三磷酸，例如通过使5’三磷酸与RNA5’焦磷酸水解酶(RppH)或ATP二磷酸水解酶(脱磷酸酶)接触。替代性地，将线性环状多核糖核苷酸的5’三磷酸转化为5’单磷酸可通过两步反应完成，该两步反应包括：(a)使线性环状多核糖核苷酸的5’核苷酸与磷酸酶(例如，热敏磷酸酶、虾碱性磷酸酶或小牛肠磷酸酶)接触以除去所有三个磷酸；和(b)在步骤(a)之后，使5’核苷酸与添加单个磷酸酯的激酶(例如，多核苷酸激酶)接触。
剪接元件
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一个剪接元件。在一些实施例中，剪接元件与至少一个表达序列相邻。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与每个表达序列相邻的剪接元件。在一些实施例中，剪接元件在每个表达序列的一侧或两侧，导致例如一种或多种肽和/或一种或多种多肽的表达产物的隔开。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括内部剪接元件，该剪接元件在被复制时，剪接端部被连接在一起。一些实例可包括具有剪接位点序列和短反向重复序列(30-40nt)的微型内含子(<100nt)，如AluSq2、AluJr和AluSz、侧接内含子中的反向序列、侧接内含子中的Alu元件以及在接近反向剪接事件的(suptable4富集基序)顺式序列元件中发现的基序，如带有侧接外显子的反向剪接位点(backsplice site)之前(上游)或之后(下游)200bp中的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一个本文其他处所述的重复核苷酸序列作为内部剪接元件。在这样的实施例中，重复核苷酸序列可以包括来自Alu家族内含子的重复序列。在一些实施例中，剪接相关的核糖体结合蛋白可以调控环状多核糖核苷酸的生物发生(例如，盲肌蛋白和震动蛋白(QKI)剪接因子)。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括侧接环状多核糖核苷酸的头尾接合点处的典范剪接位点。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可包括隆起-螺旋-隆起基序，包含两个3-核苷酸隆起侧接的4-碱基对茎。切割发生在隆起区域的一个位点处，生成末端为5’-羟基和2’,3’-环状磷酸酯的特征片段。通过将5’-OH基团亲核攻击到形成3’,5’-磷酸二酯桥的同一分子的2’,3’-环状磷酸酯上来进行环化。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可包括具有HPR元件的多聚重复RNA序列。HPR包含2’,3’-环状磷酸酯和5’-OH末端。HPR元件自处理线性环状多核糖核苷酸的5’-和3’-端，从而将端部连接在一起。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可包括介导自连接的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括HDV序列(例如，HDV复制结构域保守序列，GGCUCAUCUCGACAAGAGGCGGCAGUCCUCAGUACUCUUACUCUUUUCUGUAAAGAGGAGACUGCUGGACUCGCCGCCCAAGUUCGAGCAUGAGCC(SEQ ID NO:3)(Beeharry等人，2004)或GGCUAGAGGCGGCAGUCCUCAGUACUCUUACUCUUUUCUGUAAAGAGGAGACUGCUGGACUCGCCGCCCGAGCC(SEQ ID NO:4))，以进行自连接。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可包括环E序列(例如在PSTVd中)以进行自连接。在另一个实施例中，环状多核糖核苷酸可包括自环化内含子，例如5’和3’剪接接合，或自环化催化内含子，如I型、II型或III型内含子。I型内含子自剪接序列的非限制性实例可包括源自T4噬菌体基因td的自剪接置换内含子-外显子序列和四膜虫的插入序列(IVS)rRNA。
其他环化方法
在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可包括互补序列，包括个体内含子内或侧接内含子内的重复或非重复核酸序列。重复核酸序列是在环状多核糖核苷酸的区段内出现的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括重复核酸序列。在一些实施例中，重复核苷酸序列包括聚CA序列或聚UG序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与环状多核糖核苷酸的另一区段中的互补重复核酸序列杂交的至少一个重复核酸序列，其杂交的区段形成内部双链。在一些实施例中，两个单独的环状多核糖核苷酸的重复核酸序列和互补重复核酸序列杂交以生成单个环化多核糖核苷酸，杂交的区段形成内部双链。在一些实施例中，互补序列位于线性环状多核糖核苷酸的5’-端和3’-端。在一些实施例中，互补序列包括约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个配对的核苷酸。
修饰
在一些方面，本文所述的本发明包括使用和制备经修饰的环状多核糖核苷酸以及递送经修饰的环状多核糖核苷酸的组合物和方法。术语“经修饰的核苷酸”可指具有针对未修饰的天然核糖核苷酸(如表5中的化学式所示，例如天然的未修饰的核苷酸腺苷(A)、尿苷(U)、鸟嘌呤(G)、胞苷(C))和单磷酸酯的化学组成的一个或多个化学修饰的任何核苷酸类似物或衍生物。经修饰的核糖核苷酸的化学修饰可以是对核糖核苷酸的任何一个或多个官能团的修饰，例如糖、核碱基或核苷间键(例如连接的磷酸酯/磷酸二酯键/磷酸二酯主链)。
表5.未经修饰的天然核糖核苷
Figure BDA0002931593530000731
Figure BDA0002931593530000741
相对于参考序列(特别地亲本多核糖核苷酸)，环状多核糖核苷酸可以包括本发明范围内包括的一个或多个取代、插入和/或添加、缺失和共价修饰。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个转录后修饰(例如，加帽、切割、聚腺苷酸化、剪接、聚A序列、甲基化、酰化、磷酸化、赖氨酸和精氨酸残基的甲基化、乙酰化、以及硫醇基团和酪氨酸残基的亚硝基化等)。环状多核糖核苷酸可包括任何有用的修饰，如针对糖、核碱基或核苷间键(例如对连接的磷酸酯/对磷酸二酯键/对磷酸二酯主链)。嘧啶核碱基的一个或多个原子可以被任选取代的氨基、任选取代的硫醇、任选取代的烷基(例如甲基或乙基)或卤代(例如氯代或氟代)替代或取代。在某些实施例中，在每个糖和核苷间键中存在修饰(例如，一个或多个修饰)。修饰可以是对脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或其杂交体的核糖核酸(RNA)修饰。本文描述了其他修饰。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少一种N(6)甲基腺苷(m6A)修饰以增加翻译效率。
在一些实施例中，修饰可以包括化学或细胞诱导的修饰。例如，细胞内RNA修饰的一些非限制性实例如Lewis和Pan,“RNA modifications and structures cooperate toguide RNA-protein interactions[核糖核酸的修饰和结构共同引导核糖核酸和蛋白的相互作用]”,Nat Reviews Mol Cell Biol[自然评论：分子细胞生物学],2017,18:202-210所描述。
在另一个实施例中，“假尿苷”指m1acp3Ψ(1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷。在另一个实施例中，所述术语指m1Ψ(1-甲基假尿苷)。在另一个实施例中，所述术语指Ψm(2′-O-甲基假尿苷。在另一个实施例中，所述术语指m5D(5-甲基二氢尿苷)。在另一个实施例中，所述术语指m3Ψ(3-甲基假尿苷)。在另一个实施例中，所述术语指未经进一步修饰的假尿苷部分。在另一个实施例中，所述术语指任何上述假尿苷的单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯。在另一个实施例中，所述术语指本领域已知的任何其他假尿苷。每种可能性代表本发明的单独实施例。
在一些实施例中，对环状多核糖核苷酸的核糖核苷酸的化学修饰可以增强免疫逃避。修饰包括，例如端部修饰，如5’-端修饰(磷酸化(单、二和三磷酸化)、缀合、反向连接等)、3’-端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等)、碱基修饰(例如，用稳定的碱基、不稳定的碱基或与扩展的亲本库碱基配对的碱基替代)、碱基去除(脱碱基核苷酸)或碱基缀合。经修饰的核糖核苷酸碱基还可包括5-甲基胞苷和假尿苷。在一些实施例中，举几个功能作用，碱基修饰可以调节环状多核糖核苷酸的表达、免疫应答、稳定性、亚细胞定位。在一些实施例中，修饰包括双正交核苷酸，例如非天然碱基。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的一个或多个核糖核苷酸的糖修饰(例如在2’位置或4’位置)或糖替代以及主链修饰可以包括磷酸二酯键的修饰或替代。环状多核糖核苷酸的非限制性实例包括具有经修饰的主链或非天然核苷间键(例如那些经修饰的或替代的磷酸二酯键)的环状多核糖核苷酸。具有经修饰的主链的环状多核糖核苷酸尤其包括在主链中不具有磷原子的那些。出于本申请的目的，并且如本领域中有时提及的，在其核苷间主链中不具有磷原子的经修饰的RNA也可以被认为是寡核苷。在特定的实施例中，环状多核糖核苷酸将包括在其核苷间主链中具有磷原子的核糖核苷酸。
经修饰的环状多核糖核苷酸主链可包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(如3’-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(如3’-氨基磷酸酰胺和氨基烷基膦酸酯)、硫羰膦酰胺(thionophosphoramidate)、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯、和具有正常3’-5’键的硼烷磷酸酯，这些的2’-5’连接的类似物，以及具有相反极性的那些，其中相邻的核苷单元对3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’连接。也包括各种盐、混合盐和游离酸形式。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以带负电荷或带正电荷。
可掺入环状多核糖核苷酸中的经修饰的核苷酸可在核苷间键(例如磷酸酯主链)上被修饰。在此，在多核苷酸主链的上下文中，短语“磷酸酯”和“磷酸二酯”可互换使用。可以通过用不同的取代基替代一个或多个氧原子来修饰主链磷酸酯基团。此外，经修饰的核苷和核苷酸可包括用本文所述的另一个核苷间键合进行的对未修饰的磷酸酯部分的整体替代。经修饰的磷酸酯基团的实例包括但不限于硫代磷酸酯、亚磷酸硒酸酯、硼酸磷酸酯、硼酸磷酸酯、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯的两个非连接氧都被硫替代。也可以通过用氮(桥连的氨基磷酸酯)、硫(桥连的硫代磷酸酯)和碳(桥连的亚甲基膦酸酯)替代连接氧来修饰磷酸酯接头。
提供α-硫代取代的磷酸酯部分以通过非天然硫代磷酸酯主链键赋予RNA和DNA聚合物稳定性。硫代磷酸酯DNA和RNA具有增强的核酸酶抗性，并因此在细胞环境中具有更长的半衰期。与环状多核糖核苷酸连接的硫代磷酸酯有望通过减弱细胞先天免疫分子的结合/激活来降低先天免疫应答。
在一些实施例中，经修饰的核苷包括α-硫代-核苷(例如5’-O-(l-硫代磷酸酯)-腺苷、5’-O-(l-硫代磷酸酯)-胞苷(α-硫代胞苷)、5’-O-(l-硫代磷酸酯)-鸟苷、5’-O-(l-硫代磷酸酯)-尿苷或5’-O-(1-硫代磷酸酯)-假尿苷)。其他核苷间键可包括不包含磷原子的核苷间键。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可包括一种或多种细胞毒性核苷。例如，细胞毒性核苷可以被掺入环状多核糖核苷酸中，如双功能修饰。细胞毒性核苷可以包括但不限于阿糖腺苷、5-氮杂胞苷、4’-硫代阿糖胞苷、环戊烯基胞嘧啶、克拉屈滨、氯法拉滨、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖胞苷、l-(2-C-氰基-2-脱氧-β-D-阿拉伯-戊呋喃糖基)-胞嘧啶、地西他滨、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨、氟尿苷、吉西他滨、替加氟和尿嘧啶的组合、替加氟((R,S)-5-氟-l-(四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(lH,3H)-二酮)、曲沙他滨、替扎西他滨、2’-脱氧-2’-亚甲基胞苷(DMDC)和6-巯基嘌呤。其他实例包括氟达拉滨磷酸酯、N4-山嵛酰基-l-β-D-阿拉伯戊呋喃糖基胞嘧啶、N4-十八烷基-1-β-D-阿拉伯戊呋喃糖基胞嘧啶、N4-棕榈酰基-l-(2-C-氰基-2-脱氧-β-D-阿拉伯-戊呋喃糖基)胞嘧啶和P-4055(阿糖胞苷5’-花生酸酯)。
环状多核糖核苷酸可以沿着分子的整个长度均一地修饰。例如，一种或多种或所有类型的核苷酸(例如，天然存在的核苷酸、嘌呤或嘧啶，或A、G、U、C、I、pU中的任何一种或多种或全部)在环状多核糖核苷酸中，或在其给定的预定序列区域中可以被均一地修饰。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括假尿苷。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括肌苷，相对于病毒RNA，肌苷可以帮助免疫系统将环状多核糖核苷酸表征为内源性。肌苷的掺入还可以介导改善RNA稳定性/减少降解。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸(或其给定序列区域)中的所有核苷酸均被修饰。在一些实施例中，修饰可以包括可增强表达的m6A；可减弱免疫应答的肌苷；可增加RNA稳定性、翻译通读(终止密码子＝编码潜能)的假尿苷；可增加稳定性的m5C；和有助于亚细胞移位(例如核定位)的2,2,7-三甲基鸟苷。
在环状多核糖核苷酸的各个位置上可以存在不同的糖修饰、核苷酸修饰和/或核苷间键合(例如主链结构)。本领域普通技术人员将理解，核苷酸类似物或其他一个或多个修饰可以位于环状多核糖核苷酸的任何一个或多个位置，使得环状多核糖核苷酸的功能基本上不降低。修饰也可以是非编码区域修饰。环状多核糖核苷酸可包含约1％至约100％的经修饰核苷酸(相对于总核苷酸含量，或相对于一种或多种类型的核苷酸，即A、G、U或C中的任何一种或多种)或任何中间百分比(例如，1％至20％>、1％至25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至80％、1％至90％、1％至95％、10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％到80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、20％至25％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％、20％至95％、20％至100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％、50％至95％、50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、90％至100％和95％至100％)。
在一些实施例中，本文提供的环状多核糖核苷酸是经修饰的环状多核糖核苷酸。例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸包含全部或基本上全部的经修饰的腺苷残基、全部或基本上全部的经修饰的尿苷残基、全部或基本上全部的经修饰的鸟嘌呤残基、全部或基本上全部的经修饰的胞苷残基、或其任何组合。在一些实施例中，本文提供的环状多核糖核苷酸是杂交修饰的环状多核糖核苷酸。杂交修饰的环状多核糖核苷酸可以具有至少一个经修饰的核苷酸，并且可以具有一部分连续的未修饰的核苷酸。杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该未修饰的部分可具有至少约5、10、15或20个连续的未修饰的核苷酸，或其之间的任何数目。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸的未修饰部分具有至少约30、40、40、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、180、200、220、250、280、300、320、350、380、400、420、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900或1000个连续的未修饰核苷酸，或其之间的任何数目。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个未修饰的部分。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、30、40、50、70、80、100、120、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个经修饰核苷酸。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有至少1％、2％、5％、7％、8％、10％、12％、15％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％、95％或99％但少于100％的核苷酸被修饰。在一些实施例中，未修饰的部分包含结合位点。在一些实施例中，未修饰的部分包含被配置为结合蛋白、DNA、RNA或细胞靶的结合位点。在一些实施例中，未修饰的部分包含IRES。
在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸的免疫原性低于相应的未修饰的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸的免疫原性比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸低至少约1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0倍。在一些实施例中，本文所述的免疫原性通过RIG-I、TLR-3、TLR-7、TLR-8、MDA-5、LGP-2、OAS、OASL、PKR和IFN-β中的至少一种的表达水平或信号传导或激活来评估。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸的半衰期高于相应的未修饰的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸的半衰期比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸高至少约1.1，1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0倍。在一些实施例中，通过以下来测量半衰期：将环状多核糖核苷酸或相应的环状多核糖核苷酸引入细胞并且测量细胞内引入的环状多核糖核苷酸或相应的环状多核糖核苷酸的水平。
在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列具有与相应的未修饰的环状多核糖核苷酸相似或更高的翻译效率。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸高至少约0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8或3倍的翻译效率。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列具有比相应的环状多核糖核苷酸(其具有一部分包含经修饰的核苷酸(例如，与杂交修饰的环状多核糖核苷酸的未修饰部分对应的部分))更高的翻译效率。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列被配置为具有比相应环状多核糖核苷酸(其具有包含超过10％或至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的经修饰的核苷酸的第一部分)更高的翻译效率。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列具有比相应环状多核糖核苷酸(其具有包含经修饰的核苷酸的部分(例如，与杂交修饰的环状多核糖核苷酸的未修饰部分对应的部分))高至少约1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0倍的翻译效率。如本文所述，在一些实施例中，翻译效率是在包含环状多核糖核苷酸或相应的环状多核糖核苷酸的细胞中或在体外翻译系统(例如，兔网状细胞裂解物中)中测量的。
在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有未修饰(例如，不具有经修饰的核苷酸)的结合位点。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有结合位点，所述结合位点被配置为结合未修饰(例如，不具有经修饰的核苷酸)的蛋白、DNA、RNA或细胞靶。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有未修饰(例如，不具有经修饰的核苷酸)的内部核糖体进入位点(IRES)。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸在结合位点中具有不超过10％的核苷酸是经修饰的核苷酸。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸在结合位点中具有不超过10％的核苷酸是经修饰的核苷酸，所述结合位点被配置为结合蛋白、DNA、RNA或细胞靶。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸在内部核糖体进入位点(IRES)中具有不超过10％的核苷酸是经修饰的核苷酸。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸除了结合位点之外，遍及具有经修饰的核苷酸。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸除被配置为结合蛋白、DNA、RNA或细胞靶的结合位点外，遍及具有经修饰的核苷酸。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸除了IRES元件之外，遍及具有经修饰的核苷酸。在其他实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸除了IRES元件和一个或多个其他部分之外，遍及具有经修饰的核苷酸。不希望受某一理论的束缚，未修饰的IRES元件使杂交修饰的环状多核糖核苷酸有翻译能力，例如，对于一个或多个翻译序列而言具有与没有任何经修饰的核苷酸的相应的环状多核糖核苷酸相比类似的或更高的翻译效率。
