JP2002508925A - アルファウイルス・ベクター - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
宿主に投与したとき、セムリキ森林ウイルス等のアルファウイルスの異常スプライシングを防止するために、少なくとも１個の最適異種スプライス部位がアルファウイルスのレプリコンに導入されていることを特徴とする変形アルファウイルス表現ベクターを提供する。
Description
【０００１】 （発明の分野） 本発明はDNAワクチンの分野に関し、特に当該ワクチンに用いる変形アルファ ウイルス・ベクターに関する。
【０００２】 （発明の背景） セムリキ森林ウイルス（SFV）は、トガウイルス科のアルファウイルス属の１ 種である。成熟ウイルス粒子はプラス鎖のSSＲＮＡゲノムの単一コピーを有し、
５′末端がキャップ付加され、３′末端がポリアデニル化されている。それはｍ
ＲＮＡとして機能し、細胞に導入されると裸のＲＮＡが感染を開始する。感染／
トランスフェクションにともなってゲノムの５′末端の２／３がポリ蛋白に翻訳
され、それが自己解裂し、４種類の非構造蛋白が生成する（nsＰｌ→４）。一旦
ｎｅ蛋白が合成されると、プラス鎖（４２Ｓ）ゲノムの完全長マイナス鎖への複
写に関与する（参考文献１４）。ついで、これらのマイナス鎖はテンプレートと
して新しいプラス鎖（４２Ｓ）ゲノムおよび２６ＳサブゲノムｍＲＮＡの合成に
使用される（参考文献１−本出願では本発明に関連した技術水準を完全に記載す
るため各種の参考文献を括弧内に示す。参考文献の完全な情報は明細書の最後に
記載する。これら参考文献で開示されている記述は、比較例として本明細書に引
用する）。このサブゲノムｍＲＮＡはゲノムの最後の１／３と共直線性であり、
ＳＦＶ構造蛋白をコードしている。１９９１年、ＬｉｌｊｅｓｔｒｏｍおよびＧ
ａｒｏｆｆ（参考文献２）は、ＳＦＶ ＣＤＮＡレプリコンに基づいて一連の発
現ベクターを設計した。これらのベクターは異種挿入が可能なようにウイルス構
造蛋白遺伝子を欠失し、非構造コード領域を保持しているので、ｎｅＰｌ→４レ
プリカーゼ複合体が生成する。ＲＮＡ複写に必要な短い５′および３′配列因子
も保存されている。３フレーム全ての２６９プロモータの下流にポリリンカー、
ついで翻訳停止部位が挿入されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応に使用できる
ようにプラスミドを直線化するため、ＳＦＶ ＣＤＮＡの３′末端の直ぐ後にＳ
ｐｅＩ部位が挿入されている。
５′末端がキャップ付加され、３′末端がポリアデニル化されている。それはｍ
ＲＮＡとして機能し、細胞に導入されると裸のＲＮＡが感染を開始する。感染／
トランスフェクションにともなってゲノムの５′末端の２／３がポリ蛋白に翻訳
され、それが自己解裂し、４種類の非構造蛋白が生成する（nsＰｌ→４）。一旦
ｎｅ蛋白が合成されると、プラス鎖（４２Ｓ）ゲノムの完全長マイナス鎖への複
写に関与する（参考文献１４）。ついで、これらのマイナス鎖はテンプレートと
して新しいプラス鎖（４２Ｓ）ゲノムおよび２６ＳサブゲノムｍＲＮＡの合成に
使用される（参考文献１−本出願では本発明に関連した技術水準を完全に記載す
るため各種の参考文献を括弧内に示す。参考文献の完全な情報は明細書の最後に
記載する。これら参考文献で開示されている記述は、比較例として本明細書に引
用する）。このサブゲノムｍＲＮＡはゲノムの最後の１／３と共直線性であり、
ＳＦＶ構造蛋白をコードしている。１９９１年、ＬｉｌｊｅｓｔｒｏｍおよびＧ
ａｒｏｆｆ（参考文献２）は、ＳＦＶ ＣＤＮＡレプリコンに基づいて一連の発
現ベクターを設計した。これらのベクターは異種挿入が可能なようにウイルス構
造蛋白遺伝子を欠失し、非構造コード領域を保持しているので、ｎｅＰｌ→４レ
プリカーゼ複合体が生成する。ＲＮＡ複写に必要な短い５′および３′配列因子
も保存されている。３フレーム全ての２６９プロモータの下流にポリリンカー、
ついで翻訳停止部位が挿入されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応に使用できる
ようにプラスミドを直線化するため、ＳＦＶ ＣＤＮＡの３′末端の直ぐ後にＳ
ｐｅＩ部位が挿入されている。
