KR20220067468A - 세포질에서 자가 전사가 가능하고 발현억제 rna를 제공하는 rna/dna 시스템 - Google Patents

세포질에서 자가 전사가 가능하고 발현억제 rna를 제공하는 rna/dna 시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포 내에서 자가 전사가 가능한 발현억제 RNA를 포함하는 RNA/DNA 시스템에 관한 것이다. 상기 자가전사 RNA/DNA 시스템은 DNA 의존성 RNA polymerase(DdRp)를 발현시키기 위한 RNA 발현 카세트, 상기 DdRP에 의해 전사될 수 있는 발현억제 RNA를 코딩하는 DNA(DNAes) 발현 카세트 및 자가 전사가 가능한 auto-DdRp 발현 카세트를 포함한다. 따라서, 본 발명은 발현억제 RNA를 표적 유기체에서 효율적이고 안전하게 생산하는데 적합한 자가 복제 시스템으로 시험관내 및 생체내에서 발현억제 RNA 생산 방법을 제공한다. 본 발명은 자가전사 RNA/DNA 시스템을 코딩하는 DNA, 및 본 발명의 RNA/DNA 시스템을 포함하는 세포 또는 개체를 제공한다.

Description

세포질에서 자가 전사가 가능하고 발현억제 RNA를 제공하는 RNA/DNA 시스템{Self-transcribing RNA/DNA system that provides expression-repressing RNA in the cytoplasm}
본 발명은 세포 내 적어도 하나의 내인성 발현억제를 하고 전사가 가능한 발현억제 RNA를 제공하는 RNA/DNA 시스템으로서, 상기 시스템은 세포내 번역 가능한 구조 및 화학적 변형된 뉴클레오타이드(CM)를 포함하는 DNA 의존성 RNA Polymerase(DdRp) mRNA(캡된 CM_DdRp mRNA)를 포함하는 DdRp RNA 발현 카세트; 및 상기 DdRp에 의해 전사되는 발현억제 RNA를 코딩하는 DNA(DNAes) 발현 카세트;를 포함하는 자가전사 RNA/DNA 시스템 또는 상기 RNA/DNA 시스템에 추가적으로 상기 DdRp를 코딩하는 auto_DdRp 발현 카세트를 포함하는 자가전사 RNA/DNA 시스템으로 자가적으로 전사할 수 있는 DdRp의 발현으로 발현억제 RNA를 장기간 안정적으로 발현시키는 것을 특징으로 하는 자가전사 RNA/DNA 시스템에 관한 것이다.
핵산 기초 약물(nucleic acid-based drugs)은 디옥시리보핵산, 리보핵산 또는 백본(backbone), 당 또는 염기가 화학적으로 변형되거나 말단이 수식된 폴리뉴클레오타이드 유도체 등의 핵산, 예를 들어 mRNA, DNA, RNA-guided genome editing system, siRNA(short interfering RNA), 압타머(aptamer), 안티센스 ODN(antisense oligodeoxynucleotide), 안티센스 RNA(antisense RNA), 리보자임(ribozyme) 및 디엔에이자임(DNAzyme) 등의 핵산, 즉 음이온성 약물로서 등 매우 다양한 물질이다.
이러한 약물은 소분자 및 단백질을 표적으로 하여 난치성 질환을 치료할 수 있는 완전히 새로운 길을 제공하고 있다. 그러나 이 개념을 임상적 현실로 실행하는 것은 결코 쉬운 일이 아니다. ASO와 siRNA는 수십 년 동안 임상 개발하고 있다. 분자를 더 강력하고 덜 면역원으로 만들기 위해 새로운 의약 화학이 필요하며, 약물을 표적 조직의 표적 세포로 전달하는 장애가 있다. mRNA(messenger RNA)는 단백질을 합성하기 전 단계의 물질로서, 유전정보를 갖고있다. mRNA는 다양한 치료제로의 접근이 가능하여 예방용 또는 치료용 백신으로 활용 가능하며, 결여된 단백질도 mRNA를 통해 합성이 가능하다. 최근에 수년간의 느린 발전 끝에 이 분야는 활기를 띠고 있다.
RNA 표적 치료제의 특징은 일단 전달이 최적화되면 새로운 표적에 대한 리드(lead) 화합물을 설계하고 생산하는 것이 비교적 간단하고 생체 내 약동학이 예측 가능하다는 것이다. 즉, 표적 결정에서 동물 모델의 전임상 개념 증명, 임상 시험에서 테스트할 리드 화합물 준비까지 약물 개발은 일반적으로 몇 년이 필요하나, RNA 표적 치료제는 6개월(일부는 추정도 할 수 있음)이면 충분하다. 이러한 핵산 기초 약물에서도 특히, RNA 간섭 유도(RNAi)를 이용하는 유전자 제어 기술은 기존의 유전자를 이용한 다양한 질병 치료 방법들과 비교하여 그 위험성이 낮고 성공률과 효율성이 월등히 높다. 이러한 이유로 RNAi 기작은 각종 암들 및 바이러스성 질환에 대한 유전자 치료제로 각광을 받고 있다. 안티센스 올리고 뉴클레오타이드 (ASO), 압타머, siRNA, miRNA 및 더 최근에는 합성 mRNA를 사용하여 질병을 치료하는 방법으로 질병 관련 유전자의 발현을 제어하는 RNA 표적 치료제의 개념은 매혹적인 것이다. 그러나 세포 안으로 이러한 RNA 또는 mRNA 하나 또는 그 이상을 형질주입하는 것은 오늘날에도 여전히 주요한 도전이다.
RNA는 안정성이 낮아 생체 내에서 혈장에 대량으로 존재하는 다양한 분해 효소에 의해 단시간에 분해되며, 특히 주사에 의한 치료제의 경우, 화학적으로 안정하게 처리되지 않을 경우 더 빨리 파괴되는 문제가 있다. 또한 일반적으로, 살아있는 세포의 세포막은 음전하를 띠는 인지질로 구성되어, RNA와 같은 핵산 분자는 그것의 내재적 음이온성으로 인해 투과하기가 어렵다. 결과적으로 RNA의 세포 내 전달 효율이 낮아 이를 이용한 유전자 치료의 효과가 급격히 떨어지게 된다. 따라서, RNA의 체내 안정성(serum stability)을 향상시키는 동시에 핵산의 음이온성 특성을 보완하여 세포 내로 효과적으로 전달시키기 위해 다양한 방법들이 개발되어왔다.
개개의 세포 안으로 핵산 또는 유전자의 이동을 성공적으로 수행하기 위하여, 많은 장애물을 넘어야만 한다. 핵산의 수송(transport)은 전형적으로 세포막(cell membrane)과 핵산의 회합(association)후, 엔도좀(endosomes)에 의한 흡수(uptake)를 통해서 일어난다. 엔도좀내에서, 도입된(introduced) 핵산은 엔도좀으로부터 분리된다. 세포질에서 발현(expression)이 일어날 때, 이러한 핵산은 엔도좀을 이탈해야 한다. 만약 핵산이 엔도좀 이탈(endosomal escape)을 제대로 하지 못하면, 엔도좀이 내용물의 분해를 야기하는 라이소좀(lysosome)과 융합되거나, 세포밖으로 내용물을 보내기 위해 세포막과 엔도좀이 융합된다. 핵산의 효과적인 이동을 위하여 엔도좀의 탈출은 형질주입의 능률에 감소시키는 가장 중요한 단계중의 하나로 여겨진다.
바이러스 RNA 벡터는 증식에 능숙한 바이러스 입자를 형성함으로써 처리된 개체에서 증식할 가능성이 있기 때문에 종종 불리한 것으로 간주되어 왔다. 이것은 치료받는 사람뿐만 아니라 일반인들에 대한 건강상의 위험과 관련될 수 있다. 또한, DNA 벡터의 도입에 기초한 비바이러스성 자가 복제 시스템을 숙주세포에 도입하는 것이 개발되었다. 안전 문제로 의료 및 수의과 공동체는 DNA 벡터 또는 자가 복제 바이러스 핵산을 인간이나 동물에게 투여하는 것을 꺼리고 있다. 이에 더하여, 핵산, 특히 RNA의 전달을 위한 많은 종래 기술 접근법은 불만족스러운 수준의 목적 유전자 발현과 관련이 있다. RNA의 광범위한 적용은 목적 유전자의 충분한 발현이 중요하며 이를 충족할 수 있는 개선된 전달체의 필요성에 의해 제한되고 있다.
최근 연구 방향은 비바이러스성 전달체를 이용하여 그 단점을 개선하는 방향으로 진행되고 있다. 비바이러스성 전달체는, 바이러스성 전달체에 비하여 효율성에서 뒤떨어지지만, 생체 내 안전성의 측면에서 부작용이 적고, 경제성 측면에서 생산 가격이 저렴하다는 장점을 가지고 있다.
개체의 세포 내로 RNA 및 DNA를 혼재한 RNA/DNA 시스템을 효과적으로 전달하는 것은 따라서 여전히 이종 핵산에 의해 세포 내로 도입된 단백질의 효과적인 발현에 장애물(bottleneck)로 나타난다. 핵산-기반 약제(medicament)의 치료 효과는, 특히 유전자 치료의 분야에서 치료 핵산 분자에 코딩된 유전자 생산물의 효과적인 발현에 대체적으로 의존한다.
기존의 RNA 표적 치료제 합성 지속성을 향상시키려는 노력들은 다양한 전달체를 이용하여 RNA의 탑재 효율을 증가시킴으로써 되도록 많은 양의 RNA를 전달하려는 시도들로 나타났다. 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴, 양이온성 인지질 나노입자, 양이온성 고분자, 또는 리포좀에 기반한 전달체가 주로 사용되었으나, 양이온성 분자 또는 합성 고분자를 이용한 전달체의 경우 세포 내로의 수송 효율이 낮으며 세포 내로의 유전자 전달과정에서 유발될 수 있는 세포 독성에 대한 문제가 지적되었다.
또한, RNA 표적 치료제 합성의 지속성이 오랫동안 나타날 수 있는 바이러스 벡터의 경우, 우수한 지속성에도 불구하고 바이러스 벡터의 표면 단백질의 면역원성으로 인한 면역 부작용을 일으켜 체내 안정성이 보장되지 못하는 문제가 지적되었다. 무엇보다 외래 유전자가 환자의 게놈(genome)에 삽입될 수 있는 위험성 문제로 인해 바이러스를 이용한 표적단백질 합성은 인체적용에 제한을 가질 수 밖에 없었다.
일반적으로 원핵생물과 진행생물은 발현 카세트에 사용하는 프로모터를 달리하고 있다. 본 발명의 자가전사 RNA/DNA 시스템에서 사용하는 발현 카세트는 원핵생물이나 진행생물 특히 포유동물, 식물 등에 공통적으로 T7 프로모터를 이용하여 제작할 수 있다.
한편, RNA 표적 치료제 합성 지속성을 향상시키기 위한 노력으로, 핵-의존적 프로모터에 기반한 RNA 발현이 가능한 발현 카세트 DNA 개발이 알려져 있다. 주로 U6 소핵(Small nuclear) RNA, H1 RNA 유전자로부터 유래한 RNA 폴리머라제 Ⅲ(Pol Ⅲ) 프로모터가 가장 많이 활용되고 있으며, 이러한 핵-의존적 프로모터를 이용한 핵에서의 RNA 발현은 효과적으로 핵에서 RNA를 장기간 생산할 수 있는 방법을 제공하고 있다. 그러나, 세포막 투과에 비해 그 효율이 1%에 머무른다고 알려진 핵막 투과에 의존하는 이러한 plasmid DNA 방법은 그 표적단백질 합성 효율이 매우 낮다. 특히 plasmid DNA의 전달효율이 현저히 떨어지는 in vivo 응용에서는 낮은 효율성으로 인하여 적용이 제한을 받고 있다. 또한, 핵에서 발현된 고농도의 RNA의 경우, 세포질로 분출되어야만 표적 단백질 합성에 참여할 수 있는 성숙된 RNA로 변환이 가능하나, 이러한 세포질로의 분출에 관여하는 엑스포틴(exportin)-5 운반체가 고농도의 RNA에 의하여 포화(saturation)되는 문제를 발생시켜서 다른 세포내 기능에 관여하는 RNA의 세포질 분출까지도 방해하는 문제점을 일으키며, 이러한 RNA의 세포질 분출 이상은 심각한 독성문제로 이어진다. 그 밖에 현재 다양한 발현 카세트 DNA를 이용한 핵-의존적 RNA 발현방법이 알려져 있으나, in vivo 모델에서는 아직까지 짧은 지속성이라는 한계점을 여전히 가지고 있다.
본 발명자들은 자가적으로 전사할 수 있는 DdRp의 합성을 안정적으로 유지할 수 있는 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 안정화되고 세포내 번역 가능한 구조가 있는 DdRp RNA 발현 카세트; 및 발현억제 RNA를 코딩하는 DNA 발현 카세트를 포함하는 조성물 또는 상기 조성물에 추가적으로 DdRp각 결합하는 프로모터와 DdRp를 코딩하는 DNA를 포함하는 auto_DdRp 발현 카세트를 포함하는 조성물 및 이들을 포함하는 전달체가 DdRp에 의해 발현억제 RNA를 장기간 안정적으로 발현시킬 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 세포 내 적어도 하나의 내인성 단백질 합성을 하고 전사가 가능한 구성성분이 있는 시스템으로서, 상기 시스템은 세포내 번역 가능한 구조 및 화학적 변형된 뉴클레오타이드(CM)를 포함하는 DNA 의존성 RNA Polymerase(DdRp) mRNA(캡된 CM_DdRp mRNA)를 포함하는 DdRp RNA 발현 카세트; 및 상기 DdRp에 의해 증폭되는 목표 발현억제 RNA를 코딩하는 DNA를 포함하는 DNAes 발현 카세트를 포함하는 자가전사 RNA/DNA 시스템 또는 상기 RNA/DNA 시스템에 추가적으로 상기 DdRp를 코딩하는 DNA를 포함하는 auto_DdRp 발현 카세트를 포함하는 RNA/DNA 시스템으로 자가적으로 전사할 수 있는 DdRp의 발현을 증가시켜 발현억제 RNA를 장기간 안정적으로 발현시키는 것을 특징으로 하는 RNA/DNA 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 세포 또는 조직 내로 도입되는 자가전사 RNA/DNA 시스템을 제공하며, 세포질내에 있는 단백질 합성기구로 DdRp RNA 발현 카세트를 주형으로 합성되는 DdRp는 auto_DdRp 발현 카세트에 코딩된 DdRP 및 DNAes 발현 카세트에 코딩된 발현억제 RNA를 안정적으로 전사시켜 목적 유전적 정보의 발현을 억제시키는 것이다.
추가적으로, 본 발명은 본 발명의 auto_DdRp 발현 카세트의 산물인 DdRp에 의해 생성되는 전시체의 안정성 및 번역의 효율을 위해 전사체의 5'말단에 5'Cap 구조를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 발현억제 RNA 전략으로는 예를 들어 전염병 및 암 질환의 예방 및 치료를 위한 유망한 선택들이 있다. 병원균 및 종양 관련 분자의 수가 증가함에 따라 발현억제 RNA에 적합한 표적을 광범위하게 수집할 수 있다.
본 발명은 일반적으로 질환의 예방 및 치료를 위해서, 세포내에서 생물학적 활성이 있는 목적 발현억제 RNA를 효율적으로 생산하는 발현억제 RNA에 적합한 제제 및 방법을 포함한다.
특히, 본 발명의 목적은 유전자 치료 접종 및 개체에 투여되는 DNAes 발현 카세트의 발현억제 RNA 발현을 증가시키는 것이다.
본 발명의 근본적인 목적은 청구 대상에 의해 해결된다.
본 발명은 세포내 번역 가능한 구조 및 화학적 변형된 뉴클레오타이드(CM)를 포함하는 DNA 의존성 RNA Polymerase(DdRp) mRNA(캡된 CM_DdRp mRNA)를 포함하는 DdRp RNA 발현 카세트; 및 상기 DdRp에 의해 전사되는 발현억제 RNA를 코딩하는 DNAes 발현 카세트;를 포함하는 자가전사 RNA/DNA 시스템 또는 상기 RNA/DNA 시스템에 추가적으로 상기 DdRp를 코딩하는 auto_DdRp 발현 카세트를 포함하는 자가전사 RNA/DNA 시스템으로 DdRp RNA 발현 카세트는 세포질 내에서 DdRp의 발현을 증가시켜 auto_DdRp 발현 카세트 및 DNAes 발현 카세트를 장기간 안정적으로 발현시키는 것을 특징으로 하는 자가전사 RNA/DNA 시스템, 이의 전달체, 및 상기 전달체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서 세포내 번역 가능한 구조는 5'Cap 구조 또는 ITES를 포함하는 5'UTR를 포함하며, 이들에만 국한하는 것을 아니다.
본 발명은 자가전사 RNA/DNA 시스템을 구성하는 DdRp mRNA 발현 카세트는 적어도 하나의 화학적 변형된 뉴클레오타이드(CM)를 포함하여 안정성이 향상되어 DdRp의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 적어도 하나의 DdRp의 발현을 증가시키는 적어도 하나의 염기서열 변형(SM)을 포함하는 DdRp mRNA 발현 카세트 또는 auto_DdRp DNA 발현 카세트를 제공한다.
본 발명의 RNA/DNA 시스템에서 상기 SM_DdRp를 포함하는 발현 카세트의 약학적 조성물 및 키트의 구성품을 제공하며, 바람직하게 유전자 치료 분야에서 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 자가전사 RNA/DNA 시스템은 DdRp mRNA 발현 카세트에서 합성되는 DdRp에 의해 DNAes 발현 카세트에 내포된 유전정보의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 목적은 자가전사 RNA/DNA 시스템의 제공에 의해 해결되며, DdRp mRNA 발현 카세트과 auto-DdRp 발현 카세트에서 합성되는 DdRp에 의해 여기서 표적 조직 또는 표적 세포에서 자가전사 RNA/DNA 시스템에 의해 운반되는 유전정보의 발현은 추가적으로 증가된다.
명확성 및 가독성을 위해 다음의 정의가 제공된다. 이들 정의에 대해 언급된 임의의 기술적 특징은 본 발명의 각각 및 모두에서 이해될 수 있다. 이들에서 추가의 정의 및 설명이 특히 제공될 수 있다. 본 발명에서 핵산 서열이 보고된 곳에서, 이들 서열은 일반적으로 특정 RNA 또는 DNA 서열뿐만 아니라 이의 상응하는 DNA 또는 RNA 대응물(counterpart) 각각 모두를 포함한다. 예를 들어, DNA 서열이 제공된 곳에서, 통상의 기술자는 상응하는 RNA 서열은 우라실 잔기에 의한 티민 교환에 의해 수득되고 반대로도 같은 것을 알고 있다.
세포: 세포는 유전체 편집에 적합한 임의의 유기체에서 기원하는 세포를 포함한다. 예시적인 유기체로는, 비-제한적으로, 인간, 마우스, 랫, 원숭이, 개, 돼지, 양, 소, 고양이와 같은 포유류; 닭, 오리, 거위와 같은 가금류; 벼, 옥수수, 밀, 수수, 보리, 대두, 땅콩, 아라비돕시스 등과 같은 외떡잎 식물 및 쌍떡잎 식물 등의 식물이 있다.
유전자 치료: 유전자 치료는 일반적으로 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 핵산에 의한 환자의 신체 또는 환자의 신체의 분리된 요소(element), 예를 들어 분리된 조직/세포의 치료를 의미한다. 이는 일반적으로 a) 핵산, 바람직하게는 본원에 정의된 바와 같은 RNA 및 DNA 분자를 - 어떤 투여 경로에 의해 - 직접 환자에게 또는 생체 내(in vivo)/생체 외(ex vivo) 또는 시험관 내(in vitro) 환자의 세포의 형질주입을 초래하는 시험관 내에서(in vitro) 환자의 분리된 세포/조직에 투여; b) 도입된 핵산 분자의 전사 및/또는 번역; 그리고 선택적으로) 핵산이 직접 환자에게 투여되지 않았다면, 환자에게 분리된, 형질주입된 세포의 재투여의 단계 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
발현 카세트(Expression Cassette): 발현 카세트는 재조합 벡터와 같이 유기체에서 대상 뉴클레오티드 서열을 발현시키기에 적합한 핵산절편, 플라스미드 및 바이러스 벡터 등을 의미한다. 발현은 기능성 산물의 생성을 의미한다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열의 발현은 뉴클레오티드 서열의 전사 (예, 전사하여 mRNA 또는 기능성 RNA를 생성함) 및/또는 RNA를 단백질 전구체 또는 성숙한 단백질로 번역하는 것을 의미할 수 있다. 발현 카세트는 선형의 핵산 단편, 환형의 plasmid, 바이러스 벡터 또는 번역될 수 있는 RNA (예, mRNA)일 수 있다. 발현 카세트는 서로 다른 소스로부터 유래될 수 있는 대상 뉴클레오티드 서열 및 조절 서열, 또는 동일한 소스로부터 유래되지만 통상 천연적으로 발견되는 방식과는 다른 방식으로 정렬된 대상 뉴클레오티드 서열 및 조절 서열을 포함할 수 있다.
상류: 핵산 분자의 제2 요소에 대한 핵산 분자의 제1 요소의 상대적인 위치를 나타내며, 여기서 두 핵산 분자는 동일한 핵산 분자에 포함되며, 제1 요소는 핵산 분자의 제2 요소보다 5' 말단에 위치한다. 그 후 제2 요소는 해당 핵산 분자의 제1 요소의 "하류"인 것으로 지칭한다. 제2 요소의 "상류"에 위치한 요소는 해당 제2 요소의 "5'"에 있는 것과 동의어라고 할 수 있다. 이중가닥 핵산 분자의 경우, "상류" 및 "하류"와 같은 표시는 (+) 가닥에 대해 부여된다.
조절 서열 또는 조절 인자: 상호 호환적으로 사용되며, 조합된 코딩 서열의 전사, RNA 가공 또는 안정성 또는 번역에 영향을 미치는, 코딩 서열의 상류(5'UTR), 내부 또는 하류(3'UTR)에 위치하는, 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 서열은, 비-제한적으로, 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론 및 폴리아데닐화 인지 서열을 포함할 수 있다.
프로모터: 다른 핵산 단편의 전사를 통제할 수 있는 핵산 단편을 지칭한다. 본 발명에서, 프로모터는 세포로부터 유래되거나 또는 유래되지 않던 간에 세포에서 유전자의 전사를 통제할 수 있는 프로모터이다. 프로모터는 구성적인 프로모터 (constitutive promoter) 또는 조직-특이적인 프로모터 또는 발생-조절성 프로모터 (developmentally-regulated promoter) 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 코어 프로모터는 프로모터에 포함되는 핵산 서열을 의미한다. 코어 프로모터는 전형적으로 전사를 적절히 개시하는데 필요한 프로모터의 최소 부분이다. 코어 프로모터는 전형적으로 전사 개시 부위 및 RNA 중합효소에 대한 결합 부위를 포함한다.
중합효소: 일반적으로 단량체 빌딩 블록으로부터 중합체 분자의 합성을 촉매할 수 있는 분자 실체를 지칭한다. "RNA 중합효소"는 리보뉴클레오타이드 빌딩 블록으로부터 RNA 분자의 합성을 촉매할 수 있는 분자 실체이다. "DNA 중합효소"는 데옥시리보뉴클레오타이드 빌딩 블록으로부터 DNA 분자의 합성을 촉매할 수 있는 분자 실체이다. DNA 중합효소 및 RNA 중합효소의 경우, 분자 실체는 전형적으로 단백질 또는 복수의 단백질의 집합체 또는 복합체이다. 전형적으로, DNA 중합효소는 전형적으로 DNA 분자인 주형 핵산을 기반으로 DNA 분자를 합성한다. 전형적으로, RNA 중합효소는 주형 핵산을 기반으로 RNA 분자를 합성하고, 주형 핵산은 DNA 분자(RNA 중합효소가 DNA 의존성 RNA 중합효소, DdRP인 경우)이거나 RNA 분자이다(RNA 중합효소가 RNA 의존성 RNA 중합효소인 RdRp인 경우).
DNA 의존성 RNA Polymerase(DdRp): DdRp는 RNAP(RNA Polymerase, RNA 중합효소)의 동의어이고, 진핵생물의 핵에 있는 DdRp는 RNAP I, RNAP II 및 RNAP III이고 이들은 구조적으로 서로 매우 다르며 각각 다른 유전자 세트를 전사하다 (다른 중합효소는 미토콘드리아와 엽록체에 있다). 그러나 세 가지 모두 서로 관련된 두 개의 큰 서브유닛과 박테리아 RNAP의 가장 큰 두 개의 서브유닛을 가지고 있다. 또한, 이러한 세 가지 효소 모두에서 또는 RNAP I과 RNAP III 사이에서만 공통적으로 발견되는 여러 작은 서브유닛이 있다.
진핵 DdRp는 박테리아 RNAP와 마찬가지로 전사 개시에 필요한 특수 보조 인자가 필요하다. 그러나 박테리아의 경우와 달리 진핵 개시인자는 프로모터 요소를 중합효소 홀로엔자임의 일부가 아닌 독립적으로 인식한다. 특히 RNAP II에 의해 전사된 유전자에서 많은 다른 개시인자가 관련되며, 일부 개시인자는 그 자가로 매우 복잡한 단백질이다. 정제된 진핵 RNA 중합효소만으로는 프로모터에서 선택적으로 전사를 시작할 수 없다.
홀로엔자임은 때때로 진핵 RNAP를 지칭하는 데 사용되지만, 이 경우에는 박테리아 '핵심' 효소와 비슷한 것을 의미하며 프로모터에서 전사할 수 없다. 그러나 박테리아 핵심 효소와 달리 진핵 세포 전체 효소는 RNA의 전사 또는 처리와 관련된 많은 다른 단백질을 포함할 수 있다.
RNAP I는 nucleolus(인, 핵소체)에서 발견되며 대부분의 세포 RNA가 합성되는 큰 리보솜 RNA를 코딩하는 유전자만을 전사하다. 효모에서 효소는 13개의 서브유닛 (그리고 거의 600kDa의 질량)을 가지고 있다. 더 작은 서브유닛 중 5개는 효모 RNAP II 및 III에서도 발견되고 나머지 2개는 효모 RNAP III에서 발견된다.
RNAP II는 세포에 있는 대부분의 유전자인 단백질을 코딩하는 유전자를 전사하다. 또한 대부분의 작은 핵 RNA (snRNA)를 코딩하는 유전자를 전사하다. 대부분의 유기체는 12-subunit RNAP II (질량 약 550kDa)를 가지고 있는 것으로 보이다. 그러나 완전한 활성을 위해서는 몇 가지 다른 단백질이 필요하며 RNAP 홀로엔자임은 4000 kDa의 질량을 가질 수 있다.
RNAP III는 주로 transfer RNA 및 5S RNA를 코딩하는 유전자를 전사하지만 다른 작은 RNA를 코딩하는 일부 유전자도 전사하다. RNAP III에는 거의 700 kDa의 질량을 가진 14개 이상의 별개의 서브유닛이 있다. RNAP I 및 RNAP II에 대한 프로모터는 대부분 전사 시작 부위의 상류에 있지만 (원핵생물 프로모터의 경우처럼) RNAP III에 대한 일부 프로모터는 시작 부위의 하류에 있다.
이러한 효소에 의해 형성된 전체 신장 복합체는 박테리아 RNAP와 유사하다. 이러한 효소가 프로모터를 찾는 메커니즘은 박테리아가 사용하는 메커니즘과는 상당히 다르지만, 전사 개시의 전체 메커니즘은 매우 유사하다. 그러나 진핵 생물의 종결에 대해서는 잘 알려져 있지 않다.
DdRp는 박테리오파지 (박테리아 바이러스)의 단일 서브유닛 중합효소에서 진핵생물의 12-15개의 서브유닛 복합체에 이르기까지 서브유닛 복잡성 범위가 다양하다(표 1).
많은 파지가 더 작은 단일 서브유닛 RNA 폴리머라제를 코딩하는 파지 (예 : T7)의 경우처럼 숙주 세포의 폴리머라제와 자가적으로 코딩된 RNA 폴리머라제를 활용한다. 이러한 중합효소 중 일부는 현재 박테리아 세포에서 대량 생산이 비교적 쉽고, 프로모터 영역을 인식하기 위해 추가 단백질 보조인자가 필요하지 않으며, 박테리아 숙주 RNA 중합효소보다 최소 2배 빠른 속도로 전사체를 합성하기 때문에 생명공학의 주요 시약으로 사용된다. 다중 서브유닛 진핵생물의 핵 중합효소는 전사를 위한 템플릿의 적절한 위치를 찾기 위해 매우 많은 보조 단백질 인자를 필요로 하는 반면, 흥미롭게도 단일 서브유닛 박테리오파지 RNA 중합효소 자가는 올바른 유전자를 인식하고 정제된 DNA의 올바른 위치에서 시작할 수 있다,
박테리아 RNA 중합효소는 효소의 촉매 코어에 있는 3개의 비동일 단백질의 4개의 서브유닛을 포함하며, 이 핵심 복합체는 전사를 촉진하는 특정 서열을 인식하고 비 프로모터 부위에 대한 결합을 감소시키는 하나의 추가 보조인자 (시그마라고 함)를 필요로 한다. 박테리아의 각 종에는 여러 가지 시그마 인자가 있다.
DNA-의존성 RNA polymerase의 서브유닛
Source Number of subunits in core Sizes (kDa)
Bacteriophage T3, T7 & SP6 a 1 ～100
Bacteriophage N4 a,b 1 320
3 40, 30, 15
Eubacteria, for example,E. coli 4 150, 145, 45
Archaebacteria, for example,Sulfolobus acidocaldarius 13 122, 101, 44, 30, 27, 13.8, 12, 11.8, 10, 9.7, 9.7, 7.5, 5.5
Saccharomyces cerevisiae RNAP I 14 190, 135, 49, 43, 40, 34.5, 27, 23, 19, 14.5, 14, 12.2, 10, 10
Saccharomyces cerevisiae RNAP II 12 191, 140, 35, 25.4, 25, 19, 17.9, 16.5, 14.2, 13, 8.3, 7.7
Saccharomyces cerevisiae RNAP III 13-17 160, 128, 82, 53, 40, 37, 34, 31, 27, 25, 23, 19, 17, 14.5, 11, 10, 10
Human and yeast mitochondria 1 140
Spinach and mustard chloroplast c 1 110
4 154, 120, 78, 38
～13 141, 110, 36, 26, and others not yet fully characterized
Vaccinia virus 8 147, 132, 35, 30, 22, 19, 18, 7
Baculovirus a 4 98, 55, 53, 46
a, Virus uses the host RNA polymerase as well as its own encoded RNA polymerase for temporal regulation of transcription.
b, Virus encodes more than one RNA polymerase.
c, More than one RNA polymerase is used.
Bacillus subtilis 파지 SP01 및 E. coli phage T4와 같은 일부 박테리오파지의 게놈은 바이러스 DNA 주형의 전사를 위해 박테리아 RNA 중합효소 촉매 코어를 리디렉션하는 자가로 시그마 인자를 인코딩한다. 박테리아 효소의 촉매 코어는 이 모든 전사에 대해 동일하게 사용된다. 또한, 많은 박테리오파지는 프로모터 인식 후 전사 주기의 후속 단계를 수정하기 위해 다른 바이러스 코딩 및 숙주 코딩 조절 단백질을 활용하다.
박테리오파지 N4는 숙주 중합효소와 자가 게놈에 의해 코딩된 다른 두 중합효소를 모두 사용하다(표 1). 바이러스 중합효소 중 하나는 매우 큰 단일 서브유닛 효소로, 더 작은 단일서브유닛 박테리오파지 인코딩 중합효소와 달리 단일 가닥 DNA 결합 단백질인 숙주 보조인자 ssb가 필요하다. ssb 단백질은 이 320kDa 중합효소가 바이러스 DNA에서 특이한 헤어핀 구조를 인식하도록 한다. 이는 추가 바이러스 RNA의 합성을 허용하여 새로운 바이러스 입자의 복제 및 조립을 가능하게 한다.
원핵 바이러스와 마찬가지로 진핵 바이러스는 자신의 중합효소(예: 우두, 바큘로 바이러스)를 코딩하는 것부터 숙주 세포기구를 사용하는 것까지 전사 전략의 전체 스펙트럼을 사용하다. 여러 진핵 바이러스는 RNA 의존성 RNA 중합효소(RdRp)도 코딩하다 (예: C 형 간염 바이러스, 소아마비 바이러스). 바이러스로 코딩된 단백질 인자는 또한 전사주기의 여러 위치에서 숙주 세포의 전사를 조절하다.
진핵 DdRp는 핵과 세포 기관에서 발견될 수 있다. 미토콘드리아에서 발견되는 중합효소와 엽록체에서 발견되는 하나의 중합효소는 작은 단일 서브유닛 박테리오파지 RNA 중합효소와 유사하다. 엽록체에는 두 개의 다른 RNA 중합효소가 있으며, 그중 하나는 박테리아 효소와 매우 유사하다(표 1). 핵 RNA 중합효소는 생화학적으로 분리된 세 가지 별개의 복합체로 제공되며, 원래는 각각 전사하는 유전자의 종류에 따라 분류되었다. 최근에는 RNA 합성을 조절하기 위해 작용하는 서브유닛과 부속 단백질 인자에 의해 정의되었다. Termed RNA 중합효소 I, II 및 III (또는 각각 A, B 및 C)은 각각 12 개 이상의 서브유닛을 가지고 있다(표 1). RNA 중합효소 I은 리보솜의 서브유닛에 대한 구조적 RNA를 코딩하는 유전자를 전사하다. RNA 중합효소 II는 단백질과 작은 RNA의 하위 집합을 코딩하는 유전자를 전사하다. RNA 중합효소 III는 리보솜 5S RNA, tRNA 및 기타 작은 RNA의 하위 집합을 인코딩하는 유전자를 전사한다.
DdRp에 의한 전사: 박테리오파지 T3, T7 또는 SP6의 DNA-의존성 RNA 중합효소는 상대적으로 작은 (~ 100 kDa) 단일 서브유닛 RNA 중합효소의 계열로, 전사의 모든 단계, 즉 시작, 신장 또는 종료에 대한 추가 단백질 인자를 필요로 하지 않는다. 이러한 중합효소는 대장균에서 쉽게 과발현된다. 그들은 매우 활동적이며 덜 자주 종결되며 (E. coli RNA 중합효소와 비교하여) 자신의 프로모터에서 매우 엄격하게 전사를 한다. 이러한 특성은 이러한 중합효소를 다양한 실험 전략을 사용하여 시험관 내 RNA 합성에 매우 편리한 도구로 만들었다. 박테리오파지 T7 (T7 RNAP)의 RNA 중합효소는 아마도 가장 일반적으로 사용되며 상업적으로 이용 가능하지만 대량의 RNA 합성을 위해 사내에서 정제하는 것이 더 경제적이다.
<도 1>에서 제시하는 내용처럼, 일반적으로 박테리오파지 RNAP는 특정 서열에서 RNA 전사를 시작하고 종료하다(특정 효율로). 그러나 시험관 내 준비 RNA 생산을 위한 가장 간단한 실험 설정은 RNA 합성이 특정 T7 프로모터에서 시작되고 RNAP가 DNA 템플릿의 물리적 끝에서 떨어질 때 끝나는 소위 유출 전사가다. 이 설정은 화학적으로 합성될 수 있는 DNA 프로모터 및 템플릿 서열의 편리한 준비를 허용하다. 더욱이, DNA 주형이 완전 염기쌍일 필요는 없다는 것이 밝혀졌다. 대부분 또는 전체 코딩 가닥은 단일 가닥으로 유지될 수 있다. -15에서 -3까지의 위치에 걸친 최소 염기쌍 영역 (+1은 전사 잔기의 시작을 나타냄)은 T7 RNAP를 사용한 완전 효율적인 전사에 여전히 충분하다. 이것은 프로모터 인식 과정의 일부로서 전사 기포를 형성한다는 개념과 일치하다. 개방 프로모터가 있는 T7 RNAP의 결정 구조에서 주형 및 비 주형 가닥은 위치 -4에서 시작하여 하류에서 풀린다. 이 특성은 모든 RNA 서열의 전사를 위한 단일 범용 DNA 상단 가닥을 준비 할 수 있게하다. 매번 하단 코딩 DNA 가닥 만 재설계하면 된다.
<도 2>에서 제시하는 내용처럼, 천연 T7 RNAP 프로모터 서열은 위치 -17에서 위치 +6까지 강력하게 보존된다. 그럼에도 불구하고 RNA는 수율이 감소할 수 있지만 위치가 +1에서 +6으로 화학적 변형된 프로모터에서도 전사된다. 일반적으로 GG 또는 GA로 시작하는 RNA 서열에서 가장 효율적인 수율이 달성된다. 수율을 향상시키려면 전사 반응 조건을 각 RNA 서열에 최적화해야 한다. 여기에는 다양한 MgCl2 농도와 상대적인 양의 T7 RNAP, 주형 및 NTP가 포함된다. 올바른 RNA 단편과 여러 가지 더 짧은 중단 산물 외에도 시험관내 전사인 T7 RNAP는 종종 주 전사체의 3'- 말단에 비주형 뉴클레오티드를 통합하여 소위 'n+1 생성물'을 생성한다. 그런 다음 원하는 RNA 산물을 잘못된 크기의 전사체와 DNA 템플릿, 사용하지 않은 NTP 및 RNAP에서 분리해야 한다.
T7 RNAP을 사용하는 시험관내 전사를 통해 거의 모든 길이와 서열을 가진 RNA를 제조할 수 있다. 그러나 더 큰 RNA의 경우, 올리고 뉴클레오티드 길이를 가진 주형의 수율이 기하급수적으로 감소하기 때문에 화학적으로 합성된 DNA 주형을 사용하는 것이 실용성이 떨어진다. 50-100 nt보다 큰 템플릿의 경우 대체 방법은 선형화된 high-copy DNA plasmid(예: pUC18.31) 내에서 설계된 완전 이중 가닥 DNA 템플릿을 사용하는 것이다. 대형 RNA를 준비하는 또 다른 잠재적인 합병증은 RNA 변성이다. PAGE 정화중에 진행된다. RNA는 이러한 정제 후에 본래의 형태로 다시 접혀 져야하며, 때때로 문제가 될 수 있다.
DdRp 프로모터: 박테리오파지 T7, T3 및 SP6에 의해 코딩된 DdRp는 중합효소-프로모터 상호 작용 연구에 특히 적합하다. 각 파지 효소는 추가 단백질 인자가 없는 상태에서 전사 과정의 모든 단계를 수행할 수 있는 = 100kDa의 단일 종의 단백질로 구성된다. 박테리오파지 T7은 각각 단일 서브유닛 DdRp를 코딩하는 박테리아 바이러스 그룹의 원형이다. 이 클래스의 다른 구성원으로는 coliphages 콜리 파지 T3 및 BA14, Salmonella phage 살모넬라 파지 SP6, Pseudomonasphage 슈도모나스 파지 gh-1 및 Klebsiella phage 파지 K11 등이 있다. 파지 DdRp는 대규모 RNA 합성, 핵산 증폭을 포함한 다양한 응용 분야에서 유용하며 원핵 및 진핵 세포 모두에서 효율적인 발현시스템의 기초로 입증되었다.
<도 2>에서 제시하는 내용처럼 높은 수준의 구조적 유사성에도 불구하고 (아미노산 서열의 보존으로 판단할 때) 파지 DdRp는 자신의 프로모터 서열에 대해 정교하게 특이적으로 작용한다. 각각의 파지 프로모터는 -17에서 +6까지 확장되는 공통 23 개- 염기 쌍 컨센서스 서열과 관련이 있다. -7에서 +1까지 확장되는 핵심 뉴클레오티드 서열은 세 가지 프로모터 유형 전반에 걸쳐 매우 보존되어 있으며, 이는 이 영역이 중합효소의 공유된 특징과 공통적인 방식으로 상호 작용함을 의미한다. 프로모터 서열은 -8에서 -12까지 영역에서 크게 다르며, 이는 이 영역의 염기쌍이 특정 프로모터 인식에 중요하다는 것을 시사한다. 합성 파지 프로모터를 사용한 연구에 따르면 T3 및 T7 효소에 대한 프로모터 특이성의 주요 결정자는 위치 -10 및 -11의 염기 쌍을 포함한다. T7 프로모터 서열의 이 두 위치에서 T3 잔기의 치환은 T7 중합효소에 의한 인식을 방지하고 T3 RNA 중합효소에 의한 전사를 가능하게 한다. 이러한 결정 인자의 인식을 담당하는 T3 및 T7 RNA 중합효소의 도메인이 국소화되었으며, 예비 결정학적 데이터는 중합효소의 이 영역이 추정 DNA 결합 틈 내에 위치함을 의미한다.
키메라 효소: 키메라 효소는 자연에서 발견되는 천연 효소가 아닌 효소를 지칭한다. 따라서, 키메라 효소는, 자연에서 발견된 것과는 상이한 방식으로 배열된, 상이한 공급원(예: 상이한 효소)으로부터 유래된 촉매 도메인 또는 동일한 공급원(예: 동일한 효소)으로부터 유래된 촉매 도메인을 포함할 수 있다. 키메라 효소는 단량체성(즉, 단일 단위) 효소 뿐만 아니라 올리고머성(즉, 복수 단위) 효소, 특히 헤테로-올리고머성 효소를 포함한다. 단량체성 효소는 단지 하나의 폴리펩티드 쇄로 이루어진 단일-단위 효소와 관련된다.
핵산 분자: 핵산 분자는 바람직하게는 핵산 성분을 포함하는, 바람직하게는 이루어진 분자이다. 용어, 핵산 분자는 DNA 또는 RNA를 나타낸다. 이는 용어 "폴리뉴클레오타이드"와 동의어로 사용된다. 핵산 분자는 뉴클레오타이드 단량체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리머이며, 당/포스페이트-백본의 포스포디에스테르 결합에 의해 서로 공유 결합으로 연결되어 있다.
DNA: DNA는 데옥시리보핵산에 대한 일반적인 약자이다. 이는 핵산 분자, 즉, 뉴클레오타이드로 이루어진 폴리머이다. 이러한 뉴클레오타이드는 보통 - 그들 스스로에 의해 - 당 성분(sugar moiety), 염기 성분 및 포스페이트 성분으로 구성된 데옥시아데노신-모노포스페이트, 데옥시티미딘-모노포스페이트, 데옥시구아노신-모노포스페이트 및 데옥시사이티딘-모노포스페이트 단량체이며, 특유의 백본 구조에 의해 중합된다. 백본구조는, 일반적으로, 단량체에 근접한 첫 번째 뉴클레오타이드의 당 성분 즉, 데옥시리보오스와 두 번째 포스페이트 성분 사이의 포스포디에스테르 결합에 의해 형성된다. 단량체의 특정 순서, 즉, 당/포스페이트-백본에 연결된 염기의 순서는 DNA-서열이라고 한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥 형태(double stranded form)에서, 첫 번째 가닥의 뉴클레오타이드는 일반적으로 두 번째 가닥의 뉴클레오타이드와 예를 들어, A/T-염기쌍 및 G/C-염기쌍으로 혼성화(hybridize)된다.
RNA, mRNA: RNA는 리보핵산에 대한 일반적인 약자이다. 이는 핵산 분자 즉, 뉴클레오타이드로 이루어진 폴리머이다. 이들 뉴클레오타이드는 보통 소위 백본을 따라 서로 연결된 아데노신-모노포스페이트, 우리딘-모노포스페이트, 구아노신-모노포스페이트 및 사이티딘-모노포스페이드 단량체이다. 백본은 단량체에 근접한 첫 번째 당, 즉 리보오스, 및 두 번째 포스페이트 성분 사이에서 포스포디에스테르 결합에 의해 형성된다. 단량체의 특정 연쇄는 RNA-서열이라고 한다. 보통 RNA는 DNA-서열의 전사에 의해, 예를 들어, 세포 내부에서 수득 가능할 수 있다. 진행 세포에서, 전사는 일반적으로 핵 또는 미토콘드리아 내부에서 수행된다. 생체 내에서(In vivo), 보통 DNA의 전사는 보통 mRNA로 약칭하는 소위 전령-RNA로 가공되어야 하는 소위 미성숙 RNA(premature RNA)로 된다. 예를 들어, 진핵 유기체에서 미성숙 RNA의 가공은 스플라이싱(splicing), 5'-캡핑(capping), 아데닐산중합반응(polyadenylation), 핵 또는 미토콘드리아로부터 유출(export) 등의 다양한 상이한 전사 후-변형을 포함한다. 이들 가공의 합(sum)은 RNA의 성숙이라고 한다. 성숙 전령 RNA는 보통 특정 펩타이드 또는 단백질의 아미노산 서열로 번역될 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 일반적으로, 성숙 mRNA(mature mRNA)는 5'-캡(cap), 선택적으로 5'UTR, 오픈 리딩 프레임, 선택적으로 3'UTR 및 폴리(A) 서열을 포함한다. 전령 RNA 이외에, 여러 비-코딩 유형의 RNA가 존재하며, 이는 전사 및/또는 번역의 조절과 관련될 수 있다. 용어 "RNA"는 바이러스 RNA(viral RNA), 레트로바이러스 RNA(retroviral RNA) 및 RNA(replicon RNA)과 같은, 다른 코딩하는 RNA 분자를 또한 포함한다.
핵산 분자의 서열: 핵산 분자의 서열은 일반적으로 특정하고 개별적인 순서, 즉 이의 뉴클레오타이드의 연속인 것으로 이해된다. 단백질 또는 펩타이드의 서열은 일반적으로 순서, 즉, 이의 아미노산의 연쇄(succession)인 것으로 이해된다.
서열 상동성: 둘 이상의 서열은 만약 그들이 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 동일한 길이 및 순서를 나타낸다면 동일하다(상동성이 있다). 상동성의 백분율은 일반적으로 두 서열이 동일한 정도(extent)를 설명하며, 즉, 이는 일반적으로 그들의 서열 위치가 참조 서열(reference sequence)의 뉴클레오타이드와 상응하는 뉴클레오타이드의 백분율을 설명한다. 동일의 정도를 결정하기 위하여, 비교되는 서열은 동일한 길이, 즉, 비교될 서열의 가장 긴 서열의 길이를 나타내는 것으로 간주된다. 이는 8개 뉴클레오타이드로 이루어진 첫 번째 서열은 첫 번째 서열을 포함하는 10개 뉴클레오타이드로 이루어진 두 번째 서열과 80% 동일한 것을 의미한다. 다시 말하면, 본 발명에서, 서열의 동일은 바람직하게는 동일한 길이를 가지는 둘 이상의 서열에서 동일한 위치를 가지는 서열의 뉴클레오타이드의 백분율과 관련된다. 갭(gap)은 보통 정렬에서 이들의 실제 위치와 관계없이, 비-동일 위치로 간주된다.
안정화된 핵산 분자: 안정화된 핵산 분자는 변형 없는 핵산 분자보다, 예를 들어, 환경적 인자 또는 엑소- 또는 엔도뉴클레아제와 같은 효소 분해(digest)에 의한 붕괴(disintegration) 또는 분해(degradation)에 더 안정한, 그렇게 화학적 변형된 DNA 또는 RNA 분자이다. 본 발명에서, 안정화된 핵산 분자는 원핵 또는 진핵 세포, 인간 세포와 같은 포유동물 세포와 같은 세포에서 안정화된다. 안정화 효과는 또한 세포의 외부, 예를 들어, 버퍼 용액 등에서, 예를 들어, 안정화된 핵산 분자를 포함하는 약학적 조성물을 제조하는 공정에서 발휘될 수 있다.