在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸遍及环状多核糖核苷酸具有经修饰的核苷酸，例如5’甲基胞苷和假尿苷，但IRES元件或配置为结合蛋白、DNA、RNA或细胞靶的结合位点除外。在这些情况下，与不包含5’甲基胞嘧啶和假尿苷的相应的环状多核糖核苷酸相比，杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有更高的较低的免疫原性。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸的免疫原性比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸低至少约1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0倍。在一些实施例中，本文所述的免疫原性通过RIG-I、TLR-3、TLR-7、TLR-8、MDA-5、LGP-2、OAS、OASL、PKR和IFN-β中的至少一种的表达或信号传导或激活来评估。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸(例如不包含5’甲基胞苷和假尿苷的相应的环状多核糖核苷酸)高n的半衰期。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸高至少约1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0倍的更高的半衰期。在一些实施例中，通过以下来测量半衰期：将环状多核糖核苷酸或相应的环状多核糖核苷酸引入细胞并且测量细胞内引入的环状多核糖核苷酸或相应的环状多核糖核苷酸的水平。
在某些情况下，与相应的在其他方面相同但已被完全修饰的环状多核糖核苷酸相比，本文所述的杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有相似的免疫原性。例如，与相应的环状多核糖核苷酸(其在其他方面相同但遍及具有5’甲基胞苷和假尿苷并且不具有未修饰的胞苷和尿苷)相比，杂交修饰的环状多核糖核苷酸(其遍及具有5’甲基胞苷和假尿苷但其IRES元件除外)可以具有类似的免疫原性或更低的免疫原性。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸(其遍及具有5’甲基胞苷和假尿苷但其IRES元件除外)具有与相应的环状多核糖核苷酸(其在其他方面相同但遍及具有5’甲基胞苷和假尿苷并且不具有未修饰的胞苷和尿苷)的翻译效率相比类似的或更高的翻译效率。
环状多核糖核苷酸的缀合
本公开的circRNA可与例如化合物(例如小分子)、抗体或其片段、肽、蛋白、适体、药物或其组合缀合。在一些实施例中，小分子可以与circRNA缀合，从而产生包含小分子的circRNA。
本公开的circRNA可以包含缀合部分以促进缀合。可以在例如环状多核苷酸的内部位点或在线性多核苷酸的5′端、3′端或内部位点掺入缀合部分。可以化学或酶促地掺入结合部分。例如，可以在固相寡核苷酸合成过程中，共转录地(例如，用耐受性RNA聚合酶)或转录后地(例如，用RNA甲基转移酶)掺入缀合部分。缀合部分可以是经修饰的核苷酸或核苷酸类似物，例如溴脱氧尿苷。缀合部分可包含反应性基团或官能团，例如叠氮化物基团或炔基团。缀合部分可以能够进行化学选择性反应。缀合部分可以是半抗原基团，例如包含地高辛、2,4-二硝基苯基、生物素、亲和素，或选自唑、硝基芳基化合物、苯并呋喃、三萜、脲，硫脲、鱼藤酮，噁唑、噻唑，香豆素、环木脂体、杂联芳基化合物、偶氮芳基化合物或苯并二氮环庚三烯。缀合部分可以包含能够经历可逆的电环重排的二芳基乙烯光开关。缀合部分可包含亲核试剂、碳负离子和/或α,β-不饱和羰基化合物。
circRNA可以通过化学反应进行缀合，例如使用点击化学、施陶丁格(Staudinger)连接、Pd-催化的C-C键形成(例如铃木-宫浦(Suzuki-Miyaura)反应)、迈克尔加成、烯烃复分解或反电子需求狄尔斯－阿尔德反应(Diels-Alder)。点击化学可利用成对的官能团，它们在适当的反应条件下彼此快速且选择性地反应(“点击”)。非限制性点击化学反应包括叠氮化物-炔烃环加成反应、铜催化的1,3-偶极叠氮化物-炔烃环加成反应(CuAAC)、应变促进的叠氮化物-炔烃点击化学反应(SPAAC)和四嗪-烯烃连接反应。
官能化的核苷酸的非限制性实例包括叠氮化物修饰的UTP类似物、5-叠氮基甲基-UTP、5-叠氮基-C3-UTP、5-叠氮基-PEG4-UTP、5-乙炔基-UTP、DBCO-PEG4-UTP、乙烯基-UTP、8-叠氮基-ATP、3'-叠氮基-2',3'-ddATP、5-叠氮基-PEG4-CTP、5-DBCO-PEG4-CTP、N6-叠氮基己基-3'-dATP、5-DBCO-PEG4-dCpG和5-叠氮基丙基-UTP。在一些实施例中，circRNA包含至少一个5-叠氮基甲基-UTP、5-叠氮基-C3-UTP、5-叠氮基-PEG4-UTP、5-乙炔基-UTP，DBCO-PEG4-UTP、乙烯基-UTP、8-叠氮基-ATP、5-叠氮基-PEG4-CTP、5-DBCO-PEG4-CTP或5-叠氮基丙基-UTP。
可以在优化条件下(例如，通过固相化学合成)位点特异性掺入所选的单个经修饰的核苷酸(例如，经修饰的A、C、G、U或T，其在2′-位含叠氮化物)。可以例如通过在体外转录反应期间取代核苷酸(例如用UTP代替5-叠氮基-C3-UTP)来掺入在2′-位含叠氮化物的多个核苷酸。
circRNA缀合物可以使用铜催化的点击反应生成，例如炔烃官能化的小分子和叠氮化物官能化的多核糖核酸的铜催化的1,3-偶极叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)。线性RNA可以与小分子缀合。例如，线性RNA可以在其3′-端通过聚(A)聚合酶用叠氮基衍生的核苷酸修饰。叠氮化物可以通过铜催化或应变促进的叠氮化物-炔烃点击反应与小分子缀合，并且线性RNA可以被环化。
可以使用施陶丁格反应生成circRNA缀合物。例如，可以在三苯基膦-3,3',3"-三磺酸(TPPTS)存在下，将包含叠氮化物官能化的核苷酸的环状RNA与炔烃官能化的小分子缀合。
可以使用铃木-宫浦反应生成circRNA缀合物。例如，可以在同源反应性伴侣的存在下使包含卤代核苷酸类似物的circRNA经受铃木-宫浦反应。包含5-碘尿苷三磷酸酯(IUTP)的circRNA例如可与Pd(OAc)2和2-氨基嘧啶-4,6-二醇(ADHP)或二甲基氨基取代的ADHP(DMADHP)一起用于催化系统中以在各种硼酸和酯底物的存在下官能化碘尿苷标记的circRNA。在另一个实例中，可以在由Pd(OAc)2和水溶性三苯基磷烷-3,3′,3″-三磺酸酯配体制成的催化系统的存在下使包含8-溴鸟苷的circRNA与芳基硼酸反应。
circRNA缀合物可使用迈克尔加成法生成，例如，通过富电子的迈克尔供体与α,β-不饱和化合物(迈克尔受体)的反应来生成。
结构
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含高阶结构，例如二级或三级结构。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的互补区段将其自身折叠成双链区段，与氢键结合配对(例如，A-U和C-G)。在一些实施例中，螺旋，也称为茎，在分子内形成，具有连接至端环的双链区段。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有至少一个具有准双链二级结构的区段。在一些实施例中，具有准双链二级结构的区段具有至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个配对的核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有一个或多个具有准双链二级结构的区段(例如2、3、4、5、6或更多个)。在一些实施例中，区段被3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸隔开。
有16种可能的碱基对，但是其中的6种(AU、GU、GC、UA、UG、CG)可以形成实际的碱基对。其余的称为不匹配，以极低的频率出现在螺旋中。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的结构不容易被破坏，不影响其功能且无致命后果，这提供了保持二级结构的选择。在一些实施例中，茎的一级结构(即其核苷酸序列)仍可变化，同时仍保持螺旋区。碱基的性质是高阶结构的第二位，且只要它们保留二级结构，就可以进行取代。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有准螺旋结构。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有至少一个具有准螺旋结构的区段。在一些实施例中，具有准螺旋结构的区段具有至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有一个或多个具有准螺旋结构的区段(例如2、3、4、5、6或更多个)。在一些实施例中，区段被3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸隔开。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括富U或富A序列或其组合中的至少一个。在一些实施例中，富U和/或富A序列以将产生三联准螺旋结构的方式排列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有双准螺旋结构。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有一个或多个具有双准螺旋结构的区段(例如2、3、4、5、6或更多个)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括富C和/或富G的序列中的至少一个。在一些实施例中，富C和/或富G序列以将产生三联准螺旋结构的方式排列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有有助于稳定的分子内三联准螺旋结构。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有两个准螺旋结构(例如，通过磷酸二酯键隔开)，使得它们末端的碱基对堆叠，并且准螺旋结构变为共线性，导致“同轴堆叠”的子结构。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有至少一个miRNA结合位点、至少一个lncRNA结合位点和/或至少一个tRNA基序。
递送
本文所述的环状多核糖核苷酸可与递送载剂一起包含在药物组合物中。
本文所述的药物组合物可配制为例如包括药物赋形剂或载剂。药物载剂可以是膜，脂质双层和/或聚合物载剂，例如脂质体或颗粒，例如纳米颗粒，例如脂质纳米颗粒，并通过已知方法递送至需要其的受试者(例如人或非人农业动物或家畜，例如牛、狗、猫、马、家禽)。此类方法包括但不限于转染(例如脂质介导的阳离子聚合物，磷酸钙)；电穿孔或其他破坏膜的方法(例如核转染)、融合和病毒递送(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、AAV)。
本发明进一步涉及包含本文所述的环状多核糖核苷酸的宿主或宿主细胞。在一些实施例中，宿主或宿主细胞是植物、昆虫、细菌、真菌、脊椎动物、哺乳动物(例如人)或其他生物体或细胞。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在宿主中是非免疫原性的。在一些实施例中，与由参考化合物(例如对应于所述环状多核糖核苷酸的线性多核苷酸、未修饰的环状多核糖核苷酸或缺少加密原的环状多核糖核苷酸)引发的应答相比，环状多核糖核苷酸降低或不能产生宿主免疫系统应答。一些免疫应答包括但不限于体液免疫应答(例如，抗原特异性抗体的产生)和细胞介导的免疫应答(例如，淋巴细胞增殖)。
在一些实施例中，使宿主或宿主细胞接触(例如，递送至或施用至)环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，宿主是哺乳动物，例如人。可以在施用后的任何时间测量宿主中环状多核糖核苷酸、表达产物或两者的量。在某些实施例中，测定培养物中宿主生长的时程。如果在环状多核糖核苷酸的存在下生长增加或减少，则环状多核糖核苷酸或表达产物或两者都被认为在增加或减少宿主的生长方面是有效的。
产生方法
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含非天然存在的脱氧核糖核酸序列，并且可以使用重组DNA技术或化学合成产生。
在本发明的范围内，用于产生RNA环的DNA分子可包括天然存在的原始核酸序列的DNA序列、其修饰形式或编码通常未在自然中发现的合成多肽的DNA序列(例如，嵌合分子或融合蛋白)。DNA分子可以使用多种技术修饰，包括但不限于经典诱变技术和重组DNA技术，如定点诱变、化学处理核酸分子以诱导突变、限制性酶切割核酸片段、连接核酸片段、聚合酶链式反应(PCR)扩增和/或诱变核酸序列的选定区域、合成寡核苷酸混合物以及连接混合物基团以“建造”核酸分子混合物、及其组合。
环状多核糖核苷酸可以例如通过化学合成和酶促合成制备。在一些实施例中，线性初级构建体或线性mRNA可被环化或连环化以产生本文所述的环状多核糖核苷酸。环化或连环化的机制可以通过诸如但不限于化学、酶促、或核酶催化的方法来发生。新形成的5’-或3’-键可以是分子内键或分子间键。
药物组合物
本发明包括与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的组合物。药物组合物可任选地包含一种或多种另外的活性物质，例如治疗和/或预防活性物质。本发明的药物组合物可以是无菌的和/或无热原的。可以在以下中找到药学制剂的配制和/或生产中的一般考虑：例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy 21st ed.[雷明顿：药学科学与实践第21版],Lippincott Williams&Wilkins,2005(其通过引用并入本文)。在一方面，本发明包括产生本文所述的药物组合物的方法，所述方法包括产生环状多核糖核苷酸。
尽管本文提供的药物组合物的描述主要针对适合于施用给人的药物组合物，但是本领域技术人员应理解，此类组合物通常适合于施用给任何其他动物，例如施用给非人动物和非人哺乳动物。为了使组合物适合于施用给各种动物而对适合于施用给人类的药物组合物的修饰是众所周知的，并且普通兽医药理师可以仅通过普通的实验(如果有的话)来设计和/或进行这种修饰。预期施用药物组合物的受试者包括但不限于人和/或其他灵长类；哺乳动物，包括与商业有关的哺乳动物，例如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠；和/或鸟类，包括与商业相关的鸟类，例如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。
本文描述的药物组合物的配制品可以通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法来制备。通常，这样的制备方法包括以下步骤：使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分结合，然后，如果必要和/或期望的话，将产品分开、成形和/或包装。
本文所述的药物组合物可以采用适合单次施用精确剂量的单位剂型。在单位剂型中，将配制品分成含有适当量的一种或多种化合物的单位剂量。单位剂量可以是包含离散量的配制品的包装形式。非限制性实例是包装的注射剂、小瓶或安瓿。水性悬浮液组合物可以包装在单剂量的不可重新封闭的容器中。可以将多剂量的可重新封闭的容器例如与防腐剂一起使用或不与防腐剂一起使用。注射用配制品能以单位剂型存在，例如在安瓿中或在具有防腐剂的多剂量容器中。
在一方面，本发明包括药物组合物，所述药物组合物包含(a)环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含结合靶的结合位点，所述靶例如是RNA、DNA、蛋白、细胞的膜等；和(b)药学上可接受的载剂或赋形剂；其中所述靶和所述环状多核糖核苷酸形成复合物，其中所述靶不是微小RNA。
在一些实施例中，结合位点是第一结合位点，并且靶是第一靶。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸进一步包含与第二靶结合的第二结合位点。
在一方面，本发明包括一种药物组合物，所述药物组合物包含：(a)环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含：(i)结合第一靶的第一结合位点；和(ii)结合第二靶的第二结合位点；以及(b)药学上可接受的载剂或赋形剂；其中所述第一结合位点不同于所述第二结合位点，其中所述第一靶和所述第二靶是微小RNA。
在一些实施例中，第一靶包含第一环状多核糖核苷酸(circ-RNA)结合基序。在一些实施例中，第二靶包含第二环状多核糖核苷酸(circRNA)结合基序。在一些实施例中，第一靶、第二靶和环状多核糖核苷酸形成复合物。在一些实施例中，第一靶和第二靶彼此相互作用。在一些实施例中，当与细胞接触时，复合物调节细胞过程。在一些实施例中，当与细胞接触时，复合物的形成调节细胞过程。在这样的实施例中，细胞过程与疾病或病症的发病机理有关。
在一些实施例中，当与细胞接触时，环状多核糖核苷酸调节与第一或第二靶相关的细胞过程。在一些实施例中，第一靶和第二靶在复合物中彼此相互作用。在一些实施例中，细胞过程与疾病或病症的发病机理有关。在一些实施例中，细胞过程不同于环状多核糖核苷酸的翻译。在一些实施例中，第一靶包含脱氧核糖核酸(DNA)分子，并且所述靶包含蛋白。在一些实施例中，复合物调节DNA分子的定向转录，DNA分子的表观遗传重塑或DNA分子的降解。
在一些实施例中，第一靶包含第一蛋白，并且第二靶包含第二蛋白。在这样的实施例中，复合物调节第一蛋白的降解、第一蛋白的易位、或信号转导，或调节由第一蛋白和第二蛋白之间的直接相互作用形成的复合物的形成(例如，抑制或促进复合物的形成)。
在一些实施例中，第一靶包含第一核糖核酸(RNA)分子，并且第二靶包含第二RNA分子。在这样的实施例中，复合物可以调节第一RNA分子的降解。
在一些实施例中，靶包含蛋白，并且第二靶包含RNA分子。在这样的实施例中，复合物调节蛋白的易位或抑制由蛋白和RNA分子之间的直接相互作用形成的复合物的形成。
在一些实施例中，第一靶是受体，并且第二靶是受体的底物。在这样的实施例中，复合物抑制受体的激活。如本文所用，“受体”可以指接收来自细胞外部的化学信号的蛋白分子。化学信号可以包括但不限于小分子有机化合物(例如氨基酸及其衍生物，例如谷氨酸、甘氨酸、γ-丁酸)、脂质、蛋白或多肽、DNA和RNA分子以及离子。受体可以存在于细胞膜上、细胞质中或细胞核中。结合受体的化学信号通常可以称为受体的“底物”。与化学信号结合后，受体可通过启动一个或多个细胞过程，例如信号传导途径，引起某种形式的细胞应答。本文提供的受体可以是本领域技术人员会认识到的任何类型，包括：(1)离子受体，其可以作为快速神经递质(例如乙酰胆碱(烟碱)和GABA)的靶；并且这些受体的激活导致离子跨膜移动发生变化。它们可以具有异聚体结构，其中每个亚基由细胞外配体结合结构域和跨膜结构域组成，其中跨膜结构域又包括四个跨膜α螺旋。配体结合腔可位于亚基之间的界面处；(2)G蛋白偶联受体，其可以包括针对几种激素和慢速递质(例如多巴胺，亲代谢性谷氨酸盐)的受体。它们可以由七个跨膜α螺旋构成。连接α螺旋的环可以形成细胞外和细胞内结构域；(3)激酶连接的且相关的受体(或受体酪氨酸激酶)，其可以由包含配体结合位点的细胞外结构域和通常具有酶功能的细胞内结构域通过单个跨膜α螺旋连接构成。胰岛素受体是这类受体的一个实例，其中胰岛素可以作为其相应的底物；(4)https://en.wikipedia.org/wiki/Nuclear_receptor核受体，其可以位于细胞核或细胞质中，并在与配体结合后迁移至细胞核。它们可以由C末端配体结合区，核心DNA结合结构域(DBD)和包含AF1(激活功能1)区的N末端结构域构成。类固醇和甲状腺激素受体是这类受体的实例，并且它们相应的底物可以包括各种类固醇和激素。
在一方面，本发明包括药物组合物，所述药物组合物包含(a)环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含结合靶的结合位点；和(b)药学上可接受的载剂或赋形剂；其中所述环状多核糖核苷酸是不能翻译或翻译有缺陷的，其中所述靶不是微小RNA。
在一方面，本发明包括药物组合物，所述药物组合物包含(a)环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含结合靶的结合位点，其中所述靶包含第一核糖核酸(RNA)结合基序；和(b)药学上可接受的载剂或赋形剂；其中所述环状多核糖核苷酸是不能翻译或翻译有缺陷的，其中所述靶是微小RNA。
在这样的实施例中，靶包含DNA分子。在这样的实施例中，靶与环状多核糖核苷酸的结合调节DNA分子的转录干扰。在这样的实施例中，靶包含蛋白。在这样的实施例中，靶与环状多核糖核苷酸的结合抑制蛋白与其他分子的相互作用。在这样的实施例中，蛋白是受体，并且靶与环状多核糖核苷酸的结合激活受体。在这样的实施例中，蛋白是第一酶，环状多核糖核苷酸进一步包含与第二酶结合的第二结合位点，并且第一和第二酶与环状多核糖核苷酸的结合调节第一和第二酶的酶促活性。在这样的实施例中，靶包括信使RNA(mRNA)分子。在这样的实施例中，靶与环状多核糖核苷酸的结合调节mRNA分子的翻译的干扰。在这样的实施例中，靶包含核糖体。在这样的实施例中，靶与环状多核糖核苷酸的结合调节翻译过程的干扰。在这样的实施例中，靶包含环状RNA分子。在这样的实施例中，靶与环状多核糖核苷酸的结合螯合环状RNA分子。在这样的实施例中，靶与环状多核糖核苷酸的结合螯合靶。
在一方面，本发明包括药物组合物，所述药物组合物包含(a)环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含结合靶细胞的细胞膜的结合位点；并且其中靶细胞的细胞膜包含第一核糖核酸(RNA)结合基序；和(b)药学上可接受的载剂或赋形剂。
在一些实施例中，环状多核糖核酸进一步包含与第二靶细胞的第二膜结合的第二结合位点，其中所述第二靶细胞的所述第二细胞膜包含第二RNA结合基序。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸与靶细胞上的细胞膜和第二靶细胞的第二细胞膜两者结合，并且第一靶细胞和第二靶细胞的细胞融合被调节。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸进一步包含与第二靶结合的第二结合位点，并且第一和靶两者与环状多核糖核苷酸的结合诱导了第一靶的构象变化，从而诱导了第一细胞中第一靶下游的信号转导。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸是不能翻译的或翻译有缺陷的。
在一些实施例中，环状多核糖核酸进一步包含选自以下的至少一种结构元件：a)加密原；b)剪接元件；c)调控性序列；d)复制序列；e)准双链二级结构；和f)表达序列。在这样的实施例中，准螺旋结构包含至少一个双链RNA区段和至少一个非双链区段。在这样的实施例中，准螺旋结构包括与重复序列例如富A序列连接的第一序列和第二序列。在一些实施例中，所述加密原包含剪接元件。
