PT1029069E - Vectores de alfavírus - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Vectores de alfavírus" CAMPO DO INVENTO O presente invento refere-se ao campo das vacinas de ADN e está particularmente relacionado com vectores de alfavirus modificados para utilizar nestas vacinas.

ANTECEDENTES DO INVENTO O virus da floresta de Semliki (SFV) é um membro do género Alfavirus, dentro da família Togaviridae. As partículas do vírus maduro contêm uma cópia única de um genoma ARNcs com uma polaridade positiva, protegido na extremidade 5' e poliadenilado na extremidade 3'. Ele funciona como um ARNm, e o ARN nu pode iniciar uma infecção quando é introduzido nas células. Com a infecção/transfecção, os dois terços em 5' do genoma são traduzidos numa poliproteína, que é processada nas quatro proteínas não estruturais (nsPl a 4) por autoclivagem. Uma vez sintetizadas, as proteínas ns são responsáveis por replicar o genoma de cadeia positiva (42S) em cadeias negativas completas (ref. 14). Estas cadeias negativas servem depois de modelos para a síntese de novos genomas de cadeia positiva (42S) e do ARNm subgenómico 26S (ref. 1 - Ao longo deste pedido, são citadas várias referências entre parêntesis para descrever mais integralmente o estado da arte à qual este invento pertence. A informação bibliográfica completa para cada citação encontra-se no final do fascículo). Este ARNm subgenómico, que é colinear com o último um terço do genoma, codifica as proteínas estruturais do SFV. Em 1991, Liljestrom e Garoff (ref. 2) conceberam uma série de vectores de expressão baseados no replicão de ADNc do SFV. Estes vectores apresentavam uma deleção dos genes das proteínas estruturais do vírus, para preparar o caminho para as inserções heterólogas, mas preservavam a região codificante não estrutural para produção do complexo de replicases nsPl a 4. Elementos curtos da sequência em 5' e em 3', necessários para a replicação do ARN, também foram preservados. Foi inserido um local de clonagem múltipla a jusante do promotor 26S, seguido de locais de terminação da tradução em todas as três grelhas. 2

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Um local Spel foi inserido imediatamente após a extremidade 3' do ADNc do SFV, para linearizar o plasmideo com o objectivo de o utilizar em reacções de transcrição in vitro. A injecção de ARN de SFV codificando uma proteína heteróloga resulta na expressão da proteína estranha e na indução de anticorpo, tal como demonstrado em vários estudos (ref. 3, 4). A utilização da inoculação de ARN de SVF, para expressar proteínas estranhas com o objectivo de imunização, teria várias das vantagens associadas à imunização com ADN plasmídico. Por exemplo, o ARN de SFV codificando um antigénio virai poderá ser introduzido na presença do anticorpo para esse vírus, sem uma perda de potência devido à neutralização por anticorpos para o vírus. Além disso, como a proteína é expressa in vivo, ela deverá possuir a mesma conformação que a proteína expressa pelo próprio vírus. Assim, as preocupações sobre modificações conformacionais que poderiam ocorrer durante a purificação da proteína, conduzindo a uma perda de imunogenicidade, de epítopos protectores e possivelmente a imunopotenciação, poderiam ser evitadas através de imunização com ADN plasmídico.

Em WO 95/27044, é descrita a utilização de vectores de ADNc de alfavírus baseados na complementaridade do ADNc em relação à sequência de ARN do alfavírus. Uma vez transcrito a partir do ADNc sob controlo transcricional de um promotor heterólogo, o ARN do alfavírus é capaz de se auto-replicar por meio da sua própria replicase, amplificando, assim, o número de cópias das moléculas de ARN recombinante transcrito. WO 96/40945 descreve vacinas de ácido nucleico para imunização contra o vírus sincicial respiratório. São descritas construções de vectores recombinantes para a expressão de proteínas virais. As construções poderão opcionalmente compreender, entre outros elementos, um intrão. 0 fascículo ensina a efectuar a inserção geral do intrão (por exemplo, o intrão II da β-globina de coelho) no vector, por exemplo, entre as sequências promotoras e as sequências que codificam a proteína virai.

Em WO 96/17072, são descritas construções de vectores de expressão de alfavírus recombinantes, que compreendem 3 ΕΡ 1 029 069 /PT opcionalmente, entre outros elementos, pelo menos um intrão. 0 fascículo descreve a inserção do(s) intrão (ões) no vector entre as regiões Sindbis (virai) e do gene heterólogo.

SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento refere-se a modificações dos vectores de ADNc de alfavírus descritos no pedido WO 95/27044 acima referido, para permitir uma maior replicação do alfavírus. No presente invento, é introduzido um local de excisão-reparação (splicing) heteróloga na sequência do replicão do alfavírus, particularmente aquele do vírus da floresta de Semliki (SFV).

Consequentemente, em um aspecto, o presente invento disponibiliza um vector de expressão compreendendo uma molécula de ADN complementar de, pelo menos, parte de um genoma de ARN de alfavírus, molécula de ADN esta que compreende o complementar das regiões completas do genoma de ARN de alfavírus que são essenciais para a replicação do referido ARN de alfavírus e que inclui adicionalmente uma sequência de ADN heterólogo capaz de expressão num hospedeiro adequado, como seja um hospedeiro humano ou animal, em que a referida sequência de ADN heterólogo é inserida numa região da molécula de ADN que é não essencial para a sua replicação, e a molécula de ADN é colocada sob controlo transcricional de uma sequência promotora funcional no referido hospedeiro humano ou animal, e em que é providenciado pelo menos um local de splicing heterólogo na molécula de ADN, para impedir o splicing aberrante do ARN do alfavírus. A molécula de alfavírus é uma molécula grande, pelo que existe uma probabilidade elevada de ocorrência de locais crípticos de splicing. Esta característica prejudica a replicação do alfavírus e, consequentemente, a sua capacidade para expressar o ADN heterólogo. Ao introduzir pelo menos aquele local óptimo de splicing heterólogo, de acordo com o presente invento, na sequência do replicão do alfavírus, é provável que qualquer splicing seja dirigido para o local de splicing heterólogo e não para quaisquer locais crípticos de splicing, restabeleça a função do replicão de SVF quando é removida e possa melhorar o transporte do ARN desde o núcleo (ref. 6). 4

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Nas construções aqui fornecidas, o promotor é colocado a montante da extremidade 5' da sequência do alfavirus, para que o transcrito resultante possua uma extremidade 5' autêntica, que é necessária para a replicação eficiente do replicão de ARN do alfavirus.

Adicionalmente, poderá ser disponibilizada, na extremidade 3' do segmento do vírus da floresta de Semliki, uma sequência da ribozima do vírus da hepatite delta, para garantir uma clivagem correcta in vivo ao nível da extremidade 3' da sequência. Qualquer outra sequência conveniente poderá ser empregue para obter este efeito. A sequência do local de splicing heterólogo poderá ser fornecida pela sequência nucleotídica do intrão II da β-globina de coelho, tal como descrito na referência 5. Esta sequência do local de splicing heterólogo poderá ser inserida na sequência do complementar, em qualquer local conveniente que gere junções de splicing perfeitas. Isto impossibilita a replicação do alfavirus, a não ser que este local seja verdadeiramente removido por splicing.

Foram identificados cinco locais adequados no replicão de SFV, que estão contidos em um fragmento EcoRV-Spel do replicão com 8010 pb de comprimento (Fig. 3) . O primeiro destes locais é um local Ppu-MI, na posição 2719 do fragmento EcoRV-Spel.

Ao construir os vectores modificados aqui fornecidos, o fragmento EcoRV-Spel é cortado com Ppu-MI na posição 2719 e as suas extremidades são transformadas em extremidades lisas com a nuclease de Mung Bean, que remove três bases da sequência de SFV. Um intrão II da β-globina possuindo extremidades lisas, com 536 pb de comprimento, é ligado no local e substitui as três bases em falta com sequência adicionada na extremidade 3' da sequência intrónica da β-globina (Fig. 1).

Os outros quatro locais adequados para inserção do intrão são os locais PvuII ao nível dos pb 2518, 3113, 6498 e 6872 do fragmento EcoRV-Spel. A inserção do intrão é obtida por clivagem com PvuII (uma enzima que cria extremidades lisas), e a sequência do intrão II da β-globina possuindo extremidades lisas (Fig. 2) é ligada em um ou mais destes locais. 5

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Em um aspecto adicional do presente invento, é disponibilizado um vector de clonagem adequado para expressão de uma sequência de ADN heterólogo numa célula hospedeira, que compreende uma molécula de ADN complementar de pelo menos parte de um genoma de ARN de alfavirus, molécula de ADN esta que inclui o complementar das regiões completas do genoma de ARN de alfavirus e possui um local de clonagem para inserção de uma sequência de ADN heterólogo capaz de expressão numa célula hospedeira, em que o referido local de clonagem está localizado numa região da molécula de ADN que é não essencial para a sua replicação; uma sequência promotora funcional na referida célula hospedeira e que controla transcricionalmente a referida molécula de ADN, em que a referida sequência promotora é colocada a montante da extremidade 5' da molécula de ADN para que o transcrito resultante possua uma extremidade 5' autêntica; pelo menos um local de splicing heterólogo, providenciado no complementar da molécula de ADN, para gerar junções de splicing perfeitas no alfavirus, de forma a impedir um splicing aberrante; e uma sequência de ADN adicional, na extremidade 3' da molécula de ADN, para dirigir uma clivagem correcta in vivo ao nivel da extremidade 3' do transcrito de ARNm reagente.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 ilustra a sequência de ADN do intrão II da β-globina, incluindo os três nucleótidos adicionais na sua extremidade 3' (SEQ ID No:l); A Figura 2 representa a sequência de ADN do intrão II da β-globina (SEQ ID No:2);