이종 서열(Heterologous sequence): 일반적으로 두 서열은, 그들이 동일한 유전자로부터 이끌어낼 수 있는 것이 아니라면, '이종(heterologous)'으로 이해된다. 즉, 이종 서열은 동일한 유기체(organism)로부터 이끌어낼 수 있을 수 있지만, 그들은 동일한 mRNA에서와 같이, 동일한 핵산에서 자연적으로(자연에서) 발생하지 않는다.
유전자: 유전자는 하나 이상의 세포 생성물을 생산하고/하거나 하나 이상의 세포 간 또는 세포 내 기능을 달성하기 위한 특정 핵산 서열을 지칭한다. 보다 구체적으로, 상기 용어는 특정 단백질 또는 기능적 또는 구조적 RNA 분자를 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산 섹션(전형적으로 DNA이지만, RNA 바이러스의 경우에는 RNA이다)에 관한 것이다.
발현은 그의 가장 일반적인 의미로 사용되며, RNA의 생산 또는 RNA 및 단백질의 생산을 포함한다. 이것은 또한 핵산의 부분적 발현을 포함한다. 뿐만 아니라, 발현은 일시적이거나 안정한 것일 수 있다. RNA와 관련하여, "발현" 또는 "번역"이라는 용어는 세포의 리포좀 내에서 메신저 RNA의 한 가닥이 아미노산 서열의 어셈블리를 지시하여 펩티드 또는 단백질을 만드는 프로세스에 관한 것이다.
mRNA는 메신저-RNA를 의미하며 전형적으로 DNA 주형을 이용하여 생성되고 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 전사체에 관한 것이다. 전형적으로, mRNA는 5'-UTR, 단백질 코딩 영역, 3'-UTR, 및 폴리(A) 서열을 포함한다. mRNA는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있다. 시험관내 전사 방법론은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 것이다. 예를 들어, 시험관내 전사 키트가 시중에 다양하게 판매되고 있다. 본 발명에 따르면, mRNA는 변형 및 캡핑을 안정화시킴으로서 변형시킬 수도 있다.
발현억제 RNA: 특이적 유전자 조절과 관련된 유전자 발현 억제 현상으로 번역 또는 전사가 억제하는 RNA를 지칭하며 siRNA(short interfering RNA), miRNA(microRNA), shRNA(short hairpin RNA), hairpin RNA, artificial microRNA, intrinsic direct repeat, 3*?**?* UTR inverted repeat, artificial trans-acting siRNA, 안티센스 RNA(antisense RNA), 리보자임(ribozyme) 및 압타머(aptamer)을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 1종 이상이다.
단백질: 일반적으로 단백질은 하나 이상의 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 일반적으로 단백질은 생물학적 기능을 발휘하는 단백질을 위해 요구될 수 있는 3차원 형태로 접힌다.
펩타이드: 일반적으로 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 연결된 아미노산 단량체의 폴리머이다. 이는 일반적으로 50 단량체 단위 미만으로 함유한다. 그렇지만, 용어 펩타이드는 50 단량체 단위를 초과하여 갖는 분자를 위한 권리를 포기하는 것은 아니다. 긴 펩타이드는 폴리펩타이드라고도 불리우며, 일반적으로 50 내지 600 단량체 단위를 갖는다.
단백질의 절편 또는 부분: 본 발명에서, 단백질의 절편 또는 부분은 일반적으로 단백질의 아미노산 서열의 연속적인 부분에 상응하는 펩타이드로 이해될 수 있으며, 바람직하게는 약 6 내지 약 20개 또는 그 이상의 아미노산의 길이를 가지고, 예를 들어, MHC 클래스 I 분자에 의하여 가공되고 제시되는 부분, 바람직하게는 약 8 내지 약 10개 아미노산의 길이를 가지는, 예를 들어, 8, 9, 또는 10개, (또는 11, 또는 12개 아미노산도), 또는 MHC 클래스 II 분자에 의하여 가공 및 제시되는 절편, 바람직하게는 약 13개 또는 그 이상의 아미노산, 예를 들어, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 아미노산의 길이를 가지며, 여기서 이들 절편은 아미노산 서열의 임의의 부분으로부터 선택될 수 있다. 이들 절편은 일반적으로 펩타이드 절편 및 MHC 분자로 이루어지는 복합체의 형태로 T 세포에 의하여 인지될 수 있고, 즉 절편은 일반적으로 그들의 천연 형태로 인지되지 않는다. 본원에 정의된 바와 같은 단백질의 절편 또는 부분은 또한 이들 단백질의 에피토프 또는 기능부(functional site)를 포함할 수 있다. 단백질의 절편 또는 부분은 항원, 특히 면역원, 예를 들어 항원 결정기(또한 '에피토프'로 불리우는)이거나 항원 특성(antigenic characteristics)을 갖고, 적응 면역 반응을 유도한다. 따라서, 단백질 또는 펩타이드의 절편은 적어도 하나의 이들 단백질 또는 펩타이드의 에피토프를 포함할 수 있다. 게다가 또한, 단백질의 도메인(domain)은, 세포 외 도메인, 세포 내 도메인 또는 막관통 도메인(transmembrane domain) 및 단백질의 짧거나 절단된 버전(versions)과 같이 단백질의 절편을 포함하는 것으로 이해될 수 있다.
유사체 또는 변이체는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩티드와 관련하여 사용될 때 참조 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩티드와 70% 초과의 서열 동일성을 갖지만 100% 미만의 서열 동일성(예를 들어, 75%, 78%, 80%, 83%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 초과의 서열 동일성)을 갖는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩티드를 의미한다.
형질주입(Transfection): 형질주입은 핵산 분자, DNA 또는 RNA(예를 들어, mRNA) 분자의 세포, 바람직하게는 진핵 세포 내로의 도입을 말한다. 본 발명에서, 형질주입은 세포, 포유동물 세포(mammalian cell)와 같은 진핵 세포 내로 핵산 분자를 도입하는 통상의 기술자에게 알려진 임의의 방법을 포함한다. 이러한 방법은, 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 예를 들어, 양이온성 지질 및/또는 리포좀(liposome)에 기반한 리포펙션(lipofection), 칼슘 포스페이트 침전(calcium phosphate precipitation), 나노입자 기반의 형질주입, 바이러스 기반의 형질주입, 또는 DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민 등과 같은 양이온성 폴리머에 기반한 형질주입을 포함한다. 도입은 비-바이러스성이다.
담체/폴리머 담체: 담체는 일반적으로 또 다른 화합물(화물(cargo))의 수송 또는 복합화를 용이하게 하는 화합물일 수 있다. 폴리머 담체는 일반적으로 폴리머를 형성하는 담체이다. 담체는 이의 화물과 공유 또는 비-공유 상호작용에 의하여 연관될 수 있다. 담체는 표적 세포 내로 핵산, 예를 들어, RNA 또는 DNA를 수송할 수 있다. 담체는 양이온성 성분일 수 있다.
양이온성 성분: 용어 "양이온성 성분"은 일반적으로 전하를 띤(charged) 분자를 말하며, 이는 일반적으로 1 내지 9, 9 미만(예를 들어 5 내지 9), 또는 8 미만(예를 들어 5 내지 8), 또는 7 미만(예를 들어, 5 내지 7)의, 예를 들어 7.3 내지 7.4의 생리학적 pH 값의 양전하를(양이온) 띤다. 따라서, 양이온성 성분은 임의의 양전하를 띤 화합물 또는 폴리머, 생리학적 조건하에서, 특히 생체 내(in vivo) 생리학적 조건 하에서 양전하를 띤, 양이온성 펩타이드 또는 단백질일 수 있다. '양이온성 펩타이드 또는 단백질'은 적어도 하나의 양전하를 띤 아미노산 또는 하나 이상의 양전하를 띤 아미노산, 예를 들어 Arg, His, Lys 또는 Orn 로부터 선택된 것을 함유할 수 있다. 따라서, '다중양이온성' 화합물 또한 주어진 조건하에서 하나 이상의 양전하를 보이는 범위 내이다.
약학적 유효량(Pharmaceutically effective amount): 본 발명에서, 약학적 유효량은 일반적으로 발현된 펩타이드 또는 단백질의 병리학적 수준을 대체하는, 또는 결여 유전자 산물(lacking gene product)을 치환하는, 예를 들어, 병리학적 상황의 경우에 면역 반응과 같은 약학적 효과를 유도하기 위하여 충분한 양으로 이해된다.
비히클(Vehicle): 비히클은 일반적으로 약학적 활성 화합물(pharmaceutically active compound)과 같은 화합물을 저장, 운반, 및/또는 투여하기 위한 적절한 물질로 이해된다. 예를 들어, 이는 약학적 활성 화합물을 저장, 운반 및/또는 투여하기 위한 적절한 생리학적으로 허용가능한 지질일 수 있다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목표를 달성하기 위한 본 발명의 하나로,
세포내 번역 가능한 구조 및 화학적 변형된 뉴클레오타이드(CM)를 포함하는 DNA 의존성 RNA Polymerase(DdRp) mRNA(캡된 CM_DdRp mRNA)를 포함하는 DdRp RNA 발현 카세트; 및 상기 DdRp에 의해 전사되는 발현억제 RNA를 코딩하는 DNA(DNAes) 발현 카세트;를 포함하고, 이들이 작동 가능하게 연결되어 구성되는 것을 특징으로 하는 RNA/DNA 시스템을 제공한다.
본 발명의 DdRp RNA 발현 카세트는 5'말단에 5'-cap 구조이 첨가되거나 IRES를 포함하는 5*?**?*UTR이 있어 RNA의 안정성 및 전사의 효율성이 향상되고 또한, 화학적 변형된 뉴클레오타이드(CM)를 포함하여 안정성이 향상되어 DdRp mRNA의 전사를 증가시켜 DdRp의 합성을 증가시키는 방법을 제공한다.
상기 표적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나로,
상기 RNA/DNA 시스템은 추가적으로 상기 DdRp mRNA의 자가전사를 위해서 DdRp를 코딩하는 auto_DdRp 발현 카세트;를 포함하고, 이들이 작동 가능하게 연결되어 구성되는 것을 특징으로 하는 RNA/DNA 시스템을 제공한다.
상기 표적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나로,
캡된 CM_DdRp mRNA를 포함하는 DdRp RNA 발현 카세트; 및 DdRp mRNA의 자가전사를 위해서 DdRp를 코딩하는 DNA 및 상기 DdRp에 의해 전사되는 목표 발현억제 RNA를 코딩하는 DNA를 포함하는 auto_(DdRp+DNAes) 발현 카세트;를 포함하고, 이들이 작동 가능하게 연결되어 구성되는 것을 특징으로 하는 RNA/DNA 시스템을 제공한다.
여기서, 상기 DdRp RNA 발현 카세트, auto_DdRp 발현 카세트, DNAes 발현 카세트 또는 auto_(DdRp+DNAes) 발현 카세트는 염기서열 변형(SM)을 적어도 하나를 포함할 수 있다.
본 발명의 목적을 발성하기 위해서, <표 1>의 DdRp에서 한 개의 서브유닛으로 구성되고 효소 활성에 다른 보조요소가 필요없는 박테리오파지 T7, T3 및 SP6에 의해 코딩된 DdRp를 선정하였다.
본 발명에서 T7 RNA 폴리머라제(polymerase)는 박테리오파지 T7 유래의 약 20 염기쌍으로 구성된 파지 고유의 프로모터 배열을 인식하는 RNA 중합효소로, 5'-말단에서 3'-말단 방향으로 DNA로부터 RNA의 합성을 촉매하는 효소이다. 구체적으로, 다양한 세포 내 보조인자(cofactor)들을 필요로 하는 진핵생물의 RNA 폴리머라제와는 다르게, T7 RNA 폴리머라제는 추가적인 세포 내 보조인자가 없이도 전사를 일으킬 수 있다는 장점이 있다.
또한, 진핵생물의 세포 내에는 T7 프로모터에 특이성을 가지는 다른 RNA 폴리머라제가 존재하지 않기 때문에 T7 프로모터/T7 RNA 폴리머라제를 이용하는 전사 시스템은 세포 내 다른 전사시스템의 간섭을 받지도 않을 뿐만 아니라, 다른 전사 시스템에 간섭을 일으키지도 않는다.
반면, T7 프로모터와 동일한 RNA 폴리머라제 III 타입에 속하는 다른 프로모터들, 예를 들면 U1 프로모터 혹은 H1 프로모터들은 세포 내에 이미 존재하고 있기 때문에 T7 프로모터가 갖는 이러한 간섭을 일으키지 않는 특성을 가지지 못하며, 본 발명 전사 시스템상 전사를 제어하기에 적당하지 못하다. 보다 구체적으로, 본 발명의 T7 RNA 폴리머라제 mRNA 단편은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 T7 RNA 폴리머라제를 코딩하는 DdRp RNA 발현 카세트는 5'cap 구조를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 5'cap 구조는 대부분의 진핵세포와 바이러스의 mRNA의 5'말단에 존재하는 7-메틸구아노신(7-methylguanosine)을 의미하는 것으로, mRNA가 라이보핵산분해효소(ribonuclease, RNase)에 의해 분해되는 것을 막아주며, 세포질에서는 번역개시인자와 결합하여 리보솜 결합 위치로 작용할 수 있다. 일반적으로 세포질 내 전사체(cytoplasmic transcript)는 핵 전사체(nuclear transcript)가 필수적으로 가지는 5'cap 구조가 없기 때문에 리보솜에 의한 번역 효율이 떨어진다는 문제점을 가진다. 이에, 본 발명은 5'-cap 구조를 갖는 T7 RNA 폴리머라제 mRNA 단편을 사용하여 세포내 안정성 및 세포질 내 번역 효율을 높일뿐 만 아니라, 기존에 핵-의존적 mRNA 발현을 위해 사용된 발현 카세트 DNA의 낮은 핵막 투과의 한계점을 극복하여, 세포질 내에 효과적으로 초기 T7 RNA 폴리머라제를 제공할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서는, 5′cap 구조 및 CM를 포함하는 T7 RNA 폴리머라제 mRNA 을 포함하는 DdRp RNA 발현 카세트를 합성하기 위해, 먼저 T7 프로모터-T7 폴리머라제 서열을 갖는 dsDNA 단편을 화학합성법에 의하여 합성하고, 이러한 T7 프로모터-T7 폴리머라제 DNA 단편에 대하여 5′-cap 구조를 갖고 CM를 포함하는 T7 폴리머라제 mRNA를 시험관 내에서 합성하였다. 상기 5′cap 구조 및 CM를 포함하는 T7 폴리머라제 mRNA는 생체내 안정성을 확보하여 오랜 동안 존재할 수 있다.
본 발명의 DdRp RNA 발현 카세트로부터 합성되는 DdRp에 의해 전사되는 auto_DdRp DNA 발현 카세트는 T7프로모터, 5'UTR, DdRp를 코딩하는 DNA 및 3'UTR을 포함하여 DdRp에 의해 DdRp가 합성될 수 있도록 구성되며, 이들이 작동 가능하게 연결되어 구성된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 T7 RNA 폴리머라제 코딩하는 RNA 발현 카세트에 의해 합성되는 T7 RNA 폴리머라제는 T7 프로모터에 대한 특이성이 매우 높으며, T7 프로모터 하류의 DNA만을 전사할 수 있다.
따라서, 본 발명에서 T7 RNA 폴리머라제를 사용함으로써 세포 내에 다른 프로모터와 반응하지 않고 오직 T7 프로모터를 갖는 mRNA 을 코딩하는 DNA에 결합 및 전사를 수행하게 되고, 높은 효율로 RNA를 전사하여 증폭할 수 있다.
기존 발현 카세트, plasmid 또는 바이러스 시스템은 핵 의존성으로 핵에 있는 전사 도구로 전사를 하여 기존 발현 카세트는 핵까지 이동해야 한다. 그런데, 세포막을 통해 도입된 발현 카세트의 1% 미만이 핵으로 이동하는 단점이 있다.
본 발명의 자가전사 RNA/DNA 시스템은 <도 3>에서 제시하는 내용처럼 세포질에서 자가적으로 전사능력이 있는 DdRp를 합성하고 본 DdRp가 결합하는 프로모터를 사용함으로써 발현 카세트가 핵으로 이동 효율의 단점을 극복하고자 한다.
진핵세포의 염색체에 목표 DNA를 결합시키는 바이러스 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 시스템) 또는 플라스미드(예를 들어, Ti 플라스미드 시스템)를 본 발명의 DNA 발현 카세트로 사용하는 경우에도 본 발명에서 제공하는 DdRp RNA 발현 카세트에서 제공하는 최초의 DdRp에 의해 DNA 발현 카세트에 있는 발현억제 RNA가 전사하고 충분히 작동할 수 있도록 RNA/DNA 시스템을 제작할 수 있다.
<도 3>에서 제시하는 내용처럼, 구체적으로, 상기 DdRp RNA 발현 카세트가 세포질 내에서 리보솜에 의해 번역되어 DdRp를 생성하고, 생성된 DdRp는 상기 auto_DdRp 발현 카세트에 존재하는 프로모터를 인식하여 DdRp의 전사를 수행한다. 이후 생성된 DdRp mRNA는 세포질 내에서 다시 리보솜에 의해 번역되어 DdRp를 생성하는 것을 반복함으로써, DdRp의 자가전사가 이루어진다. 따라서, 본 발명의 조성물에 의한 DdRp 발현 루프에 의해 자가전사된 DdRp를 세포질 내에서 장기간 고농도로 유지시킬 수 있음을 특징으로 하며, 또한, 합성되는 DdRp에 의해 세포질 내에서 DNAes 발현 카세트로부터 발현억제 RNA는 장기간 안정적으로 발현되고 관심 발현억제 RNA도 증가하며 이들 표적 mRNA 및 단백질의 존재량은 감소하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 본 발명에 따른 DdRp RNA 발현 카세트 및 DNAes 발현 카세트, 또는 이들 모두를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 DNA를 제공한다.
여기서, 상기 DdRp RNA 발현 카세트는 RNA 가닥에 존재하며, DNAes 발현 카세트는 서로 다른 DNA 가닥에 존재하면서, 상기 DNAes 발현 카세트는 DdRp에 의한 트랜스(trans action)로 전사될 수 있다.
바람직하게, 상기 DdRp에 의해 전사될 수 있는 DNAes 발현 카세트는 관심 발현억제 RNA를 코딩하는 DNAes에서 선택되어진 1종 이상이다.
여기서, 상기 DNAi 발현 카세트에 상기 선택된 관심 발현억제 RNA에 관련된 DNAes와 함께, 추가적으로 외부에서 인공적으로 합성된 선택된 특정 관심 발현억제 RNA를 코딩하는 DNAes를 세포내로 주입될 수도 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 DdRp RNA 발현 카세트, 그리고 DNAes 발현 카세트를 포함하는 자가전사 RNA/DNA 시스템에 추가적으로 상기 DdRp에 의해 전사되는 DdRp를 코딩하는 DNA 절편이 포함된 auto-DdRp 발현 카세트를 제공할 수 있다. auto-DdRp 발현 카세트는 DdRp RNA 발현 카세트로부터 합성된 최초의 DdRp에 의해 상기 DdRp가 결합하는 프로모터 하류에 있는 DdRp DNA 절편이 반복적인 자가전사를 하는 DdRp 발현 루프(loop)를 실행할 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 DdRp RNA 발현 카세트, auto-DdRp 발현 카세트 및 DNAi 발현 카세트, 또는 이들 모두를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 DNA를 제공한다.
또한 auto-DdRp 발현 카세트에 포함되는 DdRp는 그 자체이거나 5'Cap 구조 형성을 촉매하는 기능을 보유한 DdRp 키메라효소일 수도 있다.
하기에서 DdRp RNA 발현 카세트 및 DNAge 발현 카세트는 각각 별도 제작하여 공동 형질주입할 수 있으며, 이 때는 이를 auto_(DdRp+DNAge) 발현 카세트로 대신할 수도 있다.
본 발명은 이하 단계를 포함하는 세포에서 자가전사 RNA/DNA 시스템에 의한 관심 발현억제 RNA 합성을 위한 방법을 제공한다.
(a) DdRp RNA 발현 카세트를 수득하는 단계,
(b) DdRp에 의해 트랜스로 전사될 수 있는 DNAes 발현 카세트를 수득하는 단계, 및
(c) DdRp RNA 발현 카세트 및 DNAes 발현 카세트를 세포 내에 함께 접종하는 단계를 포함하고,
여기서 DdRp RNA 발현 카세트는 DdRp의 번역을 유도하기 위한 5'캡을 포함하고, 추가적으로 auto_DdRp 발현 카세트를 수득하는 단계를 실시하고 및 단계 (c)에서 함께 접종할 수 있다.
상기 방법에서, DdRp RNA 발현 카세트 및/또는 DNAes 발현 카세트는 본 발명의 자가전사 RNA/DNA 시스템에 대해 상기 정의된 바와 같다.
본 발명은 자가전사 RNA/DNA 시스템을 포함하는 세포를 제공한다. 세포는 본 발명에 따른 방법에 따라 접종된다. 세포는 본 발명의 방법에 의해 수득 가능하다. 세포는 유기체의 일부일 수도 있다.
본 발명은 이하 단계를 포함하는 대상체에서 자가전사 RNA/DNA 시스템에 의한 관심 발현억제 RNA 합성을 위한 방법을 제공한다.
(a) DdRp RNA 발현 카세트를 수득하는 단계,
(b) DdRp에 의해 트랜스로 전사될 수 있는 DNAes 발현 카세트를 수득하는 단계, 및
(c) DdRp RNA 발현 카세트 및 DNAes 발현 카세트로 구성된 자가전사 RNA/DNA 시스템을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고,
여기서 DdRp RNA 발현 카세트는 DdRp의 번역을 유도하기 위한 5'캡을 포함하고, 추가적으로 auto_DdRp 발현 카세트를 수득하는 단계를 실시하고 및 단계 (c)에서 함께 접종할 수 있다.
상기 방법에서, DdRp RNA 발현 카세트 및/또는 DNAes 발현 카세트는 본 발명의 자가전사 RNA/DNA 시스템에 대해 상기 정의된 바와 같다.
I. DdRp RNA 발현 카세트
본 발명의 RNA/DNA 시스템을 구성하는 DdRp RNA 발현 카세트는 DdRp의 발현을 증가시키기 위한 5'cap 구조가 있는(캡된) CM_DdRp mRNA 또는 캡된 CM/SM_DdRp mRNA는:
(1) 5'UTR;
(2) 상기 DdRp를 코딩하는 mRNA; 및
(3) 3'UTR;를 포함한다.
상기 DdRp에 핵국지화신호(Nuclear localization signals, NLS)가 위치할 수도 있다. NLS가 없는 DdRp는 대부분 세포질에 남아있는 반면, NLS를 포함하는 단백질은 핵에 국한하여 분포한다. NLS가 없는 DdRp는 세포질 또는 NLS를 포함하는 하이브리드 DdRp는 핵에서 효소적으로 활성화되어 염색체 또는 플라스미드 DNA에 배치된 T7 프로모터에서 선택적으로 전사를 시작하고 특정 T7 종결서열에서 중지할 수 있다.
세포 번역이 가능한 구조
DdRp를 발현시키기 위한 CM_DdRp mRNA 또는 CM/SM_DdRp mRNA는 5'Cap 구조 또는 IRES를 포함하는 5'UTR를 포함한다.
용어 "5'cap", "캡", "캡된" 및 ""5'cap 구조"는 일부 진핵세포의 1차 전사체, 예컨대 전구체 메신저 RNA의 5' 말단에서 발견되는 디뉴클레오타이드를 지칭하는 것으로 동의어로 사용된다. 5'cap은 5' 트리포스페이트 결합(또는 특정 캡 유사체의 경우 화학적 변형된 트리포스페이트 결합)에서 5'을 통해 mRNA 분자의 첫 번째 뉴클레오타이드에 (임의로 화학적 변형된) 구아노신이 결합된 구조이다. 용어는 종래의 cap 또는 cap 유사체를 지칭할 수 있다.
예를 들어, RNA를 5'캡과 함께 제공하는 것은 상기 5'캡의 존재 하에 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 달성될 수 있으며, 여기서 상기 5'캡은 생성된 RNA 가닥에 공동-전사적으로 혼입되거나, RNA는 예를 들어 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있으며, 5'cap은 캡핑효소, 예를 들어 종두증 바이러스의 캡핑효소를 사용하여 전사 후 RNA에 부착될 수 있다. 캡핑된 RNA에서, (캡핑된) RNA 분자의 제1 염기의 3' 위치는 인산디에스터 결합을 통해 RNA 분자의 후속 염기("제2 염기")의 5' 위치에서 연결된다.
"종래의 5'캡"이란 용어는 자연성 발생적인 5'캡을 의미하고, 바람직하게는 7-메틸구아노신 캡을 의미한다. 7-메틸구아노신 캡에서, 캡의 구아노신은 화학적 변형된 구아노신이며, 여기서 변형은 7-위치에서의 메틸화로 이루어진다.
DdRp의 번역이 DdRp mRNA 상의 5'캡에 의해 유도된다. DdRp mRNA 상의 5'캡이 DdRp의 발현뿐만 아니라 시스템 전체의 성능에 매우 긍정적인 영향을 미친다. 트랜스로 코딩된 목적 RNA의 효율적인 생산을 달성할 수 있다.
본 발명의 SM_DdRp mRNA는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 요소를 포함할 수도 있다. 일반적으로, 내부 리보솜 진입 부위, 약칭 IRES는 SM_DdRp mRNA 서열의 5' 말단과 다른 위치, 예컨대 SM_DdRp mRNA 서열의 중앙에서의 위치로부터의 메신저 RNA (mRNA)로부터의 번역 개시를 가능하게 하는 뉴클레오타이드 서열로 mRNA 서열의 중간에 위치한다.
본 발명에서 5'캡으로 IRES의 치환은 SM_DdRp mRNA 분자에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 서열에 영향을 미치지 않는 RNA 분자의 특정 변형이다(비-폴리펩티드-서열 개질성 변형). 예를 들어, 진핵세포 메신저 RNA의 경우, 비-폴리펩티드-서열 개질성 변형은 특정 비번역된 영역의 선택, 인트론의 도입, 예를 들어 토끼 베타-글로빈 인트론 II 서열), 또는 코딩 서열의 침묵 변형, 예를 들어 코딩된 폴리펩티드 서열의 변형없이(침묵 변형) 대상세포 또는 대상 유기체에서 우선 코돈 사용법에 적응하는 것에 의한 것을 포함한다.
본 발명에 따른 에 의해 코딩되는 표적 단백질의 생산은 캡이 SM_DdRp mRNA 상에 존재할 때 효율적이다.
진핵세포 mRNA에서 5'캡의 존재는 그 중에서도 특히 mRNA의 핵내 방출 조절과 가공, 특히 5′ 근위부 인트론 절제의 촉진에서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 본 발명의 DdRp mRNA는 전형적으로 핵으로부터 배출되거나 가공될 필요가 없다. 그럼에도 불구하고, DdRp mRNA 상에 5'캡이 존재하는 것이 유리하다.
진핵세포 mRNA의 경우, 5'캡은 또한 일반적으로 mRNA의 효율적인 번역에 관여한다고 일반적으로 기술되어 있다: 일반적으로 진핵세포에서 번역은 IRES가 없는 한 메신저 RNA (mRNA) 분자의 5' 말단에서만 개시된다.
진핵세포는 핵 내 전사 중에 5'캡을 갖는 RNA를 제공할 수 있다. 새로 합성된 mRNA는 통상적으로 전사체가 20~30개의 뉴클레오타이드의 길이에 도달할 때 5'캡 구조로 변형된다. 먼저, 5'말단 뉴클레오타이드 pppN(ppp는 트리포스페이트를 나타내고, N은 임의의 뉴클레오사이드를 나타냄)은 RNA 5'트리포스파타아제 및 구아닐릴 전이효소 활성을 갖는 캡핑효소에 의해 세포에서 5'GpppN으로 전환된다. 이어서, GpppN은 (구아닌-7)-메틸 전이효소 활성을 갖는 제2 효소에 의해 세포에서 메틸화되어 모노-메틸화된 m7GpppN 캡을 형성할 수 있다.
본 발명에서 사용된 5'캡은 자연성 5'캡이다.
본 발명에서, 자연성 5'캡 디뉴클레오타이드는 전형적으로 비-메틸화 캡 디뉴클레오타이드 (G(5')ppp(5')N; GpppN이라고도 함) 및 메틸화된 캡 디뉴클레오타이드 ((m7G(5')ppp(5')N; m7GpppN이라고도 함)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 DdRp mRNA는 대상세포의 캡핑 장치에 의존하지 않는다. 대상세포 내로 형질주입되는 경우, 본 발명의 DdRp mRNA는 전형적으로 세포 핵, 즉 전형적인 진핵세포에서 캡핑이 일어나는 부위에 국한되지 않는 것으로 여겨진다.
종래 기술 에서 IRES와 유사하게, DdRp mRNA 상의 5'캡은 DdRp의 번역 개시를 유발하는데 유용하다. 진핵세포 번역 개시 인자 elF4E는 캡핑된 mRNA를 리보솜과 결합시키는 데 관여하는 것으로 생각될 수 있다. 5'캡의 존재가 성능을 상당히 증가시킨다. 따라서, 본 발명의 DdRp mRNA는 5'캡을 포함한다.
5'캡의 존재는 또한 본 발명의 트랜스-복제 시스템에서 예기치 않은 상승적인 효과를 제공한다. 캡핑된 DdRp mRNA가 RNA에 대해 트랜스로 제공될 때 캡핑된 DdRp mRNA가 목적 단백질의 생산을 유발하는 것이 보다 효율적이다. 따라서, 트랜스로 5'캡 및 복제의 상승 효과, 즉 시스로 복제하는 것보다 우수한 효과가 있다.
본 발명의 캡핑된 RNA는 시험관내에서 제조될 수 있으므로 대상세포의 캡핑 장치에 의존하지 않는다. 시험관내에서 캡핑된 RNA를 형성하는데 가장 빈번하게 사용되는 방법은 모든 4개의 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 캡 디뉴클레오타이드 예컨대 m7G(5')ppp(5')G (m7GpppG라고도 함)의 존재 하에 박테리아 또는 박테리오파지 RNA 중합효소로 DNA 주형을 전사하는 것이다.
RNA 중합효소는 다음 주형 뉴클레오사이드 트리포스페이트(pppN)의 α-포스페이트에서 m7GpppG의 구아노신 부분의 3'-OH에 의한 친핵성 공격으로 전사를 개시하여 중간체 m7GpppGpN (여기서 N은 RNA 분자의 제2 염기이다)를 형성한다. 경쟁하는 GTP-개시된 생성물 pppGpN의 형성은 시험관내 전사 동안 캡 대 GTP의 몰비가 5~10으로 설정함으로써 억제된다.
5'캡은 5'캡 유사체이다. RNA가 시험관내 전사에 의해 수득되는 경우, 예를 들어 시험관내 전사된 RNA(IVT-RNA)인 경우에 특히 적합하다. 캡 유사체는 초기에 시험관내 전사에 의해 RNA 전사체의 대규모 합성을 용이하게 하기 위해 기술하였다.
이전에 기재된 조작된 복제 시스템과 대조적으로, 본 발명의 DdRp mRNA는 바람직하게는 캡 유사체를 포함한다. 따라서, 본 발명의 시스템의 DdRp의 번역은 바람직하게는 캡 유사체에 의해 유도된다.
이상적으로, 보다 높은 번역 효율 및/또는 생체내 분해에 대한 증가된 내성 및/또는 시험관내 분해에 대한 증가된 내성과 관련된 캡 유사체가 선택된다. 따라서, 본 발명은 임의의 변형을 함유하지 않고 천연 캡 [(m7G(5')ppp(5')G; m7GpppG라고도하며, 시판된 ScriptCap m7G 캡핑 시스템 (Epicentre Biotechnologies사, 마국)으로 제작가능함]을 포함하는 발현을 제시하고 있다.
UTR
Untranslated region(비번역 영역) 또는 "UTR"은 전사되지만 아미노산 서열로 번역되지 않는 영역에 관한 것이거나 또는 mRNA 분자와 같은 RNA 분자 내의 상응하는 영역에 관한 것이다. UTR은 오픈 리딩 프레임의 상류 및/또는 DdRp를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 하류에 존재할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 DdRp RNA 발현 카세트 및 auto_DdRp 발현 카세트에서, "3'UTR"은 DdRp에 대한 코딩영역의 3'에 위치하는 영역에 관한 것이고, "5'UTR" 이는 DdRp에 대한 코딩영역의 5'에 위치하는 영역에 관한 것이다.
3'UTR은 존재하는 경우 단백질 코딩 영역의 종결 코돈의 하류에 유전자의 3'말단에 위치하지만, "3'UTR"은 바람직하게는 폴리(A) 꼬리를 포함하지 않는다. 따라서, 3'UTR은 폴리(A) 꼬리의 상류, 예를 들어 폴리(A) 꼬리에 직접 인접하여 있다(존재한다면).
5'-UTR은 존재하는 경우 단백질 코딩 영역의 시작코돈의 상류에 유전자의 5' 말단에 위치한다. 5'-UTR은 5'-캡의 하류, 예를 들어 5'-캡 바로 옆에 있다(존재한다면).
5' 및/또는 3'UTR은 오픈 리딩 프레임과 기능적으로 연결될 수 있어서, 이들 영역이 오픈 리딩 프레임과 관련되어 안정성 및/또는 상기 오픈 리딩 프레임을 포함하는 RNA의 번역 효율이 증가된다.
UTR은 RNA의 운반을 이용한 효과적인 운반의 전제 조건인 RNA의 안정성 및 번역 효율에 관여한다. 특정 5' 및/또는 3' 비번역 영역(UTR)을 선택함으로써, 5'캡 및/또는 3' 폴리(A)-꼬리에 관한 구조적 변형 이외에, 둘 모두 개선될 수 있다.
UTR 내의 서열 요소는 일반적으로 번역 효율 (주로 5'UTR) 및 RNA 안정성 (주로 3'UTR)에 영향을 미치는 것으로 이해된다. 핵산 서열의 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키기 위해 활성화한 5'UTR이 존재하는 것이 바람직하다. 독립적으로 또는 부가적으로, 핵산 서열의 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키기 위해 활성화한 3'UTR이 존재하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, DdRp RNA 발현 카세트 및 auto_DdRp 발현 카세트는 DdRp가 유래된 에 대해 이종 또는 고유하지 않은 5'UTR 및/또는 3'UTR을 포함한다. 이것은 원하는 번역 효율 및 RNA 안정성에 따라 비번역 영역을 설계할 수 있게 한다.
본 발명의 3'UTR은 엑소리보뉴클레아제의 장벽으로 작용하거나 RNA 안정성을 증가시키는 것으로 알려진 단백질(예컨대 RNA-결합 단백질)과 상호작용하는 스템-루프 구조를 제공하기 위해 폴딩할 수 있는 하나 이상의 역반복을 포함할 수 있다.
인간 베타-글로빈 3'UTR, 특히 인간 베타-글로빈 3'UTR의 2개의 연속적인 동일한 사본은 높은 전사 안정성 및 번역 효율에 기여한다.
따라서, 본 발명의 DdRp RNA 발현 카세트 및 auto_DdRp 발현 카세트는 인간 베타-글로빈 3'UTR의 2개의 연속적인 동일한 사본을 포함한다. 따라서, 그것은 5'→3' 방향으로 (a) 선택적으로 5'UTR; (b) DdRp를 코딩하는 오픈 리딩 프레임; (c) 3'UTR; 인간 베타-글로빈 3'UTR의 2개의 연속적인 동일한 사본, 이의 단편, 또는 인간 베타-글로빈 3'UTR의 변이체 또는 이의 단편을 포함하는 상기 3'UTR을 포함한다.
본 발명의 DdRp RNA 발현 카세트의 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키기 위해 활성화하지만 인간 베타-글로빈 3'UTR, 이의 단편, 또는 인간 베타-글로빈 3'UTR의 변이체 또는 이의 단편이 아닌, 3'UTR을 포함한다.
본 발명의 DdRp RNA 발현 카세트의 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키기 위해 활성화한 5'UTR을 포함한다.
본 발명에 따른 UTR-함유 RNA는 예를 들어, 시험관내 전사에 의해 제조될 수 있다. 이들은 5'UTR 및/또는 3'UTR을 갖는 RNA의 전사를 허용하는 방식으로 본 발명의 핵산 분자(예컨대 DNA)의 발현을 유전적으로 변형시킴으로써 달성될 수 있다.
3'UTR은 일반적으로 mRNA의 단백질 코딩 영역(즉, 오픈 리딩 프레임) 및 폴리(A) 서열 사이에 위치한 mRNA의 일부이다. mRNA의 3'UTR은 아미노산 서열내로 번역되지 않는다. 3'UTR은 일반적으로 유전자 발현 과정 중 각각의 mRNA 내로 전사되는 유전자에 의해 코딩된다. 게놈 서열은 먼저 선택적인 인트론을 포함하는 미성숙 mRNA로 전사된다. 그 이후, 미성숙 mRNA는 성숙 과정을 거쳐 성숙 mRNA로 되도록 추가로 처리된다. 이러한 성숙 과정은 5'캡핑(capping), 추가적인 인트로을 절단하기 위한 미성숙 mRNA 스플라이싱(splicing) 및 미성숙 mRNA 3'-말단의 아데닐산중합반응 및 추가적인 엔도-(endo-) 또는 엑소(exo)뉴클레아제 절단 등과 같은 3'-말단의 변형을 포함한다. 본 발명에서, 3'UTR은 단백질 코딩 영역의 정지 코돈의 3'에, 바람직하게는 단백질 코딩 영역의 정지 코돈의 3' 바로 옆에 위치한 성숙 mRNA의 서열에 상응하며, 폴리(A) 서열의 5'-측면, 바람직하게는 폴리(A) 서열의 5' 바로 옆 뉴클레오타이드까지 이어진다. 본 발명에서, 용어 "유전자의 3'UTR", 예컨대 "알파 또는 베타 글로빈의 3'UTR"은 이러한 유전자로부터 유래된 성숙 mRNA의 3'UTR에 상응하는 서열, 즉, 유전자의 전사 및 미성숙 mRNA의 성숙에 의해 수득된 mRNA에 상응하는 서열이다. 유전자의 3'UTR은 3'UTR의 DNA 서열 및 RNA 서열을 포함한다.
5'UTR은 일반적으로 전령 RNA(mRNA)의 특정 부분(section)으로 이해된다. 이는 mRNA의 오픈 리딩 프레임의 5'에 위치한다. 일반적으로, 5'UTR은 전사 시작부(transcriptional start site)와 함께 시작하고 오픈 리딩 프레임의 시작 코돈의 하나의 뉴클레오타이드 전에 종료된다. 5'UTR은 조절 요소라고도 불리우는 유전자 발현을 조절하기 위한 요소를 포함할 수 있다. 이와 같은 조절 요소는 예를 들어, 리보솜 결합부 또는 5'말단 올리고피리미딘관(Oligopyrimidine Tract)일 수 있다.
5'UTR은 예를 들어, 5'캡(cap)의 첨가에 의해 전사 후 변형될 수 있다. 본 발명에서, 5'UTR은 5'캡(cap) 및 시작 코돈 사이에 위치한 성숙 mRNA의 서열에 상응한다. 바람직하게, 5'UTR은 5'캡(cap)의 3'에 위치한 뉴클레오타이드로부터, 바람직하게는 5'캡(cap)의 3' 바로 옆에 위치한 뉴클레오타이드로부터, 단백질 코딩 영역의 시작 코돈의 5'에 위치한 뉴클레오타이드까지, 바람직하게는 단백질 코딩 영역의 시작 코돈의 5' 바로 옆에 위치한 뉴클레오타이드까지 이어지는 서열에 상응한다. 성숙 mRNA의 5'캡(cap)의 3' 바로 옆에 위치한 뉴클레오타이드는 일반적으로 전사 시작부에 상응한다. 5'UTR 서열이 5'UTR 서열을 정의하기 위해 사용되는 mRNA 서열과 같은 RNA 서열 또는 이와 같은 RNA 서열에 상응하는 DNA 서열일 수 있다.
유전자의 5'UTR은 이러한 유전자로부터 유래된 성숙 mRNA의 5'UTR에 상응하는 서열, 즉, 유전자의 전사 및 미성숙 mRNA의 성숙에 의해 수득된 mRNA에 상응하는 서열이다. 유전자의 5'UTR은 5'UTR의 DNA 서열 및 RNA 서열을 포함한다.
5'말단 올리고피리미딘관(Oligopyrimidine Tract, TOP)은 일반적으로 핵산 분자의 5'말단 영역, 예컨대 특정 mRNA 분자의 5'말단 영역 또는 특정 유전자의 기능성 독립체 예를 들어, 전사영역의 5'말단 영역에 위치한 피리미딘 뉴클레오타이드의 스트레치(stretch)이다. 서열은 보통 전사 시작부에 상응하는 사이티딘과 함께 시작하고, 보통 약 3 내지 30개의 피리미딘 뉴클레오타이드의 스트레치가 이어진다. 피리미딘 스트레치 그리하여 5' TOP는 TOP의 다운스트림에 위치한 제1 퓨린 뉴클레오타이드의 5'의 하나의 뉴클레오타이드로 종료된다. 5'말단 올리고피리미딘관을 함유하는 전령 RNA는 종종 TOP mRNA로서 언급된다. 따라서, 이와 같은 전령 RNA를 제공하는 유전자는 TOP 유전자로서 언급된다. TOP 서열은 예를 들어, 유전자 및 펩타이드 신장 인자를 코딩하는 mRNA 및 리보솜 단백질에서 발견된다.
본 발명에서, TOP 모티프(motif)는 상기 정의된 바와 같은 5'TOP에 상응하는 핵산 서열이다. 따라서, 본 발명에서, TOP 모티프는 바람직하게 3~30개 뉴클레오타이드 길이를 갖는 피리미딘 뉴클레오타이드 스트레치이다. 바람직하게, TOP-모티프는 적어도 3개 피리미딘 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 4개 피리미딘 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 5개 피리미딘 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 적어도 6개 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 적어도 7개 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 적어도 8개 피리미딘 뉴클레오타이드로 이루어지고, 여기서 피리미딘 뉴클레오타이드의 스트레치는 바람직하게 사이토신 뉴클레오타이드와 함께 이의 5'말단에서 시작한다.
TOP 유전자 및 TOP mRNA에서, TOP-모티프는 바람직하게 전사 시작부와 함께 이의 5'말단에서 시작하고 상기 유전자 또는 mRNA에 제1 퓨린 잔기의 5'의 하나의 뉴클레오타이드로 종료된다. 본 발명의 의미에서 TOP 모티프는 바람직하게 5'UTR을 나타내는 서열의 5'말단에 위치하거나 5'UTR을 코딩하는 서열의 5'말단에 위치한다. 따라서, 바람직하게, 만약 이러한 스트레치가 각각의 서열의 5'말단, 예컨대 본 발명에 따른 SM_DdRp의 5'UTR 요소, 또는 본원에 설명된 바와 같은 TOP 유전자의 5'UTR로부터 유래된 핵산 서열에 위치한다면 3개 이상의 피리미딘 뉴클레오타이드의 스트레치는 본 발명의 의미에서 "TOP 모티프"로 불리운다. 다시 말해서, 5'UTR 또는 5'UTR 요소의 5'-말단에 위치하지 않고, 5'UTR 또는 5'UTR 요소 내 어디든 위치한 3개 이상의 피리미딘 뉴클레오타이드의 스트레치는 바람직하게 "TOP 모티프"로서 언급되지 않는다.
TOP 유전자는 일반적으로 5' 말단 올리고피리미딘관의 존재를 특징으로 한다. 더욱이, 대부분의 TOP 유전자는 성장-연관 번역 조절을 특징으로 한다. 그러나, 조직 특이적 번역 조절을 갖는 TOP 유전자도 알려져 있다. TOP 유전자의 5'UTR은 TOP 유전자로부터 유래된 성숙 mRNA의 5'UTR의 서열에 상응하며, 5'캡(CAP)의 3'에 위치한 뉴클레오타이드로부터 시작 코돈의 5'에 위치한 뉴클레오타이드까지 이어진다. TOP 유전자의 5'UTR은 일반적으로 임의의 시작 코돈, 업스트림(upstream) AUGs(uAUGs) 또는 업스트림 오픈 리딩 프레임(uORFs)을 포함하지 않는다. 거기에서, 업스트림 AUGs 및 업스트림오픈 리딩 프레임은 일반적으로 번역되어야 할 오픈 리딩 프레임의 시작 코돈(AUG)의 5'에 나타나는 AUGs 및 오픈 리딩 프레임으로 이해된다. TOP 유전자의 5'UTR은 일반적으로 상대적으로 짧다. TOP 유전자의 5'UTR 길이는 20 뉴클레오타이드 내지 500개 뉴클레오타이드까지 달라질 수 있으며, 일반적으로 약 200개 뉴클레오타이드 미만이고, 약 150개 뉴클레오타이드 미만이며, 약 100개 뉴클레오타이드 미만이다. 본 발명의 의미에서, TOP 유전자의 5'UTR 예시는 위치 5의 뉴클레오타이드로부터 시작 코돈(예를 들어, ATG)의 5' 바로 옆에 위치한 뉴클레오타이드까지 이어지는 핵산 서열이다. 특히 바람직한 TOP 유전자의 5'UTR의 절편은 5'TOP 모티프가 결여된 TOP 유전자의 5'UTR이다. 'TOP 유전자의 5'UTR'은 바람직하게 자연적으로 발생하는 TOP 유전자의 5'UTR을 나타낸다.
폴리(A) 서열
본 발명의 DdRp RNA 발현 카세트는 전사 종결서열 및 3' 폴리(A) 서열을 포함할 수 있다.
폴리(A) 서열은 본질적으로 적어도 20, 적어도 26, 적어도 40, 적어도 80, 적어도 100개이고, 500개 이하, 400개 이하, 300개 이하, 200개 이하, 특히 150개 이하의 A 뉴클레오타이드이고, 특히 약 120개의 A 뉴클레오타이드로 구성되거나 포함한다.
폴리(A) 서열에서 뉴클레오타이드 수에 따라 전형적으로 적어도 50%, 적어도 75%의 폴리(A) 서열에서의 대부분의 뉴클레오타이드가 A 뉴클레오타이드이지만, 나머지 뉴클레오타이드는 A 뉴클레오타이드 이외의 뉴클레오타이드, 예컨대 U 뉴클레오타이드 (유리딜레이트), G 뉴클레오타이드 (구아닐레이트), C 뉴클레오타이드 (시티딜레이트)인 것을 허용한다. 폴리(A) 서열에서의 모든 뉴클레오타이드, 즉 폴리(A) 서열에서의 뉴클레오타이드의 수에 따라 100%가 A 뉴클레오타이드인 것을 의미한다. 용어 "A 뉴클레오타이드" 또는 "A"는 아데닐레이트를 지칭한다.
본 발명은 코딩 가닥에 상보적인 가닥에서 반복된 dT 뉴클레오타이드 (데옥시티미딜레이트)를 포함하는 DNA 주형에 기반하여, RNA 전사 동안, 즉 시험관내 전사된 RNA의 제조 중에 부착되는 3' 폴리(A) 서열을 제공한다. 폴리(A) 서열을 코딩하는 DNA 서열(코딩 가닥)은 폴리(A) 카세트로 지칭된다.
DNA의 코딩 가닥에 존재하는 3' 폴리(A) 카세트는 본질적으로 dA 뉴클레오타이드로 이루어지지만, 4개의 뉴클레오타이드(dA, dC, dG, dT)의 균등한 분포를 갖는 무작위 서열에 의해 중단된다. 이러한 무작위 서열은 길이가 5 내지 50개, 바람직하게는 10 내지 30개, 보다 바람직하게는 10 내지 20개일 수 있다.