在一些实施例中，环状多核糖核酸包含至少一种经修饰的核酸。在这样的实施例中，至少一种经修饰的核酸选自由以下组成的组：2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1’,5’-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸和2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺。环状多核糖核苷酸可以是完全修饰的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，所施用的环状多核糖核苷酸是杂交修饰的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含经修饰的核苷酸和未修饰的IRES。
在一些实施例中，加密原包含至少一个经修饰的核酸，例如假尿苷和N(6)甲基腺苷(m6A)。在一些实施例中，加密原包含蛋白结合位点，例如核糖核酸结合蛋白。在一些实施例中，加密原包含免疫蛋白结合位点，例如，以逃避CTL应答。
在一些实施例中，环状多核糖核酸的免疫原性比缺少加密原的对应物低至少2倍，如通过RIG-I、TLR-3、TLR-7、TLR-8、MDA-5、LGP-2、OAS、OASL、PKR和IFN-β中的至少一个的表达或信号传导或激活所评估。在一些实施例中，环状多核糖核酸的大小在约20个碱基至约20kb的范围内。在一些实施例中，环状多核糖核酸通过线性多核苷酸的环化来合成。在一些实施例中，环状多核糖核酸基本上抗降解。
应用
本文所述的环状多核糖核苷酸可施用于需要其的细胞、组织或受试者，例如以调节细胞功能或细胞过程，例如细胞、组织或受试者中的基因表达。本发明还考虑了调节细胞功能或细胞过程例如基因表达的方法，所述方法包括向需要其的细胞、组织或受试者施用本文所述的环状多核糖核苷酸。施用的环状多核糖核苷酸可以是经修饰的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，施用的环状多核糖核苷酸是完全修饰的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，施用的环状多核糖核苷酸是杂交修饰的环状多核糖核苷酸。在其他实施例中，施用的环状多核糖核苷酸是未修饰的环状多核糖核苷酸。
实施例段落
[1]一种药物组合物，所述药物组合物包含：
(a)环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含结合靶的结合位点，所述靶例如是RNA、DNA、蛋白、细胞的膜等；以及
(b)药学上可接受的载剂或赋形剂；
其中所述靶和所述环状多核糖核苷酸形成复合物，并且
其中所述靶不是微小RNA。
[2]一种药物组合物，所述药物组合物包含：
(a)环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含：
(i)结合第一靶的第一结合位点，和
(ii)结合第二靶的第二结合位点；以及
(b)药学上可接受的载剂或赋形剂；
其中所述第一结合位点不同于所述第二结合位点，并且
其中所述第一靶和所述第二靶均是微小RNA。
[3]如段落[1]所述的药物组合物，其中所述结合位点包含适体序列。
[4]如段落[2]所述的药物组合物，其中所述第一结合位点包含第一适体序列，并且所述第二结合位点包含第二适体序列。
[5]如权利要求[3]所述的药物组合物，其中所述适体序列具有结合所述靶的二级结构。
[6]如权利要求[4]所述的药物组合物，其中所述第一适体序列具有结合所述第一靶的二级结构，并且所述第二适体序列具有结合所述第二靶的二级结构。
[7]如权利要求[1]所述的药物组合物，其中所述结合位点是第一结合位点，并且所述靶是第一靶。
[8]如段落[3]、[5]、和[7]中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸进一步包含与第二靶结合的第二结合位点。
[9]如段落[2]、[4]、[6]、[7]和[8]中任一项所述的药物组合物，其中所述第一靶包含第一环状多核糖核苷酸(circRNA)结合基序。
[10]如段落[2]、[4]、[6]和[7]-[9]中任一项所述的药物组合物，其中所述第二靶包含第二环状多核糖核苷酸(circRNA)结合基序。
[11]如段落[2]、[4]、[6]和[7]-[10]中任一项所述的药物组合物，其中所述第一靶、所述第二靶和所述环状多核糖核苷酸形成复合物。
[12]如段落[2]、[4]、[6]和[7]-[11]中任一项所述的药物组合物，其中所述第一和第二靶彼此相互作用。
[13]如段落[1]、[3]、[5]和[7]-[12]中任一项所述的药物组合物，其中所述复合物调节细胞过程。
[14]如段落[2]、[4]、[6]和[7]-[13]中任一项所述的药物组合物，其中所述第一靶和第二靶是相同的，并且所述第一结合位点和所述第二结合位点结合所述第一靶和所述第二靶上的不同结合位点。
[15]如段落[2]、[4]、[6]和[7]-[13]中任一项所述的药物组合物，其中所述第一靶和所述第二靶是不同的。
[16]如段落[2]、[4]、[6]和[7]-[15]中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸进一步包含结合第三或更多靶的一个或多个另外结合位点。
[17]如段落[2]、[4]、[6]和[7]-[16]中任一项所述的药物组合物，其中所述一个或多个靶是相同的，并且一个或多个另外结合位点结合所述一个或多个靶上的不同结合位点。
[18]如段落[1]、[3]、[5]和[7]-[17]中任一项所述的药物组合物，其中所述复合物的形成调节细胞过程。
[19]如段落[2]、[4]、[6]和[7]-[18]中任一项所述的药物组合物，其中当与所述第一靶或第二靶接触时，所述环状多核糖核苷酸调节与所述第一靶或第二靶相关的细胞过程。
[20]如段落[2]、[4]、[6]和[7]-[19]中任一项所述的药物组合物，其中所述第一靶和第二靶在所述复合物中彼此相互作用。
[21]如段落[13]-[20]中任一项所述的药物组合物，其中所述细胞过程与疾病或病症的发病机理有关。
[22]如段落[13]-[21]中任一项所述的药物组合物，其中所述细胞过程不同于所述环状多核糖核酸的翻译。
[23]如段落[2]、[4]、[6]和[7]-[22]中任一项所述的药物组合物，其中所述第一靶包含脱氧核糖核酸(DNA)分子，并且所述第二靶包含蛋白。
[24]如段落[1]、[3]、[5]和[7]-[23]中任一项所述的药物组合物，其中所述复合物调节所述DNA分子的定向转录、所述DNA分子的表观遗传重塑或所述DNA分子的降解。
[25]如段落[2]、[4]、[6]和[7]-[24]中任一项所述的药物组合物，其中所述第一靶包含第一蛋白，并且所述第二靶包含第二蛋白。
[26]如段落[1]、[3]、[5]和[7]-[25]中任一项所述的药物组合物，其中所述复合物调节所述第一蛋白的降解、所述第一蛋白的易位、或信号转导，或调节天然蛋白功能，抑制或调节由第一蛋白和第二蛋白之间的直接相互作用形成的复合物的形成。
[27]如段落[2]、[4]、[6]和[7]-[26]中任一项所述的药物组合物，其中所述第一靶或所述第二靶是泛素连接酶。
[28]如段落[2]、[4]、[6]和[7]-[27]中任一项所述的药物组合物，其中所述第一靶包含第一核糖核酸(RNA)分子，并且所述第二靶包含第二RNA分子。
[29]如段落[28]所述的药物组合物，其中所述复合物调节所述第一RNA分子的降解。
[30]如段落[2]、[4]、[6]和[7]-[29]中任一项所述的药物组合物，其中所述第一靶包含蛋白，并且所述第二靶包含RNA分子。
[31]如段落[1]、[3]、[5]和[7]-[30]中任一项所述的药物组合物，其中所述复合物调节所述蛋白的易位或抑制由所述蛋白和所述RNA分子之间的直接相互作用形成的复合物的形成。
[32]如段落[2]、[4]、[6]和[7]-[31]中任一项所述的药物组合物，其中所述第一靶是受体，并且所述第二靶是所述受体的底物。
[33]如段落[1]、[3]、[5]和[7]-[32]中任一项所述的药物组合物，其中所述复合物抑制所述受体的激活。
[34]一种药物组合物，所述药物组合物包含：
(a)环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含结合靶的结合位点；以及
(b)药学上可接受的载剂或赋形剂；
其中所述环状多核糖核苷酸是不能翻译或翻译有缺陷的，并且其中所述靶不是微小RNA。
[35]一种药物组合物，所述药物组合物包含：
(a)环状多核糖核酸，所述环状多核糖核酸包含结合靶的结合位点，其中所述靶包含核糖核酸(RNA)结合基序；以及
(b)药学上可接受的载剂或赋形剂；
其中所述环状多核糖核苷酸是不能翻译或翻译有缺陷的，并且其中所述靶是微小RNA。
[36]如段落[34]和[35]中任一项所述的药物组合物，其中所述结合位点包含具有结合所述靶的二级结构的适体序列。
[37]如段落[34]和[36]中任一项所述的药物组合物，其中所述靶包含DNA分子。
[38]如段落[34]-[37]中任一项所述的药物组合物，其中所述靶与所述环状多核糖核苷酸的结合调节DNA分子的转录干扰。
[39]如段落[34]和[36]-[38]中任一项所述的药物组合物，其中所述靶包含蛋白。
[40]如段落[39]所述的药物组合物，其中所述靶与所述环状多核糖核苷酸的结合调节所述蛋白与其他分子的相互作用。
[41]如段落[39]-[40]中任一项所述的药物组合物，其中所述蛋白是受体，并且其中所述靶与所述环状多核糖核苷酸的结合激活所述受体。
[42]如段落[39]-[41]中任一项所述的药物组合物，其中所述蛋白是第一酶，其中所述环状多核糖核苷酸进一步包含与第二酶结合的第二结合位点，并且其中所述第一和第二酶与所述环状多核糖核苷酸的结合调节所述第一和第二酶的酶促活性。
[43]如段落[39]和[40]中任一项所述的药物组合物，其中所述蛋白是泛素连接酶。
[44]如段落[34]、[36]、和[38]中任一项所述的药物组合物，其中所述靶包含信使RNA(mRNA)分子。
[45]如段落[44]所述的药物组合物，其中所述靶与所述环状多核糖核苷酸的结合调节所述mRNA分子的翻译的干扰。
[46]如段落[34]、[36]、[39]和[40]中任一项所述的药物组合物，其中所述靶包含核糖体。
[47]如段落[34]-[46]中任一项所述的药物组合物，其中所述靶与所述环状多核糖核苷酸的结合调节翻译过程的干扰。
[48]如段落[34]、[36]、和[38]中任一项所述的药物组合物，其中所述靶包含环状RNA分子。
[49]如段落[48]所述的药物组合物，其中所述靶与所述环状多核糖核苷酸的结合螯合所述环状RNA分子。
[50]如段落[35]、[36]、[38]和[47]中任一项所述的药物组合物，其中所述靶与所述环状多核糖核苷酸的结合螯合所述微小RNA分子。
[51]一种药物组合物，所述药物组合物包含：
(a)环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含与细胞的膜(例如，细胞壁膜，细胞器膜等)结合的结合位点，其中所述细胞的所述膜包含核糖核酸(RNA)结合基序；以及
(b)药学上可接受的载剂或赋形剂。
[52]如段落[51]所述的药物组合物，其中所述结合位点包含具有结合所述细胞的所述膜(例如，细胞壁膜，细胞器膜等)的二级结构的适体序列。
[53]如段落[51]和[52]中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸进一步包含与第二靶结合的第二结合位点，其中所述第二靶包含第二RNA结合基序。
[54]如段落[53]所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸与所述细胞的所述膜和所述第二靶结合。
[55]如段落[51]-[54]中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸进一步包含与第二细胞靶结合的第二结合位点，并且其中所述细胞靶和所述第二细胞靶与所述环状多核糖核苷酸的结合诱导所述细胞靶中的构象变化，从而诱导所述细胞靶的下游的信号转导。
[56]如段落[1]-[55]中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸是不能翻译的或翻译有缺陷的。
[57]如段落[1]-[56]中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸进一步包含至少一种选自下组的结构元件，该组由以下组成：
a)加密原；
b)剪接元件；
c)调控性序列；
d)复制序列；
e)准双链二级结构
f)准螺旋结构；以及
g)表达序列。
[58]如段落[57]所述的药物组合物，其中所述准螺旋结构包含至少一个双链RNA区段和至少一个非双链区段。
[59]如段落[57]和[58]中任一项所述的药物组合物，其中所述准螺旋结构包含与重复序列连接的第一序列和第二序列。
[60]如段落[57]-[59]中任一项所述的药物组合物，其中所述加密原包含剪接元件。
[61]如段落[1]-[60]中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核酸包含至少一种经修饰的核酸。
[62]如段落[61]所述的药物组合物，其中至少一种经修饰的核酸选自由以下组成的组：2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1’,5’-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸和2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺。
[63]如段落[57]-[62]中任一项所述的药物组合物，其中所述加密原包含至少一种经修饰的核酸。
[64]如段落[57]-[63]中任一项所述的药物组合物，其中所述加密原包含蛋白结合位点。
[65]如段落[57]-[64]中任一项所述的药物组合物，其中所述加密原包含免疫蛋白结合位点。
[66]如段落[57]-[65]中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核酸的免疫原性比缺少所述加密原的对应物低至少2倍，如通过RIG-I、TLR-3、TLR-7、TLR-8、MDA-5、LGP-2、OAS、OASL、PKR和IFN-β中的至少一个的表达、信号传导或激活所评估。
[67]如段落[1]-[66]中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核酸的大小为约20个碱基至约20kb。
[68]如段落[1]-[67]中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核酸通过线性多核苷酸的环化来合成。
[69]如段落[1]-[68]中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核酸基本上抗降解。
[70]一种药物组合物，所述药物组合物包含：
(a)环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含结合靶的结合位点，其中所述靶包含核糖核酸(RNA)结合基序；以及
(b)药学上可接受的载剂或赋形剂，
其中所述环状多核糖核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸和含有至少约5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个连续的未修饰核苷酸的第一部分。
[71]一种药物组合物，所述药物组合物包含：
(a)环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含结合靶的结合位点，其中所述靶包含核糖核酸(RNA)结合基序；以及
(b)药学上可接受的载剂或赋形剂，
其中所述环状多核糖核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸和含有至少约5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个连续的核苷酸的第一部分，并且其中所述第一部分缺少假尿苷或5’-甲基胞苷。
[72]如段落[70]和[71]中任一项所述的药物组合物，其中所述结合位点包含具有结合所述靶的二级结构的适体序列。
[73]如段落[70]-[72]中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸的免疫原性低于相应的未修饰的环状多核糖核苷酸。
[74]如段落[70]-[72]中任一项所述的药物组合物，其中环状多核糖核酸具有比相应的未修饰的环状多核糖核酸低至少约1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0倍的免疫原性，如通过由RIG-I、TLR-3、TLR-7、TLR-8、MDA-5、LGP-2、OAS、OASL、PKR和IFN-β组成的组中的至少一个的表达或信号传导或激活所评估。
[75]如段落[70]-[74]中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸的半衰期高于相应的未修饰的环状多核糖核苷酸。
[76]如段落[70]-[74]中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸的半衰期比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸高至少约1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0倍。
[77]如段落[75]和[76]中任一项所述的药物组合物，其中通过以下来测量半衰期：将环状多核糖核苷酸或相应的未修饰的环状多核糖核苷酸引入细胞并且测量细胞内引入的环状多核糖核苷酸或相应的环状多核糖核苷酸的水平。
[78]如段落[70]-[77]中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种经修饰的核苷酸选自由以下组成的组：N(6)甲基腺苷(m6A)、5’-甲基胞苷和假尿苷。
[79]如段落70-[77]中任一项所述的药物组合物，其中至少一种经修饰的核酸选自由以下组成的组：2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1’,5’-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸和2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺。
[80]如段落[70]-[79]中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的核苷酸是经修饰的核苷酸。
[81]如段落[70]-[80]中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含由未修饰的核苷酸组成的结合位点，所述结合位点结合蛋白、DNA、RNA或细胞靶。
[82]如段落[70]-[81]中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含由未修饰的核苷酸组成的内部核糖体进入位点(IRES)。
[83]如段落[70]-[80]中任一项所述的药物组合物，其中所述结合位点由未修饰的核苷酸组成。
[84]如段落[83]所述的药物组合物，其中所述结合位点包含由未修饰的核苷酸组成的IRES。
[85]如段落[70]-[84]中任一项所述的药物组合物，其中所述第一部分包含结合蛋白、DNA、RNA或细胞靶的结合位点。
[86]如段落[70]-[85]中任一项所述的药物组合物，其中所述第一部分包含IRES。
[87]如段落[70]-[86]中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列。
[88]如段落[82]-[87]中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含所述一个或多个表达序列和所述IRES，并且其中所述环状多核糖核苷酸在IRES之外包含5’-甲基胞苷、假尿苷或其组合。
[89]如段落[70]-[88]中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列被配置为具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸更高的翻译效率。
[90]如段落[70]-[89]中任一项所述的药物组合物，其中环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸高至少约0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8或3倍的翻译效率。
[91]如段落[70]-[90]中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列的翻译效率比具有包含经修饰的核苷酸的第一部分的相应环状多核糖核苷酸更高。
[92]如段落[70]-[90]中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列的翻译效率比具有包含超过10％的经修饰的核苷酸的第一部分的相应环状多核糖核苷酸更高。
[93]如段落[70]-[92]中任一项所述的药物组合物，其中环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列具有比相应环状多核糖核苷酸(其具有包含经修饰的核苷酸的第一部分)高至少约1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、或10.0倍的翻译效率。
[94]如段落[89]-[93]中任一项所述的药物组合物，其中所述翻译效率是在包含所述环状多核糖核苷酸或所述相应的环状多核糖核苷酸的细胞中或在体外翻译系统(例如，兔网状细胞裂解物中)中测量的。
[95]如段落[70]-[94]中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸是权利要求0-[69]中任一项所述的环状多核糖核苷酸。
[96]一种治疗方法，所述治疗方法包括将如段落[1]-[95]中任一项所述的药物组合物施用给具有疾病或病症的受试者。
[97]一种制备药物组合物的方法，所述方法包括产生如段落[1]-[95]中任一项所述的环状多核糖核苷酸。
[98]如段落[1]-[95]中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其在载剂例如膜或脂质双层中配制。
[99]一种制造如段落[1]至[95]中任一项所述的环状多核糖核苷酸的方法，所述方法包括将具有核酸序列的线性多核糖核苷酸环化为环状多核糖核苷酸。
[100]一种工程化的细胞，所述工程化的细胞包含如权利要求[1]-[95]中任一项所述的组合物。
[101]一种在细胞中结合靶的方法，所述方法包括：
提供不能翻译的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含适体序列，其中所述适体序列具有结合所述靶的二级结构；并且
将所述不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至所述细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸与所述靶形成在递送后至少5天是可检测的复合物。
[102]一种在细胞中结合靶的方法，所述方法包括：