As Figuras 3A a 3C mostram a sequência de ADN do fragmento EcoRV-Spel do replicão do vírus da floresta de

Semliki (SEQ ID No:3);

As Figuras 4A a 4D ilustram a sequência de ADN do plasmídeo pSFVlink (SEQ ID No:4), preparado da forma ilustrada na Figura 5; 6

ΕΡ 1 029 069 /PT A Figura 5 representa a construção de pSFVlink (11060 pb) a partir de pSFVl, utilizando uma sequência adaptadora (SEQ ID Nos: 5, 6);

As Figuras 6A a 6D mostram a sequência nucleotídica do plasmídeo pMP76 (SEQ ID no: 11), preparado da forma ilustrada nas Figuras 8A a 8D; A Figura 7 ilustra subsecções do plasmídeo pSFVlink (ver Figura 5);

As Figuras 8A a 8D ilustram a construção do plasmídeo pMP76 a partir dos plasmídeos pMP53, pMP70, pMP47, pMP55 e pMP 71;

As Figuras 9A a 9B representam a construção dos plasmídeos pMP53, pMP54 e pMP55 a partir do plasmídeo pMP52; A Figura 10 mostra a construção do plasmídeo MP52 a partir de pUC19, utilizando uma sequência adaptadora (SEQ ID No:7, 8);

As Figuras 11A a 11B ilustram a construção dos plasmídeos pMP46, pMP47 e pMP70 a partir de pUC19 e de um fragmento de pSFVlink, preparados como apresentado na Figura 7; e

As Figuras 12A a 12B representam a construção do plasmídeo pMP71 a partir do plasmídeo pCMV3.

DESCRIÇÃO GERAL DO INVENTO

Tal como discutido acima, o presente invento disponibiliza um ADN de alfavírus modificado. O alfavírus é preferencialmente o vírus da floresta de Semliki. Em particular, o presente invento fornece um vector de clonagem para a expressão de genes heterólogos num hospedeiro, como seja um animal ou um ser humano. A sequência promotora poderá compreender um promotor de origem eucariótica ou procariótica. Os promotores adequados consistem no promotor precoce imediato de citomegalovírus (pCMV), embora outros promotores, como o promotor da repetição 7

ΕΡ 1 029 069 /PT terminal longa do vírus do sarcoma de Rous (pRSV) , dado que, no caso destes e de promotores similares, a transcrição é efectuada pela ARN-polimerase dependente de ADN da célula hospedeira. Adicionalmente, é possível utilizar os promotores SP6, T3 ou T 7, desde que a célula tenha sido primeiro transformada com genes codificando as moléculas de ARN-polimerase de SP6, T3 ou T7, os quais são inseridos no cromossoma ou permanecem epissómicos. A expressão destes genes que codificam ARN-polimerases (SP6, T3, T7) está dependente da ARN-polimerase dependente de ADN da célula hospedeira. A inserção de ADN heterólogo poderá compreender a sequência codificante de um produto desejado, que poderá ser, por exemplo, uma proteína ou polipéptido biologicamente activo; a inserção de ADN heterólogo poderá codificar sequências do VIH, por exemplo, uma proteína ou polipéptido imunogénico ou antigénico; ou uma proteína ou polipéptido terapeuticamente activo. O ADN heterólogo também poderá compreender sequências adicionais, como seja uma sequência complementar de uma sequência de ARN que é uma sequência de uma ribozima que sofre autoclivagem.

Os vectores de ADN aqui disponibilizados poderão ser administrados a um hospedeiro, incluindo um hospedeiro humano, para a expressão in vivo da sequência de ADN heterólogo, de acordo com um aspecto adicional do invento, de forma a gerar uma resposta imune no hospedeiro que poderá ser uma resposta imune protectora. Os vectores de ADN poderão ser adicionalmente formulados em composições imunogénicas para uma administração deste tipo.

DEPÓSITOS BIOLÓGICOS

Determinados vectores que contêm o replicão do vírus da floresta de Semliki e que são aqui referidos foram depositados junto da American Type Culture Collection (ATCC), localizada em University Boulevard n.° 10801, Manassas, VA 20110-2209, E.U.A., em conformidade com o Tratado de

Budapeste e antes da apresentação deste pedido.

As amostras dos plasmídeos depositados ficarão disponíveis ao público aquando da concessão de uma patente 8 ΕΡ 1 029 069 /PT baseada neste pedido de patente U.S., e todas as restrições de acesso aos depósitos serão levantadas nessa altura. Os depósitos não viáveis serão substituídos. O âmbito do invento aqui descrito e reivindicado não será limitado pelos plasmídeos depositados, uma vez que a concretização depositada pretende apenas ser uma ilustração do invento.

Resumo do depósito

Plasmídeo Designação ATCC Data do depósito pMP76 203462 12 Novembro 1998

EXEMPLOS A descrição acima descreve, de uma forma geral, o presente invento. Uma compreensão mais completa pode ser obtida por referência aos Exemplos específicos que se seguem. Estes Exemplos são descritos apenas com fins ilustrativos e não se destinam a limitar o âmbito do invento. As alterações de forma e a substituição de equivalentes estão contempladas à medida que as circunstâncias o sugiram ou tornem conveniente. Embora tenham sido aqui utilizados termos específicos, estes termos são empregues com um sentido descritivo, não tendo o intuito de limitação.

Os métodos de genética molecular, bioquímica de proteínas e imunologia utilizados, mas não explicitamente descritos nesta descrição, bem como estes Exemplos estão amplamente referidos na literatura científica e encontram-se perfeitamente dentro da perícia dos peritos na arte. EXEMPLO 1

Este Exemplo descreve a construção do plasmídeo pMP76, tal como delineado nas Figuras 5, 7, 8A, 8B, 8C, 8D, 9A, 9B, 10, 11A, 11B, 12A e 12B. O plasmídeo pSFVlink foi criado por restrição do plasmídeo pSFVl (Gibco) com BamHI. Este plasmídeo foi depois ligado a um adaptador (SEQ ID No: 5 e 6) para produzir o plasmídeo pSFVlink (Figuras 4A a 4D, Figura 5). 9

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Alguns dos fragmentos do replicão de SFV foram subclonados através da restrição de pSFVlink com EcoRV e Spel e isolamento do fragmento EcoRV-Spel de 890 pb. Este fragmento foi depois digerido com EcoRI, e os fragmentos EcoRV-EcoRI de 1906 pb, EcoRI-EcoRI de 1578 pb e 3627 pb e EcoRI-Spel de 899 pb foram isolados (Fig. 7). O fragmento EcoRV-EcoRI de 1909 pb de SFV foi clonado no plasmideo pMP52 digerido com EcoRV-EcoRI, para produzir o plasmideo pMP53 (Fig. 9A). O fragmento EcoRI-Spel de 899 pb de SFV foi clonado em pMP52 digerido com EcoRI-Spel, para produzir pMP54 (Fig. 9A). O plasmideo pMP54 foi depois sujeito a restrição com Spel, e as suas extremidades transformadas em extremidades lisas com nuclease de Mung Bean. O plasmideo foi, em seguida, sujeito a restrição com BglII, desfosforilado e ligado à seguência adaptadora da ribozima do vírus da hepatite delta (SEQ ID Nos: 9 e 10), gue havia sido fosforilada, para produzir pMP55 (Fig. 9B). O plasmideo pMP52 foi criado por ligação de um adaptador (SEQ ID Nos: 7, 8) no local EcoRI de pUC19 (Fig. 10). O fragmento EcoRI-SFV de 1578 pb foi clonado no local EcoRI de pUC19, para produzir pMP46 (Fig. 11A). Este plasmideo foi depois sujeito a restrição com PPuMI, e as suas extremidades foram transformadas em extremidades lisas com nuclease de Mung Bean. As extremidades do fragmento de PCR do intrão II da β-globina de coelho (Fig. 1) foram transformadas em extremidades lisas com nuclease de Mung Bean, fosforiladas e ligadas ao plasmideo pMP46 digerido com PpuMI, para produzir o plasmideo pMP70 (Fig. 11B). O fragmento EcoRI de 3627 pb de SFV foi clonado no local EcoRI de pUC19, para produzir pMP47 (Fig. 11A). O plasmideo pCMV3, que contém o promotor CMV, a sequência do intrão A, a sequência poli(A) de BGH e a sequência poli(A) de SV40, foi submetido a restrição com Ndel e EcoRV. O fragmento Ndel-EcoRV de 3191 pb foi isolado e desfosforilado. O fragmento Ndel-EcoRV de 1321 pb foi isolado e submetido a restrição com Saci. O fragmento Ndel-SacI de 334 pb foi isolado (Fig. 12A) . O fragmento de PCR SacI-EcoRV isolado, que 10 ΕΡ 1 029 069 /PT contém a extremidade 5' de SFV, foi ligado ao fragmento Ndel-SacI de 334 pb e ao fragmento Ndel-EcoRV de 3191 pb previamente isolados, para produzir pMP71 (Fig. 12A e 12B). O plasmideo pMP53 foi, em seguida, submetido a restrição com EcoRI e BamHI e ligado ao fragmento EcoRI de 2151 pb, isolado e desfosforilado, proveniente de pMP70 (Fig. 8A). Esta ligação foi depois sujeita a restrição com EcoRV, e o fragmento EcoRV-EcoRI de 4057 pb foi purificado (Fig. 8A). O plasmideo pMP47 foi submetido a restrição com EcoRI, e o fragmento EcoRI de 3627 pb foi isolado e desfosforilado (Fig. 8B). O plasmideo pMP55 foi, em seguida, sujeito a restrição com BglII, desfosforilado e submetido a restrição com EcoRI. O fragmento EcoRI-BglII de 985 pb foi isolado e ligado ao fragmento EcoRI, previamente isolado, proveniente de pMP47 (Fig. 8B) . A reacção de ligação foi depois fosforilada, e o fragmento EcoRI-BglII de 4612 pb foi isolado. O plasmideo pMP71 foi sujeito a restrição com EcoRV e BamHI e depois foi desfosforilado. Este fragmento foi utilizado numa reacção de ligação de 3 elementos, juntamente com o fragmento EcoRI-BglII de 4612 pb, previamente isolado, proveniente de pMP47 e pMP55, e o fragmento EcoRV-EcoRI de 4057 pb proveniente de pMP53 e pMP70, para produzir pMP76 (Fig. 8B e 8C). A extremidade 5' do replicão de SFV foi produzida através da amplificação de pSFVl por PCR, utilizando os iniciadores SFV-5'-3 de sequência 5' -ATCTATGAGCTCGrrrAGTGAACCGTATGGCGGATGTGTGACATACA-3 e EcoR-SPE de sequência 5'-TCCACCTCCAAGGATATCCAAGATGAGTGTG-3' (SEQ ID No: 9 e SEQ ID No: 10, respectivamente) entre o promotor CMV e a extremidade 5' do replicão de SFV. O fragmento de PCR resultante foi sujeito a restrição com Saci e EcoRV (Fig 13; SEQ ID No: 11), e o fragmento foi isolado. 11