본질적으로 dA 뉴클레오타이드로 이루어지지만, 4개의 뉴클레오타이드(dA, dC, dG, dT)의 균등한 분포를 갖고 길이가 예를 들어 5 내지 50개의 뉴클레오타이드인 무작위 서열에 의해 중단되는 폴리(A) 카세트는 DNA 수준에서 대장균에서의 plasmid DNA의 일정한 증식을 나타내며, RNA 수준에서 RNA 안정성 및 번역 효율을 지지하는 것과 관련하여 유익한 특성과 여전히 연관되어 있다.
결과적으로, 본원에 기술된 RNA 분자에 함유된 3' 폴리(A) 서열은 본질적으로 A 뉴클레오타이드로 구성되지만, 4개의 뉴클레오타이드(A, C, G, U)가 균등한 분포를 갖는 무작위 서열에 의해 중단된다. 이러한 무작위 서열은 길이가 5~50개, 10~30개, 10~20개일 수 있다.
아데닐산중합반응(polyadenylation)은 일반적으로 RNA 분자, 예를 들어, 미성숙 mRNA와 같은 핵산 분자에 폴리(A) 서열이 첨가되는 것으로 이해된다. 아데닐산중합반응은 소위 아데닐산중합반응 신호에 의해 유도될 수 있다. 이 신호는 아데닐산중합반응될, RNA 분자와 같은 핵산 분자의 3'-말단의 뉴클레오타이드의 스트레치(stretch) 내에 위치한다. 아데닐산중합반응 신호는 일반적으로 아데닌 및 우라실/티민 뉴클레오타이드로 이루어진 헥사머(hexamer), 헥사머 서열 AAUAAA 를 포함한다. 다른 서열, 헥사머 서열도 가능하다. 아데닐산중합반응은 프리-mRNA(미성숙-mRNA로도 불리우는)의 가공 중에 발생한다. RNA 성숙(프리-mRNA로부터 성숙 mRNA 까지)은 아데닐산중합반응의 단계를 포함한다.
코돈 사용법
일반적으로 유전 암호의 축퇴(degeneracy)는 동일한 코딩 능력을 유지하면서 다른 코돈 (염기 삼중항)에 의해 RNA 서열에 존재하는 특정 코돈(아미노산을 코딩하는 염기 삼중항)을 대체할 수 있게 한다(코돈을 대체하는 것은 대체된 코돈과 동일한 아미노산을 코딩한다).
본 발명에서, RNA 분자에 포함된 오픈 리딩 프레임의 적어도 하나의 코돈은 오픈 리딩 프레임이 유래한 종에서 각각의 오픈 리딩 프레임의 각각의 코돈과 상이하다. 오픈 리딩 프레임의 코딩 서열은 "개조된" 것으로 언급된다.
예를 들어, 오픈 리딩 프레임의 코딩 서열이 변형되는 경우, 빈번하게 사용되는 코돈이 선택될 수 있다. 더욱 빈번하게 사용되는 희귀 코돈의 치환을 포함하여, 핵산 분자의 코딩 서열의 변형을 한다.
코돈 사용의 빈도는 대상세포 또는 대상 유기체에 따라 다르기 때문에, 그러한 유형의 변형은 특정 대상세포 또는 대상 유기체에서의 발현에 핵산 서열을 맞추는 것이 적합하다. 일반적으로 말하면, 보다 빈번하게 사용되는 코돈은 전형적으로 대상세포 또는 대상 유기체에서 보다 효율적으로 번역되지만, 오픈 리딩 프레임의 모든 코돈의 변형이 항상 필요한 것은 아니다.
예를 들어, 오픈 리딩 프레임의 코딩 서열이 변형되는 경우, G (구아닐레이트) 잔기 및 C (시티딜레이트) 잔기의 함량은 각 아미노산에 대해 가장 풍부한 GC-함량을 갖는 코돈을 선택함으로써 변형될 수 있다. GC가 풍부한 오픈 리딩 프레임을 가진 RNA 분자는 면역 활성을 감소시키고 RNA의 번역 및 반감기를 향상시킬 가능성이 있다고 보고되어 있다.
본 발명에 따른 DdRp를 코딩하는 오픈 리딩 프레임은 각각 개조될 수 있다.
II. DNA 발현 카세트
본 발명의 자가전사 RNA/DNA 시스템은 발현억제 RNA를 코딩하는 DNA를 포함하는 DNAes 발현 카세트, DdRp ORF를 코딩하는 DNA를 포함하는 auto_DdRp 발현 카세트 그리고 DNAes 및 DdRp DNA를 포함하는 auto_(DdRp+DNAes) 발현 카세트를 포함할 수 있다.
본 발명의 발현억제 RNA의 발현 목적인 DNAes 발현 카세트는
(1) DdRp가 결합하는 프로모터;
(2) 5'UTR;
(3) 상기 발현억제 RNA를 코딩하는 DNAes 절편; 및
(4) 3' UTR;을 포함하고, 이들이 작동 가능하게 연결되어 구성될 수 있다.
본 발명의 auto_DdRp 발현 카세트는
(1) DdRp가 결합하는 프로모터;
(2) 5*?**?*UTR;
(3) 상기 DdRp를 코딩하는 DNA 절편; 및
(4) 3'UTR;을 포함하고, 이들이 작동 가능하게 연결되어 구성될 수 있다.
본 auto_DdRp 발현 카세트는 로상기 DdRp RNA 발현 카세트를 제조할 목적인 주형으로 사용할 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 auto_(DdRp+DNAes) 발현 카세트는
(1) DdRp가 결합하는 프로모터;
(2) 5'UTR;
(3) 상기 DdRp ORF 및 DNAes를 코딩하는 DNA 절편; 및
(4) 3'UTR;을 포함하고, 이들이 작동 가능하게 연결되어 구성되며,
여기서, 상기 DdRp ORF 및 발현억제 RNA를 코딩하는 DNA는 각각의 상류 방향에 DdRp가 결합하는 프로모터가 있거나, 또는 상류 방향에 하나의 DdRp가 결합하는 프로모터가 있을 수 있다.
본 발명의 DdRp는 한 개의 서브유닛으로 구성된 DdRp를 선택하였다.
본 발명의 상기 DdRp는 T7 RNA 폴리머라제, T3 RNA 폴리머라제 및 SP6 RNA 폴리머라제를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나의 발현을 증가시켜 표적 RNA를 장기간 안정적으로 발현시킬 수 있다.
상기 DdRp에 핵국지화신호(Nuclear localization signals, NLS)가 위치할 수도 있다. NLS가 없는 DdRp는 대부분 세포질에 남아있는 반면, NLS를 포함하는 단백질은 핵에 국한하여 분포한다. NLS가 없는 DdRp는 세포질 또는 NLS를 포함하는 하이브리드 DdRp는 핵에서 효소적으로 활성화되어 염색체 또는 플라스미드 DNA에 배치된 T7 프로모터에서 선택적으로 전사를 시작하고 특정 T7 종결서열에서 중지할 수 있다.
본 발명에 있어서, T7 RNA 폴리머라제는 T7 프로모터에 대한 특이성이 매우 높으며, T7 프로모터 하류의 DNA만을 전사할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 T7 RNA 폴리머라제를 사용함으로써 세포 내에 다른 프로모터와 반응하지 않고 오직 T7 프로모터를 갖는 DdRp RNA 발현 카세트 및 auto_DdRp 발현 카세트에 결합 및 전사를 수행하게 되고, 높은 효율로 T7 RNA 폴리머라제 자신을 자가전사하고 RNA를 전사하여 증폭할 수 있다.
상기 auto_DdRp 발현 카세트는 T7 RNA 폴리머라제 발현 루프(loop)의 반복에 의해 상기 T7 RNA 폴리머라제를 자가전사시키는 것을 특징으로 한다.
구체적으로, 상기 auto_DdRp 발현 카세트는 T7 프로모터, IRES(Internal ribosome entry site) 영역, T7 RNA 폴리머라제를 코딩하는 유전자, 폴리 아데닌 꼬리(poly A tail) 및 T7 종결서열(termination)을 포함하며, 이들이 작동 가능하게 연결되어 구성된 것일 수 있다. 상기 auto_DdRp 발현 카세트 내부에 포함된 IRES 영역은 viral IRES일 수 있으며, IRES-융합된 T7 폴리머라제 전사체를 생성함으로써 DdRp mRNA의 전사 안정성을 높일 뿐만 아니라, 세포질 내에서 T7 폴리머라제의 높은 발현효율을 유지할 수 있다.
상기 자가전사는 본 발명 조성물을 구성하는 DdRp RNA 발현 카세트에 의한 DdRp mRNA의 자가전사를 위한 auto_DdRp 발현 카세트에 의한 DdRp 발현 루프에 의해 수행될 수 있다.
또한, NLS가 있는 DdRp RNA 발현 카세트가 세포질 내에서 리보솜에 의해 DdRp를 생성하고, 핵으로 이동한 DdRp는 염색체에 위치한 auto_DdRp 발현 카세트에 존재하는 T7 프로모터를 인식하여 핵에서 DdRp의 전사를 수행한다. 이후 생성된 DdRp mRNA는 세포질로 이송되고 다시 리보솜에 의해 DdRp를 합성하는 것을 반복함으로써, DdRp mRNA의 자가전사가 이루어진다. 따라서, 본 발명의 조성물은 DdRp 발현 루프에 의해 자가전사된 DdRp mRNA를 핵에서 장기간 고농도로 유지시킬 수 있음을 특징으로 한다.
본 발명에서는, 상기 auto_DdRp 발현 카세트를 포함하는 DOPC 리포좀 전달체(auto_DNAes@LS)를 처리한 세포에서 시간에 따른 T7 폴리머라제의 발현을 웨스턴 블랏으로 조사한 결과, T7 폴리머라제는 적어도 72시간 이상 고농도로 유지되는 것을 확인하였다.
<도 3>에서 제시하는 내용처럼 구체적으로, 상기 DdRp RNA 발현 카세트가 세포질 내에서 리보솜에 의해 DdRp를 생성하고, 생성된 DdRp는 세포질에서 상기 auto_DdRp 발현 카세트에 존재하는 프로모터를 인식하여 DdRp의 전사를 수행한다. 이후 생성된 DdRp mRNA는 세포질 내에서 다시 리보솜에 의해 번역되어 DdRp를 생성하는 것을 반복함으로써, DdRp의 자가전사가 이루어진다. 따라서, 본 발명의 조성물은 DdRp 발현 루프에 의해 자가전사된 DdRp mRNA 를 세포질 내에서 장기간 고농도로 유지시킬 수 있으며, 표적 mRNA 및 단백질을 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서는, 상기 auto_DdRp 발현 카세트를 포함하는 DOPC 리포좀 전달체(auto_mRNAi@LS)를 처리한 세포에서 시간에 따른 T7 폴리머라제의 세포질 발현을 웨스턴 블랏으로 조사한 결과, T7 폴리머라제는 세포질 내에서 적어도 72시간 이상 고농도로 유지되는 것을 확인하였다.
<도 3>에서 제시하는 내용처럼 이에, 본 발명은 DdRp RNA 발현 카세트; 및 DdRp 자가전사를 위한 DdRp 을 코딩하는 DNA를 포함하는 auto_DdRp 발현 카세트에 의해 수행되는 DdRp 발현 루프를 통해 세포질 내에서 DdRp를 장기간 고농도로 유지하고, 이에 따라 발현 억제 RNA 또한 장기간 지속적으로 발현시키는 것을 특징으로 한다.
캡핑은 거의 모든 진핵세포 메신저 RNA의 5'말단에서 발견된 특수한 구조이다. 가장 단순한 캡 구조, cap0은 1차 RNA의 말단에 결합된 5'-5' 트리포스페이트 말단의 감마 포스페이트에 의해 결합되는 N7에서 메틸화된 구아닌 뉴클레오사이드 부가의 결과이다(즉, m7GpppN, 여기서 N은 임의의 염기이고, p는 포스페이트를 나타내며, m은 메틸 그룹이다). cap0의 형성은 일련의 3가지 효소 반응을 수반한다: RNA 트리포스파타제(RTPase)는 디포스페이트에 대한 발생 프리-mRNA의 5' 트리포스페이트 말단의 감마 포스페이트 잔기를 제거하고, RNA 구아닐릴트랜스퍼라제(GTase)는 GMP를 GTP로부터 디포스페이트 발생 RNA 말단으로 전달하며, RNA N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제(N7-MTase)는 GpppN 캡에 구아닌의 질소 7상의 메틸 잔기를 부가한다.
보다 고급 진핵세포 및 일부 바이러스에서, 1차(즉, cap1 구조체; m7GpppNm2'-opN) 및 2차(즉, cap2 구제초; m7GpppNm2'-opNm2'-o) 전사된 뉴클레오티드의 리보스의 2'-하이드록실 그룹은 각각 cap1- 및 cap2-특이적 MTase로서 명명된 2개의 별개의 리보스-2'-O MTase에 의해 메틸화될 수 있다.
그러나, 오로지 핵에 존재하는 세포 N7-MTase 활성과 대조적으로, cap1 리보스-2'-O MTase 활성은 헬라 세포의 세포질 및 핵 둘 다에서 검출된 반면, cap2 MTase 활성은 이들의 세포질에서 유일하게 발견되었다.
5'-말단 m7GpppN 캡의 형성은 프리-mRNA 프로세싱의 제1 단계이다. m7GpppN cap는 mRNA 안정성 및 핵으로부터 세포질로의 이의 수송에 중요한 역할을 담당한다.
또한, 5'말단 m7GpppN 캡은 진핵세포 번역 개시 인자 4F(eIF4F) 복합체를 고정함으로써 단백질로의 mRNA의 번역에 중요하며, 상기 복합체는 작은 리보솜 서브유닛의 16S 부분의 mRNA로의 보충을 매개한다. 따라서, 5'-말단 m7GpppN 캡은 시험관내 및 생체내 둘 다에서 mRNA의 번역을 현저히 향상시킨다.
본 발명의 auto_DdRp 발현 카세트의 DdRp는 DdRp 그 자가, 또는 RNA 트리포스파타제(RNA triphosphatase)의 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제(guanylyltransferase)의 촉매 도메인, N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제(N7-guanine methyltransferase) 및 DNA-의존성 RNA 폴리머라제(DNA-dependant RNA polymerase)의 촉매 도메인을 포함하는 키메라 효소가, 세포독성 및 아폽토시스의 유도 없이, 진핵세포 번역 장치에 의해 고도로 해독 가능한 5'-말단 m7GpppN 캡을 갖는 RNA 분자를 합성한다는 보고(한국, 공개특허 10-2013-0069632)를 기반으로 하는 키메라 효소를 사용하여 제작하였다.
본 발명은 적어도 하나의, 특히 RNA 트리포스파타제의 촉매 도메인, 적어도 하나의, 특히 구아닐릴트랜스퍼라제의 촉매 도메인, 적어도 하나의, 특히 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 촉매 도메인, 및 적어도 하나의, 특히 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인을 포함하는 키메라 효소에 관한 것이다.
특히, 본 발명에 따르는 키메라 효소는 5'말단 m7 GpppN 캡을 갖는 RNA 분자를 합성할 수 있다.
키메라 효소는 자연에서 발견되는 천연 효소가 아닌 효소를 지칭한다. 따라서, 키메라 효소는, 자연에서 발견된 것과는 상이한 방식으로 배열된, 상이한 공급원(예: 상이한 효소)으로부터 유래된 촉매 도메인 또는 동일한 공급원(예: 동일한 효소)으로부터 유래된 촉매 도메인을 포함할 수 있다. 키메라 효소는 단량체성(즉, 단일 단위) 효소 뿐만 아니라 올리고머성(즉, 복수 단위) 효소, 특히 헤테로-올리고머성 효소를 포함한다. 단량체성 효소는 단지 하나의 폴리펩티드 쇄로 이루어진 단일-단위 효소와 관련된다.
특히, RNA 트리포스파타제, 구아닐릴트랜스퍼라제, N7 -구아닌 메틸트랜스퍼라제 및 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인들은 함께 공유 및/또는 비공유적으로 연결되어 있다.
특히, RNA 트리포스파타제, 구아닐릴트랜스퍼라제, N7 -구아닌 메틸트랜스퍼라제 및 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 함께 작동적으로 연결되어, 5'-말단 m7 GpppN 캡을 갖는 RNA 분자를 합성한다.
특히, 적어도 하나의, 특히 RNA 트리포스파타제의 촉매 도메인, 적어도 하나의, 특히 구아닐릴트랜스퍼라제의 촉매 도메인, 적어도 하나의, 특히 N7 -구아닌 메틸트랜스퍼라제의 촉매 도메인 및 적어도 하나의, 특히 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인(여기서, 상기 촉매 도메인 중의 적어도 2개는 바람직하게는 이들의 말단(N 또는 C 말단)에서 함께 공유 또는 비공유적으로 연결되고, 보다 특히는 상기 적어도 하나의, 특히 RNA 트리포스파타제의 촉매 도메인, 상기 적어도 하나의, 특히 구아닐릴트랜스퍼라제의 촉매 도메인, 적어도 하나의, 특히 N7 -구아닌 메틸트랜스퍼라제의 촉매 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 촉매 도메인은 바람직하게는 이의 말단(N 또는 C 말단)에서 공유 또는 비공유적으로 연결된다)을 포함하는 본 발명의 키메라 효소는 상기 적어도 하나의, 특히 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인과 바람직하게는 이의 말단(N 또는 C 말단)에서 연결된다.
특히, 본 발명은 적어도 하나의, 특히 RNA 트리포스파타제의 촉매 도메인, 적어도 하나의, 특히 구아닐릴트랜스퍼라제의 촉매 도메인, 적어도 하나의, 특히 N7 -구아닌 메틸트랜스퍼라제의 촉매 도메인 및 적어도 하나의, 특히 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매적 도메인을 포함하는 본 발명의 키메라 효소에 관한 것이며, 단 RNA 트리포스파타제의 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 촉매 도메인, N7 -구아닌 메틸트랜스퍼라제의 촉매 도메인 및 핵 진핵세포 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 I, II 및/또는 III의 유일한 촉매 도메인; 및 보다 특히는, DNA-의존성 RNA 폴리머라제 II의 유일한 촉매 도메인(들)을 포함하는 키메라 효소는 제외된다.
특히, 본 발명은 적어도 하나의, 특히 RNA 트리포스파타제의 촉매 도메인, 적어도 하나의, 특히 구아닐릴트랜스퍼라제의 촉매 도메인, 적어도 하나의, 특히 N7 -구아닌 메틸트랜스퍼라제의 촉매 도메인 및 적어도 하나의, 특히 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매적 도메인을 포함하는 본 발명의 키메라 효소에 관한 것이며, 단 RNA 트리포스파타제의 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 촉매 도메인, N7 -구아닌 메틸트랜스퍼라제의 촉매 도메인 및 핵 진핵세포 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 I, II 및/또는 III의 촉매 도메인; 및 보다 특히는, DNA-의존성 RNA 폴리머라제 II의 적어도 하나의 촉매 도메인을 포함하는 키메라 효소는 제외된다.
특히, 진핵 숙주 세포에서 발현시키면, 본 발명에 따르는 상기 키메라 효소는, 바람직하게는 진핵세포 번역 장치에 의해 번역가능한, 5'말단 m7 GpppN 캡을 갖는 RNA 분자를 합성할 수 있다.
특히, 진핵 숙주 세포에서 발현시키면, RNA 트리포스파타제, 구아닐릴트랜스퍼라제 및 N7 -구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인은 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인에 의해 합성된 RNA 분자의 5'-말단에서 m7 GpppN 캡을 부가할 수 있고, 바람직하게는 5'-말단 m7 GpppN 캡을 갖는 상기 RNA 분자는 진핵세포 번역 장치에 의해 번역할 수 있다.
특히, 진핵 숙주 세포에서 발현시키면, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인이 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인인 경우, RNA 트리포스파타제, 구아닐릴트랜스퍼라제 및 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인은, 이들의 5' 말단에서 구아노신 리보뉴클레오티드를 갖는 RNA 분자의 5'말단에 m7GpppN 캡을 부가할 수 있다.
특히, 진핵 숙주 세포에서 발현시키면, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인이 박테리아 DNA-의존성RNA 폴리머라제의 촉매 도메인인 경우, RNA 트리포스파타제, 구아닐릴트랜스퍼라제 및 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인은, 이들의 5'말단에서 구아노신 또는 아데노신 리보뉴클레오티드를 갖는 RNA 분자의 5'말단에서 m7GpppN 캡을 부가할 수 있다.
특히, 진핵 숙주 세포에서 발현시키면, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인이 사람 또는 마우스 미토콘드리아 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인인 경우, RNA 트리포스파타제, 구아닐릴트랜스퍼라제 및 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인은, 이들의 5' 말단에서 아데노신 또는 티미딘 리보뉴클레오티드를 갖는 RNA 분자의 5'-말단에서 m7GpppN 캡을 부가할 수 있다.
효소의 촉매 도메인은, 특히 이의 3차원 구조에서, 효소 기능을 보장하기에 필요하고 충분한 도메인에 관한 것이다. 예를 들면, RNA 트리포스파타제의 촉매 도메인은 RNA 트리포스파타제 기능을 보장하기에 필요하고 충분한 도메인이다. 용어 "촉매 도메인"은 야생형 또는 돌연변이체 효소의 촉매 도메인을 포함한다.
본 발명의 키메라 효소는 적어도 상기 촉매 도메인을 포함하지만, 상기 촉매 도메인을 함유하는 효소 전체 또는 일부분을 추가로 포함할 수 있다. 실제로, 본 발명에 따르는 키메라 효소의 한 가지 양태에 따라, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 DNA-의존성 RNA 폴리머라제, 바람직하게는 단량체성 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 전부 또는 일부에 포함될 수 있다. RNA 트리포스파타제의 상기 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인 및 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인은 또한 캡핑 효소, 바람직하게는 단량체성 캡핑 효소의 전부 또는 일부에 포함될 수 있다.
본 발명의 키메라 효소는 핵 효소, 아세포 구획 효소(subcellular compartment enzyme) 또는 세포질 효소일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르는 키메라 효소는, 세포에서 효소의 전달을 유도하는, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 시그날 펩티드 또는 마커-시그날을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따르는 키메라 효소는 당해 효소를 핵으로 유도하는 핵국지화신호(NLS)을 포함할 수 있다. 이러한 NLS는 종종 5개의 기본적 양전하 아미노산으로 이루어진 단위이다. NLS는 펩티드 쇄 상의 어느 곳에도 위치할 수 있다.
키메라 효소는 세포질 키메라 효소일 경우, 세포질을 제외하고는, 당해 효소의 전달을 유도하는 시그날 펩티드 또는 마커-시그날을 포함하지 않는다.
본 발명의 키메라 효소의 세포질 국지화는, 세포질로부터 진핵 세포의 핵으로의 거대 DNA 분자(즉, 도입유전자)의 활발한 이동 및 핵으로부터 세포질로의 RNA 분자의 이출을 피함으로써 도입유전자 발현 수준을 최적화시키는 잇점을 갖는다.
따라서, 본 발명의 이들 세포질 키메라 효소는, 현저히 높은 양의 형질감염된 DNA가 핵과 비교하여 통상 발견되는 세포질에서 작동할 수 있는, 숙주 독립적, 진핵세포 유전자 발현시스템을 생성하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 이들 세포질 키메라 효소는, 세포독성 및 아폽토시스 유도 없이, 진핵세포 세포질 번역 장치에 의해 고도로 번역가능한, 5'말단 m7GpppN 캡을 갖는 RNA 분자를 합성할 수 있다.
내인성 유전자 전사가, 세포질에서 일어나는 도입유전자 전사와 대조적으로, 진핵 세포의 핵에서 일어나기 때문에, 내인성 유전자 잔사와 도입유전자 전사 사이에 경쟁이 없다.
따라서, 본 발명의 세포질 키메라 효소는 특히 대규모 분석 및 단백질 생산에 적절하다.
본 발명의 키메라 효소에서, RNA 트리포스파타제의 상기 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인 및 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인은 단량체, 즉 하나의 폴리펩티드에 포함된다. 예를 들면, 상기 단량체는 본 발명에 따르는 단량체성 캡핑 효소 또는 단량체성 키메라 효소일 수 있다.
특히, RNA 트리포스파타제의 상기 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인 및 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인은 단량체성 캡핑 효소에 포함된다. 이 경우, 본 발명의 키메라 효소는 단량체성 캡핑 효소를 포함하고, 이 효소는 RNA 트리포스파타제의 상기 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인 및 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인을 포함한다. 상기 단량체성 캡핑 효소는, RNA 분자의 5'-말단에서 m7GpppN 캡을 부가할 수 있는, 특히 야생형 청설병 바이러스 캡핑 효소, 야생형 대나무 모자이크 바이러스 캡핑 효소, 야생형 아프리카 돼지열 바이러스 캡핑 효소, 야생형 아칸트아메바 폴리파가 미미바이러스(acanthamoeba polyphaga mimivirus) 캡핑 효소 및 이의 돌연변이체 및 유도체로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 단량체성 바이러스 캡핑 효소 및 보다 특히는 야생형 아프리카 돼지열 바이러스 캡핑 효소일 수 있다.
특히, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 또한 단량체, 즉 하나의 폴리펩티드에 포함될 수 있다.
예를 들면, 상기 단량체는 본 발명에 따르는 단량체성 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 또는 단량체성 키메라 효소일 수 있다.
특히, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 단량체성 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 포함된다. 이 경우, 본 발명의 키메라 효소는, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인을 포함하는, 단량체성 DNA-의존성 RNA 폴리머라제를 포함한다. 상기 단량체성 DNA-의존성 RNA 폴리머라제는 단량체성 파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제일 수 있고, 특히 5' → 3' 방향에서 이본쇄 주형 DNA에 서열 상보성이 있는 일본쇄 RNA를 합성할 수 있는, T7 RNA 폴리머라제, T3 RNA 폴리머라제 및 SP6 RNA 폴리머라제 및 이의 돌연변이체 또는 유도체로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있고, 보다 특히, 5' → 3' 방향에서 이본쇄 주형 DNA에 서열 상보성이 있는 일본쇄 RNA를 합성할 수 있는 T7 RNA 폴리머라제 및 이의 돌연변이체 또는 유도체로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다.
DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인 및 RNA 트리포스파타제의 상기 촉매 도메인 구아닐릴트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인 및 N7 -구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 2개 및 보다 바람직하게는 전체 촉매 도메인은 단량체에 포함될 수 있다.
본 발명의 키메라 효소는 단량체성 또는 올리고머성일 수 있다. 실제로, RNA 트리포스파타제, 구아닐릴트랜스퍼라제, N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제 및 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 하나 또는 수개의 폴리펩티드에 포함될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 키메라 효소는 단량체성일 수 있다.
실제로, 본 발명은 RNA 트리포스파타제의 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 촉매 도메인, N7 -구아닌 메틸트랜스퍼라제의 촉매 도메인 및 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인을 포함하는 단량체성 키메라 효소가, 세포독성 및 아폽토시스 유도 없이, 진핵 번역 장치에 의해 고도로 번역가능한, 5'-말단 m7GpppN 캡을 갖는 RNA 분자를 합성할 수 다는 보고를 확인하였다.
이들의 천연 구조로 유지되어야 하는, 입체 장애 및 성분 및 효소에 기인하여, 전사체의 캡핑이 단량체성 효소로 발생다는 것은 자명하지 않다. 실제로, T7 전사체의 캡핑은, 발생 RNA 분자의 5'-말단에서 m7GpppN 캡을 유발하는 것으로 가정하더라도, 융합 효소 CTD-T7 RNA 폴리머라제에 의해 달성될 수 없다.
본 발명의 단량체성 키메라 효소는, 특히 저렴하고 신속하며 실시가 용이하여 대규모 분석 및 단백질 생산에 상당히 적절하다는 잇점을 갖는다. 실제로, 단량체성 효소의 생산은 올리고머성 효소보다 더욱 용이하다. 또한, 단일-단위만이 존재하기 때문에, 단위 조립 문제가 없다. 단량체성 효소는 또한 다량체성 효소보다 조작이 보다 용이하다.
DNA-의존성 RNA 폴리머라제(RNAP)는 5'→3' 방향에서 이본쇄 주형 DNA에 서열 상보성이 있는 RNA를 합성하는 뉴클레오티딜 트랜스퍼라제에 관한 것이다.
바람직하게는, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 효소의 촉매 도메인이고, 이는 비교적 단순한 구조이고 보다 바람직하게는 게놈 효소 조절 요소(즉, 프로모터, 전사 종결 시그날 및 연쇄 접합)를 특성화한다. 따라서, 특히, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제, 박테리아 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 또는 각종 진핵세포 세포기관(예: 미토콘드리아, 엽록체 및 전색소체)의 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인일 수 있다.
본 발명에서, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인이다. 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제는 특히 진핵세포 RNA 폴리머라제보다 높은 처리능을 가짐으로써 도입 유전자 발현 수준을 최적화하는 잇점을 상당히 갖는다. 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제는 또한, 다중 서브유닛(예: RNA 폴리머라제 II)와 함께 복잡한 구조를 갖는 대부분 핵 진핵세포 폴리머라제보다 훨씬 단순한 구조를 갖는다. 지금까지 특성화된 대부분의 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제는 단일-서브유닛 효소이고, 이는 전사의 개시, 신장 또는 종결을 위해 보조 단백질을 필요로 하지 않는다. 클로닝된 박테리오파지에 대해 명명화된 이들 효소 중의 몇가지는 또한 잘 특성화된 조절 게놈 요소(즉, 프로모터, 종결 시그날, 전사 정지 서열)을 갖고, 이들은 유전자도입에 중요하다.
또한, 내인성 유전자 전사와 도입유전자 전사 사이에 경쟁이 없다. 박테리오파지 DNA 의존성 RNA-폴리머라제 잔기를 포함하는 본 발명에 따르는 키메라 효소는, 임의의 진핵세포 종(예: 효모, 설치류 및 사람)에서 RNA 전사체의 생산을 가능하게 한다. 이들은 저렴하고 신속하며 실시가 용이하여 대규모 분석 및 단백질 생산에 적절하고, RNA 폴리머라제 II 등의 진핵세포 RNA 폴리머라제와 대조적으로, 대부분의 박테리오파지 DNA 의존성 RNA 폴리머라제가 전사의 개시, 신장 또는 종결을 위해 관련 인자를 필요로 하지 않기 때문에, 임의의 생물학적 시스템(예: 세포 반응 혼합물, 배양된 세포 및 살아있는 생물체)에서 RNA 전사체의 생산을 가능하게 한다.
박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인, 특히 T7 RNA 폴리머라제의 야생형, T3 RNA 폴리머라제의 야생형(NCBI 게놈 서열 ID# NC_003298; GeneID# 927437; UniProtKB/Swiss-Prot ID# Q778M8), K11 RNA 폴리머라제의 야생형(NCBI 게놈 K11 RNAP 서열ID# NC_004665; GeneID# 1258850; UniProtKB/Swiss-Prot ID# Q859H5), ψA1122 RNA 폴리머라제의 야생형(NCBI 게놈 서열 ID# NC_004777; GeneID# 1733944; UniProtKB/Swiss-Prot 단백질 ID# Q858N4), ψYeo3-12 RNA 폴리머라제의 야생형(NCBI 게놈 서열 ID# NC_001271; GeneID# 1262422; UniProtKB/Swiss-Prot ID# Q9T145) 및 gh-1 RNA 폴리머라제의 야생형(NCBI 게놈 서열 ID# NC 004665; GeneID# 1258850; UniProtKB/Swiss-Prot 단백질 ID#Q859H5), K1-5 RNAP RNA 폴리머라제의 야생형(NCBI 게놈 서열 ID# NC_008125; GeneID# 5075932 UniProtKB/Swiss-Prot 단백질 ID# Q8SCG8) 및 SP6 RNA 폴리머라제의 야생형(NCBI 게놈 서열 ID# NC_004831; GeneID# 1481778; UniProtKB/Swiss-Prot 단백질 ID# Q7Y5R1) 및 이의 돌연변이체 또는 유도체로 이루어진 그룹에서 선택된 촉매 도메인일 수 있고, 이들은 5'→3' 방향에서 이본쇄 주형 DNA에 서열 상보성이 있는 일본쇄 RNA를 합성할 수 있고, 보다 특히는 T7 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인일 수 있다.
T7 RNA 폴리머라제는 박테리오파지 T7 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 관한 것이다. 바람직하게는, T7 RNA 폴리머라제는 서열번호 1의 아미노산 서열(NCBI 게놈 서열 ID# NC_001604; GeneID# 1261050; UniProtKB/Swiss-Prot ID# P00573)을 갖고, 98.8kDa의 분자량을 갖는 883개 아미노산 단백질이다.
T7 RNA 폴리머라제는 특히, 시험관내에서 당해 효소가 매우 처리능이 있고, 5'→3' 방향에서 37℃에서 240 내지 250 개 뉴클레오티드/s를 신장시킨다. 더욱이, 진핵 세포에서 발현되는 경우, T7 RNA 폴리머라제는 대부분 세포질에서 유지되며[참조: Elroy-Stein and Moss 1990; Gao and Huang 1993; Brisson, He et al. 1999], 따라서 세포질로부터 진핵 세포 핵으로 거대 DNA 분자(즉, 도입유전자)의 활발한 이동 및 핵으로부터 세포질로 RNA 분자의 이출을 피함으로써 도입유전자 발현 수준을 최적화한다.
DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인은 T7 RNA 폴리머라제의 야생형 뿐만 아니라 T7 RNA 폴리머라제의 돌연변이체 중의 하나일 수 있고, 이는 감소된 처리능에서도 5'→3' 방향에서 이본쇄 주형 DNA에 서열 상보성이 있는 일본쇄 RNA를 합성할 수 있다. 예를 들면, 상기 돌연변이체는 R551S, F644A, Q649S, G645A, R627S, I810S 및 D812E로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다.
본 발명의 키메라 효소에서, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 RNA 트리포스파타제의 상기 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인 및 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인에 대해 C-말단에 위치된다.
실제로, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인이 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인, 특히 T7, T3 및 SP6-RNA 폴리머라제로 이루어진 그룹에서 선택된 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인인 경우, 상기 촉매 도메인은 바람직하게는 이의 천연 카복실 말단을 보존한다. 특히, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인, 특히 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인의 C-말단은 상기 키메라 효소의 C-말단에 상응한다. 특히, 키메라 효소가 전체 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제, 특히 T7, T3 및 SP6-RNA 폴리머라제로 이루어진 그룹에서 선택된 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제인 경우, 상기 폴리머라제는 바람직하게는 이의 천연 카복실-말단을 보존한다. 특히, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인, 특히 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인의 C-말단은 상기 키메라 효소의 C-말단에 상응한다. 특히, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인, 특히 T7, T3 및 SP6-RNA 폴리머라제로 이루어진 그룹에서 선택된 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 전체 또는 일부에 포함되고, 이때 상기 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 C-말단은 상기 키메라 효소의 C-말단에 상응한다.
본 발명의 키메라 효소에서, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인, 특히 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인, 특히 T7, T3 및 SP6-RNA 폴리머라제로 이루어진 그룹에서 선택된 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 RNA 트리포스파타제의 상기 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인 및 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인에 대하여 C-말단에 위치된다.
DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 박테리아 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인이다.
바람직하게는, 상기 박테리아 DNA-의존성 RNA 폴리머라제는 적당한 구조 복잡성을 갖는다.
예를 들면, 상기 박테리아 DNA-의존성 RNA 폴리머라제는 대장균(E. coli) DNA-의존성 RNA 폴리머라제(K-12 기질 DH10B ID# NC_010473의 NCBI 게놈 서열)일 수 있고, 이는 4개의 상이한 서브유닛(α 서브유닛: rpoA GeneID# 6060938, UniProtKB/Swiss-Prot ID# B1X6E7; β 서브유닛: rpoB GeneID# 6058462, UniProtKB/Swiss-Prot ID# B1XBY9; β' 서브유닛: rpoC GeneID# 6058956, UniProtKB/Swiss-Prot ID# B1XBZ0; σ 서브유닛: rpoE GeneID# 6060683, UniProtKB/Swiss-Prot ID# B1XBQ0)으로 이루어져 있고, 5개의 ααββ'σ 서브유닛 복합체에서 조립된다. 이. 콜라이 RNA 폴리머라제 프로모터, rho-의존성 및 -독립성 터미네이터 및 전사 중지 서열을 포함하는, 효소 활성의 조절에 수반된 게놈 요소는 잘 특성화되어 있다.
DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 미토콘드리아, 엽록체 및 전색소체와 같이 진핵세포 세포기의 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인이다. 실제로, 이들 폴리머라제는 또한 비교적 단순한 구조를 가질 수 있다.
DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 포유동물 마우스 미토콘드리아 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인일 수 있고, 이는 단일 단위 120 kDa 단백질(GeneID# 216151, UniProtKB/Swiss-Prot ID# Q8BKF1)이고 박테리오파지 RNA 폴리머라제와 상동성을 공유한다. 몇몇 전사 인자는 전사개시, 신장 또는 종결에 요구된다: 전사 종결을 위한 TFB1M (미토콘드리아 전사 인자 Bl; 마우스 GeneID#224481, UniProtKB/Swiss-Prot ID# Q8JZM0) 또는 TFB2M (미토콘드리아 전사 인자 B2; 마우스 GeneID# 15278, UniProtKB/Swiss-Prot ID# Q3TL26), TFAM (미토콘드리아 전사 인자 A; 마우스 GeneID# 21780, UniProtKB/Swiss-Prot ID# P40630), 및 mTERF (미토콘드리아 전사 종결 인자; 마우스 GeneID# 545725, UniProtKB/Swiss-Prot ID# Q8CHZ9). 전사 종결 시그날 뿐만 아니라 미토콘드리아 게놈의 경쇄 및 중쇄에서 2개의 프로모터를 포함하는, 미토콘드리아 RNA 폴리머라제의 효소 활성의 조절에 수반된 게놈 요소는 잘 특성화되어 있다.
RNA 트리포스파타제(RTPase)는, 발생 프리-mRNA의 5' 트리포스페이트 말단의 감마 포스페이트 잔기를 제거하여 디포스페이트로 되게 하는 효소이다.
RNA 구아닐릴트랜스퍼라제(GTase)는, GMP를 GTP로부터 디포스페이트 발생 RNA 말단으로 전달하는 효소를 지칭한다.
N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제(N7-MTase)는, 구아닌의 질소 7상의 메틸 잔기를 GpppN 캡에 부가하는 효소에 관한 것이다.
RNA 트리포스파타제, 구아닐릴트랜스퍼라제, N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인은 동일하거나 상이한 캡핑 효소의 것일 수 있다. 상기 촉매 도메인이 동일한 효소의 것이면, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 상이한 효소의 것이다.
바람직하게는, RNA 트리포스파타제, 구아닐릴트랜스퍼라제, N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인은, 유리하게는 비교적 단순한 구조 및 잘 특성화된 효소 활성을 갖는 하나 또는 수개의 세포질 효소로부터 기원한다. 따라서, 특히, RNA 트리포스파타제, 구아닐릴트랜스퍼라제, N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인은 하나 또는 수개의 바이러스 캡핑 효소, 또는 세포질 에피좀의 캡핑 효소의 촉매 도메인일 수 있다.
RNA 트리포스파타제, 구아닐릴트랜스퍼라제, N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인은 하나 또는 수개의 바이러스 캡핑 효소, 특히 야생형 청설병 바이러스 캡핑 효소, 야생형 대나무 모자이크 바이러스 캡핑 효소, 야생형 아프리카 돼지열 바이러스 캡핑 효소, 야생형 아칸트아메바 폴리파가 미미바이러스캡핑 효소 및 이의 돌연변이체 또는 유도체로 이루어진 그룹에서 선택된 효소의 것이고, 이들은 각각 발생 프리-mRNA의 5' 트리포스페이트 말단의 감마 포스페이트 잔기를 제거하여 디포스페이트로 되게 하거나, GMP를 GTP로부터 디포스페이트 발생 RNA 말단으로 전달하거나, 구아닌의 질소 7 상의 메틸 잔기를 GpppN 캡에 부가할 수 있고, 보다 특히는 야생형 아프리카 돼지열 바이러스 캡핑 효소의 것일 수 있다.
청설병 바이러스 캡핑 효소는 청설병 바이러스(BTV)의 단일-단위 VP4 캡핑 효소에 관한 것이고, 이는 74 kDa 단백질이다(644개 아미노산; 서열의 경우, 예를 들면, NCBI BTV 혈청형 10 게놈 서열 ID# Y00421; GeneID# 2943157; UniProtKB/Swiss-Prot ID# P07132, D0UZ45, Q5J7C0, Q65751, Q8BA65, P33428, P33429, P33427, C3TUP7, Q8BAD5, C5IWW0, B4E551, Q3KVQ2, Q3KVQ1, Q65732, Q3 VP8, Q3KVP9, Q3KVQ0). 이러한 캡핑 효소는 이의 카복실 말단에 인접하여 위치된 류신 지퍼를 통해 호모이량체화할 수 있다. VP4는 mRNA m7GpppN 캡핑 합성에 요구된 모두 3개의 효소 단계를 촉매한다: RTPase, GTase 및 N7-MTase.
대나무 모자이크 바이러스 효소는 ORF1, 대나무 모자이크 바이러스(BMV) mRNA 캡핑 효소에 관한 것이고, 이는 단일-단위 155-kDa 단백질이다(1365-아미노산; NCBI BMV 분리물 BaMV-0 게놈 서열 ID# NC 001642; GeneID# 1497253; UniProtKB/Swiss-Prot ID# Q65005). ORF1 단백질은 m7GpppN mRNA 캡핑, 즉 RTPase , GTase 및 N7-MTase 을 생성하는데 필요한 모든 효소 활성을 갖는다. 또한, ORF1은 RNA-의존성 RNA-폴리머라제 활성을 갖고, 이는 본 발명의 키메라 효소 활성에 지배되지 않으며, mRNA 캡핑 효소의 Asp1229 Asp1230 잔사의 결실에 의해 파괴될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아프리카 돼지열 바이러스 캡핑 효소"는 NP868R 캡핑 효소(G4R), (ASFV)에 관한 것이며, 이는 단일-단위 100 kDa 단백질이다(868 아미노산; NCBI ASFV 게놈 서열 균주 BA71V ID# NC_001659; GeneID# 1488865; UniProtKB/Swiss-Prot ID# P32094).
아칸트아메바 폴리파가 미미바이러스 캡핑 효소는 또다른 단일 단위 136.5 kDa 단백질인 R382(APMV)에 관한 것이다(1170 아미노산; NCBI APMV 게놈 서열 ID# NC_006450; GeneID#3162607; UniProtKB/Swiss-Prot ID# Q5UQX1).
RNA 트리포스파타제, 구아닐릴트랜스퍼라제, N7 -구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인은 pGKL2와 같이 세포질 에피좀의 하나 또는 수개의 캡핑 효소의 것이다. 특히, RNA 트리포스파타제, 구아닐릴트랜스퍼라제, N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인은 효모 선형 염색체외 에피좀 pGKL2의 캡핑 효소의 전부 또는 일부에 포함된다.
세포질 선형 에피좀은 이본쇄 DNA 구조이고, 이는 다양한 효모 균주의 세포질에서 안정하게 복제한다[참조: Cong, Yarrow et al. 1994]. 효모 선형 염색체외 에피좀의 한 가지 프로토타입, pgKL2(13,457 bp; 또한 pGK12로 명명됨)은 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) CB 2359 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) F102-2를 포함하는 다양한 효모 균주로부터 완전히 서열분석되었다[참조:Tommasino, Ricci et al. 1988]. 클루이베로마이세스 락티스 pGKL2의 ORF3 유전자에 의해 인코딩된 캡핑 효소(NCBI 클루이베로마이세스 락티스 CB 2359 pGKL2 게놈 서열 ID# NC_010187; UniProtKB/Swiss-Prot ID# P05469)은 594 아미노산 단백질(70.6 kDa 단백질)이다.
본 발명의 키메라 효소의 한 가지 양태에서, 적어도 2개, 특히 적어도 3개 및 보다 특히는 전체 촉매 도메인은 연결 펩티드에 의해 조립, 융합 또는 직접 또는 간접적으로 결합될 수 있다.
특히, RNA 트리포스파타제의 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 촉매 도메인, N7 -구아닌 메틸트랜스퍼라제의 촉매 도메인 및 DNA-의존성 RNA 폴리머라제로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 2개, 특히 적어도 3개 및 보다 특히는 전체 촉매 도메인은 직접 또는 연결 펩티드에 의해 결합된다.
연결 펩티드는, 입체 장애를 최소화하고 충분한 공간이 융합 단백질의 성분에 제공되어 이들의 천연 배좌를 유지하는 융합 단백질을 생성하는 잇점을 갖는다.
바람직하게는, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 적어도 상기 촉매 도메인은 RNA 트리포스파타제의 상기 촉매 도메인; 구아닐릴트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인; 및 N7 -구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 촉매 도메인에 연결 펩티드에 의해 결합된다.
특히, 연결 펩티드는 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인, 특히 T7, T3 및 SP6-RNA 폴리머라제로 이루어진 그룹에서 선택된 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인에 대해 N-말단에 위치할 수 있고, RNA 트리포스파타제의 상기 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인 및 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인에 대해 C-말단에 위치할 수 있다.
특히, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인, 특히 T7, T3 및 SP6-RNA 폴리머라제로 이루어진 그룹에서 선택된 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인의 N-말단은, RNA 트리포스파타제의 상기 촉매 도메인,구아닐릴트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인 및 N7 -구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나의 촉매 도메인의 C-말단에 공유 결합, 특히 연결 펩티드에 의해 연결된다.
상기 연결 펩티드는 화학식 (GlymSerp)n의 펩티드(여기서, m은 0~12의 정수, 특히 1~8의 정수 및 보다 특히는 3~6 및 보다 특히 4의 정수이고, p는 0~6의 정수, 특히 0~5의 정수, 보다 특히 0~3 및 특히 1의 정수이고, n은 0~30의 정수, 특히 0~12, 보다 특히 0~8 및 더욱 특히 1~6의 정수이다),
서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
화학식(GlymSerp)n의 가요성 링커 펩티드는, 글리신 잔기가 펩티드 가요성을 제공하고 세린이 일부 가용성을 제공하는 잇점을 갖는다. 추가로, 화학식 (GlymSerp)n 링커 서열 중의 키로트립신 I, 인자 Xa, 파파인, 플라스민, 트롬빈 및 트립신에 대한 감수성 부위의 부재는 생성 융합 단백질의 전체 안정성을 증가시키는 것으로 생각된다.
가변 길이의 화학식 (GlymSerp)n 링커는 일본쇄 Fv 단편(sFv) 항체를 작제하기 위해 통상 사용된다. 또한, 화학식 (GlymSerp)n 링커는 각종 융합 단백질을 생성하기 위해 사용되었고, 이는 종종 이들의 성분 각각의 생물학적 활성을 보유한다.
다른 형태의 펩티드 링커는 또한 본 발명에 따르는 키메라 효소, 예를 들면, GGGGIAPSMVGGGGS(서열번호 6), SPNGASNSGSAPDTSSAPGSQ(서열번호 7), EGKSSGSGSESKSTE(서열번호 8), EGKSSGSGSESKEF(서열번호 9), GGGSGGGSGGGTGGGSGGG(서열번호 10)], GSTSGSGKSSEGKG(서열번호 11), YPRSIYIRRRHPSPSLTT(서열번호 12), GSTSGSGKPGSGEGSTKG(서열번호 13), GSTSGSGKPGSGEGS(서열번호 14), SSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDA(서열번호 l5), GSADDAXXDAAXKDDAKKDDAKKDGS(서열번호 16), LSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDL(서열번호 17), AEAAAKEAAAKEAAAKA(서열번호 18), GSHSGSGKP(서열번호 19), GSTSGSGKPGSGEGSTGAGGAGSTSGSGKPSGEG(서열번호 20), LSLEVAEEIARLEAEV (서열번호 21), 및 GTPTPTPTPTGEF(서열번호 22)을 생성하는 것으로 고려될 수 있다.