将不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至所述细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸包含结合所述靶的适体序列，并且其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸与所述靶形成在递送后至少5天是可检测的复合物。
[103]如段落[101]和[102]中任一项所述的方法，其中所述靶选自由以下组成的组：核酸分子、小分子、蛋白、碳水化合物和脂质。
[104]如段落[101]-[103]中任一项所述的方法，其中所述靶是基因调控蛋白。
[105]如段落104所述的方法，其中所述基因调控蛋白是转录因子。
[106]如段落[103]所述的方法，其中所述核酸分子是DNA分子或RNA分子。
[107]如段落[101]-[106]中任一项所述的方法，其中所述复合物调节基因表达。
[108]如段落[101]-[107]中任一项所述的方法，其中所述复合物调节DNA分子的定向转录、DNA分子的表观遗传重塑或DNA分子的降解。
[109]如段落[101]-[108]中任一项所述的方法，其中所述复合物调节所述靶的降解、所述靶的易位或靶信号转导。
[110]如段落[107]-[109]中任一项所述的方法，其中所述基因表达与疾病或病症的发病机理有关。
[111]如段落[101]-[110]中任一项所述的方法，其中所述复合物在递送后至少7、8、9或10天是可检测的。
[112]如段落[101]-[111]中任一项所述的方法，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸在递送后至少五天存在。
[113]如段落[101]-[112]中任一项所述的方法，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸在递送后至少6、7、8、9或10天存在
[114]如段落[101]-[113]中任一项所述的方法，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸是未修饰的不能翻译的环状多核糖核苷酸。
[115]如段落[101]-[114]中任一项所述的方法，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸具有准双链二级结构。
[116]如段落[101]-[115]中任一项所述的方法，其中所述适体序列进一步具有结合所述靶的三级结构。
[117]如段落[101]-[116]中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞。
[118]如任一段落[117]所述的方法，其中所述真核细胞是人细胞。
[119]一种在细胞中结合转录因子的方法，所述方法包括：
提供不能翻译的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含结合所述转录因子的适体序列；并且
将所述不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至所述细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸与所述转录因子形成复合物并调节基因表达。
[120]一种在细胞中结合转录因子的方法，所述方法包括：
将不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至所述细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸包含结合所述转录因子的适体序列，并且其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸与所述转录因子形成复合物并调节基因表达。
[121]一种在细胞中螯合转录因子的方法，所述方法包括：
提供不能翻译的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含结合所述转录因子的适体序列；并且
将所述不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至所述细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸通过结合所述转录因子而螯合所述转录因子以在所述细胞中形成复合物。
[122]一种在细胞中螯合转录因子的方法，所述方法包括：
将不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至所述细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸包含结合所述转录因子的适体序列，并且其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸通过结合所述转录因子而螯合所述转录因子以形成复合物。
[123]如段落[121]和[122]中任一项所述的方法，其中所述复合物形成后细胞活率降低。
[124]一种使细胞对细胞毒性剂敏感的方法，所述方法包括：
提供不能翻译的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含结合转录因子的适体序列；并且
将所述细胞毒性剂和所述不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至所述细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸在所述细胞中与所述转录因子形成复合物；
从而使所述细胞与缺少所述不能翻译的环状多核糖核苷酸的细胞相比对所述细胞毒性剂敏感。
[125]一种使细胞对细胞毒性剂敏感的方法，所述方法包括：
将所述细胞毒性剂和不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至所述细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸包含结合所述转录因子的适体序列；并且其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸在所述细胞中与转录因子形成复合物；
从而使所述细胞与缺少所述不能翻译的环状多核糖核苷酸的细胞相比对所述细胞毒性剂敏感。
[126]如段落[124]和[125]中任一项所述的方法，其中使所述细胞对所述细胞毒性剂敏感导致在递送所述细胞毒性剂和所述不能翻译的环状多核糖核苷酸后细胞活率降低。
[127]如段落[126]所述的方法，其中在递送所述细胞毒性剂和所述不能翻译的环状多核糖核苷酸后至少两天，降低的细胞活率是降低40％或更多。
[128]一种在细胞中结合致病蛋白的方法，所述方法包括：
提供不能翻译的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含结合所述致病蛋白的适体序列；并且
将所述不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至所述细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸与所述致病蛋白形成复合物以降解所述致病蛋白。
[129]一种在细胞中结合致病蛋白的方法，所述方法包括：
将不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至所述细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸包含结合所述致病蛋白的适体序列；并且其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸与所述致病蛋白形成复合物以降解所述致病蛋白。
[130]一种在细胞中结合核糖核酸分子的方法，所述方法包括：
提供不能翻译的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含与所述核糖核酸分子的序列互补的序列；并且
将所述不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至所述细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸在所述细胞中与所述核糖核酸分子形成复合物。
[131]一种在细胞中结合核糖核酸分子的方法，所述方法包括：
将不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至所述细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸包含结合所述核糖核酸分子的适体序列；其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸在所述细胞中与所述核糖核酸分子形成复合物。
[132]一种在细胞中结合基因组脱氧核糖核酸分子的方法，所述方法包括：
提供不能翻译的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含结合所述基因组脱氧核糖核酸分子的适体序列；并且
将所述不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至所述细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸与所述基因组脱氧核糖核酸分子形成复合物并调节基因表达。
[133]一种在细胞中结合基因组脱氧核糖核酸分子的方法，所述方法包括：
将不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至所述细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸包含结合所述基因组脱氧核糖核酸分子的适体序列；其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸与所述基因组脱氧核糖核酸分子形成复合物并调节基因表达。
[134]一种在细胞中结合小分子的方法，所述方法包括：
提供不能翻译的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含结合所述小分子的适体序列；并且
将所述不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至所述细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸与所述小分子形成复合物并调节细胞过程(例如蛋白降解、细胞信号转导、基因表达等)。
[135]一种在细胞中结合小分子的方法，所述方法包括：
将不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至所述细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸包含结合所述小分子的适体序列；其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸与所述小分子形成复合物并调节细胞过程(例如蛋白降解、细胞信号转导、基因表达等)。
[136]如段落[134]和[135]中任一项所述的方法，其中所述小分子是分子量不超过900道尔顿并且调节细胞过程的有机化合物。
[137]如段落[134]-[136]中任一项所述的方法，其中所述小分子是药物。
[138]如段落[134]和[135]中任一项所述的方法，其中所述小分子是荧光团。
[139]如段落[134]-[136]中任一项所述的方法，其中所述小分子是代谢物。
[140]一种组合物，所述组合物包含不能翻译的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含适体序列，其中所述适体序列具有结合靶的二级结构。
[141]一种药物组合物，所述药物组合物包含：不能翻译的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含适体序列，其中所述适体序列具有结合所述靶的二级结构；和药学上可接受的载剂或赋形剂。
[142]一种细胞，所述细胞包含如段落[101]-[141]中任一项所述的不能翻译的环状多核糖核苷酸。
[143]一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括施用如段落[101]-[140]中任一项所述的组合物或如段[141]的所述药物组合物。
[144]一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如段落[101]-[141]中任一项所述的不能翻译的环状多核糖核苷酸。
[145]一种产生如段落[101]-[141]中任一项所述的不能翻译的环状多核糖核苷酸的方法。
本文引用的所有参考和出版物均通过引用并入本文。
提供以下实例以进一步说明本发明的一些实施例，例如使用模型元件，但无意于限制本发明的范围；通过它们的示例性性质将理解，可以替换地使用本领域技术人员已知的其他程序、方法或技术。
实例
实例1：结合DNA以调控基因表达的环状RNA
该实例描述了环状RNA结合至DNA以调控基因表达。
非天然存在的环状RNA被工程化以在模型靶基因(在本例中为二氢叶酸还原酶(DHFR))中包含序列。DHFR存在于所有生物中，在调控细胞中四氢叶酸的量方面起着关键作用。四氢叶酸及其衍生物对于嘌呤和胸苷酸合成至关重要，这对细胞增殖和细胞生长很重要。DHFR在核酸前体的合成中起着核心作用。如以下实例所示，环状RNA与DHFR基因结合以抑制其转录。
环状RNA被设计为包括DHFR结合序列5’-ACAAAUGGGGACGAGGGGGGCGGGGCGGCC-3’(SEQ ID NO:5)。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从包括上述DHFR结合序列的DNA区段合成未修饰的线性RNA。将转录的RNA用RNA纯化系统(凯杰公司(QIAGEN))纯化，按照制造商的说明用碱性磷酸酶(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，EF0652)处理，并再次用RNA纯化系统纯化。
夹板连接环状RNA是通过使用T4 DNA连接酶(新英格兰生物公司(New EnglandBio,Inc.)，M0202M)或T4 RNA连接酶2(新英格兰生物公司，M0239S)处理转录的线性RNA和DNA夹板来生成，并在用RNA酶R处理富集后分离出环状RNA。RNA质量通过琼脂糖凝胶或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
如图5C所示，通过多种方法评估了一种与DHFR基因组DNA结合的环状RNA，所述方法包括CHART-qPCR(其评估与基因组DNA的直接RNA结合)、DHFR转录物特异性qPCR以及细胞增殖和细胞生长测定。环状RNA与DHFR基因的主动结合有望导致DHFR转录降低、嘌呤和胸苷酸合成降低以及细胞增殖和细胞生长降低。
实例2：结合dsDNA以调控基因表达的环状RNA
该实例描述了环状RNA结合至dsDNA以调控基因表达。
如图5D所示，非天然存在的环状RNA被工程化以包括与模型靶基因(在本例中为转化生长因子β(TGF-β)靶序列)结合的序列。TGF-β由许多细胞类型分泌。与TGF-β受体结合后，所述受体磷酸化并激活信号传导级联，从而导致不同下游底物和调控蛋白的激活。以下实例描述了结合TGF-β靶基因以抑制其转录的环状RNA。
环状RNA被设计为包括TGF-β靶结合序列5’-CGGAGAGCAGAGAGGGAGCG-3’(SEQ IDNO:6)。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从具有TGF-β结合序列的DNA区段合成未修饰的线性RNA。将转录的RNA用RNA纯化系统(凯杰公司(QIAGEN))纯化，按照制造商的说明用碱性磷酸酶(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，EF0652)处理，并再次用RNA纯化系统纯化。
夹板连接环状RNA是通过使用T4 DNA连接酶(新英格兰生物公司，M0202M)或T4RNA连接酶2(新英格兰生物公司，M0239S)处理转录的线性RNA和DNA夹板来生成，并在用RNA酶R处理富集后分离出环状RNA。RNA质量通过琼脂糖凝胶或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
环状RNA与dsDNA的结合通过三链体免疫捕获测定法进行评估。在这里，使用生物素标记的三链体形成型寡核苷酸(TFO)ssRNA分子(对照序列或靶向序列5’-CGGAGAGCAGAGAGGGAGCG-3’(SEQ ID NO:7))从细胞内或从细胞分离的细胞核中拉下靶DNA序列，来评估RNA-DNA三重结构的形成。对通过生物素化的靶向或对照TFO拉下的DNA进行测序，以确定在RNA-dsDNA拉下后富集的DNA序列。
证明RNA与DNA结合的其他方法包括CHART-qPCR和凝胶迁移率变动测定，其中靶向ssRNA寡核苷酸(5’-CGGAGAGCAGAGAGGGAGCG-3’(SEQ ID NO:7))与靶dsDNA寡核苷酸(5’-AGAGAGAGGGAGAGAG-3’(SEQ ID NO:8)和3’-TCTCTCTCCCTCTCTC-5’(SEQ ID NO:9))相互作用，但与对照DNA寡核苷酸相互作用。
对靶RNA结合后诱导的功能变化的其他评估包括通过qPCR测量的TGF-β靶基因(包括TGFB2、TGFBR1和/或SMAD2)的变化。
实例3：结合DNA以调控基因表达的环状RNA
该实例描述了环状RNA结合至DNA以抑制转录因子结合。
非天然存在的环状RNA被工程化以包括针对靶序列(此处为γ球蛋白转录因子结合序列)的结合序列。胎儿血红蛋白是人胎儿在子宫发育的最后七个月中的主要氧转运蛋白，并持续存在于新生儿中，直到出生后约六个月。与成人血红蛋白相比，胎儿血红蛋白以更大的亲和力结合氧，使发育中的胎儿能够更好地从母亲的血流中获取氧。在新生儿中，胎儿血红蛋白在出生后大约6个月几乎被成人血红蛋白完全替代。
GATA-1是阻遏物复合物GATA-1-FOG-1-Mi2b的组成部分，其在-567Gγ/-566Aγ-珠蛋白GATA基序处结合。以下实例描述了与-567Gγ/-566Aγ-球蛋白GATA基序(分别是来自登录文件GI455025的GenBank坐标33992至33945和来自登录文件GI455025的GenBank坐标38772至38937)结合以防止抑制性转录因子/抑制性复合物结合的环状RNA。
环状RNA被设计为包括其中抑制性转录因子复合物GATA1、Mi2b或FOG1结合的非缺失结合序列。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从具有转录因子结合序列的DNA区段合成未修饰的线性RNA。将转录的RNA用RNA纯化系统(凯杰公司(QIAGEN))纯化，按照制造商的说明用碱性磷酸酶(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，EF0652)处理，并再次用RNA纯化系统纯化。
夹板连接环状RNA是通过使用T4 DNA连接酶(新英格兰生物公司(New EnglandBio,Inc.)，M0202M)或T4 RNA连接酶2(新英格兰生物公司，M0239S)处理转录的线性RNA和DNA夹板来生成，并在用RNA酶R处理富集后分离出环状RNA。RNA质量通过琼脂糖凝胶或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
通过直接DNA结合方法(如CHART-qPCR)评估与DNA结合的环状RNA，并通过胎儿血红蛋白的激活和表达等方法评估功能。环状RNA与γ-珠蛋白基因上游调控元件的主动结合有望导致竞争性抑制转录因子BCL11A或其他抑制性转录因子以激活HbF转录。HbF水平的变化可通过HPLC分析、流式细胞仪分析和/或qPCR进行测量。
实例4：结合DNA双链体的环状RNA
该实例描述了环状RNA结合至DNA双链体。
非天然存在的环状RNA可以被工程化以包括针对大沟的DNA结合序列。短(15-mer)RNA寡核苷酸(三链体形成型寡核苷酸(TFO))可以形成稳定的三螺旋RNA :DNA复合物。三链体结构(即TFO)中的第三条链遵循一条穿过双链DNA的大沟的路径。三链体结构的特异性和稳定性是通过Hoogsteen氢键提供，其不同于双链DNA中经典沃森-克里克碱基配对中形成的那些氢键。TFO通过大沟与靶双链体的富嘌呤链结合。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从具有10-15个碱基的多嘌呤序列的DNA区段合成未修饰的线性RNA。将转录的RNA用RNA纯化系统(凯杰公司(QIAGEN))纯化，按照制造商的说明用碱性磷酸酶(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，EF0652)处理，并再次用RNA纯化系统纯化。
夹板连接环状RNA是通过使用T4 DNA连接酶(新英格兰生物公司(New EnglandBio,Inc.)，M0202M)或T4 RNA连接酶2(新英格兰生物公司，M0239S)处理转录的线性RNA和DNA夹板来生成，并在用RNA酶R处理富集后分离出环状RNA。RNA质量通过琼脂糖凝胶或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
环状RNA与DNA的结合是通过直接DNA结合方法(如CHART-qPCR(其评估与基因组DNA的直接RNA结合))进行评估。评估环状RNA与dsDNA结合的其他方法包括三链体免疫捕获测定和凝胶迁移率变动测定。
实例5：结合并螯合RNA转录物的环状RNA
该实例描述了环状RNA结合并螯合RNA转录物。
非天然存在的环状RNA被工程化以包括针对RNA转录物的一个或多个新颖结合序列。具有扩增的CGG段的RNA分子被靶向用以环状RNA结合。如以下实例所示，环状RNA结合至RNA的所述重复区域以进行螯合。
环状RNA被设计为包括针对50-220个FMR1扩展重复5’-CGG-3’的互补序列。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从具有50-220个FMR1扩展重复的DNA区段合成未修饰的线性RNA。将转录的RNA用RNA纯化系统(凯杰公司(QIAGEN))纯化，按照制造商的说明用碱性磷酸酶(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，EF0652)处理，并再次用RNA纯化系统纯化。
夹板连接环状RNA是通过使用T4 DNA连接酶(新英格兰生物公司(New EnglandBio,Inc.)，M0202M)或T4 RNA连接酶2(新英格兰生物公司，M0239S)处理转录的线性RNA和DNA夹板来生成，并在用RNA酶R处理富集后分离出环状RNA。RNA质量通过琼脂糖凝胶或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
环状RNA与FMR1 mRNA的结合通过寡核苷酸拉下qPCR测定进行评估，其中与环状RNA互补的经修饰的寡核苷酸用于拉下FMR1mRNA，所述FMR1 mRNA进行反转录和qPCR扩增。还通过两种荧光寡核苷酸(一种对FMR1 mRNA具有特异性，另一种与环状RNA互补)的共定位并进行RNA FISH评估来评估结合。
实例6：结合并螯合RNA转录物的环状RNA
该实例描述了环状RNA结合并螯合RNA转录物。