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SUMARIO DA DESCRIÇÃO

Em resumo, o presente invento disponibiliza um vector de expressão baseado em alfavírus modificados, em que pelo menos um local óptimo de splicing é introduzido no replicão do alfavírus, para impedir o splicing aberrante do genoma do alfavírus e melhorar o transporte do ARN para fora do núcleo.

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Mark Parrington, Connaugnt Laboratories Limited et ai, Mark <120> VECTORES ALFAVÍRUS <130> 862 <140> PCT/CA98/01065 <141> 1998-11-13 <160> 12 <170> Patentln ver. 2.0 <210> 1 <211> 576 <212> ADN <213> Vírus da Floresta de Semliki <220> <400> 1 qtqagtrtgg ggaqggggca ggaccctcat crcactttcc atccccaaai; títcaaqgca ataattaaat cctactggca tgatatacac aaocacgttc qqaeccttga aagctttcag gataattrtg tctcattttc tcactctcgt atcagggtat gataaggtag gaaacaaeta cgccrgagat atgcctcccc ttgcccctcc ggt gttgttt cccccttcac tgcaactcrt ccatcrgcca attataccqi aatatttctg catcctggtc gaggataaaa cttcttccta tttttcgctaagaatgggaa tttctaetet tcgttaaact gattgtaagt acctcagcac catacaaatt atcatcctgc taçtctgagt caggtc ctgtaaaatt gatgtccctt gtcgacaacc ttagcttgca actttctcta agttttagag ctggctggcg ctttctcttt ccaaaccgqg ca^gttacar gtatcaccat attgtotcçt ttrqtaacga atcacttttt aacaattgtt tggaaatatt atggttacaa cccctctget 60 120 180 240 300 360 420 480 540 576 <210> 2 <211> 573 <212> ADN <213> Vírus da Floresta de SemiiKi <220> <400> 2 grgagtttgg ggaçccttga ttgctctçtc tttttcgcta ctgtaaaatn: catgttatat 60 ggagggggca aágttttcag ggcgtcgttt agaacgggaa gargtccctt gtatcaccat 120 ggaccctcat gacaatcctg cccctttcao tttctactct gtrgacaacc attgtccccc ;80 cttattttct ccccattctc Lgtaactctt tcgttaaact ttagcttqça cccgcaacga 240 atttttaast tcactctcgt ttatrtqtca gattgtaagt acttccTcta atcactcttc 300 13

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ΕΡ 1 029 069 /PT agcggeaaga aggagaactg ccaggaaata gttaacgacg tgaagaagca ccgcgggaag 2100 gggacaagca gggaaaacag tgactccatc ctgctaaacg ggcgcegtcg cgcçgcggac 2160 atcctatatg tggacgaggc cctcgcttgc catcccggta ctctgctggc ectaaccgct 2220 cttgtcaaac ctcggagcaa agcggcgcta tgcggagacc ccaagcaatg cggacccttc 2280 aatatgacgc agcttaaggt gaacctcaac cacaacatct gcactgaagt acgtcacaaa 2340 agcatatcca gacgttgcac gcgtccagcc acggccaccg tgtetacgrt gcactacgga 2400 ggcaagacgc gçacgaccaa cccgcgcaac aaacccataa tcatagacac cacaggacag 2460 QV_s_qovjv,\~wc* cagttggact aaaggggtat gagcacgtga ggcgatcccc gaagaacggo gcggacgcgc gacactgccg gaggacagag gtcgacccgg caccgggaca ctggaagcra gcagaaagaa ctgccgcacg gtcaacaaag cgacgcaggg ccaagcccag acggaattca ctcgggggag cacgccgaca agagcgccgc ctcgacaacg tacgccggag gacatagcca ggggacggcg acaccsgcgg gcgcccaacc çgggcagcgg cccacaggag acagcaatgg aagaaaaccc gagctgacca cacagtaeca gçtaccgara acatgcccat gacuccgact gcagaacgga cccccccccç ccgcccgacc gaccaçccag actgccagcg

a rr/-4/-anna/rS —~ “ accgrggaca acgccgcaag atgtaccgcr ggatcaaggt aagaagaaca cccagaacaa gaaccagatt eccacccccc acagcggccr acagaçctgg gacacaccrc saacccaacc ccctggtggc caagagggta coactcggcc gactgccggc gaatccacca acgcgccacg aaaccagcga gcccggaccg gaaagagacc aagccatgca cgrgcacaga cacgcagggc gcaeaactaa cctctgceac ccgccgaagc cgctcagcgg acgccacgga aggaagccac eagacttggt ctgacgggrc cggcagagac acgcgctggg caccaacacc ccgcccgcoc cgaaacãcca cgaeggcacc accggccgcc aCaccatgCC Λ3ΤΛΛΓΛΤrΛ ~ -j «--a — cgaagccatg gcagaaggcg gacgcgcacr cctatcaaac cgacaaaata agcgaacgcg gacagcagag agcggtggcc gccccccgcc tggaaggaCg cccgaagggg gcctcccgcg cgagtacaaq ccacgrccrg gccaccgccg cgacgccggc ccaccagçag actgctaaaa agccgctgtt cgccaccagc ctetacgcca cacggcCggg agcggctgcg cgcggcgaag aacagccacg gaçcgaageg aaacagaccg cqgaagagac cgctgacgcg cgacacgagg gagagcgcac gctgcacccg accgacgctg cgaaacaacg tcctaggaca taggteacac cgcagatggg cccagcggcc acgagggttC gccacccagt acagcagcag catercaggg cctcacocgc 2580 aacgaaaatc ccttgtatgc ccccgcgccg 2640 gaggacaggc tggtgcggaa aacgccggcc 2700 atrccacagg gtaactttac ggccacattg 2760 acgaaggtga ttgaaggace ggccgcgccr 2820 tgcrgggcga aaagçccggc gcccgccccg 2880 gagcggagca ccaraacrac agcacccaag 2940 ccgaatgaaa ccrgcaccaa gcaccacgga 3000 ccgaaggcgc ccctgtqtta cgagaacaac 3060 tatggatcca acgccgcaac agccgccagg 3120 cagcggcaca cgggcaagca ggcagtcacc 3180 ccggacaatg caacccctac caaccgcagg 3240 acggtcaaag gcagcagggc cgagcggccg 3300 ccggcgagcg agcacaaccc ggccccgccc 3360 aacgccacag gcgccgacag gcgccacgac 3420 aggcccgacc cggcctccgc gaacacccac 3480 cgtgccqacc acgceatgaa gctgcagatg 3540 cçcggcggca tcccgacgag agcccacgga 3600 ccccccccaa gcagaaaqtc ctcgcccgca 3660 aacacagaag cgccctcgcc gttetccaac 3720 caccagacga ataccaagcc gagcgccgtg 3780 çgcgcaccqt cctacagagt taagagagca 3840 grcaacgcag ccaacgcccg cggaaccgta 3900 aaacggccgc cagcccctaa qggagcagea 3960 cgcggcccgc accccgccat ccacgctgta 4020 gaaggggacc gcgaattggc cgccgcccac 4080 ccactgagca gcgtagccat cccgccgccg 4140 aggccgcagc aaccccccaa ccacccaccc 4200 accacccacc gcagagacaa aagccgggag 4260 acggccgcgg agccgcccaa cgacgaegcg 4320 ccggacagca gcccggcggg tcgcaagggc 4380 cactccgaag gcacgaaacc caaccaggct 4440 cggcccagac cgcaagaggc aaacgaacag 4600 gacaacâtea gacccaaacg tccggtgaac 4560 gcgccccgcc cgcgccgcca cgcaacgaca 4S20 caagccaaaa gcacggcggc ctgcccaccc 4680 gcgcagaagg caaagcgcga gaaggccccc 4740 agcccgcgga agcatgccgc arccacgacg 4800 gacccggacc ggaccaccga cccgcccccc 4860 tcgcagtcgc gcgacaccga cccgatcrac 4920