다른 종류의 공유 결합은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 디설파이드 결합, 트랜스글루타민화 및 화학적 및/또는 물리적 제제에 의한 단백질 트랜스-결합, 예를 들면, 트리스(비피리딘)루테늄(II)-디클로라이드 및 자외선광 조사를 포함한다.
RNA 트리포스파타제, 구아닐릴트랜스퍼라제, N7 -구아닌 메틸트랜스퍼라제 및 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 또한 특정한 단백질 요소, 예를 들면, 류신 지퍼에 의해 조립될 수 있고, 예를 들면, 본 발명에 따르는 키메라 효소에서 비오티닐화 도메인을 촉매 도메인의 하나(예: Avi-tag II 또는 PFBtag) 및 비오틴 결합 도메인을 다른 촉매 도메인의 하나(예를 들면, 스트렙-tagII 또는 nono-tag)로 조립될 수 있다.
본 발명에 따르는 키메라 효소의 한 가지 양태에서, 적어도 2개의 상기 촉매 도메인은 비공유 결합, 특히 류신 지퍼에 의해 조립될 수 있다.
바람직하게는, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 적어도 상기 촉매 도메인은 비공유 결합, 특히 류신 지퍼에 의해 RNA 트리포스파타제의 상기 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인 및 N7 -구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인으로 이루어진 그룹에서 선택된 촉매 도메인의 적어도 하나로 조립될 수 있다.
서로 상호작용하는 2개의 양쪽성 α-헬릭스로 이루어진 이량체성 나선형-코일 단백질 구조인 류신 지퍼는 통상 단백질을 호모- 또는 헤테로-이량체화하는데 사용된다. 각각의 헬릭스는 7개의 아미노산의 반복체로 이루어져 있고, 여기서 제1 아미노산(잔기 a)는 소수성이며, 제4 아미노산(잔기 d)는 통상 류신이며, 다른 잔기는 극성이다. 평행한 헤테로이량체성 2본쇄 나선형 코일 구조를 형성하는 류신 지퍼 VELCRO ACID-p1 및 BASE-p1은 평행 단백질 헤테로-이량체를 형성하는 높은 경향을 갖는다. 이들은 몇몇 가용성 단백질] 뿐만 아니라 구성원 단백질을 헤테로이량체화하는데 사용되었다.
다른 종류의 올리고머화 펩티드 도메인은 또한 본 발명에 따르는 키메라 효소를 생성하고 본 발명에 따르는 키메라 효소의 적어도 2개의 상기 도메인, 특히 항평행 헤테로이량체성 구조를 형성하는 류신 지퍼, 예를 들면, ACID-al/BASE-al, ACID-Kg/BASE-Eg, NZ/CZ, ACID-pLL/ BASE-pLL 및 EE1234L 및 RR1234L 류신 지퍼를 조립하는 것으로 생각된다. 류신 지퍼의 디설파이드-연결된 버젼은 또한 본 발명에 따르는 디설파이드 나선형 코일-결합된 헤테로이량체성 키메라 효소 뿐만 아니라 환원 조건하에 시스테인 잔기 사이의 쇄간 디설파이드 브릿지를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, RNA 트리포스파타제, 구아닐릴트랜스퍼라제, N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제 및 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 적어도 2개의 상기 촉매 도메인은 류신지퍼, 특히 항평행 헤테로이량체성 구조를 형성하는 류신지퍼, 예를 들면, ACID-al/BASE-al, ACID-Kg/BASE-Eg, NZ/CZ 및 ACID-pLL/ BASE-pLL 류신지퍼, 디설파이드 나선형 코일-결합된 지퍼, 및 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 브릿지에 의해 조립될 수 있다.
본 발명의 키메라 효소는, 특히 링커 및 보다 특히는 화학식 (Gly3Ser)4 링커를 통해 5'→3' 방향에서 이본쇄 주형 DNA에 서열 상보성이 있는 일본쇄 RNA를 합성할 수 있는 야생형 T7 RNA 폴리머라제 또는 이의 돌연변이체 또는 유도체의 아미노 말단, 특히 T7 RNA 폴리머라제의 야생형에 융합된, RNA 분자의 5'-말단에서 m7GpppN 캡을 부가할 수 있는, 아프리카 돼지열 바이러스의 야생형 mRNA 캡핑 효소 또는 이의 돌연변이체 또는 유도체, 특히 야생형 아프리카 돼지열 바이러스 캡핑 효소를 포함한다.
본 발명의 키메라 효소는, 특히 링커 및 보다 특히는 화학식 (Gly3Ser)4 링커를 통해 5'→3' 방향에서 이본쇄 주형 DNA에 서열 상보성이 있는 일본쇄 RNA를 합성할 수 있는 야생형 T3 RNA 폴리머라제 또는 이의 돌연변이체 또는 유도체의 아미노 말단, 특히 T3 RNA 폴리머라제의 야생형에 융합된, RNA 분자의 5'-말단에서 m7GpppN 캡을 부가할 수 있는, 아프리카 돼지열 바이러스의 야생형 mRNA 캡핑 효소 또는 이의 돌연변이체 또는 유도체, 특히 야생형 아프리카 돼지열 바이러스 캡핑 효소를 포함한다.
본 발명의 키메라 효소는, 특히 링커 및 보다 특히는 화학식 (Gly3Ser)4 링커를 통해 5'→3' 방향에서 이본쇄 주형 DNA에 서열 상보성이 있는 일본쇄 RNA를 합성할 수 있는 야생형 SP6 RNA 폴리머라제 또는 이의 돌연변이체 또는 유도체의 아미노 말단, 특히 SP6 RNA 폴리머라제의 야생형에 융합된, RNA 분자의 5'-말단에서 m7GpppN 캡을 부가할 수 있는, 아프리카 돼지열 바이러스의 야생형 mRNA 캡핑 효소 또는 이의 돌연변이체 또는 유도체, 특히 야생형 아프리카 돼지열 바이러스 캡핑 효소를 포함한다.
본 발명의 키메라 효소는, 류신 지퍼에 의해 조립된, RNA 분자의 5'-말단에서 m7GpppN 캡을 부가할 수 있는, 아프리카 돼지열 바이러스의 야생형 mRNA 캡핑 효소 또는 이의 돌연변이체 또는 유도체, 특히 야생형 아프리카 돼지열 바이러스 캡핑 효소 및 5'→3' 방향에서 이본쇄 주형 DNA에 서열 상보성이 있는 일본쇄 RNA를 합성할 수 있는, 야생형 T7 RNA 폴리머라제 또는 이의 돌연변이체 또는 유도체의 아미노 말단, 특히 T7 RNA 폴리머라제의 야생형을 포함한다.
본 발명에 키메라 효소는, 본 발명의 키메라 효소의 적어도 하나의 촉매 도메인, 특히 RNA 트리포스파타제의 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 촉매 도메인, N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 촉매 도메인 및 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 촉매 도메인의 활성을 증강시키는 도메인을 추가로 포함한다.
예를 들면, 본 발명의 키메라 효소의 적어도 하나의 촉매 도메인의 활성을 증강시키는 상기 도메인은, 고유한 효소 활성은 없지만 백시니아 mRNA 캡핑 효소의 D1R 서브유닛의 RNA N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제 활성을 현저히 증강시키는, 백시니아 바이러스 D12L 유전자에 의해 인코딩된 31-kDa 서브유닛일 수 있다(게놈 서열 ID#NC_006998.1; GeneID#3707515; UniProtKB/Swiss-Prot ID#YP_232999.1).
본 발명의 키메라 효소는, 특히 링커 및 보다 특히는 화학식 (Gly3Ser)4 링커 및/또는 류신 지퍼에 의해 전체 또는 부분으로 조립된, RNA-트리포스파타제, RNA 구아닐릴트랜스퍼라제 및 RNA-구아닌 메틸트랜스퍼라제 효소 활성을 갖는, 백시니아 mRNA 캡핑 효소의 적어도 하나의 촉매 도메인, 특히 백시니아 바이러스 D1R 유전자에 의해 인코딩된 95 kDa 서브유닛(genomic sequence ID# NC 006998.1; GeneID# 3707562; UniProtKB/Swiss-Prot ID# YP 232988.1); - DNA-의존성 RNA 폴리머라제, 특히 T7, T3 및 SP6-RNA 폴리머라제로 이루어진 그룹에서 선택된 폴리머라제 및 보다 특히는 T7 RNA 폴리머라제의 적어도 하나의 촉매 도메인 및 백시니아 바이러스 D12L 유전자에 의해 인코딩된 31-kDa를 포함한다.
본 발명은 또한 분리된 핵산 분자 또는 분리된 핵산 분자의 그룹에 관한 것이며, 상기 핵산 분자(들)는 본 발명에 따르는 키메라 효소를 인코딩한다.
본 발명의 키메라 효소를 인코딩하는 분리된 핵산 분자의 상기 그룹은, 이들의 발현에 의해 본 발명에 따르는 키메라 효소를 수득하는데 필요하고 충분한 모든 핵산 분자를 포함하거나 이들로 이루어진다.
본 발명의 키메라 효소를 인코딩하는 분리된 핵산 분자의 상기 그룹은 RNA 트리포스파타제의 적어도 하나의 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 적어도 하나의 촉매 도메인 및 N7 -구아닌 메틸트랜스퍼라제의 적어도 하나의 촉매 도메인을 인코딩하는 핵산 분자 및 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 적어도 하나의 촉매 도메인을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하거나 이들로 이루어진다.
본 발명의 키메라 효소를 인코딩하는 분리된 핵산 분자의 상기 그룹은 RNA 트리포스파타제의 적어도 하나의 촉매 도메인을 인코딩하는 핵산 분자, 구아닐릴트랜스퍼라제의 적어도 하나의 촉매 도메인을 인코딩하는 핵산 분자, N7 -구아닌 메틸트랜스퍼라제의 적어도 하나의 촉매 도메인을 인코딩하는 핵산 분자 및 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 적어도 하나의 촉매 도메인을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하거나 이들로 이루어진다.
본 발명의 핵산 분자는, 진핵세포 DNA 의존성 RNA 폴리머라제, 바람직하게는 RNA 폴리머라제 II를 위한 프로모터 및 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인을 위한 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나, 바람직하게는 전체 프로모터(들)에 작동적으로 연결될 수 있다.
진핵세포 DNA 의존성 RNA 폴리머라제, 바람직하게는 RNA 폴리머라제 II를 위한 프로모터에 대한 핵산의 연결은 현저하게는, 본 발명의 키메라 효소가 진핵 숙주 세포에서 발현되는 경우, 당해 키메라 효소의 발현은 진핵 RNA 폴리머라제, 바람직하게는 RNA 폴리머라제 II에 의해 유도된다는 잇점을 갖는다. 이들 키메라 효소는 또한 도입유전자의 전사를 개시할 수 있다. 조직 특이적 RNA 폴리머라제 II 프로모터가 사용되는 경우, 본 발명의 키메라 효소는 표적 조직/세포에서 선택적으로 발현될 수 있다.
상기 프로모터는 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 구조 프로모터 또는 유도 프로모터일 수 있다. 당해 프로모터는 발달상 조절될 수 있고, 유도성 또는 조직 특이성일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 상기 벡터는 반-안정한 또는 안정한 발현에 적절할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 분리된 핵산 분자의 상기 그룹을 포함하는 벡터 그룹에 관한 것이다.
특히, 본 발명의 상기 벡터는 클로닝 또는 발현 벡터이다.
당해 벡터는 박테리오파지 등의 바이러스 벡터 또는 플라스미드 벡터 등의 비바이러스성 벡터일 수 있다.
본 발명의 상기 벡터는, 특히 본 본 발명의 핵산 분자, 및 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인 및/또는 목적하는 적어도 하나의 DNA 서열을 위한 프로모터를 포함하는 비시스트로닉 벡터(bicistronic vector)이고, 상기 DNA 서열은 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인을 위한 프로모터에 작동적으로 연결된다.
본 발명의 상기 벡터는 또한 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인을 위한 프로모터를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 분리된 핵산 분자 또는 본 발명의 분리된 핵산 분자 그룹 또는 본 발명의 벡터 또는 본 발명의 벡터 그룹을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명의 숙주 세포는 대규모 단백질 생산에 유용할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 DNA-폴리머라제 RNA 폴리머라제 키메라 효소의 상기 촉매 도메인은 내인성 유전자 전사와 도입유전자 전사 사이의 경쟁을 방지하기 위해 숙주 세포의 것과는 상이한 효소의 것이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 키메라 효소를 발현하는 유전자 조작된 비사람 진핵 생물에 관한 것이다.
상기 비사람 진핵 생물은 임의의 비사람 동물 및 식물일 수 있다.
본 발명은 또한, 5'-말단 m7 GpppN 캡을 갖는 RNA 분자를 생산하기 위한, 본 발명에 따르는 키메라 효소 또는 본 발명에 따르는 분리된 핵산 분자 또는 본 발명에 따르는 분리된 핵산 분자 그룹의 특히 시험관내 또는 생체외에서의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 특히 진핵세포 시스템, 예를 들면, 시험관내 합성된 단백질 분석 또는 배양된 세포에서단백질, 특히 항체와 같은 치료학적 목적의 단백질을 생산하기 위한, 본 발명에 따르는 키메라 효소, 본 발명에 따르는 분리된 핵산 분자 또는 본 발명에 따르는 분리된 핵산 분자 그룹의 시험관내 또는 생체외 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, DNA 서열에 의해 인코딩된 5'-말단 m7 GpppN 캡을 갖는 RNA 분자를 숙주 세포에서 생산하는 특히 시험관내 또는 생체외 방법으로서, 상기 방법은 숙주 세포에서 본 발명에 따르는 핵산 분자 또는 본 발명에 따르는 분리된 핵산 분자의 그룹을 발현시키는 단계를 포함하고, 상기 DNA 서열은 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인에 대한 프로모터에 작동적으로 연결되어 있고, 특히 상기 프로모터는 상기 숙주 세포에서 효과적인, 시험관내 또는 생체외 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 키메라 효소의 DNA-의존성 RNA-폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 내인성 유전자 전사와 상기 DNA 서열 전사 사이의 경쟁을 방지하기 위해 숙주 세포의 것과는 상이한 효소의 것이다.
III. 자가전사 RNA/DNA 시스템의 변형
본 발명의 자가전사 RNA/DNA 시스템을 구성하는 상기 DdRp RNA 발현 카세트, auto_DdRp 발현 카세트, DNAes 발현 카세트 또는 auto_(DdRp+DNAes) 발현 카세트는 염기서열 변형(SM)을 적어도 하나를 포함할 수 있다.
본 발명의 자가전사 RNA/DNA 시스템은 RNA 및 DNA로 구성된다. 상기 DdRp RNA 발현 카세트는 DdRp 오픈 리딩 프레임(ORF), 5'UTR 및 3'UTR를 포함하는 DdRp mRNA이고 5'-cap 구조, 화학적 변형(CM) 및 염기서열 변형(SM)을 포함할 수 있으며, 이들 증 SM이 결여하면 캡된 CM_DdRp mRNA이라고 하고, 이들을 모두 포함하면 캡된 CM/SM_DdRp mRNA이라고 하였다.
본 발명의 "캡된 CM/SM_DdRp mRNA를 포함하는 DdRp RNA 발현 카세트"는 SM_DdRp mRNA에 화학적 변형된 뉴클레오타이드를 포함하여 CM/SM_DdRp mRNA를 제조하고 5'-cap 구조를 추가한 발현 카세트로, 특정 시점에 측정된 상기 캡된 CM/SM_mRNA로부터 생산된 단백질 또는 펩타이드의 양이 CM이 결여된 SM_DdRp mRNA("캡된 SM_DdRp mRNA")와 비교하여 증가하였다. 여기서 DdRp mRNA는 DdRp 발현을 증가시키는 CM 및 SM으로 이루어진 변형에서 적어도 하나의 변형을 포함한다. 상기 DdRp 발현은 CM와 SM이 포함된 CM/SM_DdRp mRNA의 투여에 의해 추가로 증가하였다. 캡된 CM/SM_DdRp mRNA에서 CM/SM의 적어도 하나에 따른 단백질 생산의 증가는 본원에서 "CM/SM_DdRp mRNA-연관 단백질 발현"로서 언급된다.
본 발명은 DdRp RNA 발현 카세트는 상기 DdRp mRNA의 안정성, 복제, 전사 및 번역을 관리하는 요소들을 포함하는 을 제공한다. 만약 본 발명의 DdRp RNA 발현 카세트 방법과 기존의 핵-의존적 프로모터를 갖는 plasmid DNA 방법을 비교하여 사용된다면, DdRp RNA 발현 카세트 방법의 단백질 생산의 증가는 본원에서 "DdRp RNA 발현 카세트-연관 증가"로서 언급하였다.
본 발명의 "DdRp RNA 발현 카세트-연관 단백질 발현"는 특정 기간 동안 측정된 캡된 CM/SM_DdRp mRNA로부터 생산된 단백질이 CM/SM이 결여된 참조 DdRp mRNA로부터 생산된 단백질의 총량과 비교하여 증가되는 상황, 또는 특정 시점에 측정된 캡된 CM/SM_DdRp mRNA로부터 생산된 단백질 수준이 CM/SM이 결여된 참조 DdRp mRNA로부터 생산된 단백질 수준과 비교하여 증가되는 상황을 나타낸다.
본 발명에서 상기 DNAes 발현 카세트는 적어도 하나의 발현억제 RNA DNA, 5'UTR 및 3'UTR를 포함하는 DNAes를 코딩하고, 염기서열 변형(SM)을 포함할 수 있으며, 이를 SM_DNAes이라고 하였다. 상기 DNAes 발현 카세트는 SM_DNAes를 코딩화할 수 있다.
여기에 추가적으로 auto_DdRp DNA 발현 카세트의 DdRp DNA를 포함할 수 있으며, 또한 염기서열 변형(SM)을 포함할 수 있고 auto_DdRp DNA라고 하였다.
본 발명에서는 염기서열 변형(SM)이 있는 mRNA를 코팅하는 SM_DNAes도 특정 시점에 측정된 상기 SM_DNAes로부터 생산된 단백질 또는 펩타이드의 양이 염기서열 SM이 결여된 DNA와 비교하여 증가한다. 본 발명의 RNA/DNA 시스템의 개념에서, 본 발명의 DdRp RNA 발현 카세트와 더불어 SM_DNAes를 포함하는 DNAes 발현 카세트를 세포/조직에 전환한 경우, 상기 SM_DNAes가 코딩하는 DNAes의 발현을 증가시킨다. DNA의 SM에 따른 단백질 생산의 증가는 본원에서 "SM_DNA-연관 단백질 발현"로서 언급된다.
본 발명에 따르면, SM_DNAes 분자가 제공되며, 이는 SM이 결여된 각각의 DNAes("참조 DNAes")와 비교하여 코딩된 RNA의 증가된 전사에 의해 특징화된다. SM_DNAes에 의한 생체 내(in vivo) RNA 생산을 평가하기 위해서, 코딩된 RNA의 전사는 표적 세포/조직 내로 SM_DNAes에 따라 결정되며, 참조 DNAes의 전사 전사와 비교된다.
본 발명에 따르면, DNAes DNA 분자는 코딩된 RNA의 전사를 향상하기 위해서 SM이 될 수 있다("SM_DNAes-연관 증가"). 거기서, SM은 코딩된 RNA의 전사만큼 임의의 특정 구조에 한정되지 않고 본원에 정의된 바와 같은 참조 DNAes와 비교하여 증가된다. 여러 DNA 변형체는 당 업계에 알려져 있으며, 본 발명에서 주어진 DNAes로 적용할 수 있다.
기존의 핵-의존적 프로모터를 갖는 plasmid 이용한 핵에서의 mRNA 발현 방법은 세포막 투과에 비해 그 효율이 1%에 불과한 핵막 투과에 의존하는바, RNA의 발현 억제 효율이 매우 낮다. 또한, 핵에서 발현된 mRNA는 세포질로 배출되어야만 RNA 발현에 관여할 수 있는 mRNA로 합성이 가능하나, 이러한 세포질로의 분출에 관여하는 엑스포틴(exportin)-5 운반체가 고농도의 mRNA에 의하여 포화되는 문제로 인해 다른 세포내 기능에 관여하는 mRNA의 세포질 분출까지도 방해하는 문제를 수반한다.
본 발명의 안정적인 DNAes 발현용 조성물인 RNA/DNA 시스템에서 핵-비의존적으로 DdRp RNA 발현 카세트는 세포질 내에서 DdRp의 발현을 증가시켜 auto_DdRp 발현 카세트 및 상기 DNAes 발현 카세트의 T7 프로모터 하류에 위치한 DdRp 및 DNAes 발현을 장기간 안정적으로 발현시키는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 DNAes의 안정적 발현은 상기 조성물로부터 세포질 내 장기간 안정적으로 DNAes를 생성하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
변형 RNA의 5'-말단(5' 캡)의 변형:
본 발명의 DdRp RNA 발현 카세트는 소위 "5' 캡(CAP)" 구조의 첨가에 의해 변형될 수 있다.
5'-캡(cap)은 독립체, 일반적으로 성숙한 mRNA의 5'-말단을 "덮는(caps)" 일반적으로 변형 독립체이다. 5'-캡(cap)은 일반적으로 변형, 특히 구아닌 뉴클레오타이드의 유도체에 의해 형성될 수 있다. 바람직하게, 5'-캡(cap)은 5'-5'-트리포스페이트 결합을 통해 5'-말단에 연결된다. 5'-캡(cap)은 메틸화될 수 있으며, 예를 들어, m7GpppN, 여기서 N은 5'-캡(cap), 일반적으로 RNA의 5'-말단을 운반하는 핵산의 말단 5' 뉴클레오타이드이다. m7GpppN은 폴리머라아제 II에 의해 전사된 mRNA에서 자연적으로 발생하는 5'-캡(CAP) 구조이고, 따라서, 본 발명에 따른 CM/SM_mRNA에 포함된 SM으로서 간주되지 않는다. 이는 본 발명에 따른 CM/SM_mRNA는 5'-캡(CAP)으로서 m7GpppN을 포함할 수 있는 것을 의미하지만, 추가적으로 SM_DNAes는 본 원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 추가의 SM을 포함한다.
추가적인 5'캡(cap) 구조의 예로는 글리세릴, 역(inverted) 데옥시 무염기 잔기(성분), 4',5' 메틸렌 뉴클레오타이드, 1-(베타-D-에리스로퓨라노실)뉴클레오타이드, 4'-티오 뉴클레오타이드, 카보사이클릭 뉴클레오타이드, 1,5-안하이드로헥시톨 뉴클레오타이드, L-뉴클레오타이드, 알파-뉴클레오타이드, 화학적 변형된 염기 뉴클레오타이드, 트레오-펜토퓨라노실 뉴클레오타이드, 아사이클릭(acyclic) 3',4'-세코(seco) 뉴클레오타이드, 아사이클릭 3,4-디하이드록시부틸 뉴클레오타이드, 아사이클릭 3,5 디하이드록시펜틸 뉴클레오타이드, 3'-3'-역 뉴클레오타이드 성분, 3'-3'-역 무염기 성분, 3'-2'-역 뉴클레오타이드 성분, 3'-2'-역 무염기 성분, 1,4-부탄디올 포스페이트, 3'-포스포라미데이트, 헥실포스페이트, 아미노헥실 포스페이트, 3'-포스페이트, 3'포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 가교(bridging) 또는 비-가교(non-bridging) 메틸포스포네이트 성분을 포함한다. 이들 화학적 변형된 5'-캡(CAP) 구조는 본 발명에 따른 SM_DNAes에 포함된 적어도 하나의 SM으로 여겨진다.
특히 바람직한 화학적 변형된 5'-캡(CAP) 구조는 CAP1(m7G 인접 뉴클레오타이드의 리보오스의 메틸화), CAP2(m7G의 제 2 뉴클레오타이드 다운스트림의 리보오스의 메틸화), CAP3(m7G의 제 3 뉴클레오타이드 다운스트림의 리보오스의 메틸화), CAP4(m7G의 제 4 뉴클레오타이드 다운스트림의 리보오스의 메틸화), ARCA(항-역 캡(CAP) 유사체, 화학적 변형된 ARCA (e.g. phosphothioate modified ARCA), 이노신, N1-메틸-구아노신, 2'-플루오로-구아노신, 7-데아자-구아노신, 8-옥소-구아노신, 2-아미노-구아노신, LNA-구아노신, 및 2-아지도-구아노신이다.
화학적 변형(CM)
"뉴클레오타이드의 화학적 변형"은 당 변형 또는 염기 변형뿐만 아니라 백본 변형을 포함하는 화학적 변형을 나타낼 수 있다.
본 발명의 화학적 변형 RNA 분자는 뉴클레오타이드 유사체/변형체, 예를 들어, 백본 변형체, 당 변형체 또는 염기 변형체를 함유할 수 있다. 본 발명과 관련된 백본 변형은 본원에 정의된 바와 같은 핵산 분자에 함유된 뉴클레오타이드의 백본의 포스페이트가 화학적으로 변형된 변형이다. 본 발명과 관련된 당 변형은 본원에 정의된 바와 같은 핵산 분자의 뉴클레오타이드의 당의 변형이다. 더욱이, 본 발명과 관련된 염기 변형은 핵산 분자의 핵산 분자의 뉴클레오타이드 염기 성분의 변형이다. 뉴클레오타이드 유사체 또는 변형체는 바람직하게 전사 및/또는 번역에 적용할 수 있는 뉴클레오타이드 유사체로부터 선택된다.
1) 당 변형체(Sugar Modifications):
본 발명의 변형 RNA 내로 포함될 수 있는 화학적 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 당 성분에서 화학적 변형될 수 있다. 예를 들어, 2' 하이드록실기(OH)는 상이한 수의 "옥시" 또는 "데옥시" 치환체와 함께 SM되거나 치환될 수 있다. "옥시" -2'하이드록실기 화학적 변형체의 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 알콕시 또는 아릴옥시(-OR, 예를 들어, R = H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당); 폴리에틸렌글리콜(PEG), -0(CH2CH2o)nCH2CH2OR; 2' 하이드록실이 예를 들어, 메틸렌 다리(methylene bridge)에 의해 동일한 리보오스 당의 4' 탄소에 연결된 "잠금(locked)" 핵산(LNA); 아미노기(-O-아미노, 여기서 아미노기 예를 들어, NRR은 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노, 에틸렌 디아민, 폴리아미노일 수 있다) 또는 아미노알콕시를 포함한다.
"데옥시" 변형체는 하이드로겐, 아미노(예를 들어, NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 디헤테로아릴 아미노, 또는 아미노산); 또는 연결자(linker)를 통해 당에 부착될 수 있는, 여기서 상기 연결자는 원자, C, N 및 O 중 하나 이상의 원자를 포함하는 아미노기를 포함한다.
당기(sugar group)는 또한 리보오스 내 상응하는 탄소와 반대의 입체화학적 배열을 가지는 하나 이상의 탄소를 함유할 수 있다. 따라서, SM_mRNA는 예를 들어, 당으로서 아라비노스를 함유하는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
2) 백본 변형체(Backbone Modifications):
포스페이트 백본은 또한, 본원에 설명된 바와 같이, 변형 RNA 내로 포함될 수 있는 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드로 변형될 수 있다. 백본의 포스페이트기는 상이한 치환체를 갖는 하나 이상의 산소 원자를 치환함으로써 변형될 수 있다. 또한, 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 본원에 설명된 바와 같은 변형된 포스페이트를 갖는 비화학적 변형된 포스페이트 성분의 총 치환을 포함할 수 있다. 변형된 포스페이트기의 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스테르, 하이드로겐 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르를 포함한다. 포스포로티오에이트는 황(sulfur)으로 치환된 모두 비-연결된 산소를 갖는다. 포스페이트 연결자는 또한 연결된 산소가 질소(가교 포스포로아미데이트), 황(가교 포스포로티오에이트) 및 탄소(가교 메틸렌-포스포네이트)의 치환에 의해 SM될 수 있다.
3) 염기 변형체(base modifications):
본원에 설명된 바와 같이, 변형 RNA 내로 포함될 수 있는 화학적 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 핵염기 성분(moiety)에서 추가로 변형될 수 있다. RNA에서 발견되는 핵염기의 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 아데닌, 구아닌, 사이토신 및 우라실이 포함된다. 예를 들어, 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 주홈면(major groove face)에서 화학적으로 변형될 수 있다. 화학적 변형체는 아미노기, 티올기, 알킬기, 또는 할로기를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 뉴클레오타이드 유사체/변형체는 염기 변형체로부터 선택되며, 이는 바람직하게 2-아미노-6-클로로퓨린리보사이드-5'-트리포스페이트, 2-아미노퓨린-리보사이드-5'-트리포스페이트; 2-아미노아데노신-5'-트리포스페이트, 2'-아미노-2'-데옥시사이티딘-트리포스페이트, 2-티오사이티딘-5'-트리포스페이트, 2-티오우리딘-5'-트리포스페이트, 2'-플루오로티미딘-5'-트리포스페이트, 2'-O-메틸 이노신-5'-트리포스페이트 4-티오우리딘-5'-트리포스페이트, 5-아미노알릴사이티딘-5'-트리포스페이트, 5-아미노알릴우리딘-5'-트리포스페이트, 5-브로모사이티딘-5'-트리포스페이트, 5-브로모우리딘-5'-트리포스페이트, 5-브로모-2'-데옥시사이티딘-5'-트리포스페이트, 5-브로모-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트, 5-요오도사이티딘-5'-트리포스페이트, 5-요오도-2'-데옥시사이티딘-5'-트리포스페이트, 5-요오도우리딘-5'-트리포스페이트, 5-요오도-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트, 5-메틸사이티딘-5'-트리포스페이트, 5-메틸우리딘-5'-트리포스페이트, 5-프로피닐-2'-데옥시사이티딘-5'-트리포스페이트, 5-프로피닐-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트, 6-아자사이티딘-5'-트리포스페이트, 6-아자우리딘-5'-트리포스페이트, 6-클로로퓨린리보사이드-5'-트리포스페이트, 7-데아자아데노신-5'-트리포스페이트, 7-데아자구아노신-5'-트리포스페이트, 8-아자아데노신-5'-트리포스페이트, 8-아지도아데노신-5'-트리포스페이트, 벤지미다졸-리보사이드-5'-트리포스페이트, N1-메틸아데노신-5'-트리포스페이트, N1-메틸구아노신-5'-트리포스페이트, N6-메틸아데노신-5'-트리포스페이트, O6-메틸구아노신-5'-트리포스페이트, 슈도우리딘-5'-트리포스페이트, 또는 퓨로마이신-5'-트리포스페이트, 잔토신-5'-트리포스페이트로부터 선택된다. 5-메틸사이티딘-5'-트리포스페이트, 7-데아자구아노신-5'-트리포스페이트, 5-브로모사이티딘-5'-트리포스페이트, 및 슈도우리딘-5'-트리포스페이트로 이루어진 염기-CM의 군으로부터 선택된 염기 SM을 위한 뉴클레오타이드가 특히 바람직하다.
변형된 뉴클레오사이드는 피리딘-4-온 리보뉴클레오사이드, 5-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드록시우리딘, 3-메틸우리딘, 5-카복시메틸-우리딘, 1-카복시메틸-슈도우리딘, 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸우리딘, 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘, l-타우리노메틸-4-티오-우리딘, 5-메틸-우리딘, 1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-l-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 디하이드로우리딘, 디하이드로슈도우리딘, 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-메톡시우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 및 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘을 포함한다.
변형된 뉴클레오사이드는 5-아자-사이티딘, 슈도이소사이티딘, 3-메틸-사이티딘, N4-아세틸사이티딘, 5-포밀사이티딘, N4-메틸사이티딘, 5-하이드록시메틸사이티딘, 1-메틸-슈도이소사이티딘, 피롤로-사이티딘, 피롤로-슈도이소사이티딘, 2-티오-사이티딘, 2-티오-5-메틸-사이티딘, 4-티오-슈도이소사이티딘, 4-티오-1-메틸-슈도이소사이티딘, 4-티오-1-메틸-1-데아자-슈도이소사이티딘, 1-메틸-1-데아자-슈도이소사이티딘, 제부라린, 5-아자-제부라린, 5-메틸-제부라린, 5-아자-2-티오-제부라린, 2-티오-제부라린, 2-메톡시-사이티딘, 2-메톡시-5-메틸-사이티딘, 4-메톡시-슈도이소사이티딘, 및 4-메톡시-l-메틸-슈도이소사이티딘을 포함한다.
변형된 뉴클레오사이드는 2-아미노퓨린, 2, 6-디아미노퓨린, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-8-아자-아데닌, 7-데아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-2,6-디아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2,6-디아미노퓨린, 1-메틸아데노신, N6-메틸아데노신, N6-이소펜테닐아데노신, N6-(시스-하이드록시이소펜테닐)아데노신, 2-메틸티오-N6-(시스-하이드록시이소펜테닐)아데노신, N6-글리시닐카바모일아데노신, N6-트레오닐카바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-트레오닐카바모일아데노신, N6,N6-디메틸아데노신, 7-메틸아데닌, 2-메틸티오-아데닌, 및 2-메톡시-아데닌을 포함한다.
변형된 뉴클레오사이드는 이노신, 1-메틸-이노신, 와이오신(wyosine), 와이부토신(wybutosine), 7-데아자-구아노신, 7-데아자-8-아자-구아노신, 6-티오-구아노신, 6-티오-7-데아자-구아노신, 6-티오-7-데아자-8-아자-구아노신, 7-메틸-구아노신, 6-티오-7-메틸-구아노신, 7-메틸이노신, 6-메톡시-구아노신, 1-메틸구아노신, N2-메틸구아노신, N2,N2-디메틸구아노신, 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8-옥소-구아노신, l-메틸-6-티오-구아노신, N2-메틸-6-티오-구아노신, 및 N2,N2-디메틸-6-티오-구아노신을 포함한다.
뉴클레오타이드는 변형될 수 있고 우라실의 C-5의 하이드로겐을 메틸기 또는 할로기로 교체하는 것을 포함할 수 있다.
변형된 뉴클레오사이드는 5'-0-(l-티오포스페이트)-아데노신, 5'-0-(1-티오포스페이트)-사이티딘, 5'-0-(1-티오포스페이트)-구아노신, 5'-0-(1-티오포스페이트)-우리딘 또는 5'-0-(l-티오포스페이트)-슈도우리딘이다.
SM_DNAes는 6-아자-사이티딘, 2-티오-사이티딘, α-티오-사이티딘, 슈도-이소-사이티딘, 5-아미노알릴-우리딘, 5-요오도-우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 5,6-디하이드로우리딘, α-티오-우리딘, 4-티오-우리딘, 6-아자-우리딘, 5-하이드록시-우리딘, 데옥시-티미딘, 5-메틸-우리딘, 피롤로-사이티딘, 이노신, α-티오-구아노신, 6-메틸-구아노신, 5-메틸-사이티딘, 8-옥소-구아노신, 7-데아자-구아노신, N1-메틸-아데노신, 2-아미노-6-클로로-퓨린, N6-메틸-2-아미노-퓨린, 슈도-이소-사이티딘, 6-클로로-퓨린, N6-메틸-아데노신, α-티오-아데노신, 8-아지도-아데노신, 7-데아자-아데노신으로부터 선택된 뉴클레오사이드 화학적 변형체를 포함할 수 있다.
4) 지질 변형체(Lipid modification):
본 발명의 변형 RNA는 지질 변형을 함유할 수 있다. 이와 같은 지질-변형 RNA는 일반적으로 본원에 정의된 바와 같은 RNA를 포함한다. 본 발명의 지질-변형 RNA 분자는 일반적으로 RNA 분자와 공유결합된 적어도 하나의 연결자, 및 각각의 연결자와 공유결합된 적어도 하나의 지질을 추가적으로 포함한다. 대신에, 지질-변형 RNA 분자는 본원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 RNA 분자 및 RNA 분자와 (연결자 없이) 공유결합된 적어도 하나의 (2 기능성) 지질을 포함한다. 세 번째 대안에 따라서, 지질-화학적 변형 RNA 분자는 본원에 정의된 바와 같은 RNA 분자, RNA 분자와 공유결합된 적어도 하나의 연결자, 및 각각의 연결자와 공유결합된 적어도 하나의 지질, 및 또한 RNA 분자와 (연결자 없이) 공유결합된 적어도 하나의 (2 기능성) 지질을 포함한다. 지질 변형은 선형 RNA 서열의 말단 끝에 존재하는 것이 특히 바람직하다.
염기서열의 변형(SM)
1) 오픈 리딩 프레임의 변형: G/C 함량의 변형:
본 발명의 SM_DdRp는 적어도 하나의 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는, 코딩 영역의 G/C 함량은 변형되고, 이의 특정 야생형 코딩 영역, 즉, 비변형 코딩 영역의 G/C 함량과 비교하였을 때 특히 증가된다. 코딩 역역의 아미노산 서열은 특정 야생형 코딩 영역의 코딩된 아미노산 서열과 비교하였을 때 변형되지 않는 것이 바람직하다.
본 발명에서 SM_DdRp 코딩 영역의 G/C-함량의 변형은, 번역될 임의의 mRNA 영역의 서열이 mRNA의 효율적인 번역에 중요하다는 사실을 기초로 한다. 따라서, 다양한 뉴클레오타이드의 조성 및 서열은 중요하다. 특히 G(구아노신)/C(사이토신) 함량이 증가된 mRNA 서열은, A(아데노신)/U(우라실) 함량이 증가된 mRNA 서열보다 더욱 안정하다. 본 발명에 따르면, 안정적으로 아미노산 서열로 번역되고 있는 코딩 영역의 코돈은, 이 코돈 중 G/C 뉴클레오타이드의 양이 증가되었다는 점에서 이의 야생형 코딩 영역의 코돈과는 상이하다. 몇몇 코돈은 하나의 동일한 아미노산을 코딩한다는 사실(소위 유전적 암호의 축퇴성(degeneration))에 비추어, 안정성에 가장 유리한 코돈이 결정될 수 있다(소위 대안적 코돈 선호도(alternative codon usage)).
본 발명에서 SM_DdRp의 코딩 영역에 의해 코딩될 아미노산에 따라서, 이의 야생형 코딩 영역과 비교할 때 RNA 서열, 예를 들어, 코딩 영역의 변형에 대한 다양한 가능성이 존재한다. 오직 G 또는 C 뉴클레오타이드만을 함유하는 코돈에 의해 코딩된 아미노산의 경우, 코돈의 변형은 필요하지 않다. 따라서, A 또는 U가 존재하지 않기 때문에, Pro(CCC 또는 CCG), Arg(CGC 또는 CGG), Ala(GCC 또는 GCG) 그리고 Gly (GGC 또는 GGG)에 대한 코돈은 변형이 필요하지 않다.
대조적으로, A 및/또는 U 뉴클레오타이드를 함유하는 코돈은, 동일한 아미노산을 코딩하지만 A 및/또는 U를 함유하지 않는 다른 코돈의 치환에 의해 변형될 수 있으며, 이들의 예로는 다음과 같다:
Pro에 대한 코돈은 CCU 또는 CCA에서 CCC 또는 CCG로 변형될 수 있고; Arg에 대한 코돈은 CGU 또는 CGA 또는 AGA 또는 AGG에서 CGC 또는 CGG로 변형될 수 있으며; Ala에 대한 코돈은 GCU 또는 GCA에서 GCC 또는 GCG로 변형될 수 있고; Gly에 대한 코돈은 GGU 또는 GGA에서 GGC 또는 GGG로 변형될 수 있다.
다른 경우에서, 비록 A 또는 U 뉴클레오타이드가 코돈으로부터 제거될 수 없다고 하더라도, 더욱 적은 함량의 A 및/또는 U 뉴클레오타이드를 함유하는 코돈을 사용함으로써 A 및 U 함량이 감소할 수 있다. 이들의 예로는 다음과 같은 경우가 있다:
Phe에 대한 코돈은 UUU에서 UUC로 변형될 수 있고; Leu에 대한 코돈은 UUA, UUG, CUU 또는 CUA에서 CUC 또는 CUG로 변형될 수 있으며; Ser에 대한 코돈은 UCU 또는 UCA 또는 AGU에서 UCC, UCG 또는 AGC로 변형될 수 있고; Tyr에 대한 코돈은 UAU에서 UAC로 변형될 수 있으며; Cys에 대한 코돈은 UGU에서 UGC로 변형될 수 있고; His에 대한 코돈은 CAU에서 CAC로 변형될 수 있으며; Gln에 대한 코돈은 CAA에서 CAG로 변형될 수 있고; Ile에 대한 코돈은 AUU 또는 AUA에서 AUC로 변형될 수 있으며; Thr에 대한 코돈은 ACU 또는 ACA에서 ACC 또는 ACG로 변형될 수 있고; Asn에 대한 코돈은 AAU에서 AAC로 변형될 수 있으며; Lys에 대한 코돈은 AAA에서 AAG로 변형될 수 있고; Val에 대한 코돈은 GUU 또는 GUA에서 GUC 또는 GUG로 변형될 수 있으며; Asp에 대한 코돈은 GAU에서 GAC로 변형될 수 있고; Glu에 대한 코돈은 GAA에서 GAG로 변형될 수 있으며; 종결 코돈 UAA는 UAG 또는 UGA로 변형될 수 있다.
한편, Met(AUG) 및 Trp(UGG)에 대한 코돈의 경우, 서열 변형 가능성은 없다.
본 발명에서 SM_DdRp의 코딩 영역의 G/C 함량을, 특정 야생형 코딩 영역(즉 원래의 서열)의 G/C 함량에 비해 증가시키기 위해서는, 상기 나열된 치환들은 개별적으로 적용될 수 있거나, 가능한 임의의 조합으로 적용될 수 있다. 따라서, 예를 들어 야생형 서열에서 발생하는 Thr에 대한 모든 코돈은 ACC(또는 ACG)로 변형될 수 있다.
바람직하게 본 발명에서 SM_DdRps의 코딩 영역의 G/C 함량은, 야생형 코딩 영역의 G/C 함량에 비하여 7% 이상, 더욱 바람직하게 15% 이상, 특히 바람직하게 20% 이상 증가된다. 병원성 항체 또는 절편, 이의 변이체 또는 유도체를 포함하는 적어도 하나의 펩타이드 또는 단백질을 하나 이상을 코딩하는 코딩 영역에서 치환 가능한 코돈들 중 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 더욱 더 바람직하게는 80% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 90% 이상, 95% 이상 또는 심지어 100%가 치환되며, 이로써 상기 코딩 영역의 G/C 함량이 증가하게 된다.
특히 바람직하게, 본 발명에서 SM_DdRp의 코딩 영역의 G/C 함량은, 야생형 코딩 영역의 G/C 함량에 비하여 최대값(즉, 치환 가능한 코돈의 100%)만큼 증가할 수 있다.
2) 코돈 최적화(Codon optimization):
본 발명에서 SM_DdRp의 적어도 하나의 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 코딩 영역의 추가적인 바람직한 변형은 번역 효율이 세포 내 tRNA의 출현의 상이한 빈도에 의해 또한 결정된다는 발견에 기초한다. 따라서, 만약, 소위 "희귀(rare) 코돈"이 야생형 RNA 서열의 코딩 영역에 증가된 정도로 존재하면, 상대적으로 "빈번한(frequent)" tRNA를 코딩하는 코돈이 존재하는 경우보다 현저히 낮은 정도로 번역된다.
SM_DdRp의 코딩 영역은 바람직하게 상응하는 야생형 코딩 영역과 비교하여 변형되는 결과, 적어도 하나의 세포 내에서 상대적으로 희귀한 tRNA를 코딩하는 야생형 서열의 코돈은, 세포 내에서 상대적으로 빈번한 tRNA를 코딩하고 상대적으로 희귀한 tRNA로서 동일한 아미노산을 운반하는 코돈으로 치환된다. 이러한 변형에 의해, 본 발명의 SM_DNAes의 코딩 영역은 변형되는 결과, 빈번하게 발생하는 tRNA를 이용하기 위한 코돈이 삽입된다. 다시 말해서, 본 발명에 따르면, 이러한 변형에 의해 세포 내에서 상대적으로 희귀한 tRNA를 코딩하는 야생형 코딩 영역의 모든 코돈은 각각의 경우에서 세포 내에서 상대적으로 빈번한 tRNA를 코딩하는 코돈으로 치환될 수 있고, 각각의 경우에서 상대적으로 희귀한 tRNA로서 아미노산을 운반할 수 있다.
어떤 tRNA가 세포 내에서 상대적으로 빈번하게 발생하는지, 그리고 이와는 대조적으로 어떤 tRNA가 상대적으로 희귀하게 발생하는지는 통상의 기술자에게 알려져있다. 특정 아미노산을 위해 사용하는 가장 빈번하게 발생하는 tRNA, 예를 들어, (인간) 세포내에서 가장 빈번하게 발생하는 tRNA를 사용하는 Gly 코돈이 특히 바람직하다.
본 발명의 SM_DdRp의 코딩 영역 내에 특히 최대로 증가된 서열 G/C 함량을, RNA 서열의 코딩 영역에 의해 코딩된 펩타이드 또는 단백질의 아미노산 서열이 변형되지 않은 "빈번한" 코돈과 연관짓는 것이 특히 바람직하다. 특히 효율적으로 번역 및 안정화된(화학적 변형된) RNA 서열을 제공한다.
3) UTR의 변형:
바람직하게, 본 발명의 SM_DdRp는 적어도 하나의 화학적 변형된 5' 및/또는 3'UTR 서열을 갖는다. 이들 5' 및/또는 3'UTR 내 변형은 세포 기질 내 RNA의 반감기를 증가시키는 효과를 가질 수 있거나 번역 효율을 증가시킬 수 있고 따라서 코딩된 단백질 또는 펩타이드의 발현을 향상시킬 수 있다. 이들 UTR 서열은 바이러스, 박테리아 및 진핵생물에서 발생한 자연적으로 발생하는 서열과 100% 서열 상동성을 가질 수 있으나, 부분적이거나 전체적으로도 합성될 수 있다.
본 발명에 따른 SM_DdRp는 바람직하게 5' 및/또는 3'UTR 요소, 특히 TOP 유전자의 5'UTR로부터 또는 이의 절편, 동족체 또는 변이체로부터 유래된 핵산을 포함하거나 이로 이루어진 5'UTR 요소, 또는 안정한 mRNA를 제공하는 유전자로부터, 또는 이의 동족체, 절편 또는 변이체로부터 유래할 수 있는 5' 및/또는 3'UTR 요소; 히스톤-스템-루프 구조, 바람직하게는 이의 3' 비번역 영역 내 히스톤-스템-루프; 5'캡(CAP) 구조; 폴리-A 꼬리; 또는 폴리(C) 서열을 포함하는 군에서 적어도 하나의 구조적 요소를 포함한다.
본 발명에 따른 SM_DdRp는 적어도 하나의 5' 또는 3'UTR 요소를 포함한다. UTR 요소는 임의의 자연적으로 발생하는 5' 또는 3'UTR로부터 유래되거나, 유전자의 5' 또는 3'UTR의 절편, 동족체 또는 변이체로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 바람직하게, 본 발명에 따라 사용된 5' 또는 3'UTR 요소는 본 발명에 따른 SM_DNAes의 코딩 영역에 이종(heterologous)이다. 자연적으로 발생하는 유전자로부터 유래된 5' 또는 3'UTR 요소가 바람직하다 하더라도, 본 발명에서 합성적으로 조작된(engineered) UTR 요소도 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 SM_DdRp의 서열은 TOP 유전자의 5'UTR로부터 유래되거나 TOP 유전자의 5'UTR의 절편, 동족체 또는 변이체로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 적어도 하나의 5'비번역 영역 요소(5'UTR 요소)를 포함할 수 있다.