非天然存在的环状RNA被工程化以包括针对RNA转录物的一个或多个新颖结合序列。SCA8利用CTG的扩展重复。CTG重复出现在转录但未翻译的基因中。如以下实例所示，环状RNA结合至mRNA的所述重复区域以进行螯合。
环状RNA被设计为包括针对50-120个SCA8扩展重复5’-CUG-3’的互补序列。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从具有50-120个SCA8扩展重复的DNA区段合成未修饰的线性RNA。将转录的RNA用RNA纯化系统(凯杰公司(QIAGEN))纯化，按照制造商的说明用碱性磷酸酶(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，EF0652)处理，并再次用RNA纯化系统纯化。
夹板连接环状RNA是通过使用T4 DNA连接酶(新英格兰生物公司(New EnglandBio,Inc.)，M0202M)或T4 RNA连接酶2(新英格兰生物公司，M0239S)处理转录的线性RNA和DNA夹板来生成，并在用RNA酶R处理富集后分离出环状RNA。RNA质量通过琼脂糖凝胶或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
环状RNA与SCA1 RNA的结合通过寡核苷酸拉下qPCR测定进行评估，其中与环状RNA互补的经修饰的寡核苷酸用于拉下SCA8 RNA扩展重复，所述SCA8 RNA扩展重复进行反转录和qPCR扩增。RNA FISH也用来通过两种荧光寡核苷酸(一种对SCA8 RNA具有特异性，另一种与环状RNA互补)的共定位进行RNA FISH评估来评估结合。
实例7：结合并螯合RNA转录物的环状RNA
该实例描述了环状RNA结合并螯合RNA转录物。
合成的环状RNA被工程化以包括针对RNA转录物的一个或多个新颖结合序列。亨廷顿蛋白(HTT)基因包括其野生型形式的6-35个谷氨酰胺残基的区段。如以下实例所示，环状RNA结合至mRNA的所述重复区域以进行螯合。
环状RNA被设计为包括针对40-120个HTT扩展重复5’-CAG-3’的互补序列。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从具有40-120个HTT扩展重复的DNA区段合成未修饰的线性RNA。将转录的RNA用RNA纯化系统(凯杰公司(QIAGEN))纯化，按照制造商的说明用碱性磷酸酶(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，EF0652)处理，并再次用RNA纯化系统纯化。
夹板连接环状RNA是通过使用T4 DNA连接酶(新英格兰生物公司(New EnglandBio,Inc.)，M0202M)或T4 RNA连接酶2(新英格兰生物公司，M0239S)处理转录的线性RNA和DNA夹板来生成，并在用RNA酶R处理富集后分离出环状RNA。RNA质量通过琼脂糖凝胶或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
一种评估环状RNA与HTT RNA的结合的方法是通过寡核苷酸拉下qPCR测定进行评估，其中与环状RNA互补的经修饰的寡核苷酸用于拉下HTT RNA，所述HTT RNA进行反转录和qPCR扩增。RNA FISH也用来通过两种荧光寡核苷酸(一种对HTTA具有特异性，另一种与环状RNA互补)的共定位进行RNA FISH评估来评估结合。
实例8：结合并螯合RNA转录物和酶的环状RNA酶
该实例描述了环状RNA同时结合并螯合RNA转录物和蛋白以帮助RNA降解。
非天然存在的环状RNA被工程化以包括针对转录物以及蛋白的一个或多个新颖结合序列以帮助转录物降解的。atrophin-1蛋白由ATN1编码，并用作模型系统。编码的蛋白包括丝氨酸重复、酸性和碱性氨基酸交替的区域以及可变谷氨酰胺重复。ATN1基因具有称为CAG三核苷酸重复的DNA区段。
在真核细胞中，大多数mRNA具有5’单甲基鸟苷帽结构和3’聚(A)尾，这对于mRNA的翻译和稳定性很重要。去除5’帽结构(脱帽)是使mRNA体从5’端衰减的先决条件。Dcp2蛋白已被鉴定为细胞中主要的mRNA脱帽酶。如以下实例所示，环状RNA与mRNA的重复区域结合以进行螯合，并且与Dcp2蛋白结合以进行mRNA的脱帽。
环状RNA被设计为包括针对40-120个ATN1扩展重复5’-CAG-3’的互补序列和被Dcp2识别的RNA帽结构。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从具有40-120个ATN1扩展重复和被Dcp2识别的RNA帽结构的DNA区段合成未修饰的线性RNA。将转录的RNA用RNA纯化系统(凯杰公司(QIAGEN))纯化，按照制造商的说明用碱性磷酸酶(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific)，EF0652)处理，并再次用RNA纯化系统纯化。夹板连接环状RNA是通过使用T4DNA连接酶(新英格兰生物公司，M0202M)或T4 RNA连接酶2(新英格兰生物公司，M0239S)处理转录的线性RNA和DNA夹板来生成，并在用RNA酶R处理富集后分离出环状RNA。RNA质量通过琼脂糖凝胶或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
一种评估环状RNA与ATN1 RNA的结合的方法是通过寡核苷酸拉下qPCR测定进行评估，其中与环状RNA互补的经修饰的寡核苷酸用于拉下ATN1 RNA，所述ATN1 RNA进行反转录和qPCR扩增。脱帽功能通过qSL-RT-PCR(其组合了夹板连接和定量RT-PCR)评估(Blewett等人,RNA,2011,3月,17(3):535-543)。
实例9：用于mRNA替代的环状RNA
该实例描述了环状RNA结合靶mRNA，产生核酶切割位点。
非天然存在的环状RNA被工程化以包括与丙酮酸激酶mRNA的M2同种型结合的序列。如以下实例所示，环状RNA结合靶丙酮酸激酶(PK)M2同种型，导致其切割。
环状RNA被设计为包括与丙酮酸激酶M2同种型互补的序列，其将在靶中产生VS核酶切割位点。环状RNA另外包括反式作用VS核酶的序列和丙酮酸激酶M1同种型的编码序列。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从具有M2同种型互补序列、VS核酶和M1编码序列的DNA区段合成未修饰的线性RNA。将转录的RNA用RNA纯化系统(凯杰公司(QIAGEN))纯化，按照制造商的说明用碱性磷酸酶(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，EF0652)处理，并再次用RNA纯化系统纯化。
夹板连接环状RNA是通过使用T4 DNA连接酶(新英格兰生物公司，M0202M)或T4RNA连接酶2(新英格兰生物公司，M0239S)处理转录的线性RNA和DNA夹板来生成，并在用RNA酶R处理富集后分离出环状RNA。RNA质量通过琼脂糖凝胶或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
环状RNA与PK M2 mRNA结合以及伴随的PK M2 mRNA降解通过RT-PCR进行评估。以类似的方式评估PK M1 mRNA的恢复表达。另外，通过蛋白印迹评估PK M1和PK M2蛋白的表达。在靶RNA结合和切割后诱导的功能改变的证据包括细胞增殖测定。
实例10：用于靶向mRNA切割的环状RNA
该实例描述了环状RNA结合模型靶mRNA，产生核酶切割位点。
非天然存在的环状RNA被工程化以包括与SRSF1 mRNA结合的序列。以下实例描述了环状RNA结合靶SRSF1 mRNA，从而导致其切割。
环状RNA被设计为包括与tSRSF1 mRNA互补的序列，其将在靶中产生VS核酶切割位点。环状RNA另外包含反式作用VS核酶的序列和丙酮酸激酶M1同种型的编码序列。利用其他反式作用核酶，例如HDV、锤头结构、I组和/或II组。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从具有SRSF1互补序列、VS核酶的DNA区段合成未修饰的线性RNA。将转录的RNA用RNA纯化系统(凯杰公司(QIAGEN))纯化，按照制造商的说明用碱性磷酸酶(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，EF0652)处理，并再次用RNA纯化系统纯化。
夹板连接环状RNA是通过使用T4 DNA连接酶(新英格兰生物公司，M0202M)或T4RNA连接酶2(新英格兰生物公司，M0239S)处理转录的线性RNA和DNA夹板来生成，并在用RNA酶R处理富集后分离出环状RNA。RNA质量通过琼脂糖凝胶或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
环状RNA与SRSF1 mRNA结合以及伴随的SRSF1 mRNA降解通过RT-PCR进行评估。通过蛋白印迹评估SRSF1蛋白的表达。在靶RNA结合和切割后诱导的改变的另外证据包括细胞增殖测定。
实例11：螯合环状RNA的环状RNA
该实例描述了环状RNA结合环状RNA。
环状RNA可以存在于某些细胞系中。一个这样的实例是circ-Dnmt1。如以下实例所示，环状RNA结合circ-Dnmt1。
环状RNA被设计为包括针对circ-Dnmt1的互补序列，以抑制其RNA-蛋白相互作用。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从具有适当序列的DNA区段合成未修饰的线性RNA。将转录的RNA用RNA纯化系统(凯杰公司(QIAGEN))纯化，按照制造商的说明用碱性磷酸酶(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，EF0652)处理，并再次用RNA纯化系统纯化。
夹板连接环状RNA是通过使用T4 DNA连接酶(新英格兰生物公司(New EnglandBio,Inc.)，M0202M)或T4 RNA连接酶2(新英格兰生物公司，M0239S)处理转录的线性RNA和DNA夹板来生成，并在用RNA酶R处理富集后分离出环状RNA。RNA质量通过琼脂糖凝胶或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
一种评估环状RNA与circ-Dnmt1结合的方法是通过环状RNA拉下(使用与环状RNA的区域互补的生物素化寡核苷酸)，然后进行RT-PCR。另外，电泳迁移率变动测定用于可视化环状RNA-circDnmt1复合物。
实例12：螯合两个miRNA的环状RNA
该实例描述了环状RNA结合两个单独的miRNA。
环状RNA被设计为包括针对两个模型miRNA(此处为miR-9和miR-1269)的互补序列。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从具有适当序列的DNA区段合成未修饰的线性RNA。将转录的RNA用RNA纯化系统(凯杰公司(QIAGEN))纯化，按照制造商的说明用碱性磷酸酶(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，EF0652)处理，并再次用RNA纯化系统纯化。
夹板连接环状RNA是通过使用T4 DNA连接酶(新英格兰生物公司(New EnglandBio,Inc.)，M0202M)或T4 RNA连接酶2(新英格兰生物公司，M0239S)处理转录的线性RNA和DNA夹板来生成，并在用RNA酶R处理富集后分离出环状RNA。RNA质量通过琼脂糖凝胶或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
一种评估环状RNA与miR-9和miR-1269结合的方法是通过环状RNA拉下(使用与环状RNA的区域互补的生物素化寡核苷酸)，然后进行RT-PCR。另外，电泳迁移率变动测定用于可视化环状RNA-miRNA-miRNA复合物。
实例13：结合并螯合至少两个单独的RNA转录物的环状RNA
该实例描述了环状RNA结合并螯合至少两个模型RNA转录物。
合成的环状RNA被工程化以包括针对RNA转录物的两个或更多个新颖结合序列。SCA8利用CTG的扩展重复。FMR1基因包括CGG扩展。如以下实例所示，环状RNA结合至RNA转录物的重复区域以进行螯合。
如以下实例所示，环状RNA结合至RNA的重复区域以进行FMR1或SCA8扩展重复的螯合。
环状RNA设计为包括针对50-220个FMR1扩展重复5’-CGG-3’的互补序列和针对50-120个SCA8扩展重复5’-CUG-3’的互补序列。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从具有扩展重复的DNA区段合成未修饰的线性RNA。将转录的RNA用RNA纯化系统(凯杰公司(QIAGEN))纯化，按照制造商的说明用碱性磷酸酶(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，EF0652)处理，并再次用RNA纯化系统纯化。
夹板连接环状RNA是通过使用T4 DNA连接酶(新英格兰生物公司(New EnglandBio,Inc.)，M0202M)或T4 RNA连接酶2(新英格兰生物公司，M0239S)处理转录的线性RNA和DNA夹板来生成，并在用RNA酶R处理富集后分离出环状RNA。RNA质量通过琼脂糖凝胶或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
环状RNA与FMR1或SCA1 mRNA的结合通过寡核苷酸拉下qPCR测定进行评估，其中与环状RNA互补的经修饰的寡核苷酸用于拉下FMR1或SCA1 mRNA，所述FMR1或SCA1 mRNA进行反转录和qPCR扩增。结合还通过荧光寡核苷酸(一种对FMR1或SCA1 mRNA具有特异性，另一种与环状RNA互补)的共定位来评估并且荧光通过RNA FISH来评估。
实例14：结合蛋白的环状RNA
该实例描述了环状RNA结合至蛋白以进行螯合。
TAR-DNA结合蛋白43(TDP-43)是一种多功能异源核糖核蛋白，在mRNA的加工和稳定化中涉及。TDP-43包含两个RNA识别基序(RRM)、核定位信号和介导核穿梭的核输出序列、以及在TDP-43蛋白相互作用和功能中涉及的C末端富甘氨酸结构域(GRD)。如以下实例所示，环状RNA结合至TDP-43以进行螯合。
环状RNA被设计为包括TDP-43RNA结合基序：5’-(UG)nUA(UG)m-3’、5’-GAGAGAGCGCGUGUGUGUGUGUGGUGGUGCAUA-3’(SEQ ID NO:10)或(UG)6和针对C末端富甘氨酸结构域的蛋白结合序列以竞争性结合TDP-43并且抑制其结合/下游功能。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从包含TDP-43RNA基序和针对C末端富甘氨酸结构域的蛋白结合序列的DNA区段合成未修饰的线性RNA。将转录的RNA用RNA纯化系统(凯杰公司(QIAGEN))纯化，按照制造商的说明用碱性磷酸酶(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，EF0652)处理，并再次用RNA纯化系统纯化。
夹板连接环状RNA是通过使用T4 DNA连接酶(新英格兰生物公司(New EnglandBio,Inc.)，M0202M)或T4 RNA连接酶2(新英格兰生物公司，M0239S)处理转录的线性RNA和DNA夹板来生成，并在用RNA酶R处理富集后分离出环状RNA。RNA质量通过琼脂糖凝胶或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
环状RNA与TDP-43的结合在体外通过EMSA(RNA电泳迁移率变动测定)进行评估。当TDP-43与circRNA结合时，凝胶电泳过程中的迁移速度要比未结合的环状RNA更慢。同样，使用抗TDP-43抗体的RIP(RNA免疫沉淀)与环状RNA特异性qPCR联合用来评估细胞提取物中的转录物结合。为了评估环状RNA是否结合至TDP-43以进行螯合，在使用和不使用环状RNA处理的细胞中分析TDP-43的定位。如果环状RNA螯合TDP-43，则预期TDP-43定位将保持在细胞质中。另外，在TDP43中，环状RNA的螯合预期导致存活增加。
实例15：结合蛋白的环状RNA
该实例描述了环状RNA结合至蛋白以进行螯合。
前mRNA加工剪接因子8是一种蛋白，其在人中由PRPF8基因编码并且是U2和U12依赖性剪接体的组分，并且被发现对于前mRNA剪接过程中的催化步骤II是必不可少。如以下实例所示，环状RNA结合至PRPF8以进行螯合。
环状RNA被设计为包括PRPF8 RNA结合基序5’-AUUGCCUAUAGAACUUAUAACGAACAUGGUUCUUGCCUUUUACCAGAACCAUCCGGGUGUUGUCUCCAUAGA-3’(SEQ ID NO:11)以竞争性结合PRPF8并抑制其功能。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从包含PRPF8结合序列的DNA区段合成未修饰的线性RNA。将转录的RNA用RNA纯化系统(凯杰公司(QIAGEN))纯化，按照制造商的说明用碱性磷酸酶(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，EF0652)处理，并再次用RNA纯化系统纯化。
夹板连接环状RNA是通过使用T4 DNA连接酶(新英格兰生物公司(New EnglandBio,Inc.)，M0202M)或T4 RNA连接酶2(新英格兰生物公司，M0239S)处理转录的线性RNA和DNA夹板来生成，并在用RNA酶R处理富集后分离出环状RNA。RNA质量通过琼脂糖凝胶或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
一种评估环状RNA与PRPF8结合的方法是EMSA(RNA电泳迁移率变动测定)。当PRPF8与环状RNA结合时，凝胶电泳过程中的迁移速度要比未结合的环状RNA更慢。同样，使用抗PRPF8抗体的RIP(RNA免疫沉淀)与环状RNA特异性qPCR联合用来评估细胞提取物中的转录物结合。为了评估环状RNA是否螯合PRPF8并改变细胞功能，在环状RNA递送后通过FACS评估干细胞表面标记(如CD44+/CD24+)的表达。
实例16：结合蛋白的环状RNA
该实例描述了环状RNA结合至模型蛋白以进行螯合。
人LIN28A同源物是具有N末端冷休克结构域(CSD)和两个C末端CysCysHisCys(CCHC)锌指结构域的RNA结合蛋白(RBP)。人LIN28A主要是细胞质的，并与细胞组分(如核糖体，P体和应激颗粒)缔合。如以下实例所示，环状RNA结合至LIN28A以进行螯合。
环状RNA被设计为包括前EM-let-7f序列5’-GGGGUAGUGAUUUUACCCUGGAGAU-3’(SEQID NO:12)(这是具有LIN28A GGAG结合基序的RNA序列)以竞争性结合LIN28A。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从包含LIN28A结合序列的DNA区段合成未修饰的线性RNA。将转录的RNA用RNA纯化系统(凯杰公司(QIAGEN))纯化，按照制造商的说明用碱性磷酸酶(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，EF0652)处理，并再次用RNA纯化系统纯化。
夹板连接环状RNA是通过使用T4 DNA连接酶(新英格兰生物公司(New EnglandBio,Inc.)，M0202M)或T4 RNA连接酶2(新英格兰生物公司，M0239S)处理转录的线性RNA和DNA夹板来生成，并在用RNA酶R处理富集后分离出环状RNA。RNA质量通过琼脂糖凝胶或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
一种评估环状RNA与LIN28A结合的方法是EMSA(RNA电泳迁移率变动测定)。当LIN28A与环状RNA结合时，凝胶电泳过程中的迁移速度要比未结合的环状RNA更慢。同样，使用抗LIN28A抗体的RIP(RNA免疫沉淀)与环状RNA特异性qPCR联合用来评估细胞提取物中的转录物结合并且LIN28A免疫荧光与环状RNA FISH组合用于评估细胞中的共定位。为了评估环状RNA是否与LIN28A结合以进行螯合和改变细胞功能，将环状RNA递送到人细胞中。在环状RNA处理后，通过q-RT-PCR测量成熟LET-7g的表达水平。另外，通过MTT法测量经处理的细胞的细胞生长。
实例17：结合蛋白的环状RNA
该实例描述了环状RNA结合至模型蛋白以进行螯合。
CUG结合蛋白1(CUGBP1)在可变剪接、mRNA降解和翻译的水平上调控基因表达。转录后调控网络涉及RNA结合蛋白CUG结合蛋白1(CUGBP1)，也称为CUGBP-和ELAV-样家族成员1(CELF1)，其结合至靶转录物的3’-UTR中的富GU元件(GRE)并介导含GRE的转录物的降解。如以下实例所示，环状RNA结合至CUGBP1以进行螯合。
环状RNA被设计为包括至少一个具有UGU(G/U)UGU(G/U)UGU的RNA基序，其被CUGBP1识别并竞争性结合CUGBP1。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从包含CUGBP1结合序列的DNA区段合成未修饰的线性RNA。将转录的RNA用RNA纯化系统(凯杰公司(QIAGEN))纯化，按照制造商的说明用碱性磷酸酶(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，EF0652)处理，并再次用RNA纯化系统纯化。
夹板连接环状RNA是通过使用T4 DNA连接酶(新英格兰生物公司(New EnglandBio,Inc.)，M0202M)或T4 RNA连接酶2(新英格兰生物公司，M0239S)处理转录的线性RNA和DNA夹板来生成，并在用RNA酶R处理富集后分离出环状RNA。RNA质量通过琼脂糖凝胶或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
一种评估环状RNA与CUGBP1结合的方法是EMSA(RNA电泳迁移率变动测定)。当CUGBP1与环状RNA结合时，凝胶电泳过程中的迁移速度要比未结合的环状RNA更慢。同样，使用抗CUGP1抗体的RIP(RNA免疫沉淀)与环状RNA特异性qPCR联合用来评估细胞提取物中的转录物结合并且CUGP1免疫荧光与环状RNA FISH组合用于评估细胞中的共定位。为了评估环状RNA是否结合至CUGBP1以进行螯合和改变细胞功能，将环状RNA递送到细胞中，并可以使用比色MTT测定法测量细胞增殖。
实例18：结合蛋白的环状RNA
该实例描述了环状RNA结合至模型蛋白以进行螯合。
Gemin5是RNA结合蛋白(RBP)，主要是细胞质蛋白，其C末端结构域带有由RBS1和RBS2结构域组成的非典范二分体RNA结合位点。此外，Gemin5结合RNA聚合酶II转录物中存在的7-甲基鸟苷(m7G)帽并下调内部核糖体进入位点依赖性翻译。Gemin5可以通过作为平台，充当不同RNA蛋白网络的枢纽通过直接与核糖体结合来控制全局蛋白合成。以下实例描述了环状RNA结合至GEMIN5以进行螯合。
环状RNA被设计为包括口蹄疫病毒(FMDV)IRES序列的结构域5，并竞争性结合GEMIN5。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从包含GEMIN5结合序列的DNA区段合成未修饰的线性RNA。将转录的RNA用RNA纯化系统(凯杰公司(QIAGEN))纯化，按照制造商的说明用碱性磷酸酶(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，EF0652)处理，并再次用RNA纯化系统纯化。