15 ΕΡ 1 029 069 /PT gagccaatgg gacctggcgg cctccaccgc ecggcgocga acgtccggcg gaccccgacg ggcagcggac gãLgcggtcc ctcccatagt cagargtgca qcccgaagag gaaagccgac actttgacga acgtcctgcg atttacaaca«ggaggagaa agtgacggct coctgaaccc agctgcatac gcçtgcccca goacgaggtc actaggccgc aaaacccgtt gacgtacace gcagacc atg cççgcctccc aggactgcgt gatgcgctgg gcgqgtg cat aggcagcaca crgaaecegc tggacctcga gcgcggcgga ttaggaacaa cctccgggat atattttccc atctccagcg aggcatcgcg gaacccgatt gcgaccggcg gccgcctttg taetttcgga ctcggacacc cgcacaactg ggggaagccg 4980 50-)0 5100 5160 5220 5280 5340 rcgctgctga aaagcggaga acgggagcgg tcccctaccg tacctatcca tacctggaca aagctccggt ccgtcacecr naçgucacgc aaatgcagat acatgaaagc acgtaggccg tgaccgaaag gaaattaccc tggttgaogg gctacccgaa ttcagaacac aaatgcgaga gcacccaccg gaggctaata agagtcgata ccagtctcgc 5«60 cacggtggtg qacaggctca oatcgggggc cagactgtac 5520 cacaccaaca taçgeggttc çjgtacccccg ccccgtgtac 55B0 attctcaagc cccgatgtag caatcgcagc grgcaacgaa 5640 aacagtggcg tcgtaccaga taacagatga atacgacgca 5700 gtcggacagt tgcttggaca gagcgacaít ctgcccggcg 5760 acatçatgcg taccaccagc cgactgtacg cagtgccgtc 5820 actacagaac gtgetagcgg ccgcçaccaa gagaaactgc 5880 actacccacc atggactegg cagtgttcaa cgtggagtgc 59-10 ctcaagcgct acaaccactg tcgtccgcca gtcgacatga aaagcccagg agggaattag acgccggccg ctagagacgg ctaatgatcc -ccggggaaa atgaaazcgg agcagggr ac aacaccgttc aacatggagg ggarccacag cgcccgctca cgagcactga gtggoactaa accttqgcga ggcggrccta caqqarccag CCqqçggogc çgtcgcccoc qaçaacgaga aaccaaaçca gaagaaagac cacgaagatt cagacatgtc tcgcaarcgg ttagggtagg gcaacggcau atgcccgctc agaacaicac agacccacaa aacgagatgt taattcaagc caaggagact aagaccctga acattgcacc tcgaagacct tarccagctg gcatgcc^ct; cggagcagaq acggagcgat tgaagapcat tttcrqacaq aqttgggtaa gcqaogaggt catcraggta gggacattaa qatcggcgcg accccgggta ccgcgcccgg gacrtccagq cagaacgcaa aagccgaaaa aagcaagccq gaaaatgaet gggcaccgca cgctaccctg caacggcact ataaçcataa cggagaatat tgggaagaat atgctaaaca accratccgg 6000 taçgtatgtg accaaattga aeggcccgaa agctgctgcc 6060 cttggttccg ctgcaggagg ctcccatgga çagâctcacg 6120 caaagtcact ccagggacga aacacacaqa ggaaagaccc 6180 agcggagcca ttggcgaccg attacctgtg cggeatccac 6240 aaargctqtg ttacgcecra acgtgcacac attgtttgac 6300 çgcgatcatc gcccctcact tccacccagg agaçoçggct 6360 attcgacaaa agccaggacg actccttggc tcctacaggt 6420 aggggtggaç cagtacctgc tgqacttgat cgaggcagec 6480 tcacctacca actggcacgc gcttcaagtt cggagctatg 6540 gacttrgtcc a^taacactg ttttgaacac caccatagca 6600 actcactgac tccgcccgtq cggccttcgt cggcgacgac 6660 ctccgacaag ctgatggcqg agaggtgcgc gtcgtgggtc 6720 tqacgctgtç acgggcgaaa aacccccata tttttgtggg 6780 cgtcacacag accgcctgcc gcgttceaga cccacttaag 6840 gccgctaaca gccgaagaca agcaggacga agacagqcga 6900 tagcaagtgg tcccggacag gcttgggggc cgaactggag 6960 tgaggtaqag ggctgcaaaa gcaccctcac agocatggcc 7020 ggcgtttaag aaatcgagag gacctgctac acacccctac 7080 ttaatacaca gaattccgac cggatcatag cgcactatca 7140 attaattgaa te^catccct acqcaaacgt ttçacggccg 7200 cggcecgrce tcggccgtcg caggccacx.c cggcggctcc 7260 cccagcagac gcagcaactc atcagcgccg taaacgcgct 7320 ctgcEccngc taggcccccc aaaccaaaga agaagaagac 7380 cgcagcccaa gaagatcaac ggaaaaacgc agcagoaaaa 7440 acaagaagaa gaagaaaccc ggaaaaagag aaagaatqtg 7500 gtacc^tcgt. atgcggccag ccacagt.aac gtagtgtttc 7560 ctatcacggg tgcagaaaat ctcgggcggt ctgggggcot 7620 gtgctggtcg cggtcacttg cattgggctc cgcagataag 7680 gatatagcaa gaaaafcgaa aacagaaaaa qtcagggtaa 7740 ctgtataaet rgcaacaaag cgcaacaaga cccgcgçaat 7800

16 ΕΡ 1 029 069 /PT tggccçcgtq gtncgectca cggaaacteg ataattggaa geccacacaa gcttaattcg aattggtttt taatatttcc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gggcaactca tattgacaça ttaattggca 7860 acgaataatt ggacttctac cccattttgc 7920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 7980 8010

<210> 4 <211> 11060 <212> ADN <213> Vírus da Floresta de Semliki <220> <400> 4 gatggcggat gtgcgaoata cacgacgcca gctacgcgag agactaacca cccacgatgg acagcccacx catcaagtcc trgcaqaagg aggccacacc aaotgnccat gcaaatgçca tcgagcagga gaccgacaaa gacacactca gaatgatgte tacgcacaaa caccactgeg aaaggctcga tagctacgca aagaaactgg agatcgcagg aaaaarcacc gacccgcaga ccacctttrg cctgcataca gacgtcacat aggacgtgta rgctgtacat gcaccaaçat qaacggcgta crggattggg ttrgacacca cgcacccaac cracgccaca aaccgggccg gaccgtgcgc agcatccttg actgagggaa agcaattgaa accttgcgac acagtcatgt geagaaagct accgaggagc eggcactçac cctccacccg taggtgegac accatcgtac cracgtgccc cggcotgcac ggcaaaacgg gacccccagt gcgcaagacc acagacaccg gçacctacgi: çccctcaacc atctgtgatc caccggagga ogcacagaag ctgtcagtgg gaacacagcg aaacaotaac acgacgaaga itagcaagtg ggcgaggqaa tacaaggcag gagagaggcc acttacttgc tgctgcttgt tgtacaagaa accagacacc cagacaatag tcatcccgag ectatggrcr acaggceteg trctggçcaa gaaqaccaág egaqagttaa atqecgaaca agaggagaag gagaggctgg ccctcgtccc carcgcgccg gcggagacgg agtatcaqgc aggcgcaggg gccgtggaaa agccgaaega cgtactacca ggaaactacg gctccaagtc ggccccogtg caccctctag ggagggccgg cggttaccag gccgacggat cggccacrcc ggtccctgaq ccccaagcct dâagggagcc cgtcaacagg aaactatacc ccgacgaqga gaactacgag aaagtcagâg aaagatccrg ttccagctce tgccacc^cc 60 ccgccaaagc gcatgrtgat atcgaggccg 120 cauctccgtc gttcgaqgtg gagtcattgc 180 gagcatrçtc gcacctggec accaaaccga 240 tcttggacat cggeagtgcg ccrxccagga 300 targccctat gcgcagcgca gaagaccccg 360 cagcggcetc cgggaaggcg ccggatagag 420 ccgtcatggc tacgccagqc gctgaacccc 480 gtcgtaeggc agccgaagcg gççgtatacc 540 cgccgtacca tcaggcgacg aaaggtgtca 600 ccccgrctat gtttgacgcg etagcaggcg 660 acgagcaggc gccacaggcc aggaacatag 720 gactcggeaa actgtccatt ctccgoaaga 780 tcccgg-cagg atctacattg cacactgaga 84Q cctccgtatc ccacotgaaa ggraaacaat 900 cacgtgaagg gcacgtagtt aagaaaatca 960 tagggtaogc cgtgacgtat cacgcggagg 1020 tcaaaggaga aaqaqtctca ttccctgcat 1080 aaatgactgg c-ataotagcg accgacgtca 1140 gaccgaatca gaggacagct gtgaaçggaa 1200 accacctgct tcogattgcg gccgrcgcat 1260 accttgatga rgaaaaacct ctgggcgtcc 1320 gggcatctaa aacgaggaag acgcaeacca 1380 tgaaggtgcc ttcagagttt aactcgtrcg 1440 caaccccagt cagatcacgc attaagatge 1500 tacctgttct cgacgcgtcg tcagccaggg 1560 aggccgagct aaccagagaa gccctaccac 1620 gagtcgtcga cgçcgacgtc gaagâactag 1680 cacctcgcag cgcgtcgaaa gtcaccgcac 1“M0 ragttctgtc cccgcagacc gtgctcaaga 1800 cagagcaggt gaaaacaaca acacataacg 1860 atgacggcag ggtcccacta ccatgtggac 1920 cgaqcgaqag cgccactatg gcgtacaacg 1980 araçcgccgt tcacggaccg rcgctgaaca 2040 ccgaaagaac tgacgccgag tacgtgttcg 2100 17