TOP 유전자의 5'UTR로부터 유래된 5'UTR 요소의 핵산 서열은 유전자 또는 mRNA의 시작 코돈(예를 들어, A(U/T)G)의 업스트림 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 자리에 위치한 뉴클레오타이드와 함께 이의 3'-말단에서 종결된다. 따라서, 5'UTR 요소는 단백질 코딩 영역의 임의의 부분을 포함하지 않는다. 따라서, 바람직하게, 오직 본 발명에 따른 SM_DNAes의 단백질 코딩 부분은 코딩 영역에 의해 제공된다.
TOP 유전자의 5'UTR로부터 유래된 핵산 서열은 진핵생물 TOP 유전자로부터 유래되고, 바람직하게는 식물 또는 동물 TOP 유전자, 더욱 바람직하게는 척색동물 TOP 유전자, 더욱 더 바람직하게는 척추동물 TOP 유전자, 가장 바람직하게는 인간 TOP 유전자와 같은 포유동물 TOP 유전자로부터 유래된다.
본 발명에 따른 SM_DNAes는 척색동물 유전자, 바람직하게는 척추동물 유전자, 더욱 바람직하게는 포유동물 유전자, 가장 바람직하게는 인간 유전자의 3'UTR로부터 유래되거나, 척색동물 유전자, 바람직하게는 척추동물 유전자, 더욱 바람직하게는 포유동물 유전자, 가장 바람직하게는 인간 유전자의 3'UTR의 변이체로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 적어도 하나의 3'UTR 요소를 추가로 포함한다.
용어 '3'UTR 요소'는 3'UTR로부터 유래되거나 3'UTR의 변이체로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 서열을 나타낸다. 본 발명의 의미에서, 3'UTR 요소는 mRNA의 3'UTR을 대표할 수 있다. 따라서, 본 발명의 의미에서, 바람직하게, 3'UTR 요소는 mRNA, 바람직하게는 인공 mRNA의 3'UTR 일 수 있고, 또한 이는 mRNA의 3'UTR을 위한 전자 주형일 수 있다. 따라서, 3'UTR 요소는 바람직하게 mRNA의 3'UTR, 바람직하게는 인공 mRNA, 예컨대 유전적으로 조작된 벡터 발현 카세트의 전사에 의해 수득된 mRNA의 3'UTR에 상응하는 핵산 서열이다. 바람직하게, 3'UTR 요소는 3'UTR의 기능을 실현하거나 3'UTR의 기능을 실현하는 서열을 코딩한다.
독창적인 mRNA는 (안정한 mRNA를 제공하는) 반감기가 향상된 mRNA와 관련된 유전자로부터 유래될 수 있는 3'UTR 요소를 포함하며, 예를 들어, 하기 정의 및 설명된 바와 같은 3'UTR 요소이다.
3'UTR 요소는 알부민 유전자, α-글로빈 유전자, β-글로빈 유전자, 타이로신 하이드록실라아제 유전자, 리폭시게나아제 유전자, 및 콜라겐 알파 유전자, 예컨대 콜라겐 알파 1(I) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 3'UTR로부터 유래되거나, 알부민 유전자, α-글로빈 유전자, β-글로빈 유전자, 타이로신 하이드록실라아제 유전자, 리폭시게나아제 유전자, 및 콜라겐 알파 유전자, 예컨대 콜라겐 알파 1(I) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 3'UTR의 변이체로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 3'UTR 요소는 알부민 유전자, 바람직하게는 척추동물 알부민 유전자, 더욱 바람직하게는 포유동물 알부민 유전자일 수 있다,
가장 바람직하게는 인간 알부민 유전자의 3'UTR로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
인간 알부민 3'UTR: CATCACATTT AAAAGCATCT CAGCCTACCA TGAGAATAAG AGAAAGAAAA TGAAGATCAA AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC ATAAATTTCT TTAATCATTT TGCCTCTTTT CTCTGTGCTT CAATTAATAA AAAATGGAAA GAATCT (서열번호 23)
본 발명에 따른 SM_DNAes는 다른 핵산으로부터 유래된 상응하는 RNA 또는 이의 절편, 동족체 또는 변이체를 포함하는 3'UTR 요소를 포함하는 것이 특히 바람직하다.
가장 바람직하게, 3'UTR 요소는 서열번호 6에 따른 인간 알부민 유전자의 절편으로부터 유래된 핵산 서열을 포함한다:
알부민7 3'UTR: CATCACATTT AAAAGCATCT CAGCCTACC ATGAGAATAA GAGAAAGAAA ATGAAGATCA ATAGCTTATT CATCTCTTTT TCTTTTTCGT TGGTGTAAAG CCAACACCCT GTCTAAAAAA CATAAATTTC TTTAATCATT TTGCCTCTTT TCTCTGTGCT TCAATTAATA AAAAATGGAA AGAACCT (서열번호 24).
본 발명의 독창적인 mRNA의 3'UTR 요소는 서열번호 6에 따른 핵산 서열의 상응하는 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것이 XRMGL 바람직하다.
3'UTR 요소는 α-글로빈 유전자, 바람직하게는 척추동물 α- 또는 β-글로빈 유전자, 더욱 바람직하게는 포유동물 α- 또는 β-글로빈 유전자, 가장 바람직하게는 서열번호 6 내지 7에 따른 인간 α- 또는 β-글로빈 유전자의 3'UTR로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다:
호모 사피엔스 헤모글로빈, 알파 1(HBA1)의 3'UTR: GCTGGAGCCT CGGTGGCCAT GCTTCTTGCC CCTTGGGCCT CCCCCCAGCC CCTCCTCCCC TTCCTGCACC CGTACCCCCG TGGTCTTTGA ATAAAGTCTG AGTGGGCGGC (서열번호 25)
호모 사피엔스 헤모글로빈, 알파 2(HBA2)의 3'UTR: GCTGGAGCCT CGGTAGCCGT TCCTCCTGCC CGCTGGGCCT CCCAACGGGC CCTCCTCCCC TCCTTGCACC GGCCCTTCCT GGTCTTTGAA TAAAGTCTGA GTGGGCAG (서열번호 26)
호모 사피엔스 헤모글로빈, 베타(HBB)의 3'UTR: GCTCGCTTTC TTGCTGTCCA ATTTCTATTA AAGGTTCCTT TGTTCCCTAA GTCCAACTAC TAAACTGGGG GATATTATGA AGGGCCTTGA GCATCTGGAT TCTGCCTAAT AAAAAACATT TATTTTCATT GC (서열번호 27).
예를 들어, 3'UTR 요소는 바람직하게는 서열번호 7에 따른 인간 α-글로빈 유전자와 같은 α-글로빈 유전자의 3'UTR의 중심, α-복합-결합 부분을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다:
중심, α-글로빈 유전자의 3'UTR의 α-복합-결합 부분(또한 "muag"로서 본원에 명명됨); GCCCGATGGG CCTCCCAACG GGCCCTCCTC CCCTCCTTGC ACCG (서열번호 28).
본 발명에 따른 SM_DNAes의 3'UTR 요소는 서열번호 28에 따른 핵산 서열의 상응하는 RNA 서열 또는 이의 동족체, 절편 또는 변이체를 포함하거나 이로 이루어지는 것이 특히 바람직하다.
바람직하게, 적어도 하나의 5'UTR 요소 및 적어도 하나의 3'UTR 요소는 상기 설명된 바와 같은 본 발명에 따른 SM_DNAes 유래 단백질 생산을 증가시키는데 상승적인 역할을 한다. 더욱 바람직하게, 적어도 하나의 5'UTR 요소 및/또는 적어도 하나의 3'UTR 요소는 단백질 생산을 증가시키기 위해서 SM_DNAes의 전환과 함께 상승적인 역할을 한다.
본 발명에 따른 SM_DNAes는 - 적어도 하나의 변형을 첨가하여 - 내부 리보솜 유입점(internal ribosome entry site)(IRES) 서열 또는 IRES-모티프를 추가로 포함할 수 있고, 예를 들어, 만약 SM_DNAes가 2 이상의 펩타이드 또는 단백질을 코딩하면 여러 오픈 리딩 프레임으로 분리될 수 있다. IRES-서열은 만약 mRNA가 바이- 또는 멀티시스트론 RNA라면 특히 도움이 될 수 있다.
RNA는 한정되지 않고 임의의 리보핵산을 나타낸다. 따라서, RNA는 예를 들어, 바이러스 RNA, (replicon) 또는 mRNA로서 코딩 RNA로서 기능하는 리보 핵산에, 또는 임의의 유형의 인공 DdRp RNA 발현 카세트에 동등하게 적용한다.
본 발명에 따르면, DNAes는 RNA 영역에 의해 표적 RNA 또는 단백질의 발현을 변화시키는 적어도 하나의 변형을 포함한다. 본 발명에 따른 DNAes는 본원에 정의된 바와 같은 변형 중 적어도 하나의 유형을 포함한다. 대신에, 또는 다른 유형의 변형과 조합하여, 본원에 정의된 바와 같은 특정 변형, 예컨대 3'UTR, 히스톤 스템-루프 또는 폴리 C 서열은 또한 본 발명에 따른 SM_DNAes에 하나 이상의 복제물(copy)로 존재할 수 있다. 이는 바이- 또는 멀티시스트론 RNA에 대해 특히 마찬가지이다. 본 발명에 따른 SM_DNAes는 여러 별개의 변형의 조합을 포함할 수 있으며, 예컨대, 임의의, 예를 들어, 5'UTR, 폴리 C 서열, 폴리 A 서열, 3'UTR 또는 히스톤 스템-루프와 GC-풍부(GC-enrichment)를 조합한 변형, 여기서 각각 별개의 변형은 RNA 당 단일 복제물의 형태 또는 RNA 당 다수의 복제물 형태로 존재할 수 있다.
더욱이, 투여될 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 SM_DdRp에 있어서, 코딩 영역의 3' 영역은 예를 들어, 아데닌 또는 사이토신 잔기의 다중 반복 스트레치의 삽입 또는 첨가에 의해 변형될 수 있다. RNA 분자의 3' 말단은 아데닌 뉴클레오타이드의 시리즈(series)("폴리(A) 꼬리")의 첨가에 의해 화학적 변형된다.
본 발명에 따른 SM_DdRp는 적어도 하나의 변형으로서 이의 3' 말단에 히스톤 스템-루프를 포함하거나 코딩할 수 있다.
히스톤 스템-루프 서열을 위한 특히 바람직한 실시례는 CAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACCA (서열번호 29)에 따른 서열 또는 CAAAGGCUCUUUUCAGAGCCACCA (서열번호 30)에 따른 상응하는 RNA 서열이다.
바람직하게, 본 발명에 따른 SM_DdRp는 적어도 하나의 변형으로서 이의 3' 말단에 T7 전사종결서열을 포함하거나 코딩할 수 있다.
IV. 발현억제 RNA
시퀀싱 기술과 통계적 및 실험적 접근 방식의 개발로 특정 질병을 유발하는 유전적 변이와 유전자의 정확한 식별이 가능해지고 있다. 이것은 유전체학 분야의 중요한 과제이다. 특히 다 유전자성 질병의 인과 메커니즘, 위험 변이, 세포 유형 및 환경의 다양성을 결정할 때 특히 그렇다.
전통적인 소분자 약물은 질병을 유발하는 유전자의 하류 경로를 조절하여 질병 병리를 조절한다. 현재 클리닉에서 부상하고 있는, 더 정확하고 효율적인 치료 전략은 유전자 치료법을 사용하여 DNA 또는 RNA 전구체를 표적하여 결함이 있는 유전자 산물을 수정하는 것이다.
본 발명에서 DNAes 발현 카세트를 구성하는 DNAes 절편에 있는 발현억제 RNA는 siRNA(short interfering RNA), miRNA(microRNA), shRNA(short hairpin RNA), hairpin RNA, artificial microRNA, intrinsic direct repeat, 3′UTR inverted repeat, artificial trans-acting siRNA, 안티센스 RNA(antisense RNA), 리보자임(ribozyme) 및 압타머(aptamer)를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 1종 이상이다.
본 발명에 따른 발현억제 RNA는 DNAes 발현 카세트에서 다양한 구성을 할 수 있다. DNAes 발현 카세트를 제조하기 위해서 선택된 발현억제 RNA를 이용하여 표적 유전자의 기능을 저해하거나 길항시킬 수도 있다. 또한 DNAes 발현 카세트를 제조하기 위해서, 선택된 발현억제 RNA를 사용하여 특정 유전자의 기능을 저해하거나 길항하면서 특정 단백질을 제공할 수도 있다. 바람직하게 목적하는 기능을 할 수 있도록 DNAes 발현 카세트를 제조하기 위해서 발현억제 RNA를 선택하여 DNAes 발현 카세트를구성할 수 있다.
발현억제 RNA는 이종 핵산에 의해 코딩된다. 발현억제 RNA 코딩하는 DNA(DNAes)는 발현 제어 서열과 함께 존재한다. 발현억제 RNA는 DdRp가 결합합하는 프로모터의 제어하에 있다. DNAes는 프로모터의 하류에 위치한다. DNAes는 DdRp가 결합하는 프로모터의 제어 하에 본 발명에 따른 발현 카세트 상에 존재하며, 따라서 이의 위치는 바이러스에서 구조 유전자의 위치와 유사하다. DdRp가 결합하는 프로모터의 하류 위치는 DNAes를 포함하도록 한다. DNAes는 시작코돈을 포함하지 않으며, 전형적으로는 AUG (RNA 분자에서) 또는 (각각의 DNA 분자에서) ATG를 포함하는 ORF를 포함하지 않는다.
본 발명에 따른 DNAes 발현 카세트는 단일 발현억제 RNA 또는 다중 발현억제 RNA를 코딩할 수 있다. 다중 목적 발현억제 RNA는 단일 발현억제 RNA (융합 발현억제 RNA) 또는 별도의 발현억제 RNA로서 코딩될 수 있다. 목적 발현억제 RNA가 별도의 목적 발현억제 RNA로 코딩되는 경우, 추가적인 프로모터 요소가 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 발현 카세트는 둘 이상의 발현억제 RNA를 포함할 수 있으며, 이들 각각은 프로모터의 제어 하에 있다. 이러한 다중 발현억제 RNA 발현 카세트가 진핵세포에 위치하면, 다중 전사체가 제조될 것이고, 각각의 자가 프로모터에 의해 개시될 것이다.
본 발명에 따른 발현억제 RNA에 속하는 ASO와 siRNA는 모두 상보적인 Watson-Crick 염기 쌍을 통해 표적 mRNA 또는 pre-mRNA에 결합하지만 구성과 작용 모드가 다르다.
안티센스 올리고 뉴클레오티드(Antisense oligonucleotide): ASO는 단일 가닥, 고도로 변형된 합성 RNA (또는 DNA) 서열로, 상보적 염기 쌍을 통해 관심 유전자를 암호화하는 RNA에 선택적으로 결합하도록 설계되었으며 여러 질병에서 연구되었다. ASO와 표적의 결합은 보완 표적에 결합될 때 다양한 결과를 유발할 수 있다. 이러한 결과는 mRNA 처리를 변경하는 것부터 표적 전사체를 분해하는 것까지 다양하다. 합성된 ASO는 다음을 수행할 수 있다. pre-mRNA의 상보적 서열에 결합하여 분자에 대한 스플라이싱 복합체 구성원을 변경하여 스플라이싱 이벤트를 조절한다. 성숙한 mRNA에 결합하고 리보솜에 대한 부착을 방지하여 단백질 번역을 차단하거나 RNase H를 표적 전사체에 동원할 수 있으며 이는 분해될 것이다.
siRNA & miRNA: 전통적인 약물 치료 방법을 대체하기 위한 치료제의 개발이 여러 방면으로 진행되고 있으며, 그 중 하나가 작은 간섭 RNA (small interfering RNA, 이하 siRNA 으로 표기)의 이용이다. siRNA는 16에서 27사이의 뉴클레오티드로 구성된 단일 가닥 RNA로서, 세포 내에서 리스크(RNA Induced Silencing Complex, RISC)라 알려진 리보핵산단백질 결합체 (ribonucleoprotein)의 구성 성분으로서 역할을 한다. RISC는 RNA 효소 가위로서 기능을 하는데, 메신저 RNA (messenger RNA, 이하 mRNA 로 표기)를 절단하여 mRNA로부터 단백질이 생성되는 것을 저해한다. RISC에 포함된 siRNA는 siRNA 서열과 상보적인 서열을 갖는 mRNA와 결합하여 이중가닥 RNA를 형성하고, RISC는 RNA 효소 가위로 작용하여 목표가 되는 mRNA를 절단하여 mRNA가 더 이상 단백질을 반복 생성하는 형판 (template)으로서의 기능을 수행할 수 없도록 한다.
이처럼 siRNA 기반의 항암 치료제는 단백질 생성 단계 이전의 mRNA를 차단한다는 점, 그리고 RNA와 세포 내재적인 RISC 시스템을 활용한다는 점에 있어서 기존 단분자 물질의 항암제보다 진보한 기술로 평가된다. siRNA 기반의 기술로도 해결하지 못하는 부작용이 있는데, 이는 비표적 효과 (off-target effect)이다. siRNA 서열과 상보적으로 결합하는 mRNA를 분해하는데, siRNA 서열 전체와 상보적이지 않고 일부분만 상보적인 mRNA와도 결합하여 분해를 유발하는데 이를 표적이 아닌 mRNA의 분해를 유발한다 하여 비표적 효과라고 한다.
상기 기술된 siRNA 기반의 항암 치료제의 기술적 난점을 극복하기 위하여 마이크로 RNA (microRNA, 이하 miRNA로 표기)를 치료제로 사용하려는 연구가 진행 중이다. miRNA는 16에서 27 사이의 뉴클레오티드로 구성된 RNA로서 단백질로 번역되는 메신저 RNA(mRNA)에 대비하여 단백질 비생성 RNA(protein non-coding RNA)로 분류된다. miRNA는 고등 동식물 세포의 유전체에 기록되어 있으며 세포의 생성, 성장, 분화, 사멸을 포함한 세포의 대사 및 기능을 조절하는데 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 현재까지 인간의 유전체에서는 2000 여종의 miRNA가 알려져 있으며 이 중 상당수의 miRNA의 기능은 아직 알려져 있지 않다.
miRNA는 유전체로부터 Pol II라 불리는 RNA 폴리머라제(polymerase)에 의해 RNA로 전사되는데, 초기 길이는 특정할 수 없이 다양하다. 이는 miRNA가 유전체에 포함된 위치의 다양성에 기인하는데, mRNA의 단백질 생성 비관여 부분인 인트론(intron)에 위치하여 mRNA 생성 동일 시점에 전사되는 경우 및 유전체 상에서 유전자간 빈 공간 (inter-genic region)에 위치하여 독자적으로 전사되는 경우 등 다양한 방식으로 생성되기 때문이다.
이와 같이 초기에 생성된 miRNA 모체를 일차 miR(primary microRNA)라 하는데, 일차 miR는 핵 속의 드로셔(Drosha)라 불리는 RNA 절단 효소(RNase) 등에 의하여 전구체 miR(precursor miRNA, pre-miR)로 편집된다. Pre-miR는 RNA 헤어핀 구조(RNA hair-pin structure)를 이루며 대략 70-80 개의 뉴클레오티드로 구성된다. 세포 핵 내부의 Pre-miR는 exportin 단백질 등에 의해 핵에서 세포질로 이동되며, 세포질 내에서 다이서(Dicer)라 불리는 또 다른 RNA 절단 효소(RNase)에 의하여 이차 가공이 되어 16-27 개의 뉴클레오티드로 구성되는 이중 가닥의 성숙 miR(mature microRNA, 이하 다른 수식어 없이 miR로 기술하는 경우는 성숙 miR를 의미함)를 생성한다. 이중 가닥 miR 중 한 가닥의 RNA가 선택적으로 선정되어 상기 리보핵산단백질 결합체(ribonucleoprotein comple)인 RISC와 결합하여 활성을 가지게 되고, miR의 서열을 이용하여 목표 mRNA와 결합한다.
일반적으로 mRNA는 단백질 생성 관여 여부를 기준으로 크게 세 부분으로 나눌 수 있는데, 단백질 번역 정보를 담고 있는 코딩 부분(coding region)과 코딩 부분의 각각 5' 과 3' 부분으로서 단백질 번역 정보를 가지지 않는 5'-UTR(Un-Translated Region)과 3'-UTR로 구분할 수 있다. mRNA와의 상보적 서열을 이용, 목표 mRNA의 분해를 유발하는 siRNA는 mRNA 의 5′, 3′UTR 및 코딩 부분에 상관없이 작용을 하는 반면, miR는 주로 3'-UTR과 결합을 한다.
mRNA와의 결합 위치 차이와 더불어 siRNA와 다른 miRNA의 독특한 특징은 siRNA는 siRNA 전체 서열과 상보적인 서열을 포함한 mRNA와 주로 결합하는 반면, miRNA는 miRNA의 5′ 끝으로부터 2-8 뉴클레오티드 자리에 위치한, 한정된 크기의 seed region서열이 주로 목표 mRNA 인식에 사용되는 점이 다르며, 따라서 전체 miRNA의 서열이 목표 유전자와 완벽한 상보적인 서열을 가지지 않고 일정 부분 비상보적 서열이 포함되어도 miRNA 활성에 영향을 주지 않는다.
seed region의 서열 크기가 6-8 뉴클레오티드인 만큼 이와 상보적인 서열을 3′UTR에 가지는 mRNA 종류는 다양하며, 이러한 이유로 한 종의 miRNA로 여러 종의 mRNA를 동시에 제어할 수 있다. 이러한 miRNA의 성질은 miRNA가 세포의 분열, 성장, 분화, 사멸에 이르는 많은 부분의 세포 생리학적 측면의 제어에 관여하는 효율적인 조절인자(regulator)로서의 기능을 부과한다. 또한, 조절인자로서의 miRNA 의 기능은 효과적인 항암 효과를 구현하는데 장점으로서 작용하는데, siRNA 의 경우 단일 유전자 발현의 억제를 목표로 하는데 반하여, miRNA 는 암 유발 유전자 다수의 발현을 동시에 저해할 수 있기 때문이다.
많은 수의 mRNA가 3′UTR에 한 종 이상의 miRNA가 결합할 가능성이 있는 부분을 포함하고 있으며, 한 생물정보학적인 계산에 따르면 전체 mRNA의 대략 30%가 miRNA에 의해 단백질 생성이 조절되고 있는 것으로 알려져 있다.
miRNA의 이러한 신호 전달 체계 내의 주요 조절인자로 작용하는 사실은 암을 포함한 주요 질환에서도 중요한 역할을 수행한다는 점에서 알 수 있다. 실제로 암 세포에서의 miRNA들의 발현 양식은 정상 세포에서의 발현 양식과 큰 차이를 보이는 것이 드러났다. 뿐만 아니라 암이 발생한 원발 장기에 따라서도 miRNA 발현 양식이 큰 차이가 있는데 폐암, 간암, 피부암, 혈액암 등 다양한 암들이 원발 장기에 따른 독특한 miRNA 발현 양식을 보이고, 이를 통하여 miRNA가 암 생물학에 있어 주요한 역할을 한다는 것이 알려져 있다. 특히, 암 종에서 발현되는 miRNA들이 그들의 정상 세포에서의 발현양에 대비하여 일반적으로 낮다.
RNA 압타머 및 RNA 디코이(decoy): 치료제로 유망하게 만드는 RNA의 측면은 일부 작은 RNA가 3 차원 구조로 접혀서 단백질에 결합하여 단백질 길항제와 유사한 방식으로 억제할 수 있는 능력이 있다. 이것이 RNA '디코이' 또는 RNA 압타머 사용의 논리이다. 이들은 바이러스 단백질에 결합할 수 있으므로 siRNA를 운반하는 매개체로도 사용할 수 있다.
RNA 압타머는 엑소뉴클레아제분해에 매우 민감하므로 말단 분해를 방지하기 위해 2'-O- 변형 피리미딘, 2'- 아미노 피리미딘 또는 2'- 플루오로 피리미딘과 같은 변형 또는 역전된 뉴클레오티드로 캡핑해야 한다. RNA 압타머의 장점은 기능을 수행하기 위해 먼저 세포에 들어가야 하는 다른 RNA 기반 치료제와 달리 세포 내 표적에 도달하고 세포 외 표적에 직접 결합하는 능력에 있다.
기존 RNA 압타머 및 디코이는 세포외 표적에 직접 결합하는 능력에 기반한 전략이나, 본 발명에서 RNA 시스템을 이용한 RNA 압타머 치료제 전략은 세포내에서 RNA 시스템으로 RNA 압타머 및 디코이를 합성하여 세포 내 표적에 직접 결합하는 능력에 기반하고 있다.
리보자임: 촉매 RNA 또는 리보자임이라고 하는 RNA의 하위 집합은 단백질이 전혀 없을 때 효소로 작용할 수 있다. 높은 특이성, 광범위한 표적 선택 및 단백질 번역 전의 작용으로 인해 자연 발생 및 인공적으로 합성된 리보자임 모두를 사용하여 다음을 수행할 수 있다. 특히 유전자 기능을 억제한다. 또한 질병 관련 유전자를 새로운 치료적 개입의 잠재적 표적으로 확인하는 데 사용할 수 있다. 단백질 합성을 방지하기 위해 mRNA를 절단하는 능력은 암과 바이러스학에서 응용을 찾을 수 있게 한다. 여러 다른 유형의 리보자임 중에서 망치 머리와 머리핀 리보자임이 광범위하게 연구되었다. 전자는 특이성과 촉매 효능을 모두 가진 작은 리보자임이므로 가장 널리 연구될 가능성이 높다.
본 발명에 따른 리보자임은 트랜스-스플라이싱 반응을 통해 암 특이적 유전자의 활성을 저해시켜서 선택적인 항암 효과를 나타낼 수 있을 뿐만 아니라 암 치료 유전자와 접합된 형태로 발현되어 암 치료 유전자를 활성화시킬 수 있다. 따라서, 암 특이적 유전자를 불활성화시키고, 암 치료 유전자를 활성화시킬 수 있는 특성을 나타낸다면 어떠한 형태의 것이라도 사용 가능하다.
핵산은 40년 이상 잠재적인 치료제로 인식되어 왔지만, 인간 게놈의 해독과 기술 발전으로 인해 치료 응용이 실현되고 있다. 지난 20 년 동안 실험실과 클리닉에서 진행된 수많은 연구는 특히 특이성, 기능적 다양성 및 제한된 독성에 대한 확인과 함께 치료제로서 핵산의 엄청난 잠재력을 입증했다.
다양한 핵산 요법 중 유전자 요법이 임상적으로 광범위하게 개발되었으며 특히, ASO가 많이 개발되었지만 지금까지 규제기관에서 승인한 약제는 거의 없다. 수행된 수백 건의 연구 중 2건의 사망과 4건의 악성 종양이 발생했으나, 전반적으로 양호한 수준으로 안전하다. 핵산에 의해 잠재적으로 다룰 수 있는 질병의 범위는 광범위하고 감염성 질병에서 당뇨병 및 암과 같은 질병에 이르기까지 다양하다.
핵산 치료제의 성공적인 임상을 위해 해결해야 할 핵심 과제는 작용 위치로의 전달, 직접 전달과 비히클 사용의 선택, 저렴한 비용으로 대량 생산, 보다 명확하게 정의된 약동학, 안정적인 생산 능력, 장기적 영향, 면역 원성 및 독성(부적절하거나 과도한 발현 포함) 등이다. 이러한 영역에 대한 연구는 임상 시험의 성공을 위해 꼭 필요하다. 다양한 핵산 치료의 생물학적 이해가 향상되면 미래에 새로운 치료법으로 이어질 것이라는 데는 의심의 여지가 없다.
아울러, 본 발명은 자가전사 RNA/DNA 시스템을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.
V. 발현 카세트 및 전달체
본 발명의 자가전사 RNA/DNA 시스템은 DdRp에 의해 발현하는 신규 발현 카세트에 관한 내용을 포함함으로, 보다 상세하게는 선형 DdRp RNA 발현 카세트, auto_DdRp 발현 카세트, auto-loop로 발현되는 DdRp 발현 시스템, 프로모터와 발현 억제 RNA를 코딩하는 DNAes 발현 카세트, auto_(DdRp+DNAi) 발현 카세트, 항생제 저항성 유전자, 복제원점(origin of replication) 및 상기 클로닝 부위 서열을 포함하는 재조합 발현 카세트 및 상기 발현 카세트로 형질전환된 세포 등에 관한 것이다.
제한효소(Restriction endonuclease)는 거의 모든 세균에 존재하며 이는 DNA에 존재하는 특정한 염기서열을 인식하여 인식한 서열부위 또는 그 근처의 특정부위를 절단하는 효소이다. 이러한 제한효소는 원래 세균이 자신의 세포 내로 침입해 들어오는 바이러스와 같은 외부 DNA를 제거하기 위하여 방어기전으로 가지고 있는 것이며 자신의 DNA는 절단부위의 염기(아데닌 또는 사이토신)를 메틸화시켜서 제한효소로부터 보호하고 있다. 이런 제한효소의 성질을 이용하여, 벡터 내에 원하는 유전자를 삽입할 수 있다.
특히 발현 카세트에는 다중클로닝부위(다중 clonibg site, MCS)가 있는데, 이 부위는 인위적으로 여러 가지 제한효소의 인식부위를 모아놓은 것으로 cloning을 위한 insert DNA의 제한 효소를 결정해 준다. 플라스미드 벡터는 제한효소 중에서 많이 쓰이는 것을 위주로 MCS를 구성해서 상용화되어 있다. 이러한 범용 제한효소를 활용한 MCS는 높은 빈도수로 인해서 전체 유전자의 클로닝이 어렵거나 불가능한 유전자들이 존재한다.
본 발명의 재조합 발현 카세트는 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있는 카세트로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다. 발현 카세트는 발현조절 서열 및 필요에 따라 막표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현 조절 서열(expression control sequence)이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 5′Cap 구조, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 또한 발현 카세트는 카세트를 포함하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있으며, 복제 가능한 발현 카세트인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 카세트에는 알려진 다양한 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함할 수 있으며, 이 목적 단백질을 암호화하는 염기서열은 프로모터와 작동 가능하게 연결된다. 작동 가능하게 연결(operably linked) 된다는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다.
본 발명에 따른 발현 카세트는 단백질 발현에 사용되는 기존의 카세트를 기본 골격으로 하여 본 발명의 MCS 폴리뉴클레오타이드를 각각 구조유전자가 선정된 DdRp가 결합하는 프로모터에 의해 작동가능하게 연결되도록 삽입됨으로써 제조할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 발현 카세트는 복제원점, 프로모터, 형광 단백질 유전자, MCS 및 선별 마커를 포함할 수 있으며, 추가로 단백질 발현을 위한 폴리A 신호서열이 포함될 수 있다.
본 발명에서 선별 마커(selective marker)는 항생제 저항성 유전자일 수 있으며, 이러한 항생제 저항성 유전자로 될 수 있는 유전자는 현재 다수가 공지되어 있다(예를 들어, 카나마이신, 네오마이신, 앰피실린, 테트라사이클린 등). 따라서, 당업자는 상기 공지된 항생제 저항성 유전자들로부터 원하는 유전자를 취사선택하여 사용하는 것이 가능하며 이러한 유전자의 구체적인 종류는 본 발명의 본질을 구성하는 것은 아니다. 뿐만 아니라, 이러한 항생제 저항성 유전자의 도입은 형질전환체를 선발하기 위한 것이므로, 선발에 사용될 수 있는 유전자라면 어떠한 것도 도입될 수 있다. 따라서, 항생제 저항성 유전자에만 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 본 발명의 항생제 저항성 유전자는 카나마이신 또는 네오마이신 저항성 유전자일 수 있다.
본 발명의 발현 카세트에는 본 발명의 발현 카세트의 기본 구조가 동일 또는 유사하는 한 코돈 degeneracy 등 당업자에게 공지된 방식에 따른 염기서열이 다소간의 변화된 발현 카세트도 포함한다. 아울러, 서열목록의 N-말단과 C-말단이 원형을 이루는 것은 당업자에게 자명하다.
한편, 본 발명은 본 발명의 재조합 카세트로 형질전환한 세포를 제공한다.
본 발명의 재조합 발현 카세트는 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 숙주내로 도입할 수 있다. 그 예로는 이에 한정되지는 아니하나, 염화칼슘 및 열 쇼크법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporaion), PEG-매게 융합법, 미세사출법, 미세주입법, 리포좀 매개법 및 진공침윤법 등을 사용할 수 있다.
상기 숙주 세포로는 동물, 식물, 효모 및 박테리아의 세포일 수 있으며, 바람직하게는 박테리아 외의 경우 외부로부터 도입되는 벡터를 잘 받아들일 수 있고, 세포질과 핵 등의 세포내 소기관의 경계가 뚜렷하게 구별되는 세포가 바람직하다. 더 바람직하게는 CHO-k1(ATCC CCL-61, Cricetulus griseus, hamster, Chinese), HEK293(ATCC CRL-1573, Homo sapiens, human), HeLa(ATCC CCL-2, Homo sapiens, human), SH-SY5Y(ATCC CRL-2266, Homo sapiens, human), Swiss 3T3(ATCC CCL-92, Mus musculus, mouse), 3T3-L1(ATCC CL-173, Mus musculus, mouse), NIH/3T3(ATCC CRL-1658, Mus musculus, mouse), L-929(ATCC CCL-1, Mus musculus, mouse), Rat2(ATCC CRL-1764, Rattus norvegicus, rat), RBL-2H3(ATCC CRL-2256, Rattus norvegicus, rat), MDCK(ATCC CCL-34, Canis familiaris)일 수 있다. 또한 그 밖에 각종 줄기세포, 각종 조직에서 추출된 세포 및 인위적으로 만들어진 유사 세포막 구조물일 수 있다.
한편, 본 발명에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 다음 문헌에 기재되어 있다(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989); by Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984); and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience (1987)).
본 발명은 상술한 핵-비의존적 세포질 내에서 DdRp에 의한 유전자 발현 조절서열을 포함하는 개선된 발현 카세트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 발현 카세트는 대장균 유래 플라스미드, 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드, 효모 유래 플라스미드 및 Ti 플라스미드 등의 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 아데노바이러스(Lockett LJ, et al.,Clin. Cancer Res. 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련바이러스(Adeno associated viruses: AAV)(Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager (1999)), 레트로바이러스 (Gunzburg WH, et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, (1999)), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995)), 백시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 리오바이러스, 폭스바이러스 (GCE, NJL, Krupa M, Esteban M., The poxvirus vectors MVA and NYVAC as gene delivery systems for vaccination against infectious diseases and cancer Curr Gene Ther 8(2):97-120(2008)), 셈리키 포리스터 바이러스, 폴리머 (Hwang et al., In vitro and In vivo Transfection Efficiency of Human Osteoprotegerin Gene using Non-Viral Polymer Carriers., Korean J. Bone Metab. 13(2):119-128(2006)), 리포좀 (Methods in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002), 나노물질 또는 니오좀에 적용될 수 있다.
ⅰ. 플라스미드
플라스미드는 세균 세포내에 독립적으로 존재하는 원형의 DNA분자이다. 플라스미드는 거의 항상 하나 이상의 유전자를 가지고 있으며 이들 유전자는 종종 숙주세균에 의해 나타나는 유용한 특징을 담당하고 있다. 예를 들어, 항생제의 정상적인 독성농도에서 생존하는 능력은 항생제 저항성 유전자를 가진 플라스미드가 세균내에 존재하기 때문이다. 실험실에서 이러한 항생제 저항성은 종종 선별 마커(selectable marker)로서 이용된다.
모든 플라스미드는 복제 원점(replication origin; 숙주 세포의 복제효소가 인식할 수 있는 부위를 말하며, 이 부위에서부터 복제가 시작된다.) 역할을 할 수 있는 DNA 서열을 적어도 하나 가지고 있으며, 따라서 주 세균 염색체(main bacterial chromosome)와는 독립적으로 세포내에서 복제할 수 있다. 어떤 유형의 플라스미드는 세균 염색체 안으로 자신을 삽입시킴으로써 복제할 수 있다. 이렇게 통합하는 플라스미드(episome이라 부름)들은 수많은 세포분열 동안 이 형태를 안정적으로 유지할 수 있다. 그러나 어떤 단계에서는 excision(통합되는 과정의 역과정)됨으로써 독립적인 요소로 존재한다.
Selectable marker란 벡터에 의해 운반된 유전자로서, 이 벡터 또는 재조합 DNA분자를 가진 세포의 특징이 인식될 수 있도록 해주는 유전자를 말한다.
플라스미드의 크기의 범위는 가장 작은 것은 1.0 kb로부터 가장 큰 것은 250 kb 이상까지이다. Copy number란 하나의 세균 세포에서 정상적으로 발견되는 플라스미드의 수를 말한다. Copy number를 조절하는 인자는 잘 이해되지 않았지만, 각 플라스미드는 1~50개 이상의 특징적인 수를 가지고 있다.
플라스미드가 세균에 널리 분포하고 있긴 하지만 다른 생물체에서도 그렇게 보편적인 것은 결코 아니다. 가장 많이 연구된 진핵세포성 플라스미드(eukaryotic plasmid)는 2㎛ circle로서 효모에 존재한다. 2㎛ 플라스미드의 발견은 이것이 숙주로서 매우 중요한 산업적 생물체의 유전자를 클로닝하기 위한 벡터의 제조를 가능하도록 했기 때문에 매우 운이 좋은 것이었다. 그러나 다른 진핵 생물에서는 플라스미드가 발견되지 않고 있다.
ⅱ. 아데노바이러스
아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기, 조작의 편의성, 높은 타이터, 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200 bp의 ITR (inverted terminal repeat)를 포함하며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스 엘리먼트이다. 지놈의 E1 영역(E1A 및 E1B)은 전사 및 숙주 세포 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 코딩한다. E2 영역(E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 코딩한다. 현재 개발된 아데노바이러스 벡터 중에서, E1 영역이 결여된 복제 불능 아데노바이러스가 많이 이용되고 있다. 한편, E3 영역은 통상적인 아데노바이러스 벡터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다 (Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551(1982); 및 Riordan, J. R. et al.,Science, 245:1066-1073(1989)). 따라서, 본 발명의 유전자발현 조절서열은 E1A 유전자의 프로모터 서열 위치에 삽입되어 E1A 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 또한, 본 발명의 유전자발현 조절서열-발현 유전자 카세트는 결실된 E1 영역(E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 결실된 E1 영역에 삽입된다. 또한, 본 발명의 유전자발현 조절서열-발현 유전자 카세트는 결실된 E4 영역에도 삽입될 수 있다. 본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어, "결실"은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다.
또한, 아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105%까지 패킹할 수 있기 때문에, 약 2 kb를 추가적으로 패키징할 수 있다(Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6:1733-1739(1987)). 따라서, 아데노바이러스에 삽입되는 상술한 외래 서열은 아데노바이러스의 지놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.
아데노바이러스에 의해 운반되는 외래 유전자는 에피좀과 동일한 방식으로 복제되며, 이에 숙주세포에 대해 유전적 독성이 매우 낮다. 따라서, 본 발명의 아데노바이러스 유전자 전달 시스템을 이용한 유전자 치료가 매우 안전할 것으로 판단된다.
ⅲ. 레트로바이러스
레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주의 지놈으로 삽입시키고, 대량의 외래 유전 물질을 운반할 수 있으며, 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다.
레트로바이러스 벡터를 구축하기 위하여, 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열은 레트로바이러스의 서열 대신에 레트로바이러스 지놈에 삽입되어 복제불능의 바이러스를 생산한다. 바이리온을 생산하기 위하여, gag, pol 및 env 유전자를 포함하지만 LTR(long terminal repeat)와 Ψ서열은 없는 패키징 세포주를 구축한다(Mann et al., Cell, 33:153-159(1983)). 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열, LTR 및 Ψ서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 상기 세포주에 이입하면, Ψ서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체의 생산을 가능하게 하며, 이 전사체는 바이러스로 패키징되고, 바이러스는 배지로 배출된다 (Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt(eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513(1988)). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고 농축하여 유전자 전달 시스템으로 이용한다.
2세대 레트로바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달이 발표되었다. Kasaharaet al. Science, 266:1373-1376(1994))는 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스의 변이체를 제조하였고, 여기에서 EPO(erythropoietin) 서열을 엔벨로프 부위에 삽입하여 새로운 결합 특성을 갖는 키메릭 단백질을 생산하였다. 본 발명의 유전자 전달 시스템도 이와 같은 2세대 레트로바이러스 벡터의 구축 전략에 따라 제조할 수 있다.
ⅳ. AAV 벡터
아데노-관련 바이러스 (AAV)는 비분열 세포을 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제5,139,941 호 및 제 4,797,368 호에 상세하게 개시되어 있다. 유전자 전달 시스템으로서의 AAV에 대한 연구는 LaFace et al, Viology, 162:483486(1988), Zhou et al., Exp. Hematol. (NY), 21:928-933(1993), Walsh et al, J. Clin. Invest., 94:1440-1448(1994) 및 Flotte et al., Gene Therapy, 2:29-37(1995)에 개시되어 있다. 최근에, AAV 벡터는 낭포성 섬유증의 치료제로서 임상 I을 실시하고 있다.
전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 AAV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열(릴랙신 유전자 및 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드 (McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963-1973(1988); 및 Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828(1989)) 및 말단 리피트가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드(McCarty et al., J. Virol., 65:2936-2945( 1991))를 동시 형질주입시켜 제조된다.
ⅴ. 다른 바이러스 벡터
다른 바이러스 벡터들도 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 이용할 수 있다. 배시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492(1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148( 1986) 및 Coupar et al., Gene, 68:1-10(1988)), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995)), 리오바이러스, 폭스바이러스(GCE, NJL, Krupa M, Esteban M., The poxvirus vectors MVA and NYVAC as gene delivery systems for vaccination against infectious diseases and cancer Curr Gene Ther 8(2):97-120(2008)), 셈리키 포리스터 바이러스로부터 유래된 벡터들도, 목적 뉴클레오타이드 서열을 세포내로 운반할 수 있는 운반 시스템으로 이용할 수 있다.
ⅵ. 폴리머
비바이러스성 유전자 전달체로서 폭넓게 사용되는 폴리머계 전달체로는 젤라틴, 키토산(Carreno GB, Duncan R. Evaluation of the biological properties of soluble chitosan and chitosan microspheres. Int J Pharm 148:231-240(1997)) PLL(poly-LLysine)(Maruyama A, Ishihara T, Kim JS, Kim SW, Akaike T. Nanoparticle DNA carrier with poly (L-lysine) grafted polysaccharide copolymer and poly (D,Llactide). Bioconjugate Chem 8:735-742(1997)) 및 PEI(polyethyleneamine)(Abdallah B, Hassan A, Benoist C, Goula D, Behr JP, Demeneix BA. A powerful nonviral vector for in vivo gene transfer into the adult mammalian brain: Polyethyleneimine. Human Gene Ther 7:1947-1954(1996)) 등이 이용되고 있다. 폴리머계 유전자 전달체들의 장점은 면역반응과 급성독성의 발현율이 낮고 제조법이 간단하며 대량생산이 가능하다는 점이다.
ⅶ. 리포좀 및 니오좀
리포좀은 수상에 분산된 인지질에 의해 자동적으로 형성된다. 외래 DNA 분자를 리포좀으로 성공적으로 세포 내로 운반한 예는 Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982) 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)에 개시되어 있다. 한편, 리포좀을 이용한 동물세포의 형질주입에 가장 많이 이용되는 시약으로는 Lipofectamine(Gibco BRL)이 있다. 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 내포한 리포좀은 엔도사이토시스, 세포 표면에로의 흡착 또는 플라즈마 세포막과의 융합 등의 기전을 통해 세포와 상호 작용하여 세포내로 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 운반한다.
리포좀이 인지질을 이용하여 만들어지는 것에 반하여 니오좀(niosome)은 사용하고 비-이온성 계면활성제(nonionic surfactant) 및 콜레스테롤(cholesterol)의 혼합으로 구성된 이중막 수송체로 극성 및 비극성 물질을 봉입할 수 있고, 삼투압적으로 활성이 있으며, 인지질 등에 의한 지질미립자의 운반체인 리포좀에 비하여 안정하고, 또한 제조시 사용되는 계면활성제가 보관 및 취급 시에 특별한 조건이 필요하지 않다는 장점을 가진다.
ⅷ. 나노물질
본 명세서 상의 용어 나노물질은 수 내지 수백 나노미터의 크기를 갖는 생체 적합성 고분자 물질을 의미하는 것으로서, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜(polyetheleneglycol, PEG), 폴리락타이드(poly-lactide, PLA), 폴리글리콜리드(polyglycolide, PGA), 폴리락티드코글리콜리드(poly-lactide-co-glycolide, PLGA), 폴리카프로락톤(poly-ε-carprolactone, PCL), 히알루론산(hyaluronic acid, HA), 키토산(chitosan), 또는 혈청 알부민이 이에 해당할 수 있다.
한편, 상술한 본 발명의 유전자 전달 시스템을 세포내로 도입하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다.
본 발명에서, 유전자 전달 시스템이 바이러스 벡터에 기초하여 제작된 경우에는, 당업계에 공지된 바이러스 감염 방법에 따라 실시된다. 바이러스 벡터를 이용한 숙주 세포의 감염은 상술한 인용문헌에 기재되어 있다.
본 발명에서 유전자 전달 시스템이 내이키드 (naked) 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드인 경우에는, 미세 전환법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980); 및 Harland와 Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099(1985)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973); 및 Chen과 Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752(1987)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982); 및 Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986)), 리포좀-매개 형질주입법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980); Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982); 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 방법에 의해 유전자를 세포내로 이입시킬 수 있다.
VI. 약학적 조성물:
본 발명의 발현억제 RNA/DNA 시스템 다수를 포함하는 조성물의 코딩된 펩타이드 또는 단백질의 발현 증가용 약학적 조성물의 제조용으로서의 용도, 특히 예를 들어, 바람직하게는 본원에 정의된 바와 같은 질환 치료용 유전자 치료용, 예를 들어, 본 발명의 자가전사 RNA/DNA 시스템 다수를 포함하는 조성물을, 세포(예를 들어, 발현 숙주 세포 또는 체세포), 조직 또는 유기체에, 바람직하게는 나출된(naked) 형태 또는 복합된 형태 또는 본원에 설명된 약학적 조성물로서 제트 인젝션으로 적용 또는 투여하는 약학적 조성물 제조용으로서의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 자가전사 RNA/DNA 시스템을 포함하는 약학적 조성물, 또는 본 발명의 자가전사 RNA/DNA 시스템 다수(plurality)를 포함하는 조성물 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 비히클도 포함한다.
제1 성분으로서, 약학적 조성물은 본원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 화학적 변형된 핵산을 포함한다.
제2 성분으로서, 약학적 조성물은 적어도 하나의 추가적인 약학적 활성 성분(pharmaceutically active component)을 선택적으로 포함할 수 있다. 이와 관련된 약학적 활성 성분은 본원에 언급된 바와 같은 특정 징후 또는 질환을 치유, 완화 또는 예방하는 치료 효과를 갖는 화합물이다. 이와 같은 화합물은, 이에 한정된 것을 암시하지는 않지만, 바람직하게 본원에 정의된 바와 같은 펩타이드 또는 단백질, 바람직하게 본원에 정의된 바와 같은 핵산, (치료적 활성) 저 분자량 유기 또는 무기 화합물(분자량 5000 미만, 바람직하게는 1000 미만), 바람직하게는 본원에 정의된 바와 같은 당, 항원 또는 항체, 이미 선행 기술에 알려져 있는 치료제, 항원 세포, 항원 세포 절편, 세포 분획; 세포벽 성분(예를 들어, 다당류), 화학적 변형된, 약화된 또는 불활성화된(예를 들어, 화학적 또는 조사(irradiation)에 의해) 병원체(바이러스, 박테리아 등), 바람직하게는 본원에 정의된 바와 같은 어쥬번트 등을 포함한다.