【０００３】 異種蛋白をコードしたＳＦＶ ＲＮＡを注射することにより、異種蛋白の発現
および抗体の誘導が多くの試験で認められている（参考文献３，４）。免疫賦与
を目的として異種蛋白を発現させるためにＳＦＶ ＲＮＡ接種を用いることは、
プラスミドＤＮＡ免疫化に関していくつかの利点がある。例えば、ウイルス抗原
をコードしたＳＦＶ ＲＮＡは、ウイルスに対する抗体による中和により、力価
を低下させることなく抗体の存在下でそのウイルスに導入することができる。ま
た、蛋白はｉｎ ｖｉｖｏで発現されるため、ウイルス自体により発現される蛋
白と構造が同じである。したがって、プラスミドＤＮＡ免疫化では、蛋白の精製
の過程で起こりうる免疫原性、防御エピトープおよび多分免疫強化の喪失につな
がるような構造的変化を心配する必要がない。
および抗体の誘導が多くの試験で認められている（参考文献３，４）。免疫賦与
を目的として異種蛋白を発現させるためにＳＦＶ ＲＮＡ接種を用いることは、
プラスミドＤＮＡ免疫化に関していくつかの利点がある。例えば、ウイルス抗原
をコードしたＳＦＶ ＲＮＡは、ウイルスに対する抗体による中和により、力価
を低下させることなく抗体の存在下でそのウイルスに導入することができる。ま
た、蛋白はｉｎ ｖｉｖｏで発現されるため、ウイルス自体により発現される蛋
白と構造が同じである。したがって、プラスミドＤＮＡ免疫化では、蛋白の精製
の過程で起こりうる免疫原性、防御エピトープおよび多分免疫強化の喪失につな
がるような構造的変化を心配する必要がない。
【０００４】 ここで参考例として引用したＷＯ９５／２７０４４では、アルファウイルスＲ
ＮＡ配列の補助ｃＤＮＡに基づくアルファウイルスｃＤＮＡベクターの利用が開
示されている。異種プロモータの転写制御のもとでｃＤＮＡから転写されると、
アルファウイルスＲＮＡはそれ自体のレプリカーゼによって自己複写が可能であ
り、したがって転写された組み換えＲＮＡ分子のコピー数が単純化する。
ＮＡ配列の補助ｃＤＮＡに基づくアルファウイルスｃＤＮＡベクターの利用が開
示されている。異種プロモータの転写制御のもとでｃＤＮＡから転写されると、
アルファウイルスＲＮＡはそれ自体のレプリカーゼによって自己複写が可能であ
り、したがって転写された組み換えＲＮＡ分子のコピー数が単純化する。
【０００５】 （発明の要約） 本発明は、アルファウイルスの複写を促進するために前記ＷＯ９５／２７０４
４に記載されているアルファウイルスcDNAベクターの変形に関する。本発明では
、異種スプライス部位をアルファウイルス、特にセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ
）のレプリコン配列に導入する。
４に記載されているアルファウイルスcDNAベクターの変形に関する。本発明では
、異種スプライス部位をアルファウイルス、特にセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ
）のレプリコン配列に導入する。
【０００６】 したがって、本発明は一側面でアルファウイルスＲＮＡゲノムの少なくとも一
部の補助ＤＮＡ分子からなり、ＤＮＡ分子が前記アルファウイルスＲＮＡの複写
に必須である完全なアルファウイルスＲＮＡゲノム領域の補体を構成し、さらに
ヒトまたは動物宿主等の適切な宿主でその複写には必須でないＤＮＡ分子の領域
に挿入されている異種ＤＮＡ配列を発現することができる異種ＤＮＡ配列からな
り、ＤＮＡ分子が前記動物またはヒト宿主で機能するプロモータ配列の転写制御
のもとにあり、少なくとも一つの異種スプライス部位がアルファウイルスのＲＮ
Ａスプライシング異常を防止するためにＤＮＡ分子に設けられている。
部の補助ＤＮＡ分子からなり、ＤＮＡ分子が前記アルファウイルスＲＮＡの複写
に必須である完全なアルファウイルスＲＮＡゲノム領域の補体を構成し、さらに
ヒトまたは動物宿主等の適切な宿主でその複写には必須でないＤＮＡ分子の領域
に挿入されている異種ＤＮＡ配列を発現することができる異種ＤＮＡ配列からな
り、ＤＮＡ分子が前記動物またはヒト宿主で機能するプロモータ配列の転写制御
のもとにあり、少なくとも一つの異種スプライス部位がアルファウイルスのＲＮ
Ａスプライシング異常を防止するためにＤＮＡ分子に設けられている。
【０００７】 アルファウイルス分子は巨大分子であり、したがって潜在スプライス部位であ