ΕΡ 1 029 069 /PT acgcagataa aaaatgctgc gtcaagagag aggaagcgte gggtitggtg ttggtgggag 2160 agctaaceaa ecccccgttc catgaattcg cccacgaagg gctgaagatc aggccgtcgg 2220 caecacataa gaccacagta gtaggagtct ttggggttcc gggatcaggc aagtctgeta 2280 tcattaagag cctcgcgacc aaacacgacc tggccaccag cggcaaggag gagaactgcc 2340 agggaatagt taacgacgtg aagaagcacc gcgggaaggg gacaagtagg gaaaacagcg 2400 actccatecc gctaaacggg tgtcgtcgtg ccgcggacac cccatacgtg gacgaggctc 2460 tcgcttgcca ctccggtacc ccgctggccc taactgccct tgccaaacct cggagcaaag 2520 tggcgctarg cggagacçcc aagcaatgcg gattctrcaa tacgatgcag cctaaggtga 2580 actccaacca caaeatctgc actgaagtat gtcataaaag catatccaga cgttgeacgc 2640 gtccagtcac ggccategcg cctacgttgc actacggagg caagacgcgc acgaccaacc 2700 cgçgcaacaa acccataacc atagacacca caggacagac caagcccaag ccaggagaca 2760 ccgtgttaac atgcttccga ggctgggcaa agcagccgca gtcggactae egtggacacq 2820 aagtcatgac agcagcagca tctcagqgçc tcaccegcaa aggggtatae gccgeaagge 2880 agaaggtgaa tgaaaacccc ttgtatgccc ctqcgtcgga gcacgtgaac gtaccgctga 2940 cgcgcactqa ggataggccg gtgtggaaaa cgctggccgg cgarccocgg attaaggtcc 3000 caccaaacac iccacagggt aactttacgg ccacaccgga agaatggcaa gaagaacacg 3060 acaaaaraat gaaggtgatt gaaggae-cgg ctgcgcccgt ggaogcgrtc cagaacaaag 3120 cgaaegtgtg ttgggcgaaa agcotggrgc ccgtcctrgga cactgccgga atcagattga 3180 cagcagagga grggagcacc ataaccacag catttaagga ggacagagcc tactccccag 3240 tggcggcctt gaatgaaatt; tgcaccaagc actatggagt tgacctggac agtggcctgt 3300 tttergceec gaaggtgtcc ccgtatcacg agaacaacca ctgggataae agacctggrg 3360 gaaggacgra tggattcaat gccgcaacag ctgceaggci: ggaagctaga cacacectcc 3420 tgaagggqca gcggcatacg ggcaagcagg cagttarcgc agaaagaaaa acccaaccgc 3480 ttrccgtgot ggacaatgta actcctatca accgcagget gccgcacgcc ccqgcgqctg 3540 agtacaagac ggttaaaggc agtagggttg agtggc-cggt caacaaagta agagggtacc 3600 acgtcctgct ggtgagtgag taeaacctgg ctttgcetcg acgcagggtç acçtggttgt 3660 cacegccgaa tgçeacaggc gccgataggr gccacgaccc aagtttagga ctgccggctg 3720 acgccggcag gttcgacttg gccttxgtga acattcacac ggaattcaga atccaceact 3780 accagcagtg tgtcgaccac gccatgaagc rgcagatgct tgggggagac gcgccacgac 3840 tgctaaaacc cggcggcatc ttgatgagag ctcacggata cgccgataaa atcagcgaag 3900 ccgrrgtttc ctccttaago agaaagxtct cgcccgcaag agtgttgcge ccggactgtg 3960 ccaccagcaa tacagaagtg cccctgctgt tctccaactc tgacaacgga aagagacccr 4020 ccacgctaea ccagatgaat accaagctga gtgccgtgta cgccggagaa gçrcatgcaca 4080 cggccgggtg rgcaccatcc tacagaqtta agagageaga cacagccacg cgcacagaag 4140 cggctgtggt taacgcagçi: aacgcctgcg gaactqtagg ggacggcgta tgcagggçcg 4200 cggcgaagaa atggccgtca gcccttaagg gagcagoaac acçagtgggc acaattaaaà 4260 cagtcatgtg cggcccgtac cccgtcatcç acgecgtagc gcctaaccçc tctgccacga 4320 ctgaagcgga aggggaccgc gaactggccg c^gtccaccg ggcagcggcc gcegaagtaa 4380 acagacrgcc actgagcagc gcagccaccc cgccgccgrc cacaggagtg cccagcggcg 4440 gaagagatag gctgcagcaa cccçtcaacc atczattcac agcaatggac gccacggacg 4500 ccgaegtgac catccactgc agagacaaaa gttgggagaa gaaaatccag gaagccattg 4560 acacgaggac ggctgtggag ttgctcaatg acgacgcgga gccgaccaca gacccggcga 4620 gagtgcaccc ggacagcagc ccggcgggtc gtaagggcta cagtaccact gacgggtcgc 4680 tgtacccgta ctccgaaggt acgaaancca accaggctgc cactgatatg gçagagatac 4740 rgacgctgtg gcccagactg caagaggcaa acgaacagat argcctatac gcgocgggcg 4800 aaacaatqga caacatcaga tccaaacg^c oggtgaacga tcccgattca tcaacacctc 4060 ocaggacagt gcccngcctg cgccgotacg caatgacagc agaacggai:c gccogcccca 4920 ggtcacacca agtcaaaagc atggtggtct gotcatctct tcccctcccg aaataccacg 4930 18

ΕΡ 1 029 069 /PT tagatggqgc geaqaaggta aagtgcgaga aggttcteet gttcgacccg aeggtacctc 5040 cagtggtcag cccgcggaag tatgcegcat ctacgacgga ccactcagac cggtcgtcao 5100 qagggttcga ctcggactgg accaccgact cgtcctccac rgccagcgac accacgtcgc 5150 tacccagttt gcagtçgtgt gaoatcqact cgatctacga gccaatggct cccatagtag 5220 tgacggctga cgtacaceçt gaacccgcag gcatcgcgga cctggcggca gatgtgcacc 5280 etgaacccgc agaccgcgtg gacctcgaga acccgattçc tccgccgcgc eegaagagag 5340 ctgcatacct tgcctcccgc gcggcggagc gaccggtgcc ggcgccgaga aagccgacgc 5400 ccgccceaag gaccgcgctt aggaacaagc cgcctctgac gttcggcgae cttgacgggc 5460 acgaggtcga tgcgttggcc tccgggatta ctttcggaga cttcgacgac gtcctgcgac 5520 caggccgcgc gggtgcatat attttcrcct cggacactgg cagcggaoat ttacaacaaa 5580 aacccgttag gcagcacaat ccccagtgcg cacaactqga çgeggtccag gaggagaaaa 5640 tgtacecgcc aaaactggat actgagaggg agaagctgtt gctgctgaaa atgcagatge 5700 acccatcgga ggctaacaag agtcgatacc agtctcgcaa agtggagaac acgaaagcca 5760 cggrggtgga caggcteaca tcgggggcca gattgtacac gggagcggac gtaggccgca 5820 taccaacata cgcggttcgg cacccccgcc ccgtgcacec ccctaccgtg accgaaagai: 5880 tctcaagcec cgatgtagca atcgcagcgt gcaaçgaata cctatccaga aatcacceaa 5940 cagtggcgçc gcaccogata ocogatgaat cicgscgçata ortggacatg gttgacgggt 6000 cgggtagctg ctcggacsga gcgaoattct gcccggcgaa gctccgqtgc cacccgaaac 6060 atcatgegta caaceagccg accgcacgca gtgcogtcec gtcacccrtt cagaacacac 6120 tacagaacgt gctagcggco gccaccaaga gaaactgcaa cgccacgcaa atgcgagaac 6180 tacccacoat ggactcggca gtgtccaacg tggagzgcrc caagcgctat gcctgctccg 6240 gagaacattg ggaagaatac gcraaacaac ccatccggat aaccacrgag aacatcacca 6300 cctatgtgac caaatcgaaa ggcccgaaag ccgçcgcctc gtccgccaag aeccaeaact 6360 tgqttccgcc gcaggaggrt cccarggaca gattcacggt cgacatgaaa cqagatgtca 6420 aagrcactcc agggacgaaa cacacagagg aaagacccaa agcccaggta atvcaagcag 6480 cqgagccarc ggcgaccgcc tacctgtgcg gcacccacag ggaaetagta aggagactaa 6540 acgotgtgtc acgccctaac gcgcacacac tgtccgatat gtcggccgaa gactttgacg 6600 cgaccatcgc ctctcacttc cacccaggag acccggttct agagacggac attgeatcat 6660 ccgacaaaag ccaggaegac tcctrggccc tracaggttt aacgatcctc gaagacccag 6720 gggtggatca gtaoctgctg gacttgatcg aggcagcctt tggggaaata tccagcrgtc 6780 acctaccaac tggcacgcgc ctcaagttcg gagctatgat gaaaccgggc atgtttctga 5840 ccttgcctat caacaccgci: ttgaacatca cca^agçaag cagggcaccg gagcagagac 6900 ccactgactc cgcctgtgcg gccttcatcg gcgacgacaa caccgttcac ggaqtgatçt 6960 ccgacaagct qatggcggag aggtgcgcgt cgtgggueaa catggaggçg aagatcaztg 7020 acgctgccat gggcgaaaaa cccccatacc crtgcggggg actcatagct cttgacagcg 7080 ccacacagac cgcccgccgt gtttcagacc cacttaagcg cctgttcaag ttgggtaagc 7140 cgccaacagc tgaagacaag çaggacgaag acaggcgacg agcactgagt gacgaggtca 7200 gcaagtggct ccggacaggc ttgggggccg aactggaggt ggcactaaca tctaggcacg 7260 aggtagaggg ctgcaaaagt atcctoatag ccatggceac cttggcgagg gacattaagg 7320 ogcttaagaa actgagagga cctgccatac acctctacgg cggccctaga trggrgcgct 7380 aanacacaga accctgattg gatcacagcg cactattaca ggatccagat occgggcaat 7440 cagttgaatt acatocctae gcaaacgtrc tacggccgcc ggtggcgccc gcgcccggcg 7500 gcccgtcctt. ggccgttgca ggccactccg gtggctcccg ccgtccccga ctuccaggcc 7560 cagcagacgc agcaacccac cagcgocgta aatgcgccga caacgagaca gaacgcaatt 7620 gctccrgcta ggcctcccaa accaaagaag aagaagacaa ccaaaccaaa gccgaaaacg 7680 cagccoaaga agatcaacgg aaaaacgcag cagcaaaaga agaaagacaa gcaagccgac 7740 aagaagaaga agaaacccgg aaaaagagaa agaacgcgca tgaagactga aaatgactgt 7800 açcttcgtat gcggctagcc acagtaaogt agtgcttcca gacatgcçgg gcaccgcacn 7860 19