夹板连接环状RNA是通过使用T4 DNA连接酶(新英格兰生物公司，M0202M)或T4RNA连接酶2(新英格兰生物公司，M0239S)处理转录的线性RNA和DNA夹板来生成，并在用RNA酶R处理富集后分离出环状RNA。RNA质量通过琼脂糖凝胶或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
一种评估环状RNA与GEMIN5结合的方法是EMSA(RNA电泳迁移率变动测定)。当GEMIN5与环状RNA结合时，凝胶电泳过程中的迁移速度要比未结合的环状RNA更慢。同样，使用抗GEMIN5抗体的RIP(RNA免疫沉淀)与环状RNA特异性qPCR联合用来评估细胞提取物中的转录物结合并且GEMIN5免疫荧光与环状RNA FISH组合用于评估细胞中的共定位。为了评估环状RNA是否螯合GEMIN5并改变翻译，将环状RNA添加到体外翻译测定中。在存在和不存在GEMIN5蛋白下在具有和不具有环状RNA情况下，测量具有FMDV IRES的编码萤光素酶的环状RNA的翻译。通过发光读数测量，GEMIN5螯合对GEMIN5蛋白介导的翻译的影响。
实例19：结合两个蛋白的环状RNA
该实例描述了环状RNA同时结合至两个模型蛋白。
E3泛素连接酶MDM2结合蛋白并使蛋白(例如p53)泛素化，标记它们以进行蛋白酶体降解。以下实例描述了环状RNA同时结合至MDM2和p53，以增强p53的MDM2依赖性泛素化，如图16中所示。
环状RNA被设计为包括结合MDM2和p53的FOX3 RNA序列。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从具有适当序列的DNA区段合成未修饰的线性RNA。将转录的RNA用RNA纯化系统(凯杰公司(QIAGEN))纯化，按照制造商的说明用碱性磷酸酶(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，EF0652)处理，并再次用RNA纯化系统纯化。
夹板连接环状RNA是通过使用T4 DNA连接酶(新英格兰生物公司(New EnglandBio,Inc.)，M0202M)或T4 RNA连接酶2(新英格兰生物公司，M0239S)处理转录的线性RNA和DNA夹板来生成，并在用RNA酶R处理富集后分离出环状RNA。RNA质量通过琼脂糖凝胶或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
一种评估环状RNA与MDM2和p53结合的方法是通过电泳迁移率变动测定以可视化每个RNA-蛋白复合物，或者替代性地通过使用与环状RNA的区域互补的生物素化寡核苷酸拉下环状RNA，然后进行免疫印迹。另外，经由用抗泛素抗体免疫印迹或通过质谱来测定通过环状RNA结合对p53的MDM2泛素化。
实例20：结合DNA和蛋白的环状RNA
该实例描述了环状RNA同时结合至DNA和模型蛋白(此处为CBP/p300)。
CBP/p300蛋白通过与eRNA相互作用而与增强子区域缔合。CBP/p300与RNA的结合转而增强了CBP的组蛋白乙酰转移酶(HAT)活性。另外，CBP和p300与其他HAT以及转录因子和转录机器的组分缔合。
环状RNA被设计为包括eMdm2 eRNA的CBP/p300结合区以及与靶基因组基因座互补的区域。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从具有适当序列的DNA区段合成未修饰的线性RNA。将转录的RNA用RNA纯化系统(凯杰公司(QIAGEN))纯化，按照制造商的说明用碱性磷酸酶(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，EF0652)处理，并再次用RNA纯化系统纯化。
夹板连接环状RNA是通过使用T4 DNA连接酶(新英格兰生物公司(New EnglandBio,Inc.)，M0202M)或T4 RNA连接酶2(新英格兰生物公司，M0239S)处理转录的线性RNA和DNA夹板来生成，并在用RNA酶R处理富集后分离出环状RNA。RNA质量通过琼脂糖凝胶或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
一种评估环状RNA与CBP/p300和DNA结合的方法是环状RNA拉下(使用与环状RNA的区域互补的生物素化寡核苷酸)，然后进行免疫印迹和PCR。另外，电泳迁移率变动测定用于可视化环状RNA-蛋白-DNA复合物。进行使用抗H3K27ac的染色质免疫沉淀(ChIP)，以检测目的基因座处组蛋白乙酰化的变化，并检测环状RNA、CBP和目的基因组区域之间的结合。另外，通过qPCR或RNA/蛋白印迹测定了来自沉默基因组基因座的增强表达。
实例21：结合病毒mRNA和miRNA的环状RNA
该实例描述了环状RNA同时结合至病毒mRNA和miRNA。
单纯疱疹病毒1(HSV-1)编码多种调控病毒转录的miRNA。HSV-1-miR-H27结合宿主转录调控因子Kelch-样24(KLHL24)的mRNA，以诱导病毒极早期和早期基因的转录。
环状RNA被设计为包括HSV-1miR-H27和KLHL24的互补序列。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从具有适当序列的DNA区段合成未修饰的线性RNA。将转录的RNA用RNA纯化系统(凯杰公司(QIAGEN))纯化，按照制造商的说明用碱性磷酸酶(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，EF0652)处理，并再次用RNA纯化系统纯化。
夹板连接环状RNA是通过使用T4 DNA连接酶(新英格兰生物公司(New EnglandBio,Inc.)，M0202M)或T4 RNA连接酶2(新英格兰生物公司，M0239S)处理转录的线性RNA和DNA夹板来生成，并在用RNA酶R处理富集后分离出环状RNA。RNA质量通过琼脂糖凝胶或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
一种评估环状RNA与两个转录物结合的方法是通过环状RNA拉下(使用与环状RNA的区域互补的生物素化寡核苷酸)，然后进行RT-PCR。另外，电泳迁移率变动测定可以用于可视化环状RNA-mRNA-miRNA复合物。
实例22：结合脂质膜的环状RNA
该实例描述了环状RNA结合至脂质膜。
环状RNA可以被设计为特异性结合至脂质膜。以下实例描述了环状RNA结合至膜。通过介导细胞膜的结合，环状RNA能够使相邻细胞彼此紧密接近。
环状RNA被设计为包括至少一个被设计为结合膜的RNA基序(本文所述的序列)：
GUGAUGGCGCCUACGUCGAAGAAAGGAGUCUCAAGGGAAGGAGCGUAUAUGGUCGAUGAAUCGGUCAUGUCGUCAGGGU(SEQ ID NO:13)；
GAGUCAUAGGACGCUCGCUCUUGCGACCAUGGGGCACGGGGAGCCCACUGCAUGGAUCU AUCGUAUCAUAGUGCGGU(SEQ ID NO:14)；
GUAGCUUCCAUGAGACUUGAUCGGGGUCAUGGCUCUAGGCAUCGGAGAAGCUGACUAACUUGGUCACGUCGUACCUGGU(SEQ ID NO:15)；
GGACGCGUACGAAGGGCUGAUAGGGCAGAGCUCCAACUAUGCGUCCAGCUCGUGCAGUGGAUCGGGUCGUGCCUGGU(SEQ ID NO:16)；和
CUUUGUCGGCCGAACUCGCUGUUUAACUGCCCGGCGAGAUCGCAGGGUGUUGUGCUAUUCGCGUGCCGUGUG(SEQ ID NO:17)。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从包含RNA脂质结合基序中的一个或多个的DNA区段合成未修饰的线性RNA。将转录的RNA用RNA纯化系统(凯杰公司(QIAGEN))纯化，按照制造商的说明用碱性磷酸酶(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，EF0652)处理，并再次用RNA纯化系统纯化。
夹板连接环状RNA是通过使用T4 DNA连接酶(新英格兰生物公司，M0202M)处理转录的线性RNA和DNA夹板来生成，并在用RNA酶R处理富集后分离出环状RNA。RNA质量通过琼脂糖凝胶或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
一种评估环状RNA与脂质膜结合的方法是将环状RNA与脂质体孵育。使用Sephacryl S-1000柱分离脂质体。丢弃所有未结合的RNA。通过qPCR或RNA印迹评估结合的环状RNA。
实例23：用于siRNA递送的环状RNA
该实例描述了环状RNA递送几种siRNA。
非天然存在的环状RNA被工程化以包括与模型靶运甲状腺素蛋白(TTR)mRNA结合的siRNA序列。以下实例描述了环状RNA衍生的siRNA结合至靶TTR mRNA以抑制运甲状腺素蛋白翻译。
环状RNA被设计为包括与TTR mRNA(例如auggaauacucuugguuactt)互补的序列，其结合至运甲状腺素蛋白mRNA，导致该mRNA切割。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从具有TTR互补序列的DNA区段合成未修饰的线性RNA。将转录的RNA用RNA纯化系统(凯杰公司(QIAGEN))纯化，按照制造商的说明用碱性磷酸酶(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，EF0652)处理，并再次用RNA纯化系统纯化。
为了产生环状RNA，设计了带有5’-磷酸和3’-OH的两个RNA末端以及另外的侧接互补序列。这些互补序列杂交，形成有切口的环。该切口被T4 DNA连接酶封闭。通过琼脂糖或PAGE凝胶或通过自动电泳(安捷伦公司(Agilent))评估环状RNA质量。
环状RNA与TTR mRNA的结合通过以下来评估：环状RNA拉下(使用与环内特定序列互补的生物素化寡核苷酸)，然后进行RT-PCR。在经处理的和未处理的细胞中通过用RT-PCR测量的TTR靶mRNA水平来评估siRNA功能。通过蛋白印迹评估TTR蛋白的表达。
实例24：生成具有经修饰的核苷酸的环状RNA，并选择性结合蛋白
该实例展示了支持蛋白结合的经修饰的环状多核糖核苷酸的生成。另外，该实例展示，与未修饰的RNA相比，经工程化具有核苷酸修饰的环状RNA(其与免疫系统监控中涉及的蛋白选择性相互作用)具有降低的免疫原性。
产生了一种非天然存在的环状RNA，所述环状RNA被工程化以包括全部或部分掺入的经修饰的核苷酸。如以下实例中所示，将全长经修饰的线性RNA或者经修饰的和未修饰的线性RNA的杂交体环化，并通过测量nLuc表达来评估蛋白支架。另外，与未修饰的环状RNA相比，选择性修饰的环状RNA与激活BJ细胞中免疫相关基因(MDA5、OAS和IFN-β表达的q-PCR)的蛋白的相互作用减少。
生成了具有WT EMCV Nluc终止间隔子的环状RNA。对于修饰取代，在体外转录反应期间，分别添加了经修饰的核苷酸、假尿苷和甲基胞嘧啶或m6A代替标准的未修饰的核苷酸、尿苷和胞嘧啶或腺苷。WT EMCV IRES与nLuc ORF分开合成。使用经修饰的(完全修饰的)或未修饰的核苷酸(杂交修饰的)合成WT EMCV IRES。相反，在体外转录反应过程中对于整个序列，分别使用经修饰的核苷酸、假尿苷和甲基胞嘧啶或m6A代替标准的未修饰的核苷酸、尿苷和胞嘧啶或腺苷合成了nLuc ORF序列。在合成经修饰的或未修饰的IRES和经修饰的ORF之后，使用T4DNA连接酶将这两个寡核苷酸连接在一起。如在图9A中所示，生成了完全修饰的(上构建体)或杂交修饰的(下构建体)环状RNA。
为测量蛋白支架效率，测量了来自完全修饰的或杂交修饰的构建体的nLuc表达。将0.1pmol线性RNA和环状RNA转染到BJ成纤维细胞中持续6小时之后，在转染后6小时、24小时、48小时和72小时测量nLuc表达。
如图9B和图9C所示，与未修饰的环状RNA相比，如通过蛋白翻译输出测量，完全修饰的环状RNA的蛋白结合能力大大降低。相反，杂交修饰展现出差不多的或增加的与蛋白(例如蛋白翻译机器)的结合。
为了进一步测量蛋白支架效率，将完全修饰的环状RNA转染到细胞中，并测量针对免疫蛋白的蛋白支架。在用未修饰的环状RNA或经假尿苷和甲基胞嘧啶或m6A修饰完全修饰的环状RNA转染的BJ细胞中，监测激活先天免疫应答基因的免疫蛋白的蛋白支架水平。使用基于酚的提取试剂(英杰公司(Invitrogen))从细胞中分离出总RNA，并进行反转录以生成cDNA。使用基于染料的定量PCR混合物(伯乐公司(BioRad))对免疫相关基因进行qRT-PCR分析。
如图10A-C中所示，用完全修饰的环状RNA(假尿苷和甲基胞嘧啶两者或m6A完全修饰的环状RNA)转染的BJ细胞的免疫相关基因的qRT-PCR水平显示降低的MDA5、OAS和IFN-β表达水平(如与未修饰的环状RNA转染的细胞相比)，这表明经修饰的环状RNA和激活免疫原性相关基因的免疫蛋白之间减少的蛋白支架。因此，与未修饰的环状RNA相比，环状RNA的修饰对蛋白支架有影响。选择性修饰允许结合蛋白翻译机器，而完全修饰减少了与激活转染受体细胞中免疫原性相关基因的蛋白的结合。
实例25：具有经修饰的核苷酸的环状RNA降低免疫原性
该实例展示了产生蛋白产物的经修饰的环状多核糖核苷酸的生成。另外，该实例展示了，与未修饰的RNA相比，使用核苷酸修饰工程化的环状RNA具有降低的免疫原性。
产生了一种非天然存在的环状RNA，所述环状RNA被工程化以包括一种或多种所需特性，并且具有全部或部分掺入的经修饰的核苷酸。如以下实例中所示，将全长经修饰的线性RNA或者经修饰的和未修饰的线性RNA的杂交体环化，并评估nLuc的表达。此外，与未修饰的环状RNA相比，显示出BJ细胞中经修饰的环状RNA降低了免疫相关基因(MDA5、OAS和IFN-β表达的q-PCR)的激活。
生成了具有WT EMCV Nluc终止间隔子的环状RNA。对于修饰取代，在体外转录反应期间，分别添加了经修饰的核苷酸、假尿苷和甲基胞嘧啶或m6A代替标准的未修饰的核苷酸、尿苷和胞嘧啶或腺苷。WT EMCV IRES与nLuc ORF分开合成。使用经修饰的(完全修饰的)或未修饰的核苷酸(杂交修饰的)合成WT EMCV IRES。相反，在体外转录反应过程中对于整个序列，分别使用经修饰的核苷酸、假尿苷和甲基胞嘧啶或m6A代替标准的未修饰的核苷酸、尿苷和胞嘧啶或腺苷合成了nLuc ORF序列。在合成经修饰的或未修饰的IRES和经修饰的ORF之后，使用T4DNA连接酶将这两个寡核苷酸连接在一起。如图9中所示，生成杂交修饰的环状RNA。
为了测量表达效率，将杂交修饰的环状RNA转染到细胞中并测量免疫蛋白的表达。在用未修饰的环状RNA或经假尿苷和甲基胞嘧啶或m6A修饰杂交修饰的环状RNA转染的BJ细胞中，监测先天免疫应答基因的表达水平。使用基于酚的提取试剂(英杰公司(Invitrogen))从细胞中分离出总RNA，并进行反转录以生成cDNA。使用基于染料的定量PCR混合物(伯乐公司(BioRad))对免疫相关基因进行qRT-PCR分析。
如图11中所示，用杂交修饰的环状RNA(假尿苷和甲基胞嘧啶杂交修饰的环状RNA)转染的BJ细胞的免疫相关基因的qRT-PCR水平显示降低的RIG-I、MDA5、IFN-β和OAS表达水平(如与未修饰的环状RNA转染的细胞相比)，这表明激活免疫原性相关基因的该杂交修饰的环状RNA的降低的免疫原性。与实例24中所示的完全修饰的环状RNA不同，m6A杂交修饰的环状RNA显示出与未修饰的环状RNA转染的细胞相似的RIG-I、MDA5、IFN-β和OAS表达水平。因此，与未修饰的环状RNA相比，环状RNA的修饰以及修饰水平对激活免疫原性相关基因有影响。
实例26：环状RNA结合小分子
该实例展示了环状RNA结合小分子以用于螯合/生物活性。
线性曼戈(mango)RNA适体与小分子TO-1生物素染料结合时发出荧光。如下实例所示，环状曼戈RNA结合至噻唑橙衍生物TO-1生物素以用于螯合/生物活性。
环状RNA被设计为包括曼戈RNA小分子结合适体位点和稳定茎：5’-AATAGCCGGUCUACGGCC AUACCACCCU GAACGCGCCCGAUCUCGUCU GAUCUCGGAAGCUAAGCAGGGUCGGGCCUGGUUAGUACUU GGAUGGGAGA CCGCCUGGGAAUACCGGGUGCUGUAGGCGU CGACUUGCCAUGUGUAUGUGGGUACGAAGGAAGGAUUGGU AUGUGGUAUA UUCGUACCCACAUACUCUGA UGAUCCUUCGGGAUCAUUCA UGGCAACGGCTATT-3’(SEQ ID NO:18)，以及环化序列：5’-AATAGCCG-3’(SEQIDNO:19)和5’-CGGCTATT-3’(SEQ ID NO:20)。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从包含曼戈RNA基序、茎和环化序列的DNA区段合成未修饰的线性RNA。转录的RNA用RNA纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司(NewEngland Biolabs)，T2050)纯化，按照制造商的说明用RNA 5’-磷酸水解酶(RppH，新英格兰生物学实验室公司，M0356)处理，并再次用RNA纯化柱纯化。使用与环化序列互补的夹板DNA和T4 RNA连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，M0239)将RppH处理的RNA环化。环状RNA经过脲-PAGE纯化，在缓冲液(其含有0.5M乙酸钠，0.1％SDS，1mM EDTA)中洗脱，乙醇沉淀并重悬于无RNA酶的水中。RNA质量通过脲-PAGE或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
使用荧光显微镜在体外在BJ成纤维细胞中评估环状RNA与TO-1生物素的结合。当TO-1生物素与RNA结合后，其荧光增强100倍以上。将线性或环状适体(50nM)添加到BJ成纤维细胞培养物的培养基，以及无RNA对照。添加转染试剂lipofectamine，以确保RNA都是。用TO-1生物素处理培养物，并在3和6小时后分析荧光。如图12中所示，在3和6小时时，检测到来自环状适体的增加的荧光/稳定性。
使用环状适体可观察到更高效的递送和更持久的荧光。
实例27：结合蛋白的环状RNA
该实例展示了环状RNA结合至蛋白以进行螯合。
人抗原受体(HuR)可以是一种致病蛋白，例如已知其结合并稳定与癌症相关的mRNA转录物，例如原癌基因、细胞因子、生长因子和侵袭因子的mRNA。HuR通过实现多种癌症表型而具有中心性致瘤活性。用环状RNA螯合HuR可以减弱多种癌症的致瘤生长。如以下实例所示，环状RNA可以结合至HuR以进行螯合。
环状RNA被设计为包括HuR RNA结合适体基序：5’-UCAUAAUCAA UUUAUUAUUUUCUUUUAUUUUAUUCACAUAAUUUUGUUUUU-3’(SEQ ID NO:21)、5’-AUUUUGUUUUUAA CAUUUC-3’(SEQ IDNO:22)、5’-UCAUAAUCAAUUUAUUAUUUUCUUUUAUUUUAUUCACAUAAUUUUGUUUUUAUUUUGUUUUUAACAUUUC-3’(SEQ ID NO:23)以竞争性结合HuR并抑制其结合/下游功能。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从包含HuR RNA基序和蛋白结合序列的DNA区段合成未修饰的线性RNA。
转录的RNA用Monarch RNA纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，T2050)纯化，按照制造商的说明用RNA 5’-磷酸水解酶(RppH，新英格兰生物学实验室公司，M0356)处理，并再次用RNA纯化柱纯化。使用与环化序列互补的夹板DNA和T4 RNA连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，M0239)将RppH处理的RNA环化。环状RNA经过脲-PAGE纯化，在缓冲液(其含有0.5M乙酸钠，0.1％SDS，1mM EDTA)中洗脱，乙醇沉淀并重悬于无RNA酶的水中。RNA质量通过脲-PAGE或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
通过针对HuR的RNA免疫沉淀(RIP)在体外评估环状RNA与HuR的结合。含有HuR RNA结合基序的环状RNA结合HuR蛋白，而缺少HuR RNA结合基序的环状RNA显示没有高于背景的结合(图13)。
该结果展示了circRNA与具有治疗意义的生物分子的选择性结合。
实例28：具有小分子的环状RNA结合蛋白
该实例展示了与小分子连接以结合和募集所选蛋白的环状RNA。
已知临床批准的药物酞胺哌啶酮(沙利度胺(Thalomid))缔合细胞蛋白降解机器成员E3泛素连接酶。通过将酞胺哌啶酮与环状RNA缀合(例如，通过点击化学)，缀合有酞胺哌啶酮的环状RNA可以将细胞降解机器募集到第二致病蛋白(例如，也被环状RNA靶向)。如以下实例所示，将小分子缀合至环状RNA以结合E3泛素连接酶Cereblon。
环状RNA被设计为包括反应性尿苷残基(例如5-叠氮基-C3-UTP)，用于缀合已知与目的细胞内蛋白相互作用的炔烃官能化小分子。
使用T7 RNA聚合酶(鲁西基公司(Lucigen))通过体外转录合成线性RNA。在体外转录反应中，所有UTP均被5-叠氮基-C3-UTP(吉娜生物科学公司(Jena Biosciences))取代，以生成叠氮化物官能化的RNA。用RNA纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司)纯化合成的线性RNA，并对其进行RNA 5’焦磷酸水解酶(RppH，新英格兰生物学实验室公司)处理以除去焦磷酸酯。用RNA纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司)纯化RppH处理的线性RNA。
环状RNA通过夹板连接生成。RppH处理的线性RNA(100uM)和夹板DNA(200uM)通过在75℃加热5分钟并在室温下逐渐冷却20分钟而退火。用T4 RNA连接酶2(0.2U/ul，新英格兰生物学实验室公司)在37℃下进行4小时的连接反应。通过乙醇沉淀纯化连接的混合物。为了分离环状RNA，将连接的混合物在4％变性的脲-PAGE上分离。凝胶上的RNA用SYBR-绿(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))染色，并用透照仪(透照器公司(Transilluminators))可视化。切下环状RNA的相应RNA带，并用破胶剂管(伊斯特工程公司(Ist Engineering))破碎。为了洗脱环状RNA，将具有环状RNA的破碎凝胶与洗脱缓冲液(0.5M乙酸钠，1mM EDTA，0.1％SDS)在37℃孵育一小时，并小心收集上清液。将剩余的破碎凝胶洗脱液进行另一轮洗脱，并重复总共三次。将具有环状RNA的洗脱缓冲液通过0.45um乙酸纤维素过滤器过滤，以除去凝胶碎片，并通过乙醇沉淀纯化/浓缩环状RNA。
炔烃官能化的酞胺哌啶酮(吉娜生物科学公司)根据制造商的说明书(吉娜生物科学公司)，用点击化学反应试剂盒，通过铜催化的叠氮化物-炔烃点击化学反应(CuAAC)与叠氮化物官能化的环状RNA缀合。用RNA纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司)纯化与酞胺哌啶酮缀合的环状RNA。