또한, 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 비히클을 포함할 수 있다. 본 발명에서, 약학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 독창적인 약학적 조성물의 액체 또는 비-액체 기초(basis)를 포함한다. 담체는 일반적으로 발열원 없는 물, 등장성 식염수 또는 버퍼(수성) 용액, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이드등 버퍼 용액이다. 참조 배지(Reference media)는 예를 들어, 혈액, 림프, 세포질액(cytosolic liquid)과 같은 "생체 내(in vivo)" 방법에 존재하는 액체, 또는 다른 체액, 또는 예를 들어, 통상의 버퍼 또는 액체와 같은 "시험관 내(in vitro)" 방법에 참조 배지로서 사용될 수 있는 액체이다. 이와 같은 통상의 버퍼 또는 액체는 통상의 기술자에게 알려져 있다. Ringer-Lactate 용액은 액체 기초로서 특히 바람직하다.
그러나, 하나 이상의 양립할 수 있는 고체 또는 액체 필러(filler) 또는 희석제(diluent) 또는 캡슐화된 화합물(encapsulating compound)은 치료될 환자에 투여하기 위해 적합한 약학적 조성물로서도 사용될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "양립할 수 있는(compatible)"은 이들 약학적 조성물의 구성 성분(constituent)이 일반적인 사용 조건하에서 약학적 조성물의 약학적 효과를 실질적으로 감소시키는 상호작용이 발생하지 않는 방식으로 화학적 변형된RNA를 혼합할 수 있는 것을 의미한다.
복합화(Complexation):
또한, 약학적 조성물은 본 발명의 자가전사 RNA/DNA 시스템을 위한 담체를 포함할 수 있다. 이와 같은 담체는 생리학적으로 허용가능한 액체에서 용해, 약학적으로 발명의 RNA/DNA 시스템의 수송 및 세포 흡수를 중재하기 위해 적합할 수 있다. 따라서, 이와 같은 담체는 본 발명에 따른 발명의 RNA/DNA 시스템의 저장 및 운반에 적합할 수 있는 성분일 수 있다. 이와 같은 성분은 예를 들어, 형질주입 또는 복합화 제제 역할을 할 수 있는 양이온성 또는 다중양이온성 담체 또는 화합물일 수 있다.
특히 바람직한 형질주입 또는 복합화 제제는 양이온성 또는 다중양이온성 화합물, 예를 들어, 프로타민, 뉴클레올린(nucleoline), 스퍼민 또는 스퍼미딘, 또는 다른 양이온성 펩타이드 또는 단백질, 예컨대, 폴리-L-리신(PLL), 폴리-아르기닌, 염기성 폴리펩타이드, 세포 투과성 펩타이드(CPPs), 예를 들어, HIV-결합 펩타이드, HIV-1 Tat(HIV), Tat-유래 펩타이드, 페네트라틴, VP22 유래 또는 유사 펩타이드, HSV VP22(단순 포진(Herpes simplex)), MAP, KALA 또는 단백질 형질주입 도메인(PTDs), PpT620, 프롤린-풍부 펩타이드, 아르기닌-풍부 펩타이드, 리신-풍부 펩타이드, MPG-펩타이드(들), Pep-1, L-올리고머, 칼시토닌 펩타이드(들), 안테나페디아-유래 펩타이드(Antennapedia-derived peptide)(특히, 드로소필라 안테나페디아(Drosophila antennapedia) 유래, pAntp, pIsl, FGF, 락토페린, 트랜스포탄, 버포린-2, Bac715-24, SynB, SynB(1), pVEC, hCT-유래 펩타이드, SAP, 또는 히스톤이다.
또한, 이와 같은 양이온성 또는 다중양이온성 화합물 또는 담체는 양이온성 또는 다중양이온성 펩타이드 또는 단백질일 수 있으며, 바람직하게는 적어도 하나의 -SH 성분을 포함하거나 포함하기 위해 추가적으로 변형될 수 있다.
본 발명의 자가전사 RNA/DNA 시스템은 양이온성 또는 다중양이온성 화합물, 바람직하게는 양이온성 단백질 또는 펩타이드와 함께 적어도 부분적으로 복합되는 것이 특히 바람직하다. 부분적으로는 단지 SM_DNAes 분자의 일부가 양이온성 또는 다중양이온성 화합물과 복합되고 SM_DNAes 분자의 나머지가 비복합된 형태("자유(free)")를 의미한다. 바람직하게는, 자유 SM_DNAes에 대한 복합된 SM_DNAes의 비율은 약 5:1 (w/w) 내지 약 1:10 (w/w)의 범위, 더욱 바람직하게는 약 4:1 (w/w) 내지 약 1:8 (w/w)의 범위, 더욱 더 바람직하게는 약 3:1 (w/w) 내지 약 1:5 (w/w) 또는 1:3 (w/w)의 범위로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 자유 핵산에 대한 복합된 핵산의 비율은 약 1:1 (w/w)의 비율로부터 선택된다.
독창적인 약학적 조성물에 포함될 수 있는 추가적인 첨가제는 유화제, 예컨대, 예를 들어, 트윈　 습윤제, 예컨대, 예를 들어, 소듐 라우릴 설페이트; 착색제; 향미 부여제, 약학적 담체; 정제-형성제; 안정화제; 항산화제; 방부제가 있다.
약학적 조성물은 바람직하게 피하로, 근육 내로, 피부 내로 투여될 수 있다. 약학적 조성물의 살균 주사가능한 형태는 수성 또는 유성 현탁액일 수 있다. 이들 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제(suspending agent)를 사용하여 당 업계에 알려진 기술에 따라 제형화될 수 있다.
약학적 조성물은 일반적으로 약학적 조성물의 성분, 특히 본 발명의 자가전사 RNA/DNA 시스템의 "안전하고 유효한 양"을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, "안전하고 유효한 양"은 본원에 정의된 바와 같은 질환 또는 장애의 긍정적인 변형을 현저하게 유도하는데 충분한 그런 본원에 정의된 바와 같은 발명의 자가전사 RNA/DNA 시스템의 양을 의미한다. 동시에, 그러나, "안전하고 유효한 양"은 심각한 부작용을 회피하기에 충분히 적고 장점 및 위험 사이의 합리적인(sensible) 관계를 허용하기에 충분히 적다. 이러한 한정의 결정은 일반적으로 합리적인 의학적 판단의 범위 내에 있다.
또한, 본 발명의 자가전사 RNA/DNA 시스템의, 본원에 정의된 바와 같은 자가전사 RNA/DNA 시스템의 다수를 포함하는 조성물의, 본 발명의 자가전사 RNA/DNA 시스템을 포함하는 약학적 조성물의, 또는 동일한 것을 포함하는 키트의 여러 적용 및 용도를 제공한다.
바람직하게는 본 발명의 자가전사 RNA/DNA 시스템, 본 발명의 자가전사 RNA/DNA 시스템 분자의 다수를 포함하는 독창적인 조성물, 동일한 것을 포함하는 약학적 조성물, 또는 동일한 것을 포함하는 키트의 본원에 정의된 바와 같은 질환의 예방, 치료 및/또는 완화용 약제의 제조를 위한 용도에 관한 것이다. 바람직하게, 약학적 조성물은 이러한 목적을 위해 이를 필요로 하는 환자에 사용되거나 투여된다.
바람직하게, 본 발명의 질환은 바람직하게 감염성 질환, 신생물(neoplasm)(예를 들어, 암 또는 종양 질환), 혈액 및 혈액-형성 기관 질환, 내분비, 영양성 및 대사 질환, 신경계 질환, 순환계 질환, 호흡계 질환, 소화계 질환, 피부 및 피하 조직 질환, 근골격계 및 결합 조직 질환 및 비뇨생식계(genitourinary system) 질환으로부터 선택된다.
본 발명에서 용어 *?**?*전달체*?**?*는 상기 RNA/DNA 시스템의 세포 안으로의 전달을 높여주는 물질이라면 제한없이 포함된다. 구체적으로, 상기 전달체는 리포좀, 폴리머 기반의 나노입자(nanoparticle), 덴드리머(dendrimer), 금 나노입자(gold nanoparticle)일 수 있으며, 보다 구체적으로 유전물질 전달에 일반적으로 사용되는 양이온성 리포좀일 수 있으며, 상기 리포좀은 DC-Chol/DOPE 리포좀, DMRIE/DOPE 리포좀, EDMPC/Chol 리포좀, GL-67/DOPE/DMPE/PEG 리포좀, 또는 DOPC(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 리포좀일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 전달체는 본 발명의 RNA/DNA 시스템으로, 세포 내에 전달되어 DdRp 발현 루프를 수행하여 세포질 내 DdRp의 발현 및 그에 따른 RNA의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 전달체는 암 조직에 선택적으로 축적되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 상기 암은 폐암, 위암, 결장암, 유방암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부암, 두경부암, 흑색종, 자궁암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 음문암, 호지킨 림프종(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 전립선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장암, 수뇨관암, 신장골반암, 혈액암, 뇌암, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 표적을 달성하기 위해서 상기 DNAes 전달체의 제조방법을 제공한다. 캡된 CM/SM_DdRp mRNA: auto_DdRp 발현 카세트; 및 DNAes 발현 카세트를 포함하는 자가전사 RNA/DNA 시스템 및 이들의 전달체에 관한 내용은 전술한 바와 같다.
구체적으로, 상기 제조방법은 DdRp RNA 발현 카세트, auto_DdRp 발현 카세트 및 DNAes 발현 카세트를 각각 제조하는 단계; 및 DdRp RNA 발현 카세트, auto_DdRp 발현 카세트 및 DNAes 발현 카세트를 포함하는 RNA/DNA 시스템과 DOPC를 혼합하는 단계를 포함할 수 있으며, 추가로 상기 혼합하는 단계 이후 유리 자가전사 RNA/DNA 시스템을 여과하여 제거하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 혼합하는 단계에 있어서, 상기 자가전사 RNA/DNA 시스템과 DOPC를 1:5 내지 1:10(w/w)의 비율로 혼합할 수 있으며, 보다 구체적으로 1:10의 비율로 혼합하여 제조할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, DNAes 발현 카세트: 캡된 CM/SM_DdRp mRNA; auto_DdRp 발현 카세트 = 0.4:1:1의 몰비(molar ratio)로 혼합될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 DdRp RNA 발현 카세트 및 DNAes 발현 카세트;를 포함하는 자가전사 RNA/DNA 시스템 또는 상기 RNA/DNA 시스템에 추가적으로 상기 auto_DdRp 발현 카세트;를 포함하는 RNA/DNA 시스템을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 사용될 수 있고, 특히 본원에 정의된 바와 같은 목적으로 사용될 수 있으며, 바람직하게는 본원에 정의된 바와 같은 질환들을 치료하는 유전자 치료에 사용될 수 있다.
추가적으로 본 발명은 DdRp RNA 발현 카세트 및 DNAes 발현 카세트 및 auto_DdRp 발현 카세트를 포함하는 바이러스 발현 카세트로 구성된 RNA/DNA 시스템을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 사용될 수 있다.
상기 조성물은 먼저, DNAes 발현 카세트 및 auto_DdRp 발현 카세트를 포함하는 바이러스 발현 카세트를 표적 세포 및 조직에 형질주입하고 DdRp RNA 발현 카세트를 전환하는 방법으로 특히 본원에 정의된 바와 같은 목적으로 사용될 수 있다.
약학적 조성물은 또한 유전자 치료, 특히 바람직하게 본원에 정의된 바와 같은 질환 또는 장애의 치료에 사용될 수 있다.
추가의 측면에 따르면, 본 발명은 또한 키트, 특히 부품 키트(kits of parts)를 제공한다.
이와 같은 키트, 특히 부품 키트는 일반적으로 성분 단독 또는 본원에 정의된 바와 같은 추가적인 성분, 적어도 하나의 본원에 정의된 바와 같은 RNA/DNA 시스템을 포함하는 약학적 조성물 또는 백신과 조합하여 포함한다. 본원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 RNA/DNA 시스템은 선택적으로 본원에 정의된 바와 같은 추가적인 성분과 조합되며, 이에 의해 본 발명에 따른 적어도 하나의 자가전사 RNA/DNA 시스템은 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 키트의 적어도 하나의 다른 부품과 분리되어(키트의 제 1 부품) 제공된다.
약학적 조성물은 예를 들어, 키트의 하나 또는 상이한 부품에 존재할 수 있다. 예시로서, 예를 들어, 적어도 하나의 키트의 부품은 적어도 하나의 본원에 정의된 바와 같은 RNA/DNA 시스템, 및 적어도 하나의 추가적인 키트의 부품 본원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 다른 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 적어도 하나의 키트의 다른 부품은 적어도 하나의 약학적 조성물 또는 이의 부품을 포함할 수 있고, 예를 들어, 적어도 하나의 키트의 부품은 본 발명의 RNA/DNA 시스템, 적어도 하나의 추가적인 키트의 부품 본원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 다른 성분, 적어도 하나의 추가적인 키트의 부품 적어도 하나의 약학적 조성물의 성분 또는 약학적 조성물 전체, 그리고 적어도 하나의 추가적인 키트의 부품 예를 들어, 적어도 하나의 약학적 담체 또는 비히클 등을 포함할 수 있다. 키트 또는 부품 키트가 본 발명의 자가전사 RNA/DNA 시스템 분자의 다수를 포함하는 경우에, 키트의 일 성분은 키트에 포함된 오직 하나, 여러 또는 모든 SM_DNAes 분자 또는 이에 상응하는 DNA를 포함할 수 있다. 모든/각각의 본 발명의 RNA/DNA 시스템은 키트의 상이한/분리된 성분에 포함될 수 있고 각각의 성분은 키트의 부품을 형성한다. 또한, 하나 이상의 다른(제2, 제3 등) 성분(하나 이상의 다른 부품 키트로 제공되는)은 제1 성분과 동일하거나 부분적으로 동일하거나 상이할 수 있는 하나 이상의 SM_DNAes를 함유할 수 있는 반면에, 하나 이상의 본 발명의 RNA/DNA 시스템은 키트의 부품으로서 제1 성분에 포함될 수 있다. 또한, 키트 또는 부품 키트(kit of parts)는 본 발명의 RNA/DNA 시스템, 약학적 조성물 또는 임의의 이의 성분 또는 예를 들어, 키트가 부품키트로서 제조되는 경우에는 부품(parts)의 투여 및 투여량에 대한 정보와 함께 기술적 설명서(technical instruction)를 함유할 수 있다.
바람직하게, 본 발명에 따른 키트는 바람직하게는 동결 건조된 형태의 자가전사 RNA/DNA 시스템을 위한 적합한 발현 카세트를 포함한다. RNA/DNA 시스템은 용기, 바람직하게는 RNA/DNA 시스템이 재가용화되는 용기에 제공된다.
본 발명의 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 본 발명은 세포질 내에서 핵-비의존적 및 안정적인 DdRp RNA 발현 카세트의 증폭 또는 auto-DdRp 발현 카세트의 자가전사를 통해 합성되는 DdRp에 의한 DNAes 발현 카세트에 있는 발현억제 RNA의 발현을 향상시키고, 이를 세포 또는 개체에서 안정적으로 유지시킬 수 있어 표적 유전정보의 조절에 활용될 수 있다.
다음에 나타낸 도면은 단지 예시적인 것이며, 또 다른 방법으로 본 발명을 설명한다. 이들 도면은 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
도 1은 도 1은 T7 RNAP를 사용한 시험관 내 전사를 위한 프로모터 및 템플릿 DNA 서열의 설계로 프로모터의 이중 가닥 부분은 전사 시작 부위 (+1)에 대해 번호가 매겨지고,
도 2는 박테리오파지 T7, T3, SP6 및 K11에 의해 코딩된 DdRp가 결합하는 프로모터 염기서열 비교한 도면이고,
도 3은 자가전사를 하는 자가전사 RNA/DNA 시스템을 설명하는 도면이고,
도 4는 10,000개 이상의 인간 mRNA의 개시 코돈 주변에서 가장 보존된 염기를 보여주는 서열 로고로 큰 글자는 더 높은 빈도를 나타내며, 8 위치 (-3, Kozak 위치)에서 A와 G의 더 큰 크기와 Kozak 시퀀스의 (+4) 위치에 해당하는 14 위치에서 G가 있으며,
도 5는 제조한 SM_DdRp DNA 절편을 pUC19에 클리닝한 후 재조합 플라스미드를 분리하여 EcoRI/BamHI 제한효소를 처리한 후 전기영동한 결과이고,
도 6은 제조한 SM_DdRp pUC19 벡터를 주형으로 PCR하여 얻은 T7pol mRNA 코딩 DNA를 주형으로 체외전사하고 얻은 캡된 CM_T7pol mRNA를 상이한 양으로 전기영동한 결과이고,
도 7은 제조한 캡된 SM_T7pol mRNA(Native RNA), 캡된 CM/SM_T7pol mRNA(modified RNA) 및 3′ 말단에 cholesterol이 부가된 캡된 CM/SM_T7pol mRNA(modified RNA-cholesterol)을 세포배양액에 제조한 RNA를 다양한 시간 동안 처리한 후 RT-PCR하여 in vitro 안정성을 확인한 결과이고,
도 8은 제조한 SM_DdRp DNA 절편을 포유류 발현벡터, pCI-neo 벡터에 클로닝하고 재조합 플라스미드를 BglII/HpaI 제한효소를 처리한 후 전기영동한 결과이고,
도 9는 증폭된 SM_- NP868R-T7RNAP DNA 절편를 포함하는 PCR 산물은 는 BglII/HpaI 효소를 사용하여 절단한 다음, 선형화된 pCI-neo 벡터와 T4 DNA ligase를 이용하여 클로닝 반응한 후 선정된 균주에서 플라스미드를 분리하여 BglII/HpaI 제한효소를 처리한 후 전기영동한 결괴이고,
도 10은 본 발명의 DNAes의 일종인 다중의 shRNA를 코딩하는 DNAes 발현 카세트(다중 shRNA cassettes)의 제조 방법이고,
도 11은 DNAes의 일종인 다중 shRNA 발현 카세트를 을 포유류 발현벡터, pCI-neo 벡터에 클로닝하고 재조합 플라스미드를 BglII/HpaI 제한효소를 처리한 후 전기영동한 결과이고,
도 12는 암세포 사멸을 저해하는 Bcl-2, Bcl-xL, XIAP 및 survivin 유전자를 표적하는 다중 shRNA 접합체를 코딩하는 DNAes 발현 카세트를 PCR하여 얻은 산물을 주형으로 T7 Pol 체외전사하고 제조한 다중 shRNA를 전기영동한 결과이고,
도 13은 DNAes의 일종, mTERT- 특이적 리보자임으로 <T7 프로모터- mTERT-특이적 리보자임 - HSV-tk - WPRE -muag - A64 - C30 - 히스톤SL> 구조인 DNAes 절편의 구성도이고,
도 14는 mTERT- 특이적 리보자임 발현 카세트를 pCI-neo 벡터에 클로닝하고 재조합 벡터를 BglII/HpaI 제한효소로 절단하고 전기영동한 결과이고,
도 15는 auto_(DdRp+DNAes) DNA 절편을 포함하는 pCI-neo 벡터를 플라스미드를 BglII/HpaI 제한효소로 절단하고 겔 전기영동을 수행하여 auto_(DdRp+DNAes) 발현 카세트 클론을 확인한 결과이고,
도 16은 auto_(DdRp+DNAes) DNA 절편을 포함하는 pShuttle을 XhoI/SalI 제한효소로 절단하고 겔 전기영동을 수행하여 auto_(DdRp+DNAes) DNA 절편 아데노 발현 카세트 클론을 확인한 결과이고,
도 17은 선형 auto_(DdRp+DNAes) Adeno 발현 카세트를 슈퍼 코일 바이러스 DNA 플라스미드인 pAdEasy-1과 함께 BJ5183 박테리아로 공동 형질 전환하여 얻은 형질주입체는 카나마이신 내성을 위해 선택한 후 재조합은 제한효소를 이용한 방법으로 확인한 결과이고,
도 18은 auto_(DdRp+DNAes) DNA 절편을 포함하는 pSMPUW 셔틀 벡터를 BamHI/SalI 제한효소로 절단하고 겔 전기영동을 수행하여 auto_(DdRp+DNAes) DNA 절편 렌티 발현 카세트 클론을 확인한 결과이고,
도 19는 재조합 pCAMBIA1305.1 를 분리하여 XhoI/SalI로 절단하고 겔 전기영동을 수행하여 auto_DdRp Ti 발현 카세트 클론을 확인한 결과이고,
도 20은 다중 shRNA를 코딩하는 DNA를 포함하는 pCI-neo 포유류 발현 벡터를 분리하고 재조합 플라스미드를 Pst1/XbaI 제한효소로 절단하고 겔 전기영동을 수행하여 pCI-neo_다중 shRNA 발현 카세트 클론을 확인한 결과이고,
도 21은 대조군 pCI-neo_DdRp+DNAes @LS, DdRp RNA/DNAes@LS, DdRp RNA/auto_DdRp+DNAes@LS, DdRp RNA/auto_(DdRp+DNAes)@LS, auto_(DdRp+DNAes) 아데노 발현시스템[DdRp RNA@LS와 auto_(DdRp+DNAes) 아데노 발현 카세트로 구성된 시스템] 또는 auto_DdRp 렌티 발현시스템[DdRp RNA@LS와 auto_(DdRp+DNAes) 렌티 발현 카세트로 구성된 시스템]를 각각 293T 세포에 형질주입 후, 0, 24, 48 및 72시간에서 293T 세포 내 T7 polymerase mRNA를 분석한 결과이고,
도 22는 대조군 pCI-neo_DdRp+DNAes @LS, DdRp RNA/DNAes@LS, 5 pmol DdRp RNA/auto_DdRp+DNAes@LS, DdRp RNA/auto_(DdRp+DNAes)@LS, auto_(DdRp+DNAes) 아데노 발현시스템[DdRp RNA@LS와 auto_(DdRp+DNAes) 아데노 발현 카세트로 구성된 시스템] 또는 auto_DdRp 렌티 발현시스템[DdRp RNA@LS와 auto_(DdRp+DNAes) 렌티 발현 카세트로 구성된 시스템]를 각각 293T 세포에 형질주입 후, 0, 24, 48 및 72시간에서 293T 세포 내 T7 polymerase 단백질을 분석한 결과이고,
도 23은 대조군 pCI-neo_DdRp+DNAes @LS, DdRp RNA/DNAes@LS, DdRp RNA/auto_DdRp+DNAes@LS, DdRp RNA/auto_(DdRp+DNAes)@LS, auto_(DdRp+DNAes) 아데노 발현시스템[DdRp RNA@LS와 auto_(DdRp+DNAes) 아데노 발현 카세트로 구성된 시스템] 또는 auto_DdRp 렌티 발현시스템[DdRp RNA@LS와 auto_(DdRp+DNAes) 렌티 발현 카세트로 구성된 시스템]를 각각 유방암 세포주 MCF-7 세포에 형질주입 후, 0, 24, 48 및 72시간에서 유방암 세포주 MCF-7 세포 내 Bcl-2, Bcl-xL, XIAP 및 survivin mRNA를 분석한 결과이고,
도 24는 대조군 pCI-neo_DdRp+DNAes @LS, DdRp RNA/DNAes@LS, 5 pmol DdRp RNA/auto_DdRp+DNAes@LS, DdRp RNA/auto_(DdRp+DNAes)@LS, auto_(DdRp+DNAes) 아데노 발현시스템[DdRp RNA@LS와 auto_(DdRp+DNAes) 아데노 발현 카세트로 구성된 시스템] 또는 auto_DdRp 렌티 발현시스템[DdRp RNA@LS와 auto_(DdRp+DNAes) 렌티 발현 카세트로 구성된 시스템]를 각각 유방암 세포주 MCF-7 세포에 형질주입 후, 0, 24, 48 및 72시간에서 유방암 세포주 MCF-7 세포내 Bcl-2, Bcl-xL, XIAP 및 survivin 단백질을 분석한 결과이고,
도 25는 Bcl-2, Bcl-xL, XIAP 및 survivin를 표적화하는 다중 shRNA 발현 카세트에서, 대조군 5 pmol pCI-neo_DdRp+DNAes @LS, 5 pmol DdRp RNA/DNAes@LS, 5 pmol DdRp RNA/auto_DdRp+DNAes@LS, 5 pmol DdRp RNA/auto_(DdRp+DNAes)@LS, 3x104 MOI auto_(DdRp+DNAes) 아데노 발현시스템[DdRp RNA@LS와 auto_(DdRp+DNAes) 아데노 발현 카세트로 구성된 시스템] 또는 104 MOI auto_DdRp 렌티 발현시스템[DdRp RNA@LS와 auto_(DdRp+DNAes) 렌티 발현 카세트로 구성된 시스템]를 각각 유방암 세포주 MCF-7 세포에 형질주입 후, 0, 24, 48 및 72시간에서 유방암 세포주 MCF-7 세포의 생존곡선을 분석한 결과이고,
도 26은 mTERT 특이적 리보자임을 이용한 자가전사 RNA/DNA 시스템에서, 대조군 5 pmol pCI-neo_DdRp+DNAes @LS, 5 pmol DdRp RNA/DNAes@LS, 5 pmol DdRp RNA/auto_DdRp+DNAes@LS, 5 pmol DdRp RNA/auto_(DdRp+DNAes)@LS, 3x104 MOI auto_(DdRp+DNAes) 아데노 발현시스템[DdRp RNA@LS와 auto_(DdRp+DNAes) 아데노 발현 카세트로 구성된 시스템] 또는 104 MOI auto_DdRp 렌티 발현시스템[DdRp RNA@LS와 auto_(DdRp+DNAes) 렌티 발현 카세트로 구성된 시스템]를 각각 유방암 세포주 MCF-7 세포에 형질주입 후, 0, 24, 48 및 72시간에서 유방암 세포주 MCF-7 세포의 생존곡선을 분석한 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시례를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시례는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시례만으로 한정되는 것은 아니다.
실시례 1. 자가전사 RNA/DNA 시스템 설계 및 제조
본 발명은 자가전사할 수 있는 DdRp에 의해 발현억제 RNA의 안정적 발현이 가능한 자가전사 RNA/DNA 시스템을 제안하였다. <표 1>에 있는 DdRp에서 단일 서브유닛으로 구성된 DdRp인 T7 RNA 폴리머라제(Gene ID: 1261050), T3 RNA 폴리머라제(Gene ID: 14675519) 및 SP6 RNA 폴리머라제(Gene ID: 19685893)를 이용하여 DdRp에 의해 발현억제 RNA가 안정적으로 발현할 수 있는 특히, 발현 카세트가 선형 핵산 절편, 환형 플라스미드 바이러스 유전자 전달체 또는 이들의 조합으로 구성된 시스템은 핵-비의존적으로 세포질 발현이 가능한 RNA/DNA 시스템은 다음과 같이 제조하였다. 이들에 상응하는 프로모터 염기서열을 <도 2>의 T7 프로모터 서열번호 1, T3 프로모터 서열번호 2, 및 SP6 프로모터 서열번호 3과 같다.
본 발명에서 캡된 CM_DdRp mRNA를 포함하는 DdRp RNA 발현 카세트 및 DNAes 발현 카세트로 구성된 자가전사 RNA/DNA 시스템 1이며; 캡된 CM_DdRp mRNA를 포함하는 DdRp RNA 발현 카세트, auto_DdRp 발현 카세트 및 DNAes 발현 카세트로 구성된 자가전사 RNA/DNA 시스템 2이고; 캡된 CM_DdRp mRNA를 포함하는 DdRp RNA 발현 카세트 및 auto_DdRp mRNA+DNAes 발현 카세트로 구성된 발현억제 RNA 발현 RNA/DNA 시스템 3이 있을 수 있다. 본 발명의 자가전사 RNA/DNA 시스템에서 RNA 발현 카세트는 독립적으로 단리된 RNA 분자이며, DNA 발현 카세트는 플라스미드 혹은 바이러스 시스템을 사용할 수 있다.
본 발명에서 DNA 발현 카세트는 플라스미드인 경우 전자 자가전사 RNA/DNA 시스템 1과 리포좀 전달체를 auto(-)_DNAes@LS, 후자 2개와 리포좀 전달체를 auto_DNAes@LS라고 하였다. 본 발명의 자가전사 RNA/DNA 시스템 1과 리포좀의 복합체인 auto(-)_DNAes@LS는 안정화된 캡된 CM_DdRp mRNA를 포함하는 DdRp RNA 발현 카세트에서 반복적으로 합성되는 T7 폴리머라제가 세포질 내에서 장기간 고농도로 유지되고 반복적으로 DdRp RNA 발현 카세트의 T7 promoter에 결합함으로써 발현억제 RNA 발현이 장기간 안정적으로 유지할 수 있다.
본 발명의 상기 자가전사 RNA/DNA 시스템 2 및 상기 자가전사 RNA/DNA 시스템 3로 구성된 DdRp 자가전사 루프 시스템을 "pT7/T7 polymerase system"이라고 하였다.
본 발명의 자가전사 RNA/DNA 시스템 2 또는 자가전사 RNA/DNA 시스템 3과 리포좀의 복합체인 auto_DNAes@LS는 초기에 안정화된 캡된 DdRp mRNA를 포함하는 DdRp RNA 발현 카세트에서 합성되는 T7 폴리머라제에 의한 auto_DdRp 발현 카세트 또는 auto_(DdRp+DNAes) 발현 카세트의 T7 promoter에 결합함으로써 T7 polymerase는 자가전사 결과로 세포질 내에서 장기간 고농도로 유지되며 상기 T7 polymerase는 반복적으로 DNAes 발현 카세트의 T7 promoter에 결합함으로써 발현억제 RNA 발현이 장기간 안정적으로 유지할 수 있다.
본 발명의 자가전사 RNA/DNA 시스템에서 DNA 발현 카세트를 바이러스 시스템을 사용하는 경우는 DdRp 결합 프로모터와 발현억제 RNA를 코딩하는 바이러스 발현 카세트와 DdRp RNA 발현 카세트를 나누어 제작할 수 있으며 독립적으로 형질주입할 수도 있다. 먼저 상기 렌티바이러스 발현 카세트를 주입하고 안정된 형질전환 세포를 선정하고 DdRp RNA 발현 카세트를 형질주입할 수 있다. 또는 상기 아데노바이러스 발현 카세트를 주입하고 DdRp RNA 발현 카세트를 형질주입할 수 있다.
본 발명의 자가전사 RNA/DNA 시스템이 바이러스 발현 카세트를 사용하는 경우에도 초기에 안정화된 캡된 DdRp mRNA를 포함하는 DdRp RNA 발현 카세트에서 합성되는 T7 폴리머라제에 의한 auto_DdRp 발현 카세트 또는 auto_(DdRp+DNAes) 발현 카세트의 T7 promoter에 결합함으로써 T7 polymerase는 자가전사 결과로 세포질 내에서 장기간 고농도로 유지되며 상기 T7 polymerase는 반복적으로 DNAes 발현 카세트의 T7 promoter에 결합함으로써 발현억제 RNA 발현이 장기간 안정적으로 유지할 수 있다.
1-1. DdRp RNA 발현 카세트의 제조
본 발명의 DdRp RNA 발현 카세트를 제조하기 위해, T7 polymerase mRNA를 제조할 수 있는 T7 프로모터가 있는 DdRp DNA를 설계하고 제작하여 pUC19 클로닝 벡터에 재조합하고, 재조합 pUC19 벡터에서 얻은 T7 프로모터가 있는 DdRp DNA를 주형으로 체외전사한 후, 5′Cap 구조를 부가하였다.
<DdRp DNA 설계 및 제조>
본 발명의 SM_DdRp DNA는 DdRp mRNA를 효율적으로 합성할 수 있는 DNA 절편으로 <T7 프로모터 다음에 5'UTR, DdRp를 코딩하는 DNA 절편, 3'UTR>로 구성된 DNA 절편을 설계하였다.
본 발명의 SM_DdRp DNA에서 T7 polymerase 유전자는 pUC19 벡터에서 T7 promoter와 5'UTR의 하류에 위치하면서, 동시에 muag (mutated alpha-globin-3′UTR), A64 폴리(A) 서열, 폴리(C) 서열(C30) 및 히스톤 스템-루프 서열(히스톤-SL)서열의 상류에 위치하게 하였다. SM_DdRp DNA 구조는 <T7 promoter - 5'UTR - T7Pol - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL>일 수 있다.
바람직하게, 상기 DdRp에 핵국지화신호(Nuclear localization signals, NLS)가 위치할 수도 있다. NLS가 없는 DdRp는 대부분 세포질에 남아있는 반면, NLS를 포함하는 단백질은 핵에 국한하여 분포한다. NLS가 없는 DdRp는 세포질 또는 NLS를 포함하는 하이브리드 DdRp는 핵에서 효소적으로 활성화되어 염색체 또는 플라스미드 DNA에 배치된 T7 프로모터에서 선택적으로 전사를 시작하고 특정 3'UTR에서 중지할 수 있다.
상기 SM_DdRp DNA 절편의 구성하는 단위 요소들의 염기서열은 다음과 같다.
본 발명의 목적에 따라 Bacteriophage T7 RNA Polymerase(T7Pol)를 코딩하는 T7Pol에서 NLS(SV40 NLS, PKKKRKVEDPYC)을 N 및 C-말단에 부가할 수도 있다. N-말단 부가는 시작코돈 AUG에 다음에 NLS 염기서열을 위치하도록 하며, C-말단 부가는 종결코돈 UAA 앞에 NLS 염기서열을 위치하도록 하였다.
SV40 NLS sequence: 5′-CCG AAG AAG AAG CGA AAG GTC-3′ (서열번호 31),
상기 5'UTR는 Kozak 컨센서스를 포함한다.
Kozak 컨센서스 서열 ACCAUGG (서열번호 32)
<도 4>는 그림은 10,000 개 이상의 인간 mRNA의 개시 코돈 주변에서 가장 보존된 염기를 보여주는 서열 로고이다. 큰 글자는 더 높은 빈도를 나타내며, 8 위치 (-3, Kozak 위치)에서 A와 G의 더 큰 크기와 Kozak 시퀀스의 (+4) 위치에 해당하는 14 위치에서 G가 있다.
Bacteriophage T7 RNA Polymerase(T7Pol)
augaacacga uuaacaucgc uaagaacgac uucucugaca ucgaacuggc ugcuaucccg 60
uucaacacuc uggcugacca uuacggugag cguuuagcuc gcgaacaguu ggcccuugag 120
caugagucuu acgagauggg ugaagcacgc uuccgcaaga uguuugagcg ucaacuuaaa 180
gcuggugagg uugcggauaa cgcugccgcc aagccucuca ucacuacccu acucccuaag 240
augauugcac gcaucaacga cugguuugag gaagugaaag cuaagcgcgg caagcgcccga 300
cagccuucca guuccugcaa gaaaucaagc cggaagccgu agcguacau caccauuaag 360
accacucugg cuugccuaac cagugcugac aauacaaccg uucaggcugu agcaagcgca 420
aucggucggg ccauugagga cgaggcucgc uucggucgua uccgugaccu ugaagcuaag 480
cacuucaaga aaaacguuga ggaacaacuc aacaagcgcg uagggcacgu cuacaagaaa 540
gcauuuaugc aaguugucga ggcugacaug cucucuaagg gucuacucgg uggcgaggcg 600
uggucuucgu ggcauaagga agacucuauu cauguaggag uacgcugcau cgagaugcuc 660
auugagucaa ccggaauggu uagcuuacac cgccaaaaug cuggcguagu aggucaagac 720
ucugagacua ucgaacucgc accugauacg cugaggcua ucgcaacccg ugcaggugcg 780
cuggcuggca ucucuccgau guuccaaccu ugcguaguuc cuccuaagcc guggacuggc 840
auuacuggug guggcuauug ggcuaacggu cgucguccuc uggcgcuggu gcguacucac 900
aguaagaaag cacugaugcg cuacgagacg uuuacaugc cugaggugua caaagcgauu 960
aacauugcgc aaaacaccgc auggaaaauc aacaagaaag uccuagcggu cgccaacgua 1020
aucaccaagu ggaagcauug uccggucgag gacaucccug cgauugagcg ugaagaacuc 1080
ccgaugaaac cggaagacau cgacaugaau ccugaggcuc ucaccgcgug gaaacgugcu 1140
gccgcugcug uguaccgcaa ggacaaggcu cgcaagucuc gccguaucag ccuugaguuc 1200
augcuugagc aagccaauaa guuugcuaac cauaaggcca ucugguuccc uuacaacaug 1260
gacuggcgcg gucguguuua cgcuguguca auguucaacc cgcaagguaa cgauaugacc 1320
aaaggacugc uuacgcuggc gaaagguaaa ccaaucggua aggaagguua cuacuggcug 1380
aaaauccacg gugcaaacug ugcggguguc gauaagguuc cguucccuga gcgcaucaag 1420
uucauugagg aaaaccacga gaacaucaug gcuugcgcua agucuccacu ggagaacacu 1480
uggugggcug agcaagauuc uccguucugc uuccuugcgu ucugcuuuga guacgcuggg 1540
guacagcacc acggccugag cuauaacugc ucccuuccgc uggcguuuga cgggucuugc 1620
ucuggcaucc agcacuucuc cgcgaugcuc cgagaugagg uagguggucg cgcgguuaac 1680
uugcuuccua gugaaaccgu ucaggacauc uacgggauug uugcuaagaa agucaacgag 1740
auucuacaag cagacgcaau caaugggacc gauaacgaag uaguuaccgu gaccgaugag 1820
aacacuggug aaaucucuga gaaagucaag cugggcacua aggcacuggc uggucaaugg 1880
cuggcuuacg guguuacucg cagugugacu aagcguucag ucaugacgcu ggcuuacggg 1940
uccaaagagu ucggcuuccg ucaacaagug cuggaagaua ccauucagcc agcuauugau 2000
uccggcaagg gucugauguu cacucagccg aaucaggcug cuggauacau ggcuaagcug 2060
auuugggaau cugugagcgu gacgguggua gcugcgguug aagcaaugaa cuggcuuaag 2120
ucugcugcua agcugcuggc ugcugagguc aaagauaaga agacuggaga gauucuucgc 2180
aagcguugcg cugugcauug gguaacuccu gaugguuucc cuguguggca ggaauacaag 2240
aagccuauuc agacgcgcuu gaaccugaug uuccucgguc aguuccgcuu acagccuacc 2300
auuaacacca acaaagauag cgagauugau gcacacaaac aggagucugg uaucgcuccu 2360
aacuuuguac acagccaaga cgguagccac cuucguaaga cuguagugug ggcacacgag 2420
aaguacggaa ucgaaucuuu ugcacugauu cacgacuccu ucgguaccau uccggcugac 2480
gcugcgaacc uguucaaagc agugcgcgaa acuaugguug acacauauga gucuugugau 2540
guacuggcug auuucuacga ccaguucgcu gaccaguugc acgagucuca auuggacaaa 2600
augccagcac uuccggcuaa agguaacuug aaccuccgug acaucuuaga gucggacuuc 2660
gcguucgcgu aauaa 2675 (서열번호 33)
여기에서 3'UTR은 서열 5'-GCCCGaTGGG CCTCCCAACG GGCCCTCCTC CCCTCCTTGC ACCG-3'(서열번호 34; muag; 밑줄 친 뉴클레오타이드는 야생형 서열과 비교하여 돌연변이임)를 포함하는 (알파-)글로빈의 돌연변이된 UTR이고, 폴리(A) 꼬리는 64개의 아데닌 뉴클레오타이드로 이루어지며, 폴리(C) 서열은 30개의 사이토신 뉴클레오타이드로 이루어지고 히스톤 스템-루프는 (5'-CAAAGGCUCUUUUCAGAGCCACCA-3' 서열번호 35)에 따른 RNA 서열이다.
muag - A64 - C30 - 히스톤SL: gcccgauggg ccucccaacg ggcccuccuc cccuccuugc accgagauua auaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaugca uccccccccc cccccccccc cccccccccc ccaaaggcuc uuuucagagc cacca (서열번호 36):
A64: ggacuaguag aucuaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa (서열번호 37)
C30: ugcauccccc cccccccccc cccccccccc cccccucua g (서열번호 38)
본 발명에서 SM_DdRp DNA 절편은 <T7 promoter - 5'UTR - T7Pol - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL>으로 합성하였으며(Biosynthesis, 미국), 이를 주형으로 정방향 플라이머 5'-GAATTC TAAT ACGACTCACT ATAGGGGAGA CCACAACGGT TTCCCTCTAG AAAGAACCAT GAACACGATT AACA-3' (서열번호 39) 및 역방향 프라이머 5'-GGATCCTGGTG GCTCTAAAA GAGCCTTTGG-3' (서열번호 40)을 사용하여 증폭하였다. 여기서 T7pol의 표적 서열에 밑줄이 그어져 있다. 사용된 프라이머의 양 말단은 EcoRI/BamHI 인식서열이 포함되어 있다.
증폭된 PCR 산물을 EcoRI/BamHI 효소를 사용하여 절단한 다음, EcoRI/BamHI 효소로 선형화된 pUC19 벡터와 T4 DNA ligase를 이용하여 클로닝 반응을 하였다. 상기 반응용액을 대장균에 형질주입하고 선정된 균주에서 플라스미드를 분리하여 EcoRI/BamHI 제한효소를 처리한 후 전기영동을 하였다(도 5).
상기 제조된 재조합 pUC19는 원핵생물에서 DdRp RNA 발현 카세트에서 합성된 DdRp에 의해 RNA를 합성하고 단백질 합성도구에 의해 DdRp를 합성할 수 있어 DdRp 발현 카세트로 사용할 수도 있다. 그러나, 본 발명에서 진핵세포에서는 진핵세포의 복제원점(origin of replication)이 없어 잠깐 동안만 발현벡터로 역할을 한다.
<DdRp RNA 발현 카세트의 제조>
본 발명의 RNA/DNA 시스템에서 T7 polymerase의 자가전사를 시작하기 위해서, 최초 T7 polymerase 공급이 필요한데, 본 발명에서는 낮은 핵막 투과 문제를 해결하기 위하여 캡된 화학적 변형이 있는 뉴클레오타이드(CM)를 포함하는 T7pol mRNA를 포함하는 DdRp RNA 발현 카세트를 제작하였다.
캡된 CM_T7pol mRNA을 합성하기 위하여, 먼저 T7 promoter-T7 polymerase 서열을 가지는 실시례 1-1에서 제조한 SM_DdRp pUC19 벡터를 주형으로 정방향 플라이머 5'-TAATACGACT CACTATAGGG GAGACCACAA CGGUUUC-3' (서열번호 41) 및 역방향 프라이머 5'-TGGTGGTTAT TACGCGAACG CGAAGTCCGA C-3' (서열번호 42)을 사용하여 증폭하였다. 여기서 T7pol의 표적 서열에 밑줄이 그어져 있다. PCR 산물을 주형으로 체외전사하였다(도 6).
이러한 T7 promoter-T7 polymerase DNA 주형으로 상기에서 제조한 T7프로모터가 있는 SM_DdRp PCR 산물을 주형으로여 HighYield T7 ARCA mRNA Synthesis Kit (m5CTP/Ψ-UTP) (Jena BioScience, 미국)를 이용하여 캡된 CM/SM_T7pol mRNA를 포함하는 DdRp RNA 발현 카세트를 시험관 내에서 합성하였다. 구체적으로 살펴보면, anti-reverse cap analog (ARCA) (3′-O-Me-7mG(5′)ppp(5′)G cap analog라고도 부름) 및 화학적 변형된 뉴클레오타이드 포함하는 반응용액 (6 mM ARCA, 1.5 mM GTP, 7.5 mM 5-Methyl-CTP, 7.5 mM Pseudo-UTP, 7.5 mM ATP)에서 in vitro transcription 실시하였다. dsDNA 주형을를 제거하기 위해서 DNA nuclease를 첨가하였고, 남아있는 캡된 CM/SM_T7pol mRNA는 에탄올 침전법을 이용하여 정제하였다.
대조군으로 SM_DdRp 벡터에서 Native RNA 전사체에 5′-cap 구조를 부가한 캡된 T7pol mRNA 합성은 HiScribe™ T7 ARCA mRNA Kit(NEB, 미국)를 이용하여 실시하였다.
<도 7>에서 제시한 결과처럼, 상기 제조한 캡된 SM_T7pol mRNA(Native RNA), 캡된 CM_T7pol mRNA(modified RNA) 및 3'말단에 cholesterol이 부가된 캡된 CM_T7pol mRNA(modified RNA-cholesterol)을 세포배양액에 제조한 RNA를 다양한 시간 동안 처리한 후 RT-PCR하여 in vitro 안정성을 확인하였다. 상기 제조한 캡된 CM_T7pol mRNA는 캡된 T7pol mRNA보다 in vitro 안전성이 매우 우수하였으며, 3'말단에 cholesterol이 부가된 캡된 CM_T7pol mRNA(modified RNA-cholesterol)가 가장 안정성이 높았다.
캡된 CM_T7pol mRNA는 IVT 산물을 ScriptCap m7G 캡핑 시스템 (Epicentre Biotechnologies사, 미국)으로 천연 캡(m7G(5')ppp(5')G; m7GpppG)을 부가할 수도 있다.
1-2. auto_DdRp 발현 카세트의 제조
본 발명의 auto_DdRp DNA 발현 카세트 및 auto_(DdRp/DNAi) 발현 카세트는 플라스미드 혹은 바이러스 벡터를 사용하여 제작할 수 있다. 상기auto_DdRp DNA 발현 카세트 및 auto_(DdRp/DNAi) 발현 카세트는 플라스미드 혹은 바이러스 벡터에 auto_DdRp DNA 절편(T7 promoter - 5'UTR - DdRp DNA(또는 키메라 NP868R-T7RNAP DNA) - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL> 을 삽입하여 제조하였다. 하기에서처럼 합성된 DdRp 및 키메라 DdRp DNA 절편을 주형으로 PCR하여 증폭하여 클로닝이 용이한 DdRp 및 키메라 DdRp DNA 절편을 얻었다. 특정 제한효소를 처리하여 선형화된 발현벡터에 재조합하였다.
본 실시에서 사용된 발현벡터는 포유류 발현 플라스미드 벡터 pCI-neo 벡터(Promega 사, 미국), AdEasy Adenoviral Vector System(Agilent Technologies, 미국)에 있는 pShuttle, ViraSafe™ Lentiviral Expression System(Cell Biolabs, 미국)에 있는 pSMPUW-IRES-Blasticidin Lentiviral Expression Vector, 셔틀 벡터 pSMPUW 및 식물발현용 binary vector(Ti plasmid) 등 이며 이에 쩨한 하는 것은 아니다. 본 실시례에서는 플라스미드 벡터만 제한하여 기술하였으며, 바이러스성 벡터는 하기 실시례 1-4항을 참조하여 충분히 제조할 수 있다.
<auto_DdRp 발현 카세트의 제조>
본 발명의 auto_SM_DdRp 발현 카세트는 플라스미드 혹은 바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 본 실시례에서는 플라스미드를 사용하여 DdRp를 제공하는 DNA 절편을 포함하는 auto_SM_DdRp 발현 카세트를 설계하였다.
포유류 발현 벡터로 안정화 세포주를 구축할 수 있는 pCI-neo 벡터(Promega 사, 미국)를 BglII/HpaI 제한효소 처리로 절단하고 <T7 프로모터 다음에 5'UTR, DdRp를 코딩하는 DNA 절편, muag, A64 폴리(A) 서열, 폴리(C) 서열(C30) 및 히스톤 스템-루프 서열(히스톤-SL)서열>로 구성된 SM_DdRp DNA 절편을 삽입하여 상기 auto_SM_DdRp 발현 카세트를 제조하였다.