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20 ΕΡ 1 029 069 /PT tcggcgatat aggcgccagc aaccgcacct ccggcgtaga ggatctggct agcgatgacc gtgcggaacg gcgttaecag aaactcagaa agtttacgag agagargata gggrctgctt gtacanattg tcgirtagaac gcggctaçaa acgattragg tgacacuata

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<210> 5 <211> 27 <212> ADN <213> Vírus da Floresta de Semliki <220> <400> 5 gatcatagcg cactattata ggatcca 27

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<210> 10 <211> 90 <212> ADN <213> Vírus da Floresta de Semliki <220> <400> 10 gcccagccgt accgtagagg ^ggaggagcg ccaggctgga cccgraggct tcctcctgcg 60 cgcaggtgag cccaccgatc ccccccctag 90

<210> 11 <211> 12474 <212> ADN <213> Vírus da Floresta de Semliki <2 2 0 > <400> 11 attggccatt gqcçattgca tacgttgcat ctatatcata atatgtacat ttatatcggc 60 tcatgcccaa tatgaccgcc ax:gttgacaç tgatcactga ctagtratta atagtaacoa 120 ãccacggggc cattagttca cagcccatac atggagtcco gcgttacata acttacggta 180 aacggcccgc cccgcgaccg cccaaogacc cccgçceatc gacgteaaca acgacgtatg 240 ttcccatagt aacgeeaata gggactttcc arcgacgtca atgggtggag rartPacggt 300 aaactgccca ctcggcagta caccaagrgt apcacacgcc aagccegccc cctarrgacg 360 tcaatgacgg taaarggccc gcctggcatt atgcccagca catgacccca cgggaercte 42o ctacxtggca gtacacccac gtatcagtca ccgctaccac cacggtgarg cggtxxtgge 480 agracaccaa tgggcgtgga cagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 540 trqacgticaa t.qgqagtctg -ttcggcaec aaaatcaacg ggactrccca aaatgtcgta 600 ataaccccgc cocgctgac9 caaargggcg gtaggcgtgt acggtgggag gcctatacaa 660 gcagagcccg ttcagcgaac cgtarggcgg acgtgcgaca taeacgaegc caaaagattt 720 cgttccagct cctgccacct. ccgctacgcg agagactaac cacccacgac ggocgceaaa 780 gtgcatgfcg atattgaggc tgacagccca rccatcaagt cc^rgcagaa ggcarttccg 840 ccgtccgagg tggagtcacc goaggccaca ccaaacgacc argcaaatgc cagagcattt 900 ccgcacctgg ctaccaaatt gatcgagcag gagactgaca aagacacact carcctggac 960 atcggcagtg cgcoctccag gagaacgatg tctacgcaca aacaccaotg cgtacgcect 1020 atgcgoagcg cagaagaccc cgaaaggctc gatagctaçg caaagaaact ggcagcggec 1080 tcegggaagg tgctggatag agagaccgca ggaaaaatca ccgacctgoa gaccgtcatg 1140 22

ΕΡ 1 029 069 /PT gctacgccag acgctgaatc tcctaccttt tgcctgcata caçacgtcac gtgtcgracg 1200 gcagccggag tggccqtata ceaggacgtg ratgctgtac acgcaceaac atcgctgeac 1260 catcaggcga tgaaaggtgc cagaacggcg tattggattg ggcctgacac caccccgttt 1320 angrttgacg cgctagcagg cgcgcatcea acctacgcca çaaactgggc cgacgagcag 1380 gtgtcacagg ccaggaacat aggaccgcgt gcagcatcct tgactgaggg aagacteggc 1440 aaactgccca ttctccgcaa gaagcaattg aaacctcgcg acacagtcat gttctçggta 1500 ggacctacac tgracactga gagcagaaag ocaecgagga gcrggcactt accctccgta 1560 ttccacctga aaggcaaaca acocttcacc cgcaggcgcg ataccatcgt atcatgcgaa 1620 gggcacgtag -ccaagaaaat caccatgtgc cccggcctgt acggtaaaac ggtagggtac 1680 gçcgtgaçgt atcacgcgga gggattccca gcgtgcaaga ccacagacqc cgtcaaagga 1740 gaaagagtct catcccctgt acgcacctac gtccecrcaa ccatctgtga teaaatgact 1900 ggcatactag cgaccgacgt cacaccggag gacgcaeaga agttgttagc gggattgaat 1860 cagaggatag tcgtgaacgg aagaacacag cgaaacacta acacgatgaa gaactatctg 1920 crcccgattg tggcggtcgc at;tçagcaag cgggcgaggg aatacaaggc agaccttgat 1980 gacgaaaaac ctctgggtgt ccqagagagg ccacccactt gccgctgctt gtgggcattt 2040 aaaacgagga agatgcacac catgcacaag aaaccagaca cccagacaac agtgaaggtg 2100 ccttcagagt traacrcgtt cgtaaccccg qgccxatggt ctseaggecc egoaaccçea 2160 gccagatcac gcatcaagat gctcttggcc aagaagacca agcgagagtt aatacctgtt 2220 cccgacgcgt cgtcagccag ggatgecgaa eaagaggaga aggagaggtt ggaggccgag 2280 ccgactagag aagccttacc acccctegtc cccatcgcgc cggcggagac gggagccgcc 2340 gacgccgacg ttgaagaaet agagtaccac gcaggtqcag gggtcgtgga aacacctcgc 2400 agcgcgrtga aagtcaccgc acagccgaac gacgtactae taggaaarta cgcagctctg 2460 cecccgcaga cegtgctcaa gagccccaag ccggoccccq cgcaccctcr agcagagcag 2520 gtgaaaataa taacacacaa cgggaggqcc ggcggtxacc aggtcgacgg atatgacggc 2580 agggtcctac taccatgtgg accggccatt ccggcccctg agtttcaagc tttgagcgag 2640 aqcgccacta tggtgtacaa cgaaagggag ttegtcaaca ggaaactata ccatactgcc 2100 gcccacggac cgtcgctgaa caccgacgag gagaactacg agaaagtcag agctgaaaga 2760 actgacgocg agcacgcgcc cqacgtagar aaaaaaxgct gcqtcaagag agaggaagcg 2B20 ccgggttcgg tgctggçggg agagctaaec aaccccccgi; tccatgaatx cgcctacgaa 2880 gqgccgaaga tcaggccgte ggcaccatat aagactacag tagtaggagt ccctggggct 2940 ccqggatcag gcaagrccqe cactattaag agcçtcgtga ccaaacacqa tccggccacc 3000 agcgqcaaga aggggaaccq ccaggaaata gttaacgacg tgaagaagca ccgcgggaag 3060 gggacaagta gggaaaacag tgactccacc ctgctaaacg ggtgtcgtcg tgccgcggac 3120 atQçcatatq cggaoqaggc crtcgcttgc cattccggca ctctgccagc cctaatrgct 3190

cttgtcaaae cccggagcaa agtggcgcta tgcggagace ccaagcaatg cqganccttc 324O aacatgaxgc agettaaggt gaacttcaac cacaacatce gcactgaagc atgccacaaa 3300 agcatatcca gacgccgcac gcgtccagtc aaggccaccg tgtctacgtc gcaccaegga 3360 ggcaagatigc gcacgaccaa cccgtgcaac aaacccataa ícatagaçac cacaggacag 3420 accaagooca aqccaggaga cancgcgtta acacgcttcc gaggetgggc aaagcagctg 3480 cagttgqacc accgcggaca cgaagtcarg acagcagcag catctcaggg cctcacccgc 3540 aaaggggtac acgccgtaag gcagaaggtg aatgaaaatc cetcgtatgc ccccgcgtcg 3600 gagcacgçgq acgcaccgcc gacgcqcacc gaggacaggc cggçgçggaa aacgctggcc 3660 ggcgaocccc ggaccaaggc gagtttgggg accottgatt gctctttcct ccrcgctatt 3720 gi:aaaatcca çgtcatatgg agggggcaaa gtcttcaggg tgttqcccag aatgggaaga 3780 ígtccctrgc accacoatgg accctcacga caattttgrc cctttcaccc cctactctgt 3840 cgacaaccac cgtcccccct tartttctcc teattttctg caacttttcc gtcaaacttc 3900 ggctcgcacc tgcòacgaac ccccaaattc aocccrgctç atttgccaga ctgtaagtac 3960 cttctcraat cacttttttt rcaaggcaat cagggtacat cacatcgtac cccagcacag 4020 23