酞胺哌啶酮缀合的环状RNA的结合特性使用以下进行分析：GST拉下，然后是qPCR进行RNA检测。对于进行GST拉下测定，将酞胺哌啶酮缀合的环状RNA(2nM)与GST-E3泛素连接酶Cereblon(其与酞胺哌啶酮相互作用)(50nM)在室温下在25mM Tris-HCl(pH 7.0)、100mM NaCl、1mM EDTA，0.5％NP-40、5％甘油存在下孵育2小时。将没有酞胺哌啶酮缀合情况下的叠氮化物官能化的环状RNA用作阴性对照。
将RNA-蛋白混合物与GSH-琼脂糖珠在室温下进一步孵育一小时，以评估GST-GSH相互作用。用结合缓冲液洗涤三次后，用Trizol(赛默飞世尔公司)提取特异性结合至GSH-珠的RNA。提取的环状RNA被逆转录，并通过定量RT-PCR用环状RNA特异性引物进行检测(正向：TACGCCTGCAACTGTGTTGT(SEQ ID NO:24)，反向：TCGATGATCTTGTCGTCGTC(SEQ ID NO:25))。
图14展示在GST拉下测定中，与酞胺哌啶酮小分子缀合的环状RNA高度富集，表明该环状RNA具有小分子，并通过该小分子与特定蛋白结合。
实例29：环状RNA结合小分子
该实例展示了与小分子连接的环状RNA，所述小分子特异性结合二级蛋白。
如以下实例所示，将小分子点击至环状RNA，以创建支架，用于特异性结合二级蛋白，例如E3泛素连接酶和靶。
环状RNA被设计为包括反应性尿苷残基(例如5-叠氮基-C3-UTP或5-乙基-UTP)以缀合炔烃官能化的或叠氮化物官能化的小分子用于任何下游官能度。
使用T7 RNA聚合酶(鲁西基公司(Lucigen))通过体外转录合成线性RNA。在体外转录反应中，所有UTP均被5-叠氮基-C3-UTP或5-乙基UTP(吉娜生物科学公司)取代，以分别生成叠氮化物官能化的或炔烃官能化的RNA。用RNA纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司)纯化合成的线性RNA，并对其进行RNA 5’焦磷酸水解酶(RppH，新英格兰生物学实验室公司)处理以除去焦磷酸酯。用RNA纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司)纯化RppH处理的线性RNA。
环状RNA通过夹板连接生成。RppH处理的线性RNA(100uM)和夹板DNA(200uM)通过在75℃加热5分钟并在室温下逐渐冷却20分钟而退火。用T4 RNA连接酶2(0.2U/ul，新英格兰生物学实验室公司)在37℃下进行4小时的连接反应。通过乙醇沉淀纯化连接的混合物。
为了分离环状RNA，将连接的混合物在6％变性的脲-PAGE上分离。凝胶上的RNA用SYBR-绿(赛默飞世尔公司)染色，并用透照仪(透照器公司)可视化。切下环状RNA的相应RNA带，并用破胶剂管(伊斯特工程公司(Ist Engineering))破碎。为了洗脱环状RNA，将具有环状RNA的破碎凝胶与洗脱缓冲液(0.5M乙酸钠，1mM EDTA，0.1％SDS)在37℃孵育一小时，并小心收集上清液。将剩余的破碎凝胶洗脱液进行另一轮洗脱，并重复总共三次。将具有环状RNA的洗脱缓冲液通过0.45um乙酸纤维素过滤器过滤，以除去凝胶碎片，并通过乙醇沉淀纯化/浓缩环状RNA。
炔烃官能化的Alexa Fluor 488染料或叠氮化物官能化的Alexa Fluor 488染料(吉娜生物科学公司)根据制造商的说明书(吉娜生物科学公司)，用点击化学反应试剂盒，通过铜催化的叠氮化物-炔烃点击化学反应(CuAAC)与叠氮化物官能化的环状RNA缀合。用RNA纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司)纯化与Alexa Fluor 488染料缀合的环状RNA。
通过在6％变性脲-PAGE上分离环状RNA来监测染料缀合。将未缀合和缀合AlexaFluore染料的环状RNA在凝胶上平行分离以进行比较。通过iBright成像系统(英杰公司)监测凝胶上来自RNA的荧光。监测荧光后，将凝胶用SYBR安全(SYBR safe)染色，并通过iBright成像系统(英杰公司)可视化凝胶上的RNA。
包含小分子Alexa Fluor 488的环状RNA已显示出发荧光，表明环状RNA可以包含功能性小分子。
如图15所示，缀合至酞胺哌啶酮小分子的环状RNA产生离散的PCR产物(如通过荧光检测)，表明缀合至小分子的环状RNA与二级蛋白特异性相互作用。
实例30：结合两种不同小分子的环状RNA
该实例描述了两种选择的蛋白，它们被与小分子连接的环状RNA募集。
已知临床批准的药物酞胺哌啶酮(沙利度胺)缔合细胞蛋白降解机器成员E3泛素连接酶cereblon。通过将酞胺哌啶酮与环状RNA缀合(例如，通过点击化学)，缀合有酞胺哌啶酮的环状RNA可以将细胞降解机器募集到第二致病蛋白(例如，也被环状RNA靶向)。如下实例所示，两种小分子(酞胺哌啶酮和JQ1)与环状RNA缀合，以结合(1)E3泛素连接酶Cereblon以进行泛素化以及随后降解邻近的蛋白和(2)BET家族蛋白(通过JQ1，其是与BET家族蛋白结合的小分子抑制剂)。
环状RNA被设计为包括反应性尿苷残基(例如5-叠氮基-C3-UTP)，用于缀合已知与目的细胞内蛋白相互作用的炔烃官能化小分子。
使用T7 RNA聚合酶(鲁西基公司)通过体外转录合成线性RNA。在体外转录反应中，所有UTP均被5-叠氮基-C3-UTP(吉娜生物科学公司)取代，以生成叠氮化物官能化的RNA。用RNA纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司)纯化合成的线性RNA，并对其进行RNA 5’焦磷酸水解酶(RppH，新英格兰生物学实验室公司)处理以除去焦磷酸酯。用RNA纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司)纯化RppH处理的线性RNA。
环状RNA通过夹板连接生成。RppH处理的线性RNA(100uM)和夹板DNA(200uM)通过在75℃加热5分钟并在室温下逐渐冷却20分钟而退火。用T4 RNA连接酶2(0.2U/ul，新英格兰生物学实验室公司)在37℃下进行4小时的连接反应。通过乙醇沉淀纯化连接的混合物。为了分离环状RNA，将连接的混合物在4％变性的脲-PAGE上分离。凝胶上的RNA用SYBR-绿(赛默飞世尔公司)染色，并用透照仪(透照器公司)可视化。切下环状RNA的相应RNA带，并用破胶剂管(伊斯特工程公司)破碎。为了洗脱环状RNA，将具有环状RNA的破碎凝胶与洗脱缓冲液(0.5M乙酸钠，1mM EDTA，0.1％SDS)在37℃孵育一小时，并小心收集上清液。将剩余的破碎凝胶洗脱液进行另一轮洗脱，并重复总共三次。将具有环状RNA的洗脱缓冲液通过0.45um乙酸纤维素过滤器过滤，以除去凝胶碎片，并通过乙醇沉淀纯化/浓缩环状RNA。
炔烃官能化的酞胺哌啶酮和炔烃官能化的JQ1(吉娜生物科学公司)根据制造商的说明书(吉娜生物科学公司)，用点击化学反应试剂盒，通过铜催化的叠氮化物-炔烃点击化学反应(CuAAC)与叠氮化物官能化的环状RNA缀合。为了进行比较，生成了三种不同类型的缀合小分子的环状RNA：具有JQ1和酞胺哌啶酮两者的RNA、仅具有酞胺哌啶酮的RNA和仅具有JQ1的RNA。用RNA纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司)纯化与小分子缀合的环状RNA。
使用GST拉下分析了小分子缀合的环状RNA与E3泛素连接酶CRBN和BET家族蛋白的结合。GST-CRBN(阿坝卡穆公司(Abcam))和BET家族蛋白之一，含布罗莫结构域蛋白4(BRD4，BPS生物科学公司(BPSBiosciences))用于此实验。对于进行GST拉下测定，将酞胺哌啶酮和JQ1缀合的环状RNA(2nM)与GST-CRBN和BRD4(各50nM)在室温下在25mM Tris-Cl(pH 7.0)、100mM NaCl、1mM EDTA、0.5％NP-40、5％丙三醇存在下孵育2小时。没有缀合的叠氮化物官能化的环状RNA、酞胺哌啶酮缀合的RNA和JQ1缀合的RNA用作阴性对照。将RNA-蛋白混合物与GSH-琼脂糖珠进一步孵育，以使GST-GSH在室温下相互作用一小时。用结合缓冲液洗涤三次后，将珠分成两等份。为了监测蛋白结合，将一份珠在Lammli样品缓冲液(伯乐公司)存在下煮沸，并进行蛋白印迹(用BRD4抗体(用于检测BRD4蛋白)和GST抗体(用于检测GST-CRBN))。为了监测RNA募集，用Trizol(赛默飞世尔公司)提取珠上的RNA，并将提取的环状RNA逆转录，并通过定量RT-PCR进行检测(用针对RNA的环状形式的特异性引物(正向：TACGCCTGCAACTGTGTTGT(SEQ ID NO:24)，反向：TCGATGATCTTGTCGTCGTC(SEQ ID NO:25))。
预计含有酞胺哌啶酮和JQ1小分子的环状RNA在针对CRBN和BET结构域蛋白BRD4两者的GST拉下中高度富集，这表明环状RNA不仅可以包含小分子，而且可以使用该小分子缀合物结合至两种特定蛋白，从而降解所选蛋白。
实例31：结合碳水化合物的环状RNA
该实例描述了环状RNA结合至碳水化合物。
唾液酸化路易斯X是膜蛋白的四糖糖缀合物。它在细胞粘附过程中作为针对选择素蛋白的配体。如以下实例所示，环状RNA结合至唾液酸化路易斯X以抑制细胞粘附。
工程化的环状RNA被设计为包括唾液酸化路易斯X结合序列(例如，5'-CCGUAAUACGACUCACUAUAGGGGAGCUCGGUACCGAAUUCAAGGUACUCUGUGCUUGUCGAUGUGUAUUGAUGGCACUUUCGAGUCAACGAGUUGACAGAACAAGUAGUCAAGCUUUGCAGAGAGGAUCCUU-3'(SEQ ID NO:26))。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从包含唾液酸化路易斯X结合序列的DNA区段合成未修饰的线性RNA。将转录的RNA用RNA纯化系统(凯杰公司(QIAGEN))纯化，按照制造商的说明用碱性磷酸酶(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，EF0652)处理，并再次用RNA纯化系统纯化。夹板连接环状RNA是通过使用T4 DNA连接酶(新英格兰生物公司，M0202M)或T4 RNA连接酶2(新英格兰生物公司，M0239S)处理转录的线性RNA和DNA夹板来生成，并在用RNA酶R处理富集后分离出环状RNA。RNA质量通过琼脂糖凝胶或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
一种评估环状RNA与唾液酸化路易斯X结合的方法是测量唾液酸化路易斯X介导的细胞粘附。E-选择素识别唾液酸化路易斯X，并且早幼粒细胞白血病细胞系HL60的表面富含唾液酸化路易斯X，尤其是在TNF-a处理后。将重组可溶性E-选择素(卡尔生物化学公司(Calbiochem))添加至微量滴定板(250ng/孔)的pH 9.2的0.05M NaHCO3(10μg/ml)中并在4℃孵育过夜。然后孵育带有或不带有唾液酸化路易斯X结合位点的环状RNA(10μg/mL)。TNF-α激活(10ng/ml，持续20h)的HL60人早幼粒细胞白血病细胞在室温下在板上孵育30分钟，洗涤，并测量粘附细胞的数量。
实例32：结合病毒的环状RNA
该实例描述了环状RNA结合至病毒。
流感病毒具有两个膜糖蛋白组分，包括血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。在每个病毒颗粒的表面分别表达了约900个和300个拷贝的HA和NA。如以下实例所示，工程化的环状RNA被设计为结合血凝素以进行病毒结合。
环状RNA被设计为包括血凝素结合位点(例如5'-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGGGUUAGCAGUCGGCAUGCGGUACAGACAGACCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3'(SEQ ID NO:27))以结合至流感病毒的表面。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从包含血凝素结合序列的DNA区段合成未修饰的线性RNA。将转录的RNA用RNA纯化系统(凯杰公司(QIAGEN))纯化，按照制造商的说明用碱性磷酸酶(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，EF0652)处理，并再次用RNA纯化系统纯化。夹板连接环状RNA是通过使用T4 DNA连接酶(新英格兰生物公司，M0202M)或T4RNA连接酶2(新英格兰生物公司，M0239S)处理转录的线性RNA和DNA夹板来生成，并在用RNA酶R处理富集后分离出环状RNA。RNA质量通过琼脂糖凝胶或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
一种评估环状RNA与血凝素结合的方法是RNA适体对HA诱导的膜融合的抑制作用。当血凝素与环状RNA结合时，发生膜融合的频率比未结合的环状RNA更低。
通过使用荧光标记的病毒和人红细胞(RBC)血影膜检查HA诱导的膜融合。A/Panama/2007/1999(H3N2)的病毒膜用荧光脂质探针十八烷基若丹明B(R18；分子探针公司(Molecular Probes))标记。
对于进行融合抑制测定，将与环状RNA(0.5或5mM)混合的H3N2病毒(0.05-0.1mg总蛋白/ml)添加至安装在金属室中的盖玻片上的血影膜。病毒与血影膜融合后，脂质和血影膜之间的脂质互混会诱导R18的荧光猝灭。
实例33：结合细胞的环状RNA
该实例描述了环状RNA结合至靶细胞类型。
在该实例中，通过前面描述的方法之一设计工程化的环状RNA。环状RNA和线性RNA被设计为包括曼戈适体、稳定茎和非编码区：转铁蛋白适体(例如GGGGGAUCAAUCCAAGGGACCCGGAAACGCUCCCUUACACCCC(SEQ ID NO:28))。该适体区结合转铁蛋白受体，这允许RNA结合至表达所述受体的细胞。转铁蛋白受体在多种细胞类型中表达，包括红细胞和一些癌细胞。作为阴性对照，RNA被设计为不包括适体区。
HeLa细胞是已知表达转铁蛋白受体的宫颈癌细胞。HeLa细胞在标准条件下生长(在DMEM(具有10％FBS)中，在37℃，在5％CO2下)。细胞定期传代以维持指数生长。使用荧光显微镜在体外在HeLa细胞中评估环状RNA与TO-1生物素的结合。当TO-1生物素与RNA结合后，其荧光增强100倍以上。将带有或不带有适体(50nM)的环状RNA添加到HeLa培养物的培养基，以及无RNA对照。添加基于脂质的转染试剂(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific))以确保RNA递送。用TO-1生物素处理培养物，并在3和6小时后分析荧光。
实例34：结合适体的环状RNA
该实例描述了环状RNA结合至适体。
工程化的环状RNA被设计为包括针对RNA适体的一个或多个新颖结合序列。RNA适体通过互补性靶向进行环状RNA结合。如以下实例所示，环状RNA与LIN28A结合适体互补结合以进行螯合。
环状RNA被设计为包括针对LIN28A结合适体序列的互补序列，5’-GGGGUAGUGAUUUUACCCUGGAGAU-3’(SEQ ID NO:12)。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从具有互补LIN28A结合适体序列的DNA区段合成未修饰的线性RNA。将转录的RNA用RNA纯化系统(凯杰公司(QIAGEN))纯化，按照制造商的说明用碱性磷酸酶(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，EF0652)处理，并再次用RNA纯化系统纯化。
夹板连接环状RNA是通过使用T4 DNA连接酶(新英格兰生物公司(New EnglandBio,Inc.)，M0202M)或T4 RNA连接酶2(新英格兰生物公司，M0239S)处理转录的线性RNA和DNA夹板来生成，并在用RNA酶R处理富集后分离出环状RNA。RNA质量通过琼脂糖凝胶或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
环状RNA与LIN28A结合适体的结合通过寡核苷酸拉下qPCR测定进行评估，其中与环状RNA互补的经修饰的寡核苷酸用于拉下LIN28A结合适体，所述LIN28A 结合适体进行反转录和qPCR扩增。
实例35：环状RNA结合转录因子
该实例展示了环状RNA结合至蛋白以进行螯合。NF-kB是激活转录并诱导存活途径的转录因子家族。如以下实例所示，环状RNA结合至NF-kB以进行螯合。
环状RNA被设计为包括NF-kB RNA结合适体基序：5’-aaaaaaaaaaGATCTTGAAACTGTTTTAAGGTTGGCCGATCTTaaaaaa-3’
(SEQ ID NO:29)竞争性结合NF-kB并抑制其结合/下游功能。将聚(A)段添加至内部结合基序以(1)使RNA寡核苷酸易于连接并保持适体的二级结构。使用RNAfoldWebServer检查了正确的折叠。作为对照，使用了乱序RNA序列(aaaaaaaTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAAaaaaaa(SEQ ID NO:30)。这种乱序RNA序列折叠成与适体相似的3D结构，但不靶向任何蛋白，如Mi等人,Mol Ther.[分子疗法]2008年1月；16(1):66-73中所述。
具有NF-kB结合适体基序的RNA由商业供应商(IDT)合成，具有5’单磷酸基团和3’羟基基团。RNA连接酶1(新英格兰生物学实验室公司，M0204S)用于连接RNA寡核苷酸。根据制造商的说明(鲁西基公司，RNR07250)，使用RNA酶R从样品中去除残留的线性RNA。另外，通过从15％脲PAGE凝胶中提取环状RNA来纯化环状mRNA。在含有以下的缓冲液中从凝胶洗脱环状RNA：0.5M乙酸钠、0.1％SDS、1mM EDTA。通过将洗脱液运行通过旋转柱(新英格兰生物学实验室公司，T2030S)，从凝胶提取物去除残留的凝胶碎片或盐。将RNA洗脱到RNA储存缓冲液(1mM柠檬酸钠，赛默飞世尔公司，AM7000)中，并通过脲-PAGE或通过自动凝胶毛细管电泳(安捷伦公司(Agilent))评估RNA完整性。
进行了电泳迁移率变动测定(EMSA)，以评估环状RNA与NF-kB的结合亲和力。将一皮摩尔线性或环状RNA与重组NF-kB p50亚基(卡门化学公司(Caymen Chemical)，10009818)在变化浓度的RNA浓度(即，0、0.1、1、10皮摩尔)下在室温下在缓冲反应(20mMTris-HCl，pH 8.0，50mM NaCl，1mM MgCl2)中孵育20分钟。样品在200V下在6％TBE尿素凝胶上运行25分钟。凝胶用SybrGold(赛默飞科技公司(Thermo Scientific)，S11494)染色，并用蓝色E-凝胶成像系统(赛默飞科技公司，4466612)成像。
如图17中所示，具有乱序结合适体序列的RNA没有显示出对NF-kB的p50亚基的结合亲和力。NF-kB结合适体序列的线性和环状形式两者以相似的亲和力结合至p50亚基。
通过针对NF-kB的EMSA评估环状RNA与NF-kB的结合。NF-kB选择性结合含有NF-kBRNA结合适体基序的环状RNA。该结果证明了目的生物分子被环状RNA中的序列选择性地结合。
实例36：环状RNA螯合靶蛋白并抑制功能
该实例展示了环状RNA结合至细胞中的蛋白，并且这种螯合导致功能抑制。如以下实例所示，环状RNA结合至NF-kB以进行螯合，导致细胞中由NF-kB激活的存活的抑制。
如前所述设计并合成环状、线性和线性乱序RNA。
通过MTT测定(赛默飞科技公司，V13154)测量细胞活率来确定递送带有NF-kB结合适体序列的环状RNA后非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系A549中的NF-kB功能。简而言之，在与脂质转染试剂(赛默飞科技公司，LMRNA003)复合后，用1皮摩尔的线性、线性乱序或环状RNA转染A549细胞。通过根据制造商的说明进行的MTT测定来测量活率
如图18中所示，用线性RNA处理的细胞在第1天的活率没有变化，在第2天的活率略有下降(第1天的活率为101％，第2天的活率为97％)。相反，用环状RNA处理的细胞在第1天表现出可测量的活率下降，到第2天表现出更大的增长(第1天为89％、第2天为86％)。
总体而言，结果证明，环状RNA结合细胞中的NF-kB并抑制NF-kB激活存活途径。
实例37：环状RNA结合并螯合蛋白以影响化学治疗剂敏化
该实例展示了环状RNA结合至细胞中的靶蛋白，导致靶蛋白的信号传导途径的抑制。如以下实例所示，环状RNA螯合化学抗性细胞中的NF-kB并抑制NF-kB的信号传导，从而使细胞对化学治疗剂重新敏感。
如前所述设计并合成线性、线性乱序和环状RNA。
在递送靶向NF-kB的环状RNA并暴露于化学治疗剂后，确定了NF-kB螯合在化学抗性非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系A549中的作用。细胞活率通过MTT测定(赛默飞科技公司，V13154)确定。简而言之，在与脂质转染试剂(赛默飞科技公司，LMRNA003)复合后，用1皮摩尔的乱序线性对照、线性或环状RNA转染A549细胞。转染后24小时，将细胞用5uM阿霉素处理另外18小时。通过根据制造商的说明进行的MTT测定来测量活率。转染后48和72小时重复阿霉素处理。
如图19中所示，在第1天用乱序线性RNA(对照)的阿霉素处理不影响dox抗性A549肺癌细胞系中的细胞活率。阿霉素与线性RNA共同处理在第2天降低细胞活率(78％存活)。相反，与环形适体共同处理导致在第1天和第2天都有更多的细胞死亡(第1天存活79％，并且第2天存活73％)。
总体而言，结果证明，环状RNA结合细胞中的NF-kB并抑制NF-kB存活信号传导，从而增加了细胞对化学治疗剂阿霉素的敏感性。
实例38：环状RNA标记靶蛋白以进行降解
该实例展示了与小分子连接的环状RNA募集两种不同的选择的蛋白，从而标记靶蛋白以进行降解。
已知临床批准的药物酞胺哌啶酮(来那度胺(Revlimid))缔合细胞蛋白降解机器成员E3泛素连接酶。通过将酞胺哌啶酮与环状RNA缀合(例如，通过点击化学)，缀合有酞胺哌啶酮的环状RNA可以将细胞降解机器募集到第二致病蛋白(例如，也被环状RNA靶向)。图20是显示示例性环状RNA的示意图，所述环状RNA被递送到细胞中并标记细胞中的靶BRD4蛋白以通过泛素系统降解。如下实例所示，两个小分子(酞胺哌啶酮和JQ1)与环状RNA缀合，以结合(1)E3泛素连接酶Cereblon以进行泛素化以及随后降解邻近的蛋白；和(2)BET家族蛋白(通过JQ1，其是与BET家族蛋白结合的小分子抑制剂)。
环状RNA被设计为包括多个(49个残基)反应性尿苷残基(例如5-叠氮基-C3-UTP)，用于缀合已知与目的细胞内蛋白相互作用的炔烃官能化小分子。
使用T7 RNA聚合酶(鲁西基公司)通过体外转录合成线性RNA。在体外转录反应中，所有UTP均被5-叠氮基-C3-UTP(吉娜生物科学公司)取代，以生成叠氮化物官能化的RNA。用RNA纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司)纯化合成的线性RNA，并对其进行RNA 5’焦磷酸水解酶(RppH，新英格兰生物学实验室公司)处理以除去焦磷酸酯。用RNA纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司)纯化RppH处理的线性RNA。