상기 DdRp에 핵국지화신호(Nuclear localization signals, NLS)이 위치할 수도 있다. NLS가 없는 DdRp는 대부분 세포질에 남아있는 반면, NLS를 포함하는 단백질은 핵에 국한하여 분포한다. NLS가 없는 DdRp는 세포질 또는 NLS를 포함하는 하이브리드 DdRp는 핵에서 효소적으로 활성화되어 염색체 또는 플라스미드 DNA에 배치된 T7 프로모터에서 선택적으로 전사를 시작하고 특정 3'UTR에서 중지할 수 있다.
상기 SM_DdRp DNA 절편의 구성하는 단위 요소들의 염기서열은 다음과 같다.
본 실시례 1-1-1에서 합성한 SM_DdRp DNA 절편을 정방향 플라이머 5'-AGATCT TTAA TACGACTCAC TATAGGGGAG ACCACAACGG TTTCCCTCTA GAAAGAACCA TGAACACGAT TAACA-3'(서열번호 43) 및 역방향 프라이머 5'-GTTAACTGGT GCTCTAAAA GAGCCTTTGG-3' (서열번호 44)을 사용하여 증폭하였다. 여기서 T7pol의 표적 서열에 밑줄이 그어져 있다. 사용된 프라이머의 양 말단은 BglII/HpaI 인식서열이 포함되어 있다.
증폭된 SM_DdRp DNA 절편를 포함하는 PCR 산물은 는 BglII/HpaI 효소를 사용하여 절단한 다음, BglII/HpaI 효소로 선형화된 pCI-neo 벡터와 T4 DNA ligase를 이용하여 클로닝 반응을 하였다. 상기 반응용액을 대장균에 형질주입하고 선정된 균주에서 플라스미드를 분리하여 BglII/HpaI 제한효소를 처리한 후 전기영동을 하였다(도 8).
상기에서 <T7 프로모터 다음에 5'UTR, DdRp를 코딩하는 DNA 절편, muag, A64 폴리(A) 서열, 폴리(C) 서열(C30) 및 히스톤 스템-루프 서열(히스톤-SL)서열>로 구성된 SM_DdRp DNA 절편로 제작된 재조합 pCI-neo 벡터를 auto_SM_DdRp 발현 카세트이라고 지칭하였다.
<auto_SM_키메라 DdRp 발현 카세트의 제조>
본 발명의 auto_SM_키메라 DdRp 발현 카세트는 플라스미드 혹은 바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 본 실시례에서는 플라스미드를 사용하여 DdRp를 제공하는 DNA 절편을 포함하는 auto_SM_키메라DdRp 발현 카세트를 설계하였다.
포유류 발현 벡터로 안정화 세포주를 구축할 수 있는 pCI-neo 벡터(Promega 사, 미국)를 BglII/HpaI 제한효소 처리로 절단하고 <T7 프로모터 다음에 5'UTR, 키메라 DdRp를 코딩하는 DNA 절편, muag, A64 폴리(A) 서열, 폴리(C) 서열(C30) 및 히스톤 스템-루프 서열(히스톤-SL)서열>로 구성된 SM_DdRp DNA 절편을 삽입하여 상기 auto_SM_키메라 DdRp 발현 카세트를 제조하였다.
본 발명의 키메라 DdRp를 코딩하는 DNA 절편은 NP868R-T7RNAP(서열번호 21)의 ORF이다. NP868R, 아프리카 돼지열 바이러스의 mRNA 캡핑 효소, 및 박테리오파지 T7의 야생형 파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 사이의 융합을 인코딩하는 하나의 플라스미드를 합성했다. 당해 캡핑 효소는 (Gly3Ser)4 링커에 의해 T7 RNA 폴리머라제의 아미노 말단에 융합시켰다.
NP868R-T7RNAP의 ORF에 대한 염기서열은 아래 서열번호 21과 같다.
atggaattcg ccagcctgga caacctggtg gccagatacc agcggtgctt caacgaccag 60
agcctgaaga acagcaccat cgagctggaa atccggttcc agcagatcaa cttcctgctg 120
ttcaagaccg tgtacgaggc cctggtcgcc caggaaatcc ccagcaccat cagccacagc 180
atccggtgca tcaagaaggt gcaccacgag aaccactgcc gggagaagat cctgcccagc 240
gagaacctgt acttcaagaa acagcccctg atgttcttca agttcagcga gcccgccagc 300
ctgggctgta aagtgtccct ggccatcgag cagcccatcc ggaagttcat cctggacagc 360
agcgtgctgg tccggctgaa gaaccggacc accttccggg tgtccgagct gtggaagatc 420
gagctgacca tcgtgaagca gctgatgggc agcgaggtgt cagccaagct ggccgccttc 480
aagaccctgc tgttcgacac ccccgagcag cagaccacca agaacatgat gaccctgatc 540
aaccccgacg acgagtacct gtacgagatc gagatcgagt acaccggcaa gcctgagagc 600
ctgacagccg ccgacgtgat caagatcaag aacaccgtgc tgacactgat cagccccaac 660
cacctgatgc tgaccgccta ccaccaggcc atcgagttta tcgccagcca catcctgagc 720
agcgagatcc tgctggcccg gatcaagagc ggcaagtggg gcctgaagag actgctgccc 780
caggtcaagt ccatgaccaa ggccgactac atgaagttct acccccccgt gggctactac 840
gtgaccgaca aggccgacgg catccggggc attgccgtga tccaggacac ccagatctac 900
gtggtggccg accagctgta cagcctgggc accaccggca tcgagcccct gaagcccacc 960
atcctggacg gcgagttcat gcccgagaag aaagagttct acggctttga cgtgatcatg 1020
tacgagggca acctgctgac ccagcagggc ttcgagacac ggatcgagag cctgagcaag 1080
ggcatcaagg tgctgcaggc cttcaacatc aaggccgaga tgaagccctt catcagcctg 1140
acctccgccg accccaacgt gctgctgaag aatttcgaga gcatcttcaa gaagaaaacc 1200
cggccctaca gcatcgacgg catcatcctg gtggagcccg gcaacagcta cctgaacacc 1260
aacaccttca agtggaagcc cacctgggac aacaccctgg actttctggt ccggaagtgc 1320
cccgagtccc tgaacgtgcc cgagtacgcc cccaagaagg gcttcagcct gcatctgctg 1380
ttcgtgggca tcagcggcga gctgtttaag aagctggccc tgaactggtg ccccggctac 1440
accaagctgt tccccgtgac ccagcggaac cagaactact tccccgtgca gttccagccc 1500
agcgacttcc ccctggcctt cctgtactac caccccgaca ccagcagctt cagcaacatc 1560
gatggcaagg tgctggaaat gcggtgcctg aagcgggaga tcaactacgt gcgctgggag 1620
atcgtgaaga tccgggagga ccggcagcag gatctgaaaa ccggcggcta cttcggcaac 1680
gacttcaaga ccgccgagct gacctggctg aactacatgg accccttcag cttcgaggaa 1740
ctggccaagg gacccagcgg catgtacttc gctggcgcca agaccggcat ctacagagcc 1800
cagaccgccc tgatcagctt catcaagcag gaaatcatcc agaagatcag ccaccagagc 1860
tgggtgatcg acctgggcat cggcaagggc caggacctgg gcagatacct ggacgccggc 1920
gtgagacacc tggtcggcat cgataaggac cagacagccc tggccgagct ggtgtaccgg 1980
aagttctccc acgccaccac cagacagcac aagcacgcca ccaacatcta cgtgctgcac 2040
caggatctgg ccgagcctgc caaagaaatc agcgagaaag tgcaccagat ctatggcttc 2100
cccaaagagg gcgccagcag catcgtgtcc aacctgttca tccactacct gatgaagaac 2160
acccagcagg tcgagaacct ggctgtgctg tgccacaagc tgctgcagcc tggcggcatg 2220
gtctggttca ccaccatgct gggcgaacag gtgctggaac tgctgcacga gaaccggatc 2280
gaactgaacg aagtgtggga ggcccgggag aacgaggtgg tcaagttcgc catcaagcgg 2340
ctgttcaaag aggacatcct gcaggaaacc ggccaggaaa tcggcgtcct gctgcccttc 2400
agcaacggcg acttctacaa tgagtacctg gtcaacaccg cctttctgat caagattttc 2460
aagcaccatg gctttagcct cgtgcagaag cagagcttca aggactggat ccccgagttc 2520
cagaacttca gcaagagcct gtacaagatc ctgaccgagg ccgacaagac ctggaccagc 2580
ctgttcggct tcatctgcct gcggaagaac gggcccggcg gaggcggaag tggaggcgga 2640
ggaagcggag ggggaggatc tggcggcgga ggcagcctcg agaacaccat caatatcgcc 2700
aagaacgact tcagcgacat cgagctggcc gccatccctt tcaacaccct ggccgaccac 2760
tatggcgagc ggctggccag agaacagctg gccctggaac acgagagcta cgaaatgggc 2820
gaggcccggt tccggaagat gttcgagaga cagctgaagg ccggcgaggt ggccgataat 2880
gccgccgcta agcccctgat caccaccctg ctgcccaaga tgatcgcccg gatcaacgat 2940
tggttcgagg aagtgaaggc caagcggggc aagaggccca ccgccttcca gtttctgcag 3000
gaaatcaagc ccgaggccgt ggcctacatc accatcaaga ccaccctggc ctgcctgacc 3060
agcgccgaca ataccaccgt gcaggctgtc gcttctgcca tcggcagagc catcgaggac 3120
gaggccagat tcggcagaat ccgggacctg gaagccaagc acttcaagaa aaacgtggag 3180
gaacagctga acaagcgcgt gggccacgtg tacaagaaag ccttcatgca ggtggtggag 3240
gccgacatgc tgagcaaggg cctgctgggc ggagaagcct ggtccagctg gcacaaagag 3300
gacagcatcc acgtcggcgt gcggtgcatc gagatgctga tcgagtcgac cggcatggtg 3360
tccctgcaca ggcagaatgc cggcgtggtg ggccaggaca gcgagacaat cgaactggcc 3420
cccgagtatg ccgaggccat tgccacaaga gccggcgctc tggccggcat cagccccatg 3480
ttccagccct gcgtggtgcc tcctaagccc tggacaggca tcacaggcgg cggatactgg 3540
gccaacggca gacgccctct ggctctggtg cggacccaca gcaagaaagc cctgatgcgc 3600
tacgaggacg tgtacatgcc cgaggtgtac aaggccatca acattgccca gaacaccgcc 3660
tggaagatca acaagaaagt gctggccgtg gccaatgtga tcaccaagtg gaagcactgc 3720
cccgtggagg acatccccgc catcgagcgg gaggaactgc ccatgaagcc cgaggacatc 3780
gacatgaacc ccgaggccct gacagcctgg aaaagggccg ctgccgccgt gtaccggaag 3840
gacaaggccc ggaagtcccg gcggatcagc ctggagttca tgctggaaca ggccaacaag 3900
ttcgccaacc acaaggccat ttggttccct tacaacatgg actggcgggg cagagtgtac 3960
gccgtgagca tgttcaatcc acaaggcaac gacatgacca aggggctgct gaccctggcc 4020
aagggcaagc ccatcggcaa agagggctac tactggctga agatccacgg cgccaactgc 4080
gctggcgtgg acaaggtgcc cttcccagag cggatcaagt tcatcgagga aaaccacgag 4140
aacatcatgg cctgcgccaa gagccctcta gaaaacactt ggtgggccga gcaggacagc 4200
cccttctgct tcctggcctt ctgctttgag tacgccggag tgcagcacca cggcctgagc 4260
tacaactgca gcctgcccct ggccttcgat ggcagctgca gcggcatcca gcacttcagc 4320
gccatgctga gggacgaagt gggcggcaga gccgtgaatc tgctgccaag cgagacagtg 4380
caggacatct acgggatcgt ggccaagaaa gtgaacgaga tcctgcaggc cgacgccatc 4440
aacggcaccg acaacgaggt ggtgaccgtg accgatgaga acaccggcga gatcagcgag 4500
aaagtgaagc tcggcaccaa ggccctggct ggccagtggc tggcctacgg cgtgaccaga 4560
tccgtgacca agcggagcgt gatgacactg gcctatggca gcaaagagtt cggcttccgg 4620
cagcaggtgc tggaagatac catccagcct gccatcgaca gcggcaaggg gctgatgttc 4680
acccagccca accaggccgc tggctacatg gccaagctca tatgggagag cgtgtccgtg 4740
acagtggtgg ccgccgtgga ggccatgaat tggctgaagt ccgccgccaa actgctggcc 4800
gctgaagtga aggacaaaaa gaccggcgaa atcctgcgga agagatgcgc cgtgcactgg 4860
gtgacccccg atggcttccc cgtgtggcag gagtacaaga agcccatcca gacccggctg 4920
aacctgatgt tcctgggcca gttcagactg cagcccacca tcaacaccaa caaggactcc 4980
gagatcgacg cccacaagca ggaaagcggc attgccccca acttcgtgca cagccaggac 5040
ggcagccacc tgagaaagac cgtggtgtgg gctcacgaga agtacggcat cgagagcttc 5100
gccctgatcc acgacagctt cggcaccatt cccgccgacg ccgccaacct gttcaaggcc 5160
gtgcgggaga caatggtgga cacctacgag agctgcgacg tgctggccga cttctacgac 5220
cagttcgccg accagctgca cgagagccag ctggacaaga tgcccgccct gcccgccaag 5280
gggaacctga acctgcggga catcctggaa agcgacttcg ccttcgcctg a 5331 (서열번호 45)
상기 키메라 DdRp에 핵국지화신호(Nuclear localization signals, NLS)이 위치할 수도 있다. NLS가 없는 키메라 DdRp는 대부분 세포질에 남아있는 반면, NLS를 포함하는 단백질은 핵에 국한하여 분포한다. NLS가 없는 키메라 DdRp는 세포질 또는 NLS를 포함하는 키메라 DdRp는 핵에서 효소적으로 활성화되어 염색체 또는 플라스미드 DNA에 배치된 T7 프로모터에서 선택적으로 전사를 시작하고 특정 T7 종결서열에서 중지할 수 있다.
상기 SM_키메라 DdRp DNA 절편의 구성하는 단위 요소들의 염기서열은 다음과 같다.
본 발명에서 <T7 promoter - 5'UTR - NP868R-T7RNAP - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL>로 구성된 SM_DdRp DNA 절편을 합성하였으며(Biosynthesis,미국), 이를 주형으로 정방향 프라이머 5'-AGATCTTAAT ACGACTCACT ATAG GAGACC ACAACGGTTTC CCTCTAGAAA GAACC ATGGAATTC GCCAGCCTGG A-3'(서열번호 43) 및 역방향 프라이머 5'-GTTAACTGGT GGCTCTAAAA GAGCCTTTGG-3' (서열번호 44)을 사용하여 증폭하였다. 여기서 T7pol의 표적 서열에 밑줄이 그어져 있다. 사용된 프라이머의 양 말단은 BglII/HpaI 인식서열이 포함되어 있다.
증폭된 SM_DdRp DNA 절편를 포함하는 PCR 산물은 는 BglII/HpaI 효소를 사용하여 절단한 다음, BglII/HpaI 효소로 선형화된 pCI-neo 벡터와 T4 DNA ligase를 이용하여 클로닝 반응을 하였다. 상기 반응용액을 대장균에 형질주입하고 선정된 균주에서 플라스미드를 분리하여 BglII/HpaI 제한효소를 처리한 후 전기영동을 하였다(도 8).
상기에서 <T7 프로모터 다음에 5'UTR, DdRp를 코딩하는 DNA 절편, 3'UTR, A64 폴리(A) 서열, 폴리(C) 서열(C30) 및 히스톤 스템-루프 서열(히스톤-SL)서열>로 구성된 SM_DdRp DNA 절편로 제작된 재조합 pCI-neo 벡터를 auto_SM_키메라 DdRp 발현 카세트이라고 지칭하였다.
1-3. DNAes 발현 카세트의 제조
본 발명의 DNAes 발현 카세트는 플라스미드 혹은 바이러스 벡터를 사용하여 제작할 수 있다. 상기 DNAes 발현 카세트는 플라스미드 혹은 바이러스 벡터에 DNAes 절편을 삽입하여 제조하였다. 하기에서처럼 합성된 DNAes 절편을 주형으로 PCR하여 증폭하여 클로닝이 용이한 DNAes 절편를 얻었다. 특정 제한효소를 처리하여 선형회된 발현벡터에 재조합하였다.
본 실시에서 사용된 발현벡터는 포유류 발현 플라스미드 벡터 pCI-neo 벡터(Promega 사, 미국), AdEasy Adenoviral Vector System(Agilent Technologies, 미국)에 있는 pShuttle, ViraSafe™ Lentiviral Expression System(Cell Biolabs, 미국)에 있는 pSMPUW-IRES-Blasticidin Lentiviral Expression Vector, 셔틀 벡터 pSMPUW 및 식물발현용 binary vector(Ti plasmid) 등 이며 이에 쩨한 하는 것은 아니다. 본 실시례에서는 플라스미드 벡터만 제한하여 기술하였으며, 바이러스성 벡터는 하기 실시례 1-4항을 참조하여 충분히 제조할 수 있다.
발현억제 RNA는 siRNA(short interfering RNA), miRNA(micro RNA), RNA 압타머(aptamer), 안티센스 RNA(antisense RNA) 및 리보자임(ribozyme)을 포함하는 발현억제 RNA으로부터 선택되어진 1종 이상인 RNA이다.
shRNA
본 발명에서 발현억제 RNA는 siRNA이며 이의 전구체 shRNA를 코딩하는 DNAes 절편을 포유류 발현 벡터로 안정화 세포주를 구축할 수 있는 pCI-neo Mammalian Expression Vector (Promega 사, 미국)에 재조합한 DNAes 발현 카세트를 제작하였다. 본 발명의 발현억제 RNA/DNA시스템의 구성성분으로 상기 재조합한 DNAes 발현 카세트를 사용하였다.
상기 DNAes 발현 카세트는 T7 프로모터, 표적서열을 기준으로 설계된 shRNA와 DNA, T7 전사 종결 서열로 구성할 수 있다.
먼저, shRNA DNA를 설계하였다. 본 실시례에서 목표 발현억제 유전자는 BCL2, Bcl-xL, XIAP 및 Survivin이며, 이들 mRNA를 표적화하는 siRNA는 문헌(Int J Oncol. 2012 Oct; 41(4): 1271-1277. doi: 10.3892/ijo.2012.1549)를 참조하였으며, 염기서열은 <표 2>과 같다. 이들 유전자는 암세포의 사멸을 방지하는 역할을 하여 siRNA에 의해 이들의 발현을 억제함으로써 암세포를 사멸케 할 수 있다.
shRNA DNA는 5'에서 3'까지 다음과 같이 구성된다. (1) 표적 부위의 뉴클레오티드 3 ~ 22로 구성된 센스 서열(표 3), (2) 19-nt 루프 서열 (5'-CTGTAAAGCC ACAGATGGG-3') 이것은 자연적으로 발생하는 인간 miR-30 전사체에서 부분적으로 파생되며, (3) 표적 부위의 상보적인 안티센스 서열(위치 3~22)이다.
siRNAs의 표적 염기서열
Target gene siRNA name siRNA target sequence
BCL2 B2-1 CGGUGGUGGAGGAGCUCUU (서열번호 48)
BCL2 B2-2 GCAUGCGGCCUCUGUUUGA (서열번호 49)
Bcl-xL BX-1 GGGACAGCAUAUCAGAGCU (서열번호 50)
Bcl-xL BX-2 CAGCUGGAGUCAGUUUAGU (서열번호 51)
XIAP X-1 CGAGCAGGGUUUCUUUAUA (서열번호 52)
XIAP X-2 CUGGGCAGGUUGUAGAUAU (서열번호 53)
Survivin S-1 GAAGCAGUUUGAAGAAUUA (서열번호 54)
Survivin S-2 CCAACAAUAAGAAGAAAGA (서열번호 55)
다음은 목표 발현억제 유전자는 BCL2, Bcl-xL, XIAP 및 Survivin의 mRNA를 대상으로 <표 3>의 표적염기서열에 대해 설계한 shRNA이다.
B2-1; CGGUGGUGGA GGAGCUCUUC UGUAAAGCCA CAGAUGGGAA GAGCUCCUCC ACCACCG (서열번호 56)
B2-2: GCAUGCGGCC UCUGUUUGAC UGUAAAGCCA CAGAUGGGU CAAACAGAGG CCGCAUGC (서열번호 57)
BX-1: GGGACAGCAU AUCAGAGUUC UGUAAAGCCA CAGAUGGGAG CUCUGAUAUG CUGUCCC (서열번호 58)
BX-2: CAGCUGGAGU CAGUUUAGUC UGUAAAGCCA CAGAUGGGAC UAAACUGACU CCAGCUG (서열번호 59)
X-1; CGAGCAGGGU UUCUUUAUAC UGUAAAGCCA CAGAUGGGUA UAAAGAAACC CUGCUCG (서열번호 60)
X-2; CUGGGCAGGU UGUAGAUAUC UGUAAAGCCA CAGAUGGGAU AUCUACAACC UGCCCAG (서열번호 61)
S-1:GAAGCAGUUU GAAGAAUUAC UGUAAAGCCA CAGAUGGGUA AUUCUUCAAA CUGCUUC (서열번호 62)
S-2; CCAACAAUAA GAAGAAAGAC UGUAAAGCCA CAGAUGGGUC UUUCUUCUUA UUGUUGG (서열번호 63)
Bcl-xL 유전자의 표적 서열 BX-1인 경우, siRNA 듀플렉스의 불안정성을 부여하기 위해 센스 가닥의 3' 말단에서 C를 U로 변환하였다. 일반적으로, 뉴클레오타이드 G는 표준 쌍을 이루는 C와 강력하게 결합하나 C를 대신하여 이보다 더 약하게 U와 결합할 수 있다. 표적 서열 선정으로 siRNA 듀플렉스의 센스 가닥의 3' 말단의 표적 부위의 19~22 위치에 C가 있으며 이를 U로 전환할 수도 있다. 일반적으로, siRNA 듀플렉스의 형성에서 안티센스 가닥과 혼성화를 촉진하기 위해 센스 가닥만 전환하는 것을 권장한다. BX-1 RNA 듀플렉스의 센스 서열의 말단 부위에 있는 3개 뉴클레오티드는 GCU에서 GUU로 변환하였다.
서열번호 33에서 서열번호 40까지의 shRNA를 코딩하는 발현 카세트의 기본 단위(shRNA unit)는 <T7 프로모터 - shRNA DNA - 전사종결 서열(5'-TTTTTT-3' (서열번호 41))의 구성으로 제작하였다. T7 프로모터는 T7 RNA 중합 효소에 의해 인식되는 전사 시작 부위에서 +1까지 18개 염기쌍로 이루어진 DNA 서열 번호 1(5'-TAATACGACT CACTATAG-3')이다.
다중의 shRNA를 코딩하는 DNAes 발현 카세트(다중 shRNA cassettes)는 <도 9>에 제시하는 방법으로 제작하였다. 핵산 링커가 부착된 단일 shRNA를 코딩하는 shRNA unit들을 제작하여(바이오니아, 한국) 혼성화하여 단일가닥 구조로 다중 shRNA DNA를 제작하였다.
본 발명의 다중 shRNA DNA의 구성은 <T7 프로모터 - B2-1 shRNA - B2-2 shRNA - BX-1 shRNA - BX-2 shRNA X-1 - shRNA - X-2shRNA - S-1 shRNA - S-2 shRNA-전사종결서열>이다
상기 혼성화하여 제작된 다중 shRNA DNA를 주형으로 정방향 프라이머 (5'-AGATCTTAAT ACGACTCACT ATAGCGGUGG UGGAGGAGCU CUU-3', 서열번호 64) 및 역방향 프라이머 (5'-GTTAACAAAA AACCAACAAT AAGAAGAAAG A-3', 서열번호 65)를 사용하여 얻은 PCR 산물을 BglII/HpaI 제한효소를 처리하고, BglII/HpaI 제한효소로 선형화된 pCI-neo 벡터에 클로닝하였으며 이를 다중 shRNA 발현 카세트라고 하였다.
구체적으로 살펴보면, 5 μl 10 × MgCl2 반응 버퍼, 1 μl 정방향 프라이머 (20 μM), 1 μl 역방향 프라이머 (20 μM), 1μl dNTP (10mM), 1μl 혼성화된 다중 shRNA 발현 카세트 (10ng / μl), 0.5μl 효소 믹스(즉, 중합 효소)을 포함하는 반응용액에 40.5 μl dH2O를 첨가하여 PCR를 준비하였다.
PCR 기기에서 증폭은 3분 동안 94℃, 30초 동안 94℃, 30초 동안 54℃, 30초 동안 72℃의 30주기, 5분 동안 72℃을 하였다. PCR 산물에 BglII/HpaI 제한효소를 처리하고 BglII/HpaI 제한효소로 선형화된 pCI-neo 벡터를 혼합하여 DNA ligase를 첨가하여 클로닝 반응을 수행하였다. 2-3 μl 상기 pCI-neo 클로닝 반응용액을 대장균에 형질도입하여 암피실린 선택 플레이트에 플레이트하여 37℃에서 밤새 배양하였다.
6-12 개의 콜로니를 골라 각각 50μg/ml의 암피실린이 있는 LB 성장 배지 3ml에 접종한다. 37℃에서 셰이커에서 밤새 배양한다. 표준 절차 또는 상용 Qiaprep Miniprep 키트 (Qiagen)를 사용하여 재조합 pCI-neo 벡터를 분리하였다. 재조합 pCI-neo 벡터를 BglII/HpaI으로 절단하고 겔 전기영동을 수행하여 다중 shRNA 발현 카세트 클론을 선정하였다(도 10).
본 발명에서 암세포 사멸을 저해하는 Bcl-2, Bcl-xL, XIAP 및 서비빈(survivin) 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 코딩하는 DNAes 발현 카세트를 PCR하여 얻은 산물을 주형으로 T7 Pol 체외전사하고 얻은 다중 접합체 shRNA를 제조하였다(도 11).
리보자임(ribozyme)
본 발명에서 발현억제 RNA, 리보자임을 포함하는 DNAes 절편을 포유류 발현 벡터로 안정화 세포주를 구축할 수 있는 pCI-neo Mammalian Expression Vector (Promega 사, 미국)에 재조합한 DNAes 발현 카세트를 구성성분으로 하는 하여 발현억제 RNA/DNA시스템을 제조하였다.
상기 DNAes 발현 카세트를 구성하는 특정 유전자를 표적할 수 있는 리보자임을 포함하는 DNAes 절편은 기 보고된 mTERT- 특이적 리보자임(Kwon BS. et al.,(2005) Mol. Ther. 12: 824-834)을 변형하여, <T7 프로모터- mTERT-특이적 리보자임 - HSV-tk - WPRE -muag - A64 - C30 - 히스톤SL> 구조인 DNAes 절편으로 제조하였다(도 12).
구체적으로 살펴보면, 상기 DNAes 절편은 hTERT mRNA의 +21번 부위를 표적으로 하고, 326 뉴클레오티드 길이의 안티센스(antisense) 서열(서열번호 8)을 보유하며, 치료 유전자로 HSV-tk를 보유하는 트랜스-스플라이싱 리보자임에 T7 프로모터를 도입하였다. 치료 유전자인 HSV-tk의 3' 부위에는 Woodchuck Hepatitis Virus의 전사 후 조절 인자(posttranscriptional Regulatory Element)인 WPRE를 삽입하여 치료 유전자의 단백질 발현 효율을 높였다.
상기 설계된 mTERT- 특이적 리보자임 DNA 절편을 구성하는 단위의 염기서열은 다음과 같다.
hTERT targeting trans-splicing ribozyme
ggcaggaaaa gttatcaggc atgcacctgg tagctagtct ttaaaccaat agattgcatc 60
ggtttaaaag gcaagaccgt caaattgcgg gaaaggggtc aacagccgtt cagtaccaag 120
tctcagggga aactttgaga tggccttgca aagggtatgg taataagctg acggacatgg 180
tcctaaccac gcagccaagt cctaagtcaa cagatcttct gttgatatgg atgcagttca 240
cagactaaat gtcggtcggg gaagatgtat tcttctcata agatatagtc ggacctctcc 300
ttaatgggag ctagcggatg aagtgatgca acactggagc cgctgggaac taatttgtat 360
gcgaaagtat attgattagt tttggagtac tcg 393 (서열번호 66)
HSV-tk
atggcttcgt acccctgcca tcaacacgcg tctgcgttcg accaggctgc gcgttctcgc 60
ggccatagca accgacgtac ggcgttgcgc cctcgccggc agcaagaagc cacggaagtc 120
cgcctggagc agaaaatgcc cacgctactg cgggtttata tagacggtcc tcacgggatg 180
gggaaaacca ccaccacgca actgctggtg gccctgggtt cgcgcgacga tatcgtctac 240
gtacccgagc cgatgactta ctggcaggtg ctgggggctt ccgagacaat cgcgaacatc 300
tacaccacac aacaccgcct cgaccagggt gagatatcgg ccggggacgc ggcggtggta 360
atgacaagcg cccagataac aatgggcatg ccttatgccg tgaccgacgc cgttctggct 420
cctcatatcg ggggggaggc tgggagctca catgccccgc ccccggccct caccctcatc 480
ttcgaccgcc atcccatcgc cgccctcctg tgctacccgg ccgcgcgata ccttatgggc 540
agcatgaccc cccaggccgt gctggcgttc gtggccctca tcccgccgac cttgcccggc 600
acaaacatcg tgttgggggc ccttccggag gacagacaca tcgaccgcct ggccaaacgc 660
cagcgccccg gcgagcggct tgacctggct atgctggccg cgattcgccg cgtttacggg 720
ctgcttgcca atacggtgcg gtatctgcag ggcggcgggt cgtggcggga ggattgggga 780
cagctttcgg ggacggccgt gccgccccag ggtgccgagc cccagagcaa cgcgggccca 840
cgaccccata tcggggacac gttatttacc ctgtttcggg cccccgagtt gctggccccc 900
aacggcgacc tgtacaacgt gtttgcctgg gccttggacg tcttggccaa acgcctccgt 960
cccatgcacg tctttatcct ggattacgac caatcgcccg ccggctgccg ggacgccctg 1020
ctgcaactta cctccgggat ggtccagacc cacgtcacca cccccggctc cataccgacg 1080
atctgcgacc tggcgcgcac gtttgcccgg gagatggggg aggctaactg a 1131 (서열번호 67)
WPRE sequence:
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc 589 (서열번호 68)
muag - A64 - C30 - 히스톤SL: gcccgauggg ccucccaacg ggcccuccuc cccuccuugc accgagauua auaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaugca uccccccccc cccccccccc cccccccccc ccaaaggcuc uuuucagagc cacca (서열번호 69)
상기 설계된 mTERT- 특이적 리보자임 DNA 절편을 유기합성하여 제조하였다(바이오니아, 한국). 여기서, 3*?**?*UTR은 <muag - A64 - C30 - 히스톤SL>을 사용하였다. 포유류 발현 벡터로 안정화 세포주를 구축할 수 있는 pCI-neo 벡터(Promega 사, 미국), AdEasy Adenoviral Vector System(Agilent Technologies, 미국) 및 ViraSafe™ Lentiviral Expression System(Cell Biolabs, 미국)에 삽입하였다.
합성된 mTERT- 특이적 리보자임은 정방향 플라이머 5'-AGATCTTAAT ACGACTCACT ATAGGGCAGG AAAATTATCA GGC-3'(서열번호 70) 및 역방향 프라이머 5'-GTTAACTGGTGG CTCTGAA-3' (서열번호 71)을 사용하여 증폭하였다. 여기서 T7pol의 표적 서열에 밑줄이 그어져 있다. 사용된 프라이머의 양 말단은 BglII/HpaI 인식서열이 포함되어 있다.
구체적으로 살펴보면, 5 μl 10×MgCl2 반응 버퍼, 1 μl 정방향 프라이머 (20 μM), 1 μl 역방향 프라이머 (20 μM), 1μl dNTP (10mM), 1μl 제작된 DNA 절편 (10ng/μl), 0.5μl 효소 믹스 (즉, 중합 효소)을 포함하는 반응용액에 40.5 μl dH2O를 첨가하여 PCR을 하였다.
상기 증폭 산물을 BglII/HpaI 제한효소를 처리하고, BglII/HpaI 제한효소로 선형화된 pCI-neo 벡터를 혼합하여 DNA ligase를 첨가하여 클로닝 반응을 수행하였다. 2-3 μl 상기 pCI-neo 반응용액을 대장균에 형질도입하여 암피실린 선택 플레이트에 플레이트하여 37℃에서 밤새 배양하였다.
6-12 개의 콜로니를 골라 각각 50μg / ml의 암피실린이 있는 LB 성장 배지 3ml에 접종한다. 37℃에서 셰이커에서 밤새 배양한다. 표준 절차 또는 상용 Qiaprep Miniprep 키트 (Qiagen)를 사용하여 재조합 pCI-neo 벡터를 분리하였다. 재조합 pCI-neo 벡터를 BglII/HpaI으로 절단하고 겔 전기영동을 수행하여 mTERT- 특이적 리보자임 발현 카세트 클론을 선정하였다(도 13).
1-4. auto_(DdRp+DNAes) 발현 카세트의 제조
본 발명의 auto_DdRp 발현 카세트, DNAes 발현 카세트 및 auto_(DdRp+DNAes) 발현 카세트는 플라스미드 혹은 바이러스 벡터를 사용하여 제작할 수 있다. 본 실시례에서는 auto_(DdRp+DNAes) 발현 카세트를 플라스미드 및 바이러스 벡터를 사용하여 제작하였다. 상기 auto_(DdRp+DNAes) DNA 절편은 (T7 promoter - 5'UTR - DdRp DNA(또는 키메라 NP868R-T7RNAP DNA) - muag - A64 - C30 - 히스톤-S - DNAes 절편은 (T7 promoter - 5'UTR - DNAes - 3'UTR)을 삽입하여 제조하였다.
실시례 1-2에서 제조한 auto_DdRp 발현 카세트를 주형으로 PCR하여 auto_DdRp DNA 절편(T7 promoter - 5'UTR - DdRp DNA(또는 키메라 NP868R-T7RNAP DNA) - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL) 및 실시례 1-3에서 제조한 DNAi 발현 카세트를 주형으로 PCR을 하여 DNAes 절편(T7 promoter - 5'UTR - DNAes - 3'UTR)를 제조하였다.
바람직하게, DNAes가 shRNA인 경우, 3'UTR은 T7 전사종결서열, 리보자임인 경우는 3'UTR은 muag - A64 - C30 - 히스톤-SL일 수 있으며 이에 제한하는 것은 아니다.
상기 제조된 auto_DdRp와 DNAes DNA 절편을 포유류 발현 벡터로 안정화 세포주를 구축할 수 있는 AdEasy Adenoviral Vector System(Agilent Technologii, 미국) 및 ViraSafe™ Lentiviral Exprision System(Cell Biolabs, 미국)에 삽입하여 auto_(DdRp+DNAes) 발현 카세트를 제조할 수 있다.
본 발명의 DNAen은 NLS-SpCas9-HF1(N497A/R661A/Q695A/Q926A)-NLS, NLS-NgAgo-NLS 및 NLS-SpCas9H840A-linker-M_MLV_RT-NLS를 포함할 수 있다.
본 실시례에서 NLS-SpCas9H840A-linker-M_MLV_RT-NLS을 사용하였다.
실시례 1-3에서 제조한 다중 siRNA 접합체를 코딩하는 DNAes 발현 카세트를 주형으로 PCR하여 암세포 사멸을 저해하는 Bcl-2, Bcl-xL, XIAP 및 서비빈(survivin) 유전자를 표적하는 다중 siRNA 접합체를 코딩하는 DNAes 절편을 제조하였다.
<플라스미드>
일반적으로 원핵생물과 진행생물은 발현카세트에 사용하는 프로모터를 달리하고 있다. 본 발명의 발현억제 RNA/DNA 시스템에서 사용하는 발현카세트는 원핵생물이나 진행생물 특히 포유동물, 식물 등에 공통적으로 T7 프로모터를 이용하여 제작할 수 있다.
본 발명에서 auto_DdRp 발현카세트 또는 auto_(DdRp/DNAes) 발현카세트는 포유류 발현 벡터로 안정화 세포주를 구축할 수 있는 pCI-neo를 BglII/HpaI 제한효소를 처리하여 선형화하고 auto_DdRp DNA 절편(T7 promoter - 5'UTR - DdRp DNA - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL) 또는 auto_(DdRp/DNAes) DNA 절편(T7 promoter - 5'UTR - DdRp DNA - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL -T7 promoter - DNAes - 전사종결서열)을 삽입하여 제조하였다.
상기 auto_DdRp 발현카세트의 제조를 위해, 실시례 1-2에서 제조한 auto_DdRp 발현카세트를 주형으로 PCR을 하여 auto_DdRp DNA 절편(T7 promoter - 5'UTR - DdRp DNA - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL)을 제조하였다. 상기 auto_DdRp 발현카세트를 주형으로 정방향 프라이머 (5'AGATCTTAAT ACGACTCACT ATAG-3', 서열번호 72), 역방향 프라이머(5'-GTTAACAATT CTGGTGGCTC TC-3', 서열번호 73)를 사용하여 양 말단에 BglII/HpaI 인식서열이 있는 PCR 산물을 확보하였다. 리보자임 DNAes를 위한 프라이머는 별도로 제작하여 진행한다.
상기 auto_DdRp 발현카세트 및 상기 다중 shRNA 접합체 또는 리보자임을 코딩하는 DNAes 절편을 포함하는 플라스미드 발현카세트를 제조하기 위해서, 아래와 같이 진행하였다.
상기 auto_(DdRp+DNAes) 발현카세트의 제조를 위해, 먼저 실시례 1-2에서 제조한 auto_DdRp 발현카세트를 주형으로 PCR을 하여 auto_DdRp DNA 절편(T7 promoter - 5'UTR - DdRp DNA - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL)을 제조하였다. 상기 auto_DdRp 발현카세트를 주형으로 정방향 프라이머 (5'AGATCTTAAT ACGACTCACT ATAG-3', 서열번호 50), 역방향 프라이머(5'-GAATTCAATT CTGGTGGCTC TC-3', 서열번호 51)를 사용하여 양 말단에 BglII/EcoRI 인식서열이 있는 PCR 산물을 확보하였다.
실시례 1-3에서 제조한 DNAes 발현카세트를 주형으로 PCR을 하여 siRNA 다중 접합체 DNA 절편(T7 promoter - DNAes - 전사종결서열)을 제조하였다. 상기 DNAes 발현카세트를 PCR할 때 정방향 프라이머 (5'-GAATTCTAAT ACGACTCACT ATAGCGGUGG UGGAGGAGCU CUU-3', 서열번호 74) 및 역방향 프라이머 (5'-GTTAACAAAA AACCAACAAT AAGAAGAAAG A-3', 서열번호 75)를 사용하여 PCR 산물의의 양 말단에 EcoRI/HpaI 인식서열를 부여하였다.
상기 증폭된 PCR 산물들을 BglII/EcoRI/HpaI 제한효소 처리한 후 T4 DNA ligase를 이용하여 BglII/HpaI 제한효소로 선형화된 pCI-neo 벡터에 삽입되었다. 이때 auto_(DdRp/DNAes) DNA 절편은 pCI-neo 벡터에서 T7 promoter의 하류에 위치하면서, 동시에 돌연변이된 알파 글로빈의 3'-UTR(muag), A64 폴리(A) 서열, 폴리(C) 서열(C30) 및 히스톤 스템-루프 서열(히스톤-SL)의 upstream에 위치하게 되며, auto_(DdRp/DNAes) DNA 절편의 구성은 (T7 promoter - 5'UTR - DdRp DNA - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL - T7 promoter - DNAes - 전사종결서열)일 수 있다.
본 실시례에서 제조한 auto_(DdRp/DNAes) DNA 절편을 포함하는 pCI-neo 발현카세트를 auto_(DdRp/DNAes) 발현카세트라고 하고, auto_DdRp DNA 절편을 포함하는 pCI-neo 발현카세트를 *?**?*auto_DdRp 발현카세트*?**?*라고 하였다.
상기 증폭 산물을 BglII/HpaI 제한효소를 처리하고, BglII/HpaI 제한효소로 선형화된 pCI-neo 벡터를 혼합하여 DNA ligase를 첨가하여 재조합 반응을 수행하였다. 2-3 μl 상기 pCI-neo 벡터 재조합 용액을 대장균에 형질도입하여 암피실린 선택 플레이트에 플레이트하여 37℃에서 밤새 배양하였다.
6-12 개의 콜로니를 골라 각각 50μg/ml의 암피실린이 있는 LB 성장 배지 3ml에 접종한다. 37℃에서 셰이커에서 밤새 배양한다. 표준 절차 또는 상용 Qiaprep Miniprep 키트 (Qiagen)를 사용하여 auto_(DdRp/DNAes) DNA 절편이 재조합 pCI-neo를 분리하였다. 재조합 플라스미드를 BglII/HpaI 제한효소로 절단하고 겔 전기영동을 수행하여 auto_(DdRp/DNAes) DNA 발현카세트를 포함하는 클론을 확인하였다(도 14).
<아데노바이러스 시스템>
일반적으로 원핵생물과 진행생물은 발현 카세트에 사용하는 프로모터를 달리하고 있다. 본 발명의 자가전사 RNA/DNA 시스템에서 사용하는 발현 카세트는 원핵생물이나 진행생물 특히 포유동물, 식물 등에 공통으로 선정된 DdRp에 상응하는 프로모터를 사용할 수 있다. 예를 들어 DdRp가 T7 Polymerase인 경우는 T7 프로모터를 이용하여 제작할 수 있다.
본 발명에서 auto_(DdRp+DNAes) 발현 카세트는 포유류 발현 벡터로 안정화 세포주를 구축할 수 있는 pShuttle 벡터를 XhoI/SalI 제한효소를 처리하여 선형화하고 auto_(DdRp+DNAes) DNA 절편은 (T7 promoter - 5'UTR - DdRp DNA - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL - T7 promoter - DNAes - T7 전사종결서열)을 삽입하여 제조하였다.
상기 auto_(DdRp+DNAes) 발현 카세트 발현 카세트의 제조를 위해, 먼저 실시례 1-4에서 제조한 auto_(DdRp+DNAes) 플라스미드 발현 카세트를 주형으로 PCR을 하여 auto_(DdRp+DNAes) DNA 절편(T7 promoter - 5'UTR - DdRp DNA - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL - T7 promoter - DNAes - T7 전사종결서열)을 제조하였다. 상기 auto_(DdRp+DNAes) 플라스미드 발현 카세트를 주형으로 정방향 프라이머 (5'-CTCGAG TAAT ACGACTCACT ATAG GGAGACCAC AACGGUUUCC CUCU-3',, 서열번호 72), 역방향 프라이머(5'-GTCGACGGT GGCTCTAAAA GAGCCTTTGG-3', 서열번호 73)를 사용하여 양 말단에 XhoI/SalI 인식서열이 있는 PCR 산물을 확보하였다. 리보자임 DNAes를 위한 프라이머는 별도로 제작하여 진행하였다.
상기 증폭된 PCR 산물들을 XhoI/SalI 제한효소 처리한 후 T4 DNA ligase를 이용하여 XhoI/SalI 제한효소로 선형화된 pShuttle 벡터에 삽입되었다. 이때 auto_(DdRp+DNAes) 절편은 pShuttle 벡터에 (T7 promoter - 5'UTR - DdRp DNA - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL - (T7 promoter - DNAes - T7 전사종결서열)로 구성된다.
2-3 μl 상기 pShuttle 벡터 재조합 용액을 대장균에 형질도입하여 암피실린 선택 플레이트에 플레이트하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 6-12 개의 콜로니를 골라 각각 50μg/ml의 암피실린이 있는 LB 성장 배지 3ml에 접종한다. 37℃에서 셰이커에서 밤새 배양한다. 표준 절차 또는 상용 Qiaprep Miniprep 키트 (Qiagen)를 사용하여 auto_(DdRp+DNAes) DNA 절편이 재조합 pShuttle를 분리하였다. 재조합 플라스미드를 BglII/HpaI 제한효소로 절단하고 겔 전기영동을 수행하여 auto_(DdRp+DNAes) DNA 발현 카세트를 포함하는 클론을 확인하였다(도 14).
본 실시례에서 제조한 auto_(DdRp+DNAes) 절편을 포함하는 pShuttle 발현 카세트를 auto_(DdRp+DNAes) 발현 카세트라고 하고, auto_DdRp DNA 절편을 포함하는 pShuttle 발현 카세트를 auto_DdRp 발현 카세트라고 하였다.
본 발명의 재조합 auto_(DdRp+DNAes) 아데노바이러스의 생산은 AdEasy Adenoviral Vector System(Agilent Technologies, 미국)의 지침서에 따라 수행하였다. 먼저, 재조합 auto_(DdRp+DNAes) Adeno 발현 카세트를 Pme I로 선형화하였다. 선형화된 auto_(DdRp+DNAes) Adeno 발현 카세트를 슈퍼 코일 바이러스 DNA 플라스미드인 pAdEasy-1과 함께 BJ5183 박테리아로 공동 형질 전환하였다. 형질주입체는 카나마이신 내성을 위해 선택한다. 재조합은 제한효소를 이용한 방법으로 확인하였다(도 16). Pac I로 재조합 Ad 플라스미드 DNA를 제한하면 ~ 30kb의 큰 단편과 3.0kb (왼쪽 팔 사이에서 재조합이 발생한 경우) 또는 4.5kb (재조합이 원래 복제 위치에서 발생한 경우)의 작은 단편이 생성하였다.
재조합이 확인되면 재조합 능력이 없는 XL10-Gold 균주를 사용하여 대량으로 생산하고 Pac I로 분해하였다. 정제된 재조합 Ad 플라스미드 DNA를 Pac I로 분해하여 역 말단 반복(ITR)을 노출된 DNA가 들어 있는 튜브에 ViraPack Transfection Kit의 Solution I 25 ㎕와 Solution II 250 ㎕를 첨가하여 실온에서 10분 동안 배양하였다. 인큐베이터에서 MBS 함유 배지에 AD-293 세포가 들어있는 플레이트를 준비하였다. DNA 침전물을 재현탁하기 위해 위아래로 피이펫팅하여 DNA 현탁액을 부드럽게 혼합한 다음 DNA 현탁액을 한 방울 씩 플레이트에 추가하여 AD-293 (또는 HEK293) 세포에 처리하였다.
조직 배양 플레이트를 37℃ 인큐베이터에서 3 시간 동안 배양한 후, 플레이트에서 배지를 제거하고 25μM 클로로퀸이 보충된 4ml의 성장 배지로 교체하였다 (배지 및 시약 준비 참조). 플레이트를 37℃ 인큐베이터에서 추가 6 시간 동안 배양 한 후 25μM 클로로퀸이 포함 된 성장 배지를 제거하고 4ml 성장 배지 (클로로퀸)로 교체한다.
배양 플레이트를 37℃에서 7~10일 동안 배양하고 필요할 때 성장 배지를 보충하였다(배지 색상 기준). 세포가 플레이트에 잘 부착된 것처럼 보이면 배지를 4ml의 신선한 배지로 교체하였다. 또는 성장 배지에서 분리된 세포가 관찰되는 경우 기존 배지에 동일한 부피의 신선한 배지를 추가하여 배양하였다. 이 세포 배양용액으로부터 1차 바이러스 스톡을 획득하였다.