ΕΡ 1 029 069 /PT tcctagagaa ggetggcgtg rtotctccat aaaccgggco aacattccac ataacgaagg gtgtgttggg gaggagtgga gccrtgaatg gccccgaagg argtatggat gggcagtggc gtgccqgaca aagacggcca ctgctggtga ccgaatgica ggcaggtccg cagtgcgtog aaacccggcg gtctcctect agcaatacag ccacaecaga gggtgtgcac gtggttaacg aagaaarggc atgtgcggct gcggaaggqg ctgtcaccga gataggcxgc gtgaccatct àqgacggct.9 cacccggaca tcgtactctg rcgtggccca acgçacaaea acagtgccct caccaaqtta ggggtgcaga gttagtcegc tttgacttgq agtctgcagç gccgacgtac cccgcagacc caccctgccc ceaaggaccg gtcgatgcgt cgcgcgggrg grcaggcagc caattgttac gaaatattct ggrtaeaacg ecrccgcraa agggtaacct rgattgaagg cgaaaagcct gçaccataat aaatttgcac cgcocccgca tcaacgccgc acacgggcaa atgcaacccc aaggcagcag gtgagcacaa'' caggcgccga acttggtctit accaogccat gcacctcgat taagcagaaa aagtgtcctt tgaataccaa catccracag cagcraacgc cgzcagcczz cgtaccccgt accgcgaact gcagcgcagc agcaatcccc acrgcagaga tggagttgcc gcagccçggc aaggtacgaa gactgcaaga ccagacecaa gcctgtgccg aaagcatggc aggtaaagtg ggaagtatgc actggaccac cgtgtgacat accccgaacc atgtggaçcc cecgcgcggc cgcrcaggaa rggcctccgg catacatttt acaatcccca aattaaatga cattggtaga acatacaccg ecatgttcat tacggccaca accggctgcg ggtgcctgcc cacagcatrr caagtactac ttacgagaac aacagcrgcc gcaggcagtc catcaaccgc ggttgagcgg cctggctttg taggtgccac tgcgaacact gaagçtgcag gagagcccac gttctcgcct gctgtccccc gctgagrgcc agttaagaga ccgcqgaacc caagggagca catccacgcc ggccgccgcc caccccgctg caacoaccca caaaagccgg caatgatgac gggtcgcaag actcaaccag ggcaaacgaa acgcccggcg ccacgcaacg ggctcgccca cgagaagqtt cgcatctacg cgaçtcgcct cgactcgacc cqcaggcatç cgagaacccg ggagcgaccg caagctgoct gattacttcc ctcctcgqac gtqogcacaa taaggtagaa catttctgca tataaactct 4080 aacaactaca rcctggtcac caccctgcct 4140 cttgagatga ggataaaaca ctcrgagtcc 4200 gccrcottct tttccctaca gqtcctatca 4260 rtggaagaat ggcaagaaga acacgacaaa 4320 cctgtggacg cgrtccagaa caaagcgaac 4380 ctggacactg ccggaatcaq atçgacagca 4440 aaggaggaoa gagcttactc cccagtggtg 4500 ggagtcgacc tggacagtgg eetgctttct 4560 aaecactggg ataacagacc tggtggaagg 4620 aggctggaag ctagacacac ctccctgaag 4680 ategcagaaa gaaaaaccca accgcrttcc 4740 aggctgcegc acgccctggt ggctgagtac 4S00 crggtcaata aagcaagagg gtaccacgtc 4860 cctcgacgca gggrcacttg gttgccaccg 4920 gacctaagtt taggaetgcc ggctgacgcc 4980 cacacggoat ccagaatcea ecactaecag S04Q atgettgggg gagargcgct âCgactgctâ 5100 ggatacgccg ataaaaccag cgaagccgcr 5160 geaagagtgt rgcgcccgga tcgtgtcacc 5220 aaccctgaca acggaaagag accctctacg 5280 grgtatgccg gagaagccat gcacacggcc 5340 geagacatag ccacgcgcac agaagcggct 5400 gçaggggarg gcgcatgcag ggccgtggeg 5460 gcaacaccag cgggcacaat paaaacagtc 5520 gtagcgccta acttctccgc cacgaccgaa 5580 cacrgggcag tggccgccga agcaaacaga 5640 ctgtccacag gagtgtccag cggcggaaga 5700 cccacagcaa tggacgccae ggacgctgac 5760 gagaagaaaa cccaggaagc cacrgacatg S820 gtggagctga ccacagactr ggtgagagcg 5880 ggccacagra ccaccgacgg gtcgctgtac 5940 gccgccatcg atatggcaga gacaocgacg 6000 cagaracgcc tacacgcgct gggcgaaaca 6060 aacgactccg attcatcaac acetcccagg 6120 acagcagaac ggarcgcccg cctcaggtca 6180 tccíccccec ccccgaaata ccatgcagat 6240 ctcocgctcg acccgacggt accttcagtg 6300 acggaccact eagatcggce gtcacgaggg 6360 cccaccgcca gcgataecat grcgccaccc 6420 cacgagccaa cggctcccat agtagrgacg 6480 gcggacctgg cggcagacgt gcaccctgaa 6540 atccccccac Cgcgcccgaa gagagcçgca 6600 gcgccggcgc cgggaaagcc gacgecrgco 6660 ccgacgttqg gcgacttrga cgagcacgag 6720 ggagacctcg acgacgcccc gcgactaggc 6780 actggcagcg gacactcaca acaaaaaccc 6840 ccggatgcgg cccaggagga gaaaacgtac 6900

24 ΕΡ 1 029 069 /PT ccgccagaar tggatactga ccggaggcta ataagagtcg gtggacaggc tcacatcggg acatacgcg9 ttcggtaccc agccccgatg tagcaatcgc gcgtcgtacc agaraacaga agttgcttgg acagagcgac gegraecace agccgaçtgt aacgcgctag cggccgccac accatggact cggcagtgti; tattgggaag aatatgccaa gtgaccaaat tgaaaggccc ccgctgcagg aggttcccat actccaggga cgaaacacac ccattggcga ccgcttacct gtgttaçgcc ctaacgtgca stcgcctctc acttccaccc aaaagccagg acgactcctt gaccagtacc cgccggactt ccaactggca cgcgcttcaa cccactaaca crgctttgaa gacrccgcct gtgcggcctt aagcrgatgg cggagaggtg gtcatgggcg aaaaaccccc cagaccgcct gccgtgtttc acagctgaag acaagcagga cggttccgga caggcccggg qagggctgca aaagtatccc aagaaattga gaggacccgt acagaattei: gattggatca gaattacatc cccacgcaaa tcctcggccg ttgcaggcca ggtgeagcaa ctcaccagcg cgctaggccc cccaaaccaa caagaagacc aacggaaaaa gaagaagaaa cccggaaaaa cgtatgcggc tagccacagt gggtgcagaa aatctcgggt ctgtggteac ttgcarcggg caagaaaact gaaaacagaa acttgtaaca aagcgcaaca ccggggcaac ccatattgac ccgacgaata atcggatçct aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaacqqgtcg gcatggcatc cgcacgtcca ctcggatggc tgtcgttcgc ccctcccccg ttcctaataa aatgaggaaa gagggagaag crgctgctgc tgaaaatgca gatgcaccca 6960 ataccagtet cgcaaagcgg agaacacgaa agccacggtg 7020 ggccagattg tacacgggag cggacgragg ccgcatacca 7080 ccgccccgtg tactccccra ccgtgatcga aagaccctca 7140 agcgtgcaac gaatacctat ccagaaarta cccaacagtg 7200 tgaatacgac geatactrgg acatggccga cgggtcggat 7260 acçctgcccg gcgaagctçc ggtgctaccc gaaacaccar 7320 acgcagtgcc gtcccgtcac cctttcagaa cacactacag 7380

caagagaaac tgcaacgtea cgcgaatgcg agaaccaccc 744O caaegtggag tgctteaagc gctatgcctq crccggagaa 7500 acaacecacc cggataacca ccgagaacat cgctacctat 7560 gaaagctgcr gccttgttçg ctaagaccca cagcctggtT 7620 ggacagatte acggccgaca tgaaacgaga tgtcaaagtc 7680 agaggaaaga cccaaagtcc aggtaattca agcagcggag 7740 gtgcggeate cacagggaac tagtaaggag actaaacgcí 7800 cacatcgttt gatacgtcgg ccgaagacct tggcgcgate 7860 aggagacecg gptetagaga eggacattgr: ar.cartcgac 7 920 ggctcttaca ggtttaatga cccrcgaaga tctaggggrg 7980 gatcgaggca gccttrgqgg aaatatccag ctgtcaçcta 8O4O gttcggager acgatgaaat cgggcacgtt tctggcttíg 8100 caccaccata gcaagcaggg cacrggagca gagactcacc 8160 caccggcgac ggcaacatcg ttcacggagr gacetocgac 8220 cgcgrcgtgg gtcaacatgg aggtgaagac cacigacgct 8280 acatttrcgt ggggggttca tagtttcpgg cagcgtcaca 8340 agacecgctt aagcgaccgt tcaagttggg taagccgcta 8400 cgaagaoagg cgacgagcac tgagtgacga ggttagcaag 846O ggccgaaccg gaggtggcac taacatctag gratgaggta 8520 catagçcatg gocaccttgg crgagggacat taaggcgttc 8580 tatacacctc cacggcgqcc ctagactggr gcqtcaatac 864O tagcgcacta ctataggacc cagatcccgg gtaartaatc 8700 cgccttacgg ccqccggtgg cgeccgcgcc çggcggcccg 8760 ctccggcggc ccccgtcgtc cccgacttcc aggccçagca 8820 ccgtaaatgc gctgacaatg agacagaacg caacrgcccc 8880 agaagaagaa gacaaccaaa ccaaagccga aaacgcagcc 8940 cgcagcagca aaagaagaaa gacaagcaag ccgagaagaa 9000 gagaaagaat gcgcatgaag actgaaaatg accgtatcct 9060 aacgcagcgc ctccagacac gccgggcacc gcactatcat 9120 ggtctggggg ccttcgcaac cggcgctatc ccggtgctgg 9180 crccgcagac aagttagggc aggcaatggc attgaratag 9240 aaagttaggg taagcaatgg cacataacca taactgcaca 9300 agacctgoqc aattggcccc gtggtccgcc tcacggaaac 9360 acattaaccg gcaataatcg gaagcrraca taagctcaat 9420 catcttactc rgcaattggt tcctaatatc tccaaaaaaa 9480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 9540 cccacctcct cgcggtccga cctgggcatc cgaaggagga 9600 taagggagat cctgaactta acqctcgagc gccagccacc 9660 tgcctccctt gacoctggaa ggtgccacta ccactgtCcC 9720 ccgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ccatcctggg 9780 25