环状RNA通过夹板连接生成。RppH处理的线性RNA(100uM)和夹板DNA(200uM)通过在75℃加热5分钟并在室温下逐渐冷却20分钟而退火。用T4 RNA连接酶2(0.2U/ul，新英格兰生物学实验室公司)在37℃下进行4小时的连接反应。通过乙醇沉淀纯化连接的混合物。为了分离环状RNA，将连接的混合物在4％变性的脲-PAGE上分离。凝胶上的RNA用SYBR-绿(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))染色，并用透照仪(透照器公司(Transilluminators))可视化。切下环状RNA的相应RNA带，并用破胶剂管(伊斯特工程公司(Ist Engineering))破碎。为了洗脱环状RNA，将具有环状RNA的破碎凝胶与洗脱缓冲液(0.5M乙酸钠，1mM EDTA，0.1％SDS)在37℃孵育一小时，并小心收集上清液。将剩余的破碎凝胶进行另一轮洗脱，并重复总共三次。将具有环状RNA的洗脱缓冲液通过0.45μm乙酸纤维素过滤器过滤，以除去凝胶碎片，并通过乙醇沉淀纯化/浓缩环状RNA。
炔烃官能化的酞胺哌啶酮和/或JQ1(噻吩并三唑并二氮环庚三烯，吉娜生物科学公司)根据制造商的说明书(吉娜生物科学公司)，用点击化学反应试剂盒，通过铜催化的叠氮化物-炔烃点击化学反应(CuAAC)与叠氮化物官能化的环状RNA缀合。为了进行比较，将三种不同类型的小分子与环状RNA缀合；具有JQ1和酞胺哌啶酮两者的RNA、仅具有酞胺哌啶酮的RNA或仅具有JQ1的RNA。用RNA纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司)纯化与小分子缀合的环状RNA。
然后，根据制造商的说明，使用脂质转染试剂(英杰公司)将这些不同的RNA转染到HEK293T细胞中，以监测靶蛋白的降解。将1皮摩尔的每个RNA用于转染HEK293T细胞，并将细胞接种到12孔板中(最终2nM)。在与JQ1和酞胺哌啶酮两者缀合的环状RNA情况下，将3皮摩尔RNA转染到HEK293T细胞中，以测试不同浓度的环状RNA对BRD4降解的影响(最终6nM)。作为阳性对照，使用PROTAC dBET1(托克瑞斯生物科学公司(Tocris Biosciences))(2uM，10uM浓度)，其具有JQ1和酞胺哌啶酮两者，并且已知通过CRBN募集降解细胞中的BRD4蛋白。对于阴性对照，使用仅载剂和没有缀合的环状RNA。转染24小时后，通过将RIPA缓冲液直接添加到板上来收获细胞。
使用蛋白印迹分析了小分子缀合的环状RNA与E3泛素连接酶CRBN和BET家族蛋白的结合降解能力。简而言之，将12ug蛋白在4％-12％梯度的Bis-Tris凝胶(赛默飞世尔科技公司)上分离，并使用印迹转移系统(赛默飞世尔科技公司)转移至硝酸纤维素膜上。兔抗BRD4抗体(阿坝卡穆公司)用于检测BRD4蛋白，并且兔抗α微管蛋白抗体(阿坝卡穆公司)用于检测作为上样对照的α微管蛋白。来自BRD4和α微管蛋白的蛋白条带的化学发光信号通过Fc成像系统(LI-COR)进行监测。
BRD4蛋白水平以及作为上样对照的α微管蛋白也使用光密度测定法使用ImageJ进行了测量。
如图21中所示，含有酞胺哌啶酮和JQ1小分子的环状RNA能够降解BRD4，如通过BRD4的标准化水平所证实。该结果证明了具有小分子的环状RNA使用小分子缀合物结合至两种特定蛋白以降解靶蛋白。
实例39：环状RNA结合比其线性对应物更长的小分子
该实例展示了环状RNA结合小分子以用于螯合/生物活性。如以下实例所示，环状RNA比其线性对应物更稳定。
线性曼戈RNA适体与小分子TO-1生物素染料结合时发出荧光。如下实例所示，环状曼戈RNA结合至噻唑橙衍生物TO-1生物素以用于螯合/生物活性。
环状RNA被设计为包括曼戈RNA小分子结合位点和稳定茎：5’-AATAGCCGGUCUACGGCC AUACCACCCU GAACGCGCCC GAUCUCGUCU GAUCUCGGAAGCUAAGCAGG GUCGGGCCUGGUUAGUACUU GGAUGGGAGA CCGCCUGGGAAUACCGGGUG CUGUAGGCGU CGACUUGCCA UGUGUAUGUGGGUACGAAGGAAGGAUUGGU AUGUGGUAUA UUCGUACCCA CAUACUCUGA UGAUCCUUCG GGAUCAUUCAUGGCAA CGGCTATT-3’(SEQ ID NO:18)，以及环化序列：5’-AATAGCCG-3’(SEQ ID NO:19)和5’-CGGCTATT-3’(SEQ ID NO:20)。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从包含曼戈RNA基序、茎和环化序列的DNA区段合成未修饰的线性RNA。转录的RNA用RNA纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，T2050)纯化，按照制造商的说明用RNA 5’-磷酸水解酶(RppH，新英格兰生物学实验室公司，M0356)处理，并再次用RNA纯化柱纯化。使用与环化序列互补的夹板DNA和T4 RNA连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，M0239)将RppH处理的RNA环化。环状RNA经过脲-PAGE纯化，在缓冲液(其含有0.5M乙酸钠，0.1％SDS，1mM EDTA)中洗脱，乙醇沉淀并重悬于无RNA酶的水中。RNA质量通过脲-PAGE或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
使用荧光显微镜在体外在HeLa细胞中评估环状RNA与TO-1生物素的结合。当TO-1生物素与RNA结合后，其荧光增强100倍以上。将线性或环状适体(50nM)添加到BJ成纤维细胞培养物的培养基，以及无RNA对照。添加转染试剂lipofectamine，以确保RNA都是。用TO-1生物素处理培养物，并在6h和第1-12天分析荧光。如图22中所示，检测到来自环状适体的增加的荧光/稳定性，其中在培养物中检测到荧光持续至少10天。
实例40：环状RNA结合蛋白和RNA
该实例展示了环状RNA结合至蛋白和RNA以进行螯合。
人抗原受体(HuR)可以是一种致病蛋白，例如已知其结合并稳定与癌症相关的mRNA转录物，例如原癌基因、细胞因子、生长因子和侵袭因子的mRNA。HuR通过实现多种癌症表型而具有中心性致瘤活性。用环状RNA螯合HuR可以减弱多种癌症的致瘤生长。
RNA在细胞代谢中起着中心作用，并且RNA分子经历多种转录后过程，例如剪接、编辑、修饰、翻译和降解。
如以下实例所示，环状RNA结合至HuR和RNA以进行螯合。
环状RNA被设计为包括HuR RNA结合基序：5’-UCAUAAUCAAUUUAUUAUUUUCUUUUAUUUUAUUCACAUAAUUUUGUUUUU-3’(SEQ ID NO:31)以竞争性结合HuR并抑制其结合/下游功能，和RNA结合基序：5’-CGA GAC GCT ACG GAC TTA AAA TCC GTT GAC-3’(SEQ ID NO:32)。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从包含HuR RNA基序和蛋白结合序列的DNA区段合成未修饰的线性RNA。
环状RNA被设计为包括HuR RNA结合适体基序：5’-UCAUAAUCAAUUUAUUAUUUUCUUUUAUUUUAUUCACAUAAUUUUGUUUUU-3’(SEQ ID NO:31)以竞争性结合HuR并抑制其结合/下游功能，和RNA结合适体基序：5’-CGA GAC GCT ACG GAC TTA AAA TCC GTT GAC-3’(SEQ ID NO:32)。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从包含HuR RNA基序和蛋白结合序列的DNA区段合成未修饰的线性RNA。
转录的RNA用RNA纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，T2050)纯化，按照制造商的说明用RNA 5’-磷酸水解酶(RppH，新英格兰生物学实验室公司，M0356)处理，并再次用RNA纯化柱纯化。使用与环化序列互补的夹板DNA和T4 RNA连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，M0239)将RppH处理的RNA环化。环状RNA经过脲-PAGE纯化，在缓冲液(其含有0.5M乙酸钠，0.1％SDS，1mM EDTA)中洗脱，乙醇沉淀并重悬于无RNA酶的水中。RNA质量通过脲-PAGE或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
通过组合HuR免疫沉淀(IP)和生物素RNA拉下测定，然后进行qPCR，体外评估了环状RNA与HuR和RNA的结合。将偶联至蛋白G-抗HuR抗体的HuR蛋白与环状RNA孵育，洗涤并在低pH下洗脱。将结合的材料与生物素化的RNA孵育，洗涤，并用链霉亲和素免疫磁珠拉下。
HuR结合具有HuR RNA结合适体基序的环状RNA，并且链霉亲和素拉下产生了具有如图23中所示的RNA结合适体基序的RNA。因此，当存在这两个HuR和RNA结合基序时，观察到结合。该结果证明了目的生物分子被选择性地结合。
实例41：环状RNA结合蛋白和DNA
该实例展示了环状RNA结合至蛋白和DNA以进行螯合。
DNA与蛋白和RNA的结合在不同的细胞过程(即转录)中起着关键作用。
人抗原受体(HuR)在mRNA命运中起着中心作用，并在转录后调控具有中心细胞功能的mRNA靶中发挥关键作用，这使其成为发病机理中的重要蛋白。已知其结合并稳定癌症相关的mRNA转录物，因此，HuR通过实现多种癌症表型而具有中心性致瘤活性。
通过环状RNA靶向并与这些接触竞争，可用于调节这些相互作用并控制疾病和非疾病过程的结果。
环状RNA被设计为包括DNA结合适体基序：5’-CGA GAC GCT ACG GAC TTA AAA TCCGTT GAC-3’(SEQ ID NO:32)RNA。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从DNA区段合成未修饰的线性RNA。转录的RNA用RNA纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，T2050)纯化，按照制造商的说明用RNA 5’-磷酸水解酶(RppH，新英格兰生物学实验室公司，M0356)处理，并再次用RNA纯化柱纯化。使用与环化序列互补的夹板DNA和T4 RNA连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，M0239)将RppH处理的RNA环化。环状RNA经过脲-PAGE纯化，在缓冲液(其含有0.5M乙酸钠，0.1％SDS，1mMEDTA)中洗脱，乙醇沉淀并重悬于无RNA酶的水中。通过尿素-PAGE评估RNA质量。
通过组合HuR免疫沉淀(IP)和生物素化的DNA拉下测定，然后进行RT-qPCR，体外评估了环状RNA与DNA和HuR的结合。缺少DNA结合基序或HuR基序的环状RNA被用作特异性对照。生物素化的DNA结合具有DNA结合适体基序的环状RNA。
将偶联至蛋白G-抗HuR珠的HuR蛋白与环状RNA孵育，洗涤并在低pH下洗脱。将结合的材料与生物素化的DNA孵育，洗涤，并用链霉亲和素免疫磁珠拉下。HuR结合具有HuR DNA结合适体基序的环状DNA，并且链霉亲和素拉下产生了具有如图24中所示的RNA结合适体基序的RNA。因此，当存在这两个HuR和DNA结合适体基序时，观察到结合。该结果证明了目的蛋白和DNA分子选择性地结合至相同环状构建体。
实例42：环状RNA翻译蛋白，并结合至影响其翻译的不同蛋白
该实例展示了环状RNA编码蛋白并结合对环状RNA翻译有影响的不同蛋白。
人抗原受体(HuR)在mRNA命运中起着中心作用，并在转录后调控具有中心细胞功能的mRNA靶中发挥关键作用。因此，使用HuR控制RNA表达可以提供对翻译的蛋白剂量的控制。
如以下实例所示，非天然存在的环状RNA被工程化以编码高斯萤光素酶(GaussiaLuciferase，GLuc)(一种生物学活性的分泌型蛋白)并结合HuR以调控GLuc翻译。该环状RNA包括IRES、编码高斯萤光素酶的ORF，两个侧接IRES-ORF的间隔子元件和1X、2X或3X HuR结合适体基序：5’-UCA UAA UCA AUU UAU UAU UUU CUU UUA UUU UAU UCA CAU AAU UUU GUUUUU-3’(SEQ ID NO:33)、5’-AUU UUG UUU UUA ACA UUUC-3’(SEQ ID NO:34)、5’-UCA UAAUCA AUU UAU UAU UUU CUU UUA UUU UAU UCA CAU AAU UUU GUU UUU AUU UUG UUU UUAACA UUU C-3’(SEQ ID NO:35)以结合HuR。
使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从包含HuR RNA基序和蛋白结合序列的DNA区段合成未修饰的线性RNA。
转录的RNA用RNA纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，T2050)纯化，按照制造商的说明用RNA 5’-磷酸水解酶(RppH，新英格兰生物学实验室公司，M0356)处理，并再次用RNA纯化柱纯化。使用与环化序列互补的夹板DNA和T4 RNA连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，M0239)将RppH处理的RNA环化。环状RNA经过脲-PAGE纯化，在缓冲液(其含有0.5M乙酸钠，0.1％SDS，1mM EDTA)中洗脱，乙醇沉淀并重悬于无RNA酶的水中。RNA质量通过脲-PAGE或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
通过如前所述的体外RNA拉下测定来确定环状RNA与HuR的结合。
为了评估HuR结合的作用及其对细胞中环状RNA蛋白表达的影响，成功地将5x 103个HeLa细胞用基于脂质的转染试剂(英杰公司)和2nM环状RNA进行了反向转染。使用高斯萤光素酶测定试剂盒并按照制造商的说明，在细胞培养上清液中每天监测高斯萤光素酶活性长达96小时，作为表达的量度。
图25显示具有HuR结合适体位点的环状RNA的较低分泌型蛋白表达。甚至，GLuc表达水平随着环状RNA中HuR结合适体基序的数量而改变。该实例证明了来自工程化的环状RNA的翻译水平受另外蛋白结合适体的影响。
虽然已经示出和在本文描述了本披露的优选实施例，对本领域技术人员将是显而易见的是，仅通过举例的方式来提供这样的实施例。在不脱离本披露内容的情况下，本领域技术人员现在将清楚许多变型、改变和替代。应当理解，在实践本披露中可以采用本文描述的实施例的各种替代方案。所附权利要求旨在限定本披露内容的范围，并且由此覆盖这些权利要求及其等同物的范围内的方法和结构。

Claims (37)

1.一种在细胞中结合靶的方法，所述方法包括：
提供不能翻译的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含适体序列，其中所述适体序列具有结合所述靶的二级结构；并且
将所述不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至所述细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸与所述靶形成在递送后至少5天是可检测的复合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述靶选自由以下组成的组：核酸分子、小分子、蛋白、碳水化合物和脂质。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述靶是基因调控蛋白。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述基因调控蛋白是转录因子。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述核酸分子是DNA分子或RNA分子。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述复合物调节基因表达。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述复合物调节DNA分子的定向转录、DNA分子的表观遗传重塑或DNA分子的降解。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述复合物调节所述靶的降解、所述靶的易位或靶信号转导。
9.如权利要求6所述的方法，其中所述基因表达与疾病或病症的发病机理有关。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述复合物在递送后至少7、8、9或10天是可检测的。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸在递送后至少五天存在。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸在递送后至少6、7、8、9或10天存在。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸是未修饰的不能翻译的环状多核糖核苷酸。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸具有准双链二级结构。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述适体序列进一步具有结合所述靶的三级结构。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是真核细胞。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述真核细胞是人细胞。
18.一种在细胞中结合转录因子的方法，所述方法包括：
提供不能翻译的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含结合所述转录因子的适体序列；并且
将所述不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至所述细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸与所述转录因子形成复合物并调节基因表达。
19.一种在细胞中螯合转录因子的方法，所述方法包括：
提供不能翻译的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含结合所述转录因子的适体序列；并且
将所述不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至所述细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸通过结合所述转录因子而螯合所述转录因子以在所述细胞中形成复合物。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述复合物形成后细胞活率降低。
21.一种使细胞对细胞毒性剂敏感的方法，所述方法包括：
提供不能翻译的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含结合转录因子的适体序列；并且
将所述细胞毒性剂和所述不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至所述细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸在所述细胞中与所述转录因子形成复合物；
从而使所述细胞与缺少所述不能翻译的环状多核糖核苷酸的细胞相比对所述细胞毒性剂敏感。
22.如权利要求21所述的方法，其中使所述细胞对所述细胞毒性剂敏感导致在递送所述细胞毒性剂和所述不能翻译的环状多核糖核苷酸后细胞活率降低。
23.如权利要求22所述的方法，其中在递送所述细胞毒性剂和所述不能翻译的环状多核糖核苷酸后至少两天，降低的细胞活率是降低40％或更多。
24.一种在细胞中结合致病蛋白的方法，所述方法包括：
提供不能翻译的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含结合所述致病蛋白的适体序列；并且
将所述不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至所述细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸与所述致病蛋白形成复合物以降解所述致病蛋白。
25.一种在细胞中结合核糖核酸分子的方法，所述方法包括：
提供不能翻译的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含与所述核糖核酸分子的序列互补的序列；并且
将所述不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至所述细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸与所述核糖核酸分子形成复合物。
26.一种在细胞中结合基因组脱氧核糖核酸分子的方法，所述方法包括：
提供不能翻译的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含结合所述基因组脱氧核糖核酸分子的适体序列；并且
将所述不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至所述细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸与所述基因组脱氧核糖核酸分子形成复合物并调节基因表达。
27.一种在细胞中结合小分子的方法，所述方法包括：
提供不能翻译的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含结合所述小分子的适体序列；并且
将所述不能翻译的环状多核糖核苷酸递送至所述细胞，其中所述不能翻译的环状多核糖核苷酸与所述小分子形成复合物并调节细胞过程。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述小分子是分子量不超过900道尔顿并且调节细胞过程的有机化合物。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述小分子是药物。
30.如权利要求27所述的方法，其中所述小分子是荧光团。
31.如权利要求27所述的方法，其中所述小分子是代谢物。
32.一种组合物，所述组合物包含不能翻译的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含适体序列，其中所述适体序列具有结合靶的二级结构。
33.一种药物组合物，所述药物组合物包含：不能翻译的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含适体序列，其中所述适体序列具有结合所述靶的二级结构；和药学上可接受的载剂或赋形剂。
34.一种细胞，所述细胞包含如权利要求32所述的不能翻译的环状多核糖核苷酸。
35.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括施用如权利要求32所述的组合物或如权利要求33所述的药物组合物。
36.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如权利要求32所述的不能翻译的环状多核糖核苷酸。
37.一种产生如权利要求32所述的不能翻译的环状多核糖核苷酸的方法。
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