아데노바이러스를 생산하는 AD-293 플레이트에서 성장 배지를 조심스럽게 제거하고 PBS로 세포를 한 번 세척하였다. 수확할 세포의 각 플레이트에 PBS 0.5ml를 추가하였다. 플레이트를 비스듬히 잡고 세포 리프터로 PBS의 풀에 세포를 긁어 세포를 수집하였다. 세포 현탁액을 1.7ml 스크류 캡 미세 원심 분리 튜브로 옮겼다. 드라이아이스-메탄올 욕조와 37℃ 수조 사이의 튜브를 번갈아 가며 각 해동 후 잠시 볼텍싱하여 세포 현탁액을 4 회 동결/해동하였다. 실온에서 10분 동안 12,000 × g에서 미세 원심 분리하여 세포 파편을 수집하였다. 상층액(1 차 바이러스 스톡)을 신선한 스크류 캡 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮겼다. 이 1 차 바이러스 스톡는 -80℃에서 1 년 이상 보관할 수 있다.
제조된 1 차 바이러스 스톡의 titer는 아데노바이러스 유래 벡터 유전자 치료제의 분석시험 1(대한민국 식약처)의 방법으로 결정하였으며 107-08 pfu/ml를 유지하였다.
<레티바이러스 시스템>
본 실시례에서 레티바이러스 시스템에 본 실시례 1-4의 <플라스미드 발현 카세트>에서 제조한 auto_(DdRp+DNAes) 발현 카세트를 주형으로 PCR한 auto_(DdRp+DNAes) DNA 절편을 재조합하여 이를 "aauto_(DdRp+DNAes) 렌티 발현 카세트"라고 하였으며. 캡된 SM DdRp RNA@LS와 auto_(DdRp+DNAes) 렌티 발현 카세트를 이용한 형질주입 시스템을 auto_(DdRp+DNAes) 렌티 발현시스템이라고 하였다. 또한 레티바이러스 시스템에 auto_DdRp DNA 절편을 재조합하여 이를 "auto_DdRp 렌티 발현 카세트"라고 하였으며. 캡된 SM DdRp RNA@LS와 auto_DdRp 렌티 발현 카세트를 이용한 형질주입 시스템을 auto_DdRp 렌티 발현시스템이라고 하였다.
상기 다중 shRNA 접합체 또는 리보자임을 코딩하는 DNAes 절편을 포함하는 레티 발현 카세트를 제조하기 위해서, 아래와 같이 진행하였다.
먼저, ViraSafe™ Lentiviral Expression System(Cell Biolabs, 미국)에 있는 pSMPUW-IRES-Blasticidin Lentiviral Expression Vector, 셔틀 벡터 pSMPUW 멀티클로닝 자리의 BamHI/SalI 자리를 이용하여 auto_(DdRp+DNAes) 절편은 (T7 promoter - 5'UTR - DdRp DNA - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL - T7 promoter - DNAes - T7 전사종결서열)을 삽입할 수 있다.
본 실시례 1-4의 <플라스미드 발현 카세트>에서 제조한 auto_(DdRp+DNAes) 발현 카세트*?**?*를 주형으로 PCR하여 auto_(DdRp+DNAes) 절편을 제조하였다. 이때, 정방향 프라이머(5'-GGATCCTAAT ACGACTCACT ATAG-3' 서열번호 78) 및 역방향 프라이머 (5'-GTCGACAAAA AACCAACAAT AAGAAGAAAG A-3', 서열번호 79)를 사용하여 PCR 산물의 양 말단에 BamHI/SalI 인식서열을 부여하였다. 리보자임 DNAes를 위한 프라이머는 별도로 제작하여 진행한다.
상기 증폭 산물을 BamHI/SalI 제한효소를 처리하고, BamHI/SalI 제한효소로 선형화된 셔틀 벡터 pSMPUW 클로닝 벡터를 혼합하여 DNA ligase를 첨가하여 클로닝 반응을 수행하였다. 2-3 μl 상기 셔틀 벡터 pSMPUW 반응용액을 대장균에 형질도입하여 선택 플레이트에 플레이트하여 37℃에서 밤새 배양하였다.
6-12 개의 콜로니를 골라 각각 LB 선택 배지 3ml에 접종한다. 37℃에서 셰이커에서 밤새 배양한다. 표준 절차 또는 상용 Qiaprep Miniprep 키트 (Qiagen)를 사용하여 auto_(DdRp+DNAes) DNA 절편을 포함하는 재조합 pSMPUW 셔틀 벡터를 분리하였다. 재조합 벡터를 BamHI/SalI로 절단하고 겔 전기영동을 수행하여 auto_(DdRp+DNAes) DNA 렌티 발현 카세트 클론을 선정하였다(도 17).
본 발명의 재조합 auto_(DdRp+DNAes) Lenti 발현 카세트 바이러스 생산은 pSMPUW Universal Lentiviral Expression Vector(Cell Biolabs, 미국) 및 Lipofectamine　 LTX Reagent (ThermoFisher, 미국)의 지침서에 따라 다음과 같이 수행하였다.
형질주입 하루 전에 충분한 293T 세포 또는 293LTV 세포(Cat. # LTV-100)를 플레이트하여 형질주입 당일에 배양용기의 70-80 % 덮을 정도 배양한다. 운반(Transfer) 플라스미드로 본 발명에 제조한 pSMPUW, 외피(envelope) 및 패키징(packaging) 플라스미드를 Lipofectamine™ Plus(Invitrogen)로 즉, pSMPUW : pCMV-VSV-G : pRSV-REV : pCgpV 벡터의 몰비는 3:1:1:1로 혼합하여 세포를 형질주입시킨다.
형질주입 후 36~72시간에 렌티 바이러스 상층액을 수확한다. 상층액은 12시간마다 2~3회 수확할 수 있다. 수집기간 동안 4℃에서 보관한다. 수집된 상층액을 수집하여 1500rpm에서 5분 동안 원심 분리하여 세포 파편을 제거하고 0.22 μm에서 여과한다. 상층액은 직접 사용하거나 필요한 경우 정제/농축할 수 있다. 장기 보관을 위해 상층액을 분주하여 -80℃에서 보관한다.
상기 수확하여 보관하는 렌티 바이러스 용액은 숙주세포에 형질주입시키기 전에 ViraBind™ Lentivirus 농축 및 정제 키트(카탈로그 번호 VPK-090, Cell Biolabs, 미국)를 사용하여 바이러스를 고도로 농축시켰다. 본 발명의 auto_(DdRp+DNAes) 렌티 바이러스에 대한 숙주세포로의 일관된 바이러스 형질 도입을 보장하기 위해 p24 ELISA, QuickTiter™ Lentivirus Titer Kit(카탈로그 번호 VPK-107, Cell Biolabs, 미국)를 사용하여 렌티 바이러스 역가를 측정하였으며 정제 및 농축된 바이러스 스톡의 titer는 106-07 pfu/ml를 유지하였다.
목표 세포가 본 발명의 auto_(DdRp+DNAes) 렌티 바이러스로 감염되기 어려우며 보조 시약 없이는 형질 도입 효율이 낮을 수 있어. ViraDuctin™ Lentivirus Transduction Kit (카탈로그 번호 LTV-200, Cell Biolabs, 미국)을 사용하여 바이러스와 세포 상호작용을 촉진하여 형질 도입 효율성을 높일 수 있다.
<식물형질주입용 Binary vector>
본 실시례에서 식물 형질주입용 Binary vector(Ti plasmid)에 auto_(DdRp+DNAes) DNA 절편을 재조합하여 이를 "auto_(DdRp+DNAes) Ti 발현 카세트"라고 하였으며. 캡된 DdRp RNA@LS와 auto_(DdRp+DNAes) Ti 발현 카세트를 이용한 형질주입 시스템을 auto_(DdRp+DNAes) Ti 발현시스템이라고 하였다.
기존에 Sun 등이 보고한에서 SlNCED1-RNAi 벡터의 구축 및 식물 형질 전환 방법(Journal of Experimental Botany, Volume 63, Issue 8, May 2012, Pages 3097-3108, https://doi.org/10.1093/jxb/ers026)을 참조하였다.
본 논문에서는 토마토 열매 숙성 과정에서 중요한 역할을 하는 Abscisic acid (ABA)에 의한 카로티노이드 생합성의 조절을 연구하기 위해, ABA 생합성의 핵심효소인 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase (NCED)를 코딩하는 SlNCED1 유전자의 발현을 억압하는 <E8 :: antisense SlNCED1 :: GUS :: sense SlNCED1 :: Nos-종결서열> 구성을 하는 pCAM-RNAi 발현 카세트를 제안하였다.
본 실시레에서 DNAes 절편은 Sun 등이 보고한 <E8 :: antisense SlNCED1 :: GUS :: sense SlNCED1 :: Nos-종결서열> 구성을 하는 pCAM-RNAi 발현 카세트에서 E8 프로모터를 T7 프로모터(5'-TAATACGACT CACTATAG-3')로 치환하여, DNAes 절편(T7 promoter :: antisense SlNCED1 :: GUS :: sense SlNCED1 :: Nos-종결서열)을 제작하였다.
이 구축물을 생성하기 위해 사용된 PCR 프라이머는 <표 6>에 있다. antisense SlNCED1와 sense SlNCED1 DNA 절편은 토마토 과일 cDNA를 대상으로 <표 3>에 제시된 프라이머쌍로 RT-PCR하여 획득하여 사용하였다. GUS 및 Nos-종결서열은 pCAMBIA1301(abcam, 미국)를 주형으로 각각 PCR하여 획득하였다.
본 실시레에서 상기 제조한 DNA 절편을 재조합하여 DNAes 절편(T7 promoter :: antisense SlNCED1 :: GUS :: sense SlNCED1 :: Nos-종결서열)을 제작하였다. 양쪽 말단에 EcoRI/XhoI 부위를 PCR 방법으로 부여하였다.
SlNCED1-RNAi 구축에 사용하는 프라이머
Name Oligonucleotides Length (bp)
Nos-f (HindIII) 5′-GAATTTCCCC GATCGTTCAA ACATTTGGC-3′(서열번호 80) 265
Nos-r (SalI) 5′-CCGATCTAGT AACATAGATG ACACCGCGC-3′(서열번호 81)
NCED-sense-f (EcoRI) 5′-TGGGTCGCCC TGTTTTCCCT AAAGCCATT-3′(서열번호 82) 427
NCED-sense-r (HindIII) 5′-TCATGCATCA TTGTTGGGTC TTCAACTGG-3′(서열번호 83)
NCED-anti-f (BamHI) 5′-TGGGTCGCCC TGTTTTCCCT AAAGCCATT-3′(서열번호 84) 427
NCED-anti-r (XbaI) 5′-TCATGCATCA TTGTTGGGTC TTCAACTGG-3′(서열번호 85)
GUS-f (PstI) 5′-TGGTCAGTCC CTTATGTTAC GTCCTGTAG-3′(서열번호 86) 1879
GUS-r (EcoRI) 5′-GGTAGCAATT CCCGAGGCTG TAGCCGACG-3′(서열번호 87)
SlNCED2-3′ RACE-F 5′-CTATTGTTGT TCTATGCCCG TGGAG-3′ (서열번호 88)
SlNCED2-3′ RACE-R 5′-AATCCTTCAA GTTTTCTCCA GACGG-3′(서열번호 89)
안티센스 및 센스 SlNCED1 단편은 토마토 과일 cDNA에서 증폭하였으며.β- 글루쿠로니다제(GUS) 단편과 Nos- 종결염기서열은 GUS 및 Nos 서열을 포함하는 플라스미드에서 증폭하였다.
본 발명에서 auto_(DdRp+DNAes) DNA 절편은 실시례 1-3에서 제조한 것을 기반으로 PCR방법으로 양쪽 말단에 XhoI/SalI 부위를 부여한 auto_DdRp DNA 절편(T7 promoter - 5'UTR - DdRp DNA - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL)과 상기 제조한 DNAes 절편을 XhoI 제한효소로 절단하고 ligase로 연결하여 양쪽 말단에 EcoRI/SalI 부위를 부여한 auto_(DdRp+DNAes) 절편(T7 promoter - 5'UTR - DdRp DNA - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL - T7 promoter :: antisense SlNCED1 :: GUS :: sense SlNCED1 :: Nos-종결서열)을 완성하고, 이를 pCAMBIA1305.1 (abcam, 미국)에 있는 EcoRI/SalI 부위에 클로닝하여 auto_(DdRp+DNAes) Ti 발현 카세트라고 지칭하였다. 또한, auto_DdRp DNA 절편을 포함하는 Binary vector(Ti plasmid)을 auto_DdRp Ti 발현 카세트라고 하였다.
2-3 μl 상기 재조합된 벡터 클로닝 반응용액을 대장균에 형질도입하여 선택 플레이트에 플레이트하여 37℃에서 밤새 배양하였다.
6-12 개의 콜로니를 골라 각각 50μg/ml의 LB 선택 배지 3ml에 접종한다. 37℃에서 셰이커에서 밤새 배양한다. 표준 절차 또는 상용 Qiaprep Miniprep 키트 (Qiagen)를 사용하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. 재조합 Binary vector(Ti plasmid)를 EcoRI/SalI로 절단하고 겔 전기영동을 수행하여 auto_(DdRp+DNAes) Ti 발현 카세트 클론을 스크리닝하였다(도 18).
이렇게 얻어진 auto_(DdRp+DNAes) Ti 발현 카세트를 E. coli DH5α로 옮겨 증폭시켰다. auto_(DdRp+DNAes) Ti 발현 카세트는 이후 동결-해동 방법을 사용하여 Agrobacterium tumefaciens LBA4404에 도입하여 auto_(DdRp+DNAes) Ti 발현시스템을 제조하였다.
본 발명의 auto_(DdRp+DNAes) Ti 발현 카세트는 A. tumefaciens LBA4404 매개 방법을 통해 토마토 식물의 자가 계통으로 형질 전환할 수 있다.
1-5. CMV promoter 기반 핵-의존적 pSuper_DNAes plasmid 제조
대조군으로 상기 다중 shRNA 접합체 또는 리보자임을 코딩하는 DNAes 절편을 포함하는 플라스미드 발현 카세트를 제조하기 위해서, 아래와 같이 진행하였다.
pCI-neo Mammalian Expression Vector(미국, Promega)를 이용하여 핵에서 CMV immediate-early enhancer/promoter region 및 β-globin/IgG chimeric intron에 전사되는 시스템을 구축하기 위하여, 실시례 1-3에서 제조한 암세포 사멸을 저해하는 Bcl-2, Bcl-xL, XIAP 및 survivin mRNA를 표적하는 siRNA 다중 접합체 또는 리보자임을 발현할 수 있는 pCI-neo_DNAes를 제조하였다.
상기 다중 shRNA 접합체 또는 리보자임을 코딩하는 DNAes 절편을 PCR하기 위한 프라이머로 설계된 다중 shRNA 발현 카세트 염기서열에 해당하는 정방향 프라이머 (5'-CTCGAGCGGU GGUGGAGGAG CUCUU-3', 서열번호69) 및 역방향 프라이머 (5'-TCTAGAAAAA ACCAACAATA AGAAGAAAGA-3', 서열번호 70)를 주문하였다(바이오니아, 한국). 제작된 프라이머는 PCR 산물에 XhoI/XbaI 제한효소를 부여할 수 있게 하였다. 리보자임 DNAes를 위한 프라이머는 별도로 제작하여 진행한다.
제작된 DNAes 발현 카세트를 상기 주문된 프라이머를 사용하여 PCR을 하여 얻은 dsDNA를 Pst1/XbaI 제한효소로 처리한 후 T4 DNA ligase를 이용하여 Pst1/XbaI 제한효소로 선형화된 pCI-neo plasmid(미국, OriGene)의 멀티클로닝 자리의 Pst1/XbaI자리에 삽입하였으며, 이를 pCI-neo_다중 shRNA 발현 카세트라고 하였다.
상기 재조합 벡터 클로닝 반응용액을 대장균에 형질도입하여 선택 플레이트에 플레이트하여 37℃에서 밤새 배양하였다.
6-12 개의 콜로니를 골라 각각 50μg/ml의 LB 선택 배지 3ml에 접종한다. 37℃에서 셰이커에서 밤새 배양한다. 표준 절차 또는 상용 Qiaprep Miniprep 키트 (Qiagen)를 사용하여 다중 shRNA를 코딩하는 DNA를 포함하는 pCI-neo를 분리하였다. 재조합 플라스미드를 Pst1/XbaI 제한효소로 절단하고 겔 전기영동을 수행하여 pCI-neo_DNAes 발현 카세트 클론을 선별하였다(도 19).
실시례 2. 리포좀 전달체 제조
본 발명에서 제조된 선형의 DdRp RNA 발현 카세트, 여러 종류의 환형 플라스미드 발현 카세트 및 이들의 조합을 Lipofectamine　 2000 Transfection Reagent(ThermoFisher, 미국)로 리포좀 전달체를 제조하였다.
상기 제조된 DdRp RNA 발현 카세트, 플라스미드 발현 카세트 및 이들의 조합(같은 몰비)의 혼합물 1 ㎍과 Opti-MEM 100 ㎕를 1.5 ㎖ 튜브에 넣어 섞고, Lipofectamin2000 5㎕와 무혈청 배지 100 ㎕를 다른 1.5 ㎖ 튜브에 넣어 혼합한 후 5분 동안 상온에 방치하였다. 이후 상기 두 튜브의 내용물을 혼합하고, 리포좀(liposome) 형태의 복합체를 이룰 수 있도록 20분 동안 상온에서 보관하였다. 20분 후 튜브를 10초 동안 원심 분리한 후 각각의 세포 위에 처리하여 형질주입(transfection)하고, 4시간 후 새로운 배지로 갈아주었다.
상기 RNA/DNA 시스템1과 리포좀의 복합체인 auto(-)_DNAes@LS로 DdRp RNA 발현 카세트, DNAes 발현 카세트와 리포좀의 복합체인 "DdRp RNA/DNAes@LS"이라고 하였다. 안정화된 캡된 CM_DdRp mRNA에서 반복적으로 합성되는 T7 폴리머라제가 세포질에서 장기간 고농도로 유지할 수 있다.
또한, 상기 RNA/DNA 시스템2 또는 RNA/DNA 시스템3과 리포좀의 복합체인 auto_DNAes@LS로 DdRp RNA 발현 카세트, auto_DdRp 발현 카세트, DNAes 발현 카세트와 리포좀의 복합체인 "DdRp RNA/auto_DdRp+DNAes@LS 또는 DdRp RNA 발현 카세트, auto_(DdRp+DNAes) 발현 카세트와 리포좀의 복합체인 DdRp RNA/auto_(DdRp+DNAes)@LS"이라고 하였다. 초기에 안정화된 캡된 CM DdRp mRNA에서 합성되는 T7 폴리머라제에 의한 auto_DdRp 발현 카세트 또는 auto_(DdRp+DNAes) 발현 카세트의 T7 promoter에 결합함으로써 T7 polymerase는 자가전사 결과로 세포질에서 장기간 고농도로 유지할 수 있다.
대조군으로 pCI-neo_DNAes를 탑재한 DOPC 리포좀 나조입자를 제조하였으며 pCI-neo_DNAes와 리포좀의 복합체인 pCI-neo_DNAes@LS라고 하였다.
실시례 3. 자가전사 RNA/DNA 시스템의 형질주입
본 발명의 자가전사 RNA/DNA 시스템은 RNA 성분과 DNA 성분으로 구성되며, 이들의 운반체는 선형의 핵산절편, 환형의 플라스미드 및 바이러스 등 다양하게 할 수 있으며, 이들의 조합일 수도 있다. 제작된 RNA/DNA 시스템의 전달체는 비바이러스성인 경우 다양한 방법을 선택할 수 있다. 본 실시례에서는 리포좀 유형을 선택하였으나, 이에 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 발현억제 RNA/DNA 시스템의 표적 세포에 형질주입은 안정화된 형질전환 세포를 원활하게 얻기 위해 2차로 나누어 아래와 같이 진행하였다. 물론 동일에 형질전환을 할 수 있다.
1차 형질주입은 관심 발현억제 RNA를 코딩하는 DNAes를 포함하는 발현 카세트를 형질주입하고 선택배지를 이용하여 형질전환 세포를 선정하는 단계이며, 2차 형질주입은 1차 형질주입으로 선택배지에서 안정화된 세포를 대상으로 DdRp RNA 발현 카세트를 도입하여 형질전환 세포에서 합성된 DdRp에 의해 관심 mRNA 및 이들이 코딩하는 단백질을 발현하도록 하는 단계이다.
<1차 형질주입>
- 플라스미드 전달체
상기 플라스미드 전달체의 경우, pCI-neo Mammalian Expression Vector (Promega 사, 미국) 및 Lipofectamine　 2000 Transfection Reagent(ThermoFisher, 미국)의 지침서에 따라서, 표적 세포를 준비하여 1x105개의 세포를 96-웰에 분주하였다. 다음날 실시례 2에서 준비한 리포좀 유전자 전달체를 세포 배양 배지로 총 부피 100㎕로 만든 후 각 웰에 처리하였다. 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양한 후 1X PBS로 세포를 세척하고, 트립신(trypsin)을 처리하여 세포를 떼어낸 후 100mm 배양 접시로 옮겨 배양하였다. 플라스미드 유전자 전달체의 형질주입은 RNA/DNA 시스템을 함께 리포좀 전달체로 제작하여 형질주입을 할 수도 있으며 이들을 나누어 리포좀을 제작하여 각각 형질주입할 수도 있다.
리포좀 전달체에 의한 안정적 형질전환 세포의 선정을 위해, 형질주입 후, 형질주입된 세포는 항생제 G-418로 선택하였다. 형질주입 후 낮은 세포 밀도로 세포를 접종하고 선택을 위해 G-418 항생제를 400~600μg/ml의 G-418 농도로 넣었고 안정적인 형질전환체의 유지를 위해 200~400μg/ml의 G-418 농도로 처리하였다.
- 바이러스 전달체
상기 바이러스 전달체의 경우, AdEasy Adenoviral Vector System(Agilent Technologies, 미국), pSMPUW Universal Lentiviral Expression Vector(Cell Biolabs, 미국) 및 Lipofectamine　 2000 Transfection Reagent(ThermoFisher, 미국)의 지침서에 따라서, 표적 세포를 준비하여 1x105개의 세포를 96-웰에 분주하였다. 다음날 세포에 처리할 감염 다중도(다중plicity of Infection, MOI)에 따라 바이러스 유전자 전달체를 세포 배양 배지로 총 부피 100㎕로 만든 후 각 웰에 처리하였다. 바이러스 유전자 전달체 처리 후, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양한 후 1X PBS로 세포를 세척하고, 트립신(trypsin)을 처리하여 세포를 떼어낸 후 100mm 배양 접시로 옮겨 배양하였다.
렌티바이러스 경우는 2일 내지 3일에 한 번씩 항생제인 블라스티시딘(blasticidin)을 5㎍/㎖의 농도로 포함하는 배지로 갈아주었다.
<2차 형질주입>
2차 형질주입은 1차 형질주입된 세포를 대상으로 실시례 2에서 제조된 DdRp RNA@LS을 형질주입하는 단계로 T7 프로모터에 작용하는 최초의 T7 Polymerase를 제공하기 위한 것이다. 상기 1차 형질주입의 상기 플라스미드와 렌티바이러스 전달체를 처리하고 선정된 안정화된 세포, 그리고 아데노바이러스 유전자 전달체는 접종한 직후 세포를 대상으로 DdRp RNA@LS의 형질주입을 수행하였다.
실시례 4. T7 polymerase 발현 지속성 실험
본 발명의 대조군 5 pmol pCI-neo_DNAes@LS, 5 pmol DdRp RNA/DNAes@LS, 5 pmol DdRp RNA/auto_DdRp/DNAes@LS, 5 pmol DdRp RNA/auto_(DdRp/DNAes)@LS, 3x104 MOI auto_(DdRp/RSV-F DNAi) 아데노 발현시스템[DdRp RNA@LS와 auto_(DdRp/DNAes) 아데노 발현 카세트로 구성된 시스템] 또는 104 MOI auto_(DdRp/DNAes) 렌티 발현시스템[DdRp RNA@LS와 auto_(DdRp/DNAes) 렌티 발현 카세트로 구성된 시스템]를 실시례 3의 방법으로 각각 293T 세포에 형질주입 후, 0, 24, 48 및 72시간에서 293T 세포 내 T7 polymerase mRNA 및 단백질을 분석하였다. 본 실시례에서는 auto_DdRp의 DdRp는 T7RNAP 또는 NP868R-T7RNAP가 있는 자가전사 RNA/DNA 시스템을 사용하였다. 여기서, DNAes는 상기 다중 shRNA 집합체이다.
- T7 polymerase mRNA 분석
상기 형질전환 293T 세포의 T7 polymerase mRNA 분석은 2차 형질주입한 후, 0, 24, 48 및 72시간에서 293T 세포에서 총 RNA를 분리하여 quantitative PCR (qPCR) with SYBR Green로 분석하였다.
구체적으로, 형질주입된 293T 세포에서 RNeAsy 미니 키트 (Qiagen)를 사용하여 총 RNA를 추출했다. 총 150ng의 총 RNA를 cDNA 로 역전사하고(SuperScript II Reverse Transcriptase, Invitrogen), 상기 cDNA를 이용하여 KAPA SYBR　 FAST qPCR Kits(Sigma aldrich, 미국)를 사용하여 분석하였다.
qPCR 반응을 준비하기 전에 KAPA PROBE FAST Bio-Rad iCycler ™ qPCR 마스터 믹스 (2X), 템플릿 DNA, 프라이머 및 프로브를 <표 4>에 제시 내용으로 철저히 혼합하였다.
qPCR의 구성 시약
Final Concentration 20 μl rxn
PCR grade water up to 20 μl 7.2 μl
qPCR Master Mix (2X) 1X 10 μl
Forward Primer (10 μM) 200 nM 0.4 μl
Reverse Primer (10 μM) 200 nM 0.4 μl
Template DNA(10 ng/1 μl) 1 ng/μl 2.0 μl
정방향 프라이머 5'-TCACGACTCC TTCGGTACCA T-3' (서열번호 90), 역방향 프라이머 5'-CATAGTTTCG CGCACTGCTT T-3' (서열번호 91)를 사용하였다.
qPCR 프로토콜은 1단계는 3분 동안 95℃에서 효소 활성화 (1주기), 2단계로40 사이클 (변성: 95℃, 15초, 어닐링/연장: 60℃, 1분)은 Bio-Rad iCycler(Bio-Rad, 미국)를 사용하여 수행하여 사용하는 장비의 제조사의 지침에 따라 데이터를 분석하였다. 본 실시례에서 최고 발현치, DdRp RNA/auto_DdRp/RSV-F DNAi@LS의 72시간에서 얻은 값을 100%으로 하여 그에 비례하여 그 수치를 백분율로 표시한 결과는 <도 20>와 같다. 5회 실험하여 평균값을 표기하였다.
<도 20>에서처럼, auto_DdRp의 DdRp가 T7RNAP를 사용한 형질전환 세포를 분석한 결과로 대조군 pCI-neo_DNAes@LS에서는 T7 polymerase mRNA의 발현이 없으며, DdRp RNA/DNAes@LS 형질전환 세포에서는 형질주입된 5'Cap 구조가 있고 안정화된 DdRp RNA가 세포내에서 천천히 분해되는 것을 확인할 수 있었다, DdRp RNA/auto_DdRp/DNAes@LS; DdRp RNA/auto_(DdRp/DNAes)@LS; auto_(DdRp/DNAes) 아데노 발현시스템 또는 auto_(DdRp/RSV-F DNAi) 렌티 발현시스템을 포함하는 auto(+) DdRp 발현시스템이 형질전환된 세포에서는 DdRp RNA 발현 카세트에서 합성되는 최초의 T7 polymerase가 auto_DdRp 발현 카세트의 T7 프로모터에 결합하여 하류지역에 있는 DdRp를 합성하는 자가전사 루프가 작용하여 안정적으로 DdRp를 합성함을 확인할 수 있었다.
auto_DdRp의 DdRp가 T7RNAP 또는 NP868R-T7RNAP를 갖는 형질전환체 세포를 비교한 결과는 경우 T7RNAP보다 NP868R-T7RNAP 형질전환 세포가 평균적으로 5~6배정도 T7 polymerase mRNA의 발현량이 높았으며 NP868R의 효과로 생각이 되었다(자료 미제시).
- T7 polymerase 분석
상기 형질주입 293T 세포를 0, 24, 48 및 72시간에 채집하여 cocktail protease inhibitor가 포함된 RIPA 버퍼로 lysis한 뒤 원심분리를 이용하여 단백질 시료들을 준비하였다. 이러한 시료들을 ELISA Plate에 4℃에서 12시간 동안 코팅하고 비특이적 염색을 예방하기 위해 0.2% Tween-20 및 5% dry milk에서 blocking을 한 후, Anti-T7 RNA Polymerase antibody (CABT-B8990, Creative diagnostic, 영국)로 1차 염색, HRP가 결합된 2차 항체로 2차 염색을 하고 Promega™ Microplate Reader(Promega, 미국) 분석하였다. 5회 실험하여 평균값을 표기하였다.
<도 21>에서처럼, auto_DdRp의 DdRp가 T7RNAP를 사용한 형질전환 세포를 분석한 결과로 결론적으로, DdRp RNA/DNAes@LS인 auto(-) DdRp 발현시스템 그리고 DdRp RNA/auto_DdRp/DNAes@LS; DdRp RNA/auto_(DdRp/DNAes)@LS; auto_(DdRp/DNAes) 아데노 발현시스템 또는 auto_(DdRp/DNAes) 렌티 발현시스템을 포함하는 auto(+) DdRp 발현시스템이 형질전환된 세포에서 합성되는 T7 polymerase은 세포질 내에서 적어도 72시간 이상 고농도로 유지되는 것이다.
auto_DdRp의 DdRp가 T7RNAP 또는 NP868R-T7RNAP를 갖는 형질전환체 세포를 비교한 결과는 경우 T7RNAP보다 NP868R-T7RNAP 형질전환 세포가 평균적으로 10~15배정도 T7 polymerase의 발현량이 높았으며 NP868R의 효과로 생각이 되었다(자료 미제시).
실시례 5. 다중 shRNA 발현의 변환 조사
본 발명의 대조군 5 pmol pCI-neo_DdRp+DNAes @LS, 5 pmol DdRp RNA/DNAes@LS, 5 pmol DdRp RNA/auto_(DdRp+DNAes)@LS, 5 pmol DdRp RNA/auto_(DdRp+DNAes)@LS, 3x104 MOI auto_(DdRp+DNAes) 아데노 발현시스템[DdRp RNA@LS와 auto_(DdRp+DNAes) 아데노 발현 카세트로 구성된 시스템] 또는 104 MOI auto_DdRp 렌티 발현시스템[DdRp RNA@LS와 auto_(DdRp+DNAes) 렌티 발현 카세트로 구성된 시스템]을 실시례 3에 기술한 내용으로 각각 유방암 세포주 MCF-7 세포에 형질주입 후, 0, 24, 48 및 72시간에서 다중 shRNA의 표적 mRNA 및 단백질 발현의 수준을 분석하였다.
- 표적 mRNA 발현
상기 DNAes를 구성하는 다중 shRNA 접합체는 암세포 사멸을 저해하는 Bcl-2, Bcl-xL, XIAP 및 survivin mRNA를 표적하는 siRNA로 작용하여 상응하는 mRNA를 파괴한다.
다중 shRNA의 표적 mRNA 발현의 분석은 구체적으로, 형질주입된 유방암 세포주 MCF-7 세포에서 총 RNA는 제조업체의 지침 (InviTrap Spin Cell RNA Mini Kit, Invitek, Berlin, Germany)에 따라 분리하고 cDNA (SuperScript II Reverse Transcriptase, Invitrogen)로 역전사하였다. 정량적 실시간 PCR (qPCR)은 Human Bcl-2 qPCR Primer Pair(Sino Biological, 미국), Human Bcl-XL qPCR Primer Pair(Sino Biological, 미국), Human Survivin qPCR Primer Pair(Sino Biological, 미국), Human TBP qPCR Primer Pair(Sino Biological, 미국) 및 Human XIAP qPCR Primer Pair(Sino Biological, 미국)를 사용하며, 대조유전자 TBP (TATA 상자 결합 단백질)의 mRNA로 정규화하고 상기 키트는 SYBR　 Green-based quantitative real-time PCR(qPCR)이다.
구체적으로 살펴보면, 상기 제조된 cDNA 주형; qPCR 프라이머 믹스 (10 nM); RNase가 없는 H2O; 2 × SYBR Green PCR 마스터 믹스. SYBR Green이 포함된 qPCR 믹스는 빛으로부터 멀리하고 실온에서 해동(-20 ℃에 보관하는 경우)한 다음 뒤집어서 부드럽게 섞은 다음 얼음 위에 놓았으며, qPCR 실험을 위한 관련 시약 및 재료 준비를 하였다. <표 5>에 있는 성분으로 PCR 시약의 마스터 믹스를 준비하였다.
qPCR 의 시약
Component Volume/reaction (μl)
2×SYBR Green mix (Roche) 10 25
qPCR Primer mix (10 nM) 0.8 2
Template (DNA or cDNA, ≤5 pmol) 5 5
ddH2O 4.2 16
Total 20 50
Light Cycler 480 Ⅱ사용 설명서에 따라 PCR 반응을 수행 할 프로그램을 설정하고 실행하였다. 95℃ 30 초; 95℃ 10 초, 60℃ 20s 45주기, 72℃ 10 초; 95℃ 5 초, 65℃ 1 분, 65℃ ~ 97℃ (연속, 램프 속도 0.11℃/s, 획득 5s/℃); 40℃ 30초로 구성된 3단계 방식으로 진행하였다. 반응 후 기계 매뉴얼에 따라 데이터를 분석하였다.
<도 22>은 대조군 5 pmol pCI-neo_DNAes@LS에 비해 본 발명의 5 pmol DdRp RNA/DNAes@LS, 5 pmol DdRp RNA/auto_DdRp+DNAes@LS, 5 pmol DdRp RNA/auto_(DdRp+DNAes)@LS, 3x104 MOI auto_(DdRp+DNAes) 아데노 발현시스템 또는 104 MOI auto_(DdRp+DNAes) 렌티 발현시스템을 처리한 유방암 세포주 MCF-7 세포에서 다중 shRNA의 표적 mRNA의 변화 양상이다.
- 표적 단백질 발현
다중 shRNA의 표적 단백질 발현은 형질주입된 유방암 세포주 MCF-7 세포(샘플 당 5x104)를 20μl 로딩 버퍼 (20 % 글리세롤, 2 % SDS, 125mM Tris pH 6.8, 5 % β- 머캅토에탄올, 브로모페놀블루)에 용해시키고 95℃에서 5분 동안 배양한 후 10% SDS-PAGE 전기영동을 한 후 PVDF 막으로 이동하였다. 상기 막을 비특이적 염색을 예방하기 위해 0.2% Tween-20 및 5% dry milk에서 blocking을 한 후, 다중 shRNA의 표적 단백질 항체로 1차 항체, HRP가 결합된 2차 항체로 2차 염색을 하고 Enhanced chemiluminescence Kit (GE Healthcare)를 시각화에 사용하였다.
사용한 1차 항체는 BCL2 (1:200; clone 124; Dako, Glostrup, Denmark), Bcl-xL (1:100; clone 2H12; QED Bioscience Inc., San Diego, CA, USA), XIAP (1:250; clone 28; BD Biosciences) or survivin (1:1,000; NB500-201; Novus Biologicals, Littleton, CO, USA)와 대조군으로 단일클론 항-β-액틴 항체 (1:20,000; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)이다.
2차 다클론 토끼 항-마우스 면역글로불린 HRP-결합 항체(β- 액틴, BCL2, Bcl-xL 및 XIAP의 경우1:1,000; Dako; ) 또는 다클론 돼지 항-토끼 면역 글로불린 HRP-결합 항체 (survivin의 경우, 1:1,000, Dako)이다.
상기 DNAes를 구성하는 다중 shRNA 접합체는 암세포 사멸을 저해하는 Bcl-2, Bcl-xL, XIAP 및 survivin mRNA를 표적하는 siRNA로 작용하여 상응하는 단백질 발현을 억제한다.
<도 23>는 대조군 pCI-neo_DNAes@LS에 비해 본 발명의 DdRp RNA/DNAes@LS, DdRp RNA/auto_(DdRp+DNAes)@LS, DdRp RNA/auto_(DdRp+DNAes)@LS, auto-(DdRp+DNAes) 아데노 발현시스템, auto-(DdRp+DNAes) 렌티 발현시스템을 처리한 유방암 세포주 MCF-7 세포에서 다중 shRNA의 표적 단백질 발현의 변화 양상이다.
- 생존력 분석
<도 24>는 2차 형질주입한 후, 0, 24, 48 및 72시간에서 유방암 세포주 MCF-7 세포가 있는 용액에 MTS assay 시약을 넣은 후 450 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하는 방법으로 살아있는 유방암 세포주 MCF-7 세포를 5회 분석한 결과이다.
<도 22, 23 및 24>의 결과로 본 발명에서 제안하는 자가전사 RNA/DNA 시스템의 DdRp mRNA 발현 카세트가 최초의 DdRp 합성하고 auto_DdRp 발현 카세트의 T7 프로모터에 작용하여 추가적인 DdRp를 합성한다. 따라서 최초의 DdRp와 추가적으로 합성된 DdRP는 직접 DNAes 발현 카세트의 T7 프로모터에 결합하여 목표 발현억제 RNA, <T7 프로모터 - B2-1 shRNA - B2-2 shRNA - BX-1 shRNA - BX-2 shRNA X-1 - shRNA - X-2 shRNA - S-1 shRNA - S-2 shRNA-전사종결서열>로 구성된 Bcl-2, Bcl-xL, XIAP 및 서비빈(survivin) 에 대한 다중 shRNA를 발현시킨다. 합성된 다중 shRN는 유방암 세포주 MCF-7 세포의 표적 mRNA 파괴하여 암세포를 사멸케함을 알 수 있었다.
실시례 6. 리보자임을 이용한 자가전사 RNA/DNA 시스템
실시례 1-4에서 제조한 리보자임 포함하는 DNAes 절편은 <T7 프로모터- mTERT-특이적 리보자임 - HSV-tk - WPRE - muag - A64 - C30 - 히스톤SL> 구조로 암세포에서 공통적으로 발현하고 있고 동시에 일반세포에서는 거의 발현이 안되는 mTERT(텔로머라아제 역전사효소)를 표적으로 하고 표적 하류 부위를 HSV-tk로 치환시키는 기능이 있다. 따라서, 상기 DNAes 절편이 mTERT가 발현하는 암세포에서 작용하면 thymidine kinase/ganciclovir (TK/GCV) system으로 암세포만을 사멸케할 수 있게 된다. 상기 제조한 DNAes 절편을 다양한 유전자 전달체에 재조합하였다.
본 발명에서 재조합된 5 pmol DdRp RNA/DNAes@LS, 5 pmol DdRp RNA/auto_DdRp+DNAes@LS, 5 pmol DdRp RNA/auto_(DdRp+DNAes)@LS, 3x104 MOI auto_(DdRp+DNAes) 아데노 발현시스템[DdRp RNA@LS와 auto_(DdRp+DNAes) 아데노 발현 카세트로 구성된 시스템] 또는 104 MOI auto_DdRp 렌티 발현시스템[DdRp RNA@LS와 auto_(DdRp+DNAes) 렌티 발현 카세트로 구성된 시스템]을 실시례 3에서 기술한 내용으로 유방암 세포주 MCF-7 세포에 처리하였다.
<도 25>은 2차 형질주입하고 10 μM GCV를 처리한 후, 0, 24, 48 및 72시간에서 유방암 세포주 MCF-7 세포가 있는 용액에 MTS assay 시약을 넣은 후 450 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하는 방법으로 살아있는 유방암 세포주 MCF-7 세포를 5회 분석한 결과이다.
본 발명에서 제안하는 자가전사 RNA/DNA 시스템의 DdRp mRNA 발현 카세트가 최초의 DdRp 합성하고 auto_DdRp 발현 카세트의 T7 프로모터에 작용하여 추가적인 DdRp를 합성한다. 따라서 최초의 DdRp와 추가적으로 합성된 DdRp는 직접 DNAes 발현 카세트의 T7 프로모터에 결합하여 목표 발현억제 RNA인 mTERT-특이적인 라보자임이 있는 <T7 프로모터- mTERT-특이적 리보자임 - HSV-tk - WPRE - muag - A64 - C30 - 히스톤SL> 하류 지역을 발현시킨다. 합성된 mTERT-특이적 리보자임- HSV-tk는 유방암 세포주 MCF-7 세포의 mTERT를 표적화하고 표적부위 하류지역을 HSV-thymidine kinase로 치환시켜 암세포를 thymidine kinase/ganciclovir (TK/GCV) system으로 사멸케함을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변형하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시례들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변형 또는 화학적 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (23)

  1. 세포 내 적어도 하나의 내인성 RNA 발현억제를 하고 자가 전사가 가능한 구성성분이 있는 시스템으로서, 상기 시스템은
    세포내 번역이 가능한 구조를 갖추고 화학적 변형된 뉴클레오타이드(CM)를 포함하는 DNA 의존성 RNA Polymerase(DdRp) mRNA를 포함하는 RNA(DdRp RNA) 발현 카세트; 및
    상기 DdRp에 의해 전사될 수 있는 발현억제 RNA를 코딩하는 DNA(DNAes) 발현 카세트;를 포함하는 자가전사 RNA/DNA 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포내 번역이 가능한 구조는
    5'cap 구조 및 IRES(internal ribosomal entry sites)를 포함하는 군에서 하나 이상이 있는 5'UTR를 특징으로 하는 자가전사 RNA/DNA 시스템.
  3. 제1항에 있어서, 상기 DdRp RNA 발현 카세트는
    (1) 5'UTR;
    (2) 상기 DdRp를 코딩하는 RNA; 및
    (3) 3'UTR;를 포함하는 RNA;를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가전사 RNA/DNA 시스템.
  4. 제1항 내지 제3항에 있어서, 상기 화학적 변형된 뉴클레오타이드(CM)는
    당 변형, 염기 변형, 백본 변형 및 지질 변형을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가전사 RNA/DNA 시스템.
  5. 제1항 내지 제4항에 있어서, 상기 DdRp는
    핵국지화신호(Nulcear localization Signal)가 있는 것을 특징으로 하는 자가전사 RNA/DNA 시스템.
  6. 제1항에 있어서, 상기 발현억제 RNA는
    siRNA(short interfering RNA), miRNA(microRNA), shRNA(short hairpin RNA), hairpin RNA, artificial microRNA, intrinsic direct repeat, 3'UTR inverted repeat, artificial trans-acting siRNA, 안티센스 RNA(antisense RNA), 리보자임(ribozyme) 및 압타머(aptamer)를 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나를 특징으로 하는 자가전사 RNA/DNA 시스템.
  7. 제1항에 있어서, 상기 DNAes 발현 카세트는
    (1) 상기 DdRp가 결합하는 프로모터;
    (2) 상기 발현억제 RNA를 코딩하는 DNA 절편; 및
    (4) 3'UTR;을 포함하는 DNA를 특징으로 하는 자가전사 RNA/DNA 시스템.
  8. 제7항에 있어서, 상기 DNAes 절편은
    하나 이상의 발현억제 RNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가전사 RNA/DNA 시스템.
  9. 제1항 내지 제8항에 있어서, 상기 DNAes 발현 카세트에 있는 선택된 유전체의 특정 표적화 염기서열에 관련된 발현억제 RNA와 상이한 표적화 염기서열에 관련된 발현억제 RNA를 외부에서 인공적으로 합성하여 세포내로 형질주입하는 것을 특징으로 하는 자가전사 RNA/DNA 시스템.
  10. 제1항 내지 제9항에 있어서, 상기 DdRp mRNA의 자가전사를 위해서,
    추가적으로 상기 DdRp가 결합할 수 있는 프로모터와 DdRp를 코딩하는 DNA를 포함하는 auto_DdRp 발현 카세트;를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가전사 RNA/DNA 시스템.
  11. 제10항에 있어서, 상기 auto_DdRp 발현 카세트는
    (1) 상기 DdRp가 결합하는 프로모터;
    (2) 5'UTR;
    (3) 상기 DdRp를 코딩하는 DNA 절편; 및
    (4) 3'UTR;를 포함하는 DNA를 특징으로 하는 자가전사 RNA/DNA 시스템.
  12. 제1항 내지 제11항에 있어서, 상기 발현 카세트는
    선형의 핵산 단편, 환형의 플라스미드 및 바이러스 벡터를 포함한 다양한 형태 또는 이들의 조합을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나를 특징으로 하는 자가전사 RNA/DNA 시스템.
  13. 제1항 내지 제12항에 있어서, 상기 DNAes 발현 카세트 및 상기 auto_DdRp 발현 카세트는
    한 개의 유전자 전달체 이상에 있는 것을 특징으로 하는 자가전사 RNA/DNA 시스템.
  14. 제1항 내지 제13항에 있어서, 상기 DdRp RNA 발현 카세트, 상기 auto_DdRp 발현 카세트 및 상기 DNAes 발현 카세트는
    G/C 함량, 코돈 최적화(optimization), UTR 변형, 30개 초과의 아데노신 뉴클레오타이드를 갖는 폴리(A) 꼬리, 폴리(C) 서열, m7GpppN을 제외한 5'-캡(CAP) 구조 및 히스톤-스템-루프 서열로 이루어진 염기서열 변형(SM)으로부터 선택된 적어도 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가전사 RNA/DNA 시스템.
  15. 제1항 내지 제14항에 있어서, 상기 자가전사 RNA/DNA 시스템은
    세포질에서 상기 DdRp를 합성하는 것을 특징으로 하는 발현 RNA/DNA 시스템.
  16. 제15항에 있어서, 상기 자가전사 RNA/DNA 시스템의 표적 세포 및 조직에 형질주입은
    DdRp RNA 발현 카세트와 DNA 발현 카세트를 동시에 형질주입하는 방법; 또는
    DdRp RNA 발현 카세트와 DNA 발현 카세트를 각각 독립적으로 형질주입하는 방법;을 특징으로 하는 자가전사 RNA/DNA 시스템.
  17. 상기 자가전사 RNA/DNA 시스템에서 상기 DdRp RNA 발현 카세트는
    T7 프로모터 하류에 있는 DNA의 전사를 유도하는 것을 특징으로 하는 자가전사 RNA/DNA 시스템.
  18. 상기 자가전사 RNA/DNA 시스템을 포함하는 키트.
  19. 상기 자가전사 RNA/DNA 시스템을 형질도입된 세포 또는 개체.
  20. 제1항 내지 제19항에 있어서, 상기 DdRp는
    T7 RNA 폴리머라제(polymerase), T3 RNA 폴리머라제 및 SP6 폴리머라제를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나; 또는
    적어도 하나의 DdRp의 촉매 도메인을 포함하는 키메라 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가전사 RNA/DNA 시스템.
  21. 제20항에 있어서, 상기 키메라 효소는
    적어도 하나의 RNA 트리포스파타제의 촉매 도메인,
    적어도 하나의 구아닐릴트랜스퍼라제의 촉매 도메인,
    적어도 하나의 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 촉매 도메인 및
    적어도 하나의 DdRp의 촉매 도메인을 포함하는 키메라 효소를 특징으로 하는 자가전사 RNA/DNA 시스템.
  22. 제20항 내지 제21항에 있어서, 상기 키메라 효소는
    RNA 트리포스파타제의 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 촉매도메인, N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 촉매 도메인 및 DdRp의 촉매 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 상기 촉매 도메인이 연결 펩티드에 의해 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 자가전사 RNA/DNA 시스템.
  23. 제1항 내지 제21항에 있어서, 상기 DNAi 발현 카세트는 상기 DNAi 발현 카세트의 DNA 일부를 전사체로 하여 합성되는 mRNA에 5’Cap 구조를 부가할 수 있는 효소 또는 촉매 도메인을 지시하는 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가전사 RNA/DNA 시스템.
KR1020210077583A 2020-11-17 2021-06-15 세포질에서 자가 전사가 가능하고 발현억제 rna를 제공하는 rna/dna 시스템 KR20220067468A (ko)

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