ΕΡ 1 029 069 /PT gqgcaggaca ggctctagga acgccatgcc atttcgagct acaattccgc gtgagctaac rcgtgccagc cgctcttccq gtgtcggcte aagaacacgt gegttctccc aggtggcgaa gtgcgctccc ggaagcgtgg cgctccaagc ggtaactatc actggtaaca tggcctaact gttacccccg ggtggErttc ccxttgarcc tcggtcacqa rccaaatcaa agcgaggcac gggggggggg aaccgcccca ggtggaccag aagacgçgtg tcccgícaag aaaaactcar tactcttgaa atggcaagat gacttcccct cccggtgaga ttacgctegt tgagcgggac aaccggcgca tctagtacct ggagtacgga ctgaccatet ccEggcgcac rcgcgagccc gagcaagacg gcagacagtt ccctgagaca 98«0 9900 9960 10020 10080 10140 10200 10260 10320 10380 10440 10500 10560 10620 10680 10740 10800 10860 10920 10980 11040 11100 11160 11220 11280 11340 11400 11460 11520 1X580 11640 11700 11760 11820 11880 11940 12000 12060 12120 12180 12240 12300 123 60 12420 12474 gacaatagea gatactgccc cccagctttt çtgtttcccg ataaagtgta tcaccgcccg cgcgcgggga ccgcgctcgg ttatooàcag gccaggaacc gagcaccaca tacçgggcgr accggataec tgtaggcatc cccgttcaqc agacacgact gtaggcggtg gtacttgata tgacccggca acgcgeagaa cagcggaacg acctagaccc açttggtetg ccccgctcat agaaggtgct ggagccacgg ccctgccacg aaaagttcqa tgctacaacc aattrattca ggagaaaacc ecgactcgtc agtgagaaar ECECtçcaga accaaaccgc aaaggacaac acaaaat uti a accgcagtgg agaggcacaa acgctaccct; tagattgccg gcatccatgt. ataacacccc CECCtaccCE cccccgagcc gggtggggtg ggatgcggtg catgatcctq gcgagggtca ttatccgccc tgcctaatga gggaaacctg gcgcatcggg gcggcgagcg taacgcagga egcgttgctg ctcaagtcag aagecccctc tctcccttcg gtaggtcgtt cgccttgtcc ggeageagcc cctgaagtgg gctgaagcca egccggtagc ceaagaagar ttaagggatt aaaatgaagt aigçttaacc ctgactccgg aceaggcetg çtctgctgta cgttgccggg aaagccgccg ttctgaftag atcaatacca grtccatagg ãcaacctatt gacgacrgaa aggccagcca cgatcgcgçc aaççgaatgc aggacattct cgcaccacca ccagccçagt cagaaacaac cccgacatta ccgcggoccc gtttatgtaa acateagaga gcaaggggga tctcgaccat agcctagtrc cggcgcaatc acaacatacg tcacattaat cgcartaatg CEECctcgçt actcaaaggc gagcaaaagg ataggccccg acccgacagg crgttccgac cgctfcctca cgggctgtgt gtcttgagtc ggottagcag acgactacac gaaaaagagt ttgtttgcaa tttctgcggg gattatcaaa cctaaagtat ctatcccagc cgctgaggtc tcatccagcc EEggtgacrt arcEgaccct tcagcgcaat cgageatcaa aaagccgtcc cccggtatcg cgtcagaaar atggcaaaag catcaaaate gaaatacgcg ggaacactgc gggacgctgt

Eaaaacgccc catctgtaae cgggctx.ccc atttataccc cttcccgrcg ccattgtrca caacgtggçt ggattgggaa gcagggcaag taggtggagc atggtcarag agccggaagc tgegtcgcgc aatcggccaa cactgactcg ggtaatacgg ccagcaaaag cccccctgac actataaaga cctgccgctt cagcrcacgc qcgcgaaccc caacccggta agcrgaggçaç tagaaggaca tggtagctct gcagcagatt gcccgacgcr aaggatcttc atacgagtaa gatctgtcta trgccrcgtga agaaagtgag cgaacccttg tcaactcagc gccctgccag atgaaaccgc ccgtsargaa g-cccgcgaci: aaggttatca ctratgcatt actcgcaLca atcgctgtca cagcgcatca tttcccgggg gatggtcgga atcattggca atacaaccga atataaatca aatatggctç ígatgacata tccccccccc ggcacgcEgg ggaacaaaac gtteecECta cgtgaaattg aagcccgggg ctct;ccagtc gaggcggctt rcgcccggct aaLcaggggà gtaaaaaggc aaaatcgacg ttccccccgg tgtccgcctt tcagctcggt gcgaccgccg catcgccact ctacagagct

CctgcgctCE aacaaaccac gaaaagqatc aaaacccacg ttctgaatta acagttacca ccatagttgc gctgactcac crgargagag gaacggtctg ctçattcaac aafcaaccaa caccaggatt caccgaggca caacaccaac caeeatgagt cttqEtcaac tattcarccg tacaaacagg cacccgaatc tgagtaacca attccgtcag

EgccacgcEE cacctgattg tggaacttaa

Etgtatcacc gtgcaacgca tgat

<210> 12 <211> 292 <212> ADN <213> Vírus da Floresta de Semlikí <220> 26

ΕΡ 1 029 069 /PT <400> 12 cgtttagtga accgtacggc ggatgtgtga cacacacgac gccaaaagat. tttgttccag 60 cteccgccac ctccgetacg egagagatna accacccaog acggccgcca aagtgcatgt 120 tgatatcgag gctgacagcc cattcaccaa gtctccgcag aaggcatttc cgtcgttcga 180 ggtggagtca rtgcaggtca caccaaatga coatgcaaat gccagagcat trrcgcacct 240 ggctaccaaa ttgatcgagc aqgagacpga caaagacaca ctcarctrgg at 292

Lisboa,

Claims (11)

1. ΕΡ 1 029 069 /PT 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Vector de expressão, compreendendo uma molécula de ADN que inclui o complementar das regiões completas do genoma de ARN de um alfavírus que são essenciais para a replicação do referido ARN de alfavírus e que compreende, além disso, uma sequência de ADN heterólogo capaz de expressão num hospedeiro, em que a referida sequência de ADN heterólogo é inserida numa região da molécula de ADN que não é essencial para a replicação desta, e a molécula de ADN é colocada sob o controlo transcricional de uma sequência promotora funcional no referido hospedeiro, no qual é inserido pelo menos um intrão heterólogo na sequência do replicão do alfavírus, num local que gera junções de splicing perfeitas e que impossibilita a replicação do vector de alfavírus, a não ser que o intrão seja verdadeiramente removido por splicing.
2. 2. Vector de acordo com a reivindicação 1, em que o referido promotor é colocado a montante da extremidade 5' da molécula de ADN, para que o transcrito resultante possua uma extremidade 5' verdadeira.
3. 3. Vector de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o referido promotor é o promotor precoce imediato de citomegalovírus.
4. 4. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, compreendendo ainda uma sequência de ADN adicional na extremidade 3' da molécula de ADN que é complementar de uma sequência de ARN que é uma ribozima que sofre autoclivagem.
5. 5. Vector de acordo com a reivindicação 4, em que a sequência de ADN adicional é uma sequência de ADN complementar de uma sequência da ribozima do virus da hepatite delta.
6. 6. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o intrão heterólogo é fornecido pela sequência de ADN do intrão II da β-globina de coelho.
7. 7. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o alfavírus é um vírus da ΕΡ 1 029 069 /PT 2/3 floresta de Semliki e em que pelo menos um local de splicing heterólogo está localizado ao nível de um local Ppu-MI na posição 2719 e/ou de um local PvuII na posição 2518, 3113, 6498 e/ou 6872 num fragmento EcoRV-Spel do replicão de SFV, tal como ilustrado na Figura 3.
8. 8. Vector de clonagem apropriado para a expressão de uma sequência de ADN heterólogo numa célula hospedeira, que compreende: uma molécula de ADN que inclui o complementar das regiões completas de replicação do genoma de ARN de um alfavírus e que possui um local de clonagem para inserção de uma sequência de ADN heterólogo capaz de expressão numa célula hospedeira, em que o referido local de clonagem está situado numa região da molécula de ADN que não é essencial para a replicação desta; uma sequência promotora funcional na referida célula hospedeira e que controla, de forma transcricional, a referida molécula de ADN, em que a referida sequência promotora é colocada a montante da extremidade 5' da molécula de ADN, para que o transcrito resultante possua uma extremidade 5' verdadeira; pelo menos um intrão heterólogo, que é providenciado no complementar da molécula de ADN e é inserido na sequência do replicão de um alfavírus, num local que gera junções de splicing perfeitas e que impossibilita a replicação do vector de alfavírus, a não ser que o intrão seja verdadeiramente removido por splicing; e uma sequência de ADN adicional na extremidade 3' da molécula de ADN, que é complementar de uma sequência de ARN que é uma ribozima que sofre autoclivagem.
9. 9. Vector de clonagem de acordo com a reivindicação 8, em que o referido alfavírus é um vírus da floresta de Semliki e em que o pelo menos um local de splicing heterólogo está localizado ao nível do local Ppu-MI na posição 2719 e/ou de um local PvuII na posição 2518, 3113, 6498 e/ou 6872 num fragmento EcoRV-Spel do replicão de SFV, tal como ilustrado na Figura 3.
10. 10. Vector de clonagem de acordo com a reivindicação 8 ou 9, em que a sequência de ADN adicional é uma sequência de ΕΡ 1 029 069 /PT 3/3 ADN complementar de uma sequência da ribozima do vírus da hepatite delta.
11. 11. Vector de clonagem de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, que é o plasmídeo pMP76 (N.° de acesso ATCC 203462) . Lisboa,