る可能性が高く、それによってアルファウイルスの複写障害が起こり、異種ＤＮ
Ａ発現能力が損なわれる。本発明にしたがって少なくとも一つの最適異種スプラ
イス部位をアルファウイルスのレプリコン配列に導入することによって、スプラ
イシングが潜在スプライス部位ではなく異種スプライス部位に指向され、除去し
てもＳＦＶレプリコンの機能が保存され、核からのＲＮＡの運搬が改善される（
参考文献６）。
る可能性が高く、それによってアルファウイルスの複写障害が起こり、異種ＤＮ
Ａ発現能力が損なわれる。本発明にしたがって少なくとも一つの最適異種スプラ
イス部位をアルファウイルスのレプリコン配列に導入することによって、スプラ
イシングが潜在スプライス部位ではなく異種スプライス部位に指向され、除去し
てもＳＦＶレプリコンの機能が保存され、核からのＲＮＡの運搬が改善される（
参考文献６）。
【０００８】 ここで提供する構成物で、プロモータはアルファウイルスＲＮＡレプリコンの
効果的な複写に必要な同一５′末端を有する複写が得られるようにアルファウイ
ルス配列の５′末端の上流に配置されている。
効果的な複写に必要な同一５′末端を有する複写が得られるようにアルファウイ
ルス配列の５′末端の上流に配置されている。
【０００９】 さらに、配列の３′末端で適切なｉｎ ｖｉｖｏ解裂が起こるように、セムリ
キ森林ウイルスセグメントの３′末端にデルタ型肝炎ウイルスリボザイム配列を
設けてもよい。その他の配列を用いても、同じ効果が得られる。
キ森林ウイルスセグメントの３′末端にデルタ型肝炎ウイルスリボザイム配列を
設けてもよい。その他の配列を用いても、同じ効果が得られる。
【００１０】 異種スプライス部位配列は、参考文献５に記載されているように、ウサギβ−
グロビンイントロンＩＩのヌクレオチド配列によって提供してもよい。当該異種
スプライス部位配列は、完全なスプライスジャンクションが得られるように完全
な配列のいずれの位置に挿入してもよい。スプライシングによって確実に除去し
ない限り、これによってアルファウイルスの複写が排除される。
グロビンイントロンＩＩのヌクレオチド配列によって提供してもよい。当該異種
スプライス部位配列は、完全なスプライスジャンクションが得られるように完全
な配列のいずれの位置に挿入してもよい。スプライシングによって確実に除去し
ない限り、これによってアルファウイルスの複写が排除される。
【００１１】 私はＳＦＶレプリコン中に５カ所の適切な部位を同定した。これらの部位は、
レプリコンのＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩフラグメント（長さ８０１０ｂｐ）内に含ま
れている（図３）。これら部位の最初の部位は、ＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩフラグメ
ント内の２７１９の位置に存在するＰｐｕ−ＭＩ部位である。
レプリコンのＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩフラグメント（長さ８０１０ｂｐ）内に含ま
れている（図３）。これら部位の最初の部位は、ＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩフラグメ
ント内の２７１９の位置に存在するＰｐｕ−ＭＩ部位である。
【００１２】 ここで提供する変形ベクターを構築するにあたって、ＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩフ
ラグメントを位置２７１９のＰｐｕ−ＭＩで切断し、マングビーンのヌクレアー
ゼでＳＦＶ配列から塩基３個を除去して末端を平滑とする。長さ５３６ｂｐの平
滑末端β−グロビンＩＩイントロンを部位に結紮し、除去した３塩基の代わりに
β−グロビンイントロン配列の３′末端に付加した配列を挿入する（図１）。
ラグメントを位置２７１９のＰｐｕ−ＭＩで切断し、マングビーンのヌクレアー
ゼでＳＦＶ配列から塩基３個を除去して末端を平滑とする。長さ５３６ｂｐの平
滑末端β−グロビンＩＩイントロンを部位に結紮し、除去した３塩基の代わりに
β−グロビンイントロン配列の３′末端に付加した配列を挿入する（図１）。
【００１３】 残りのイントロンの挿入に適した４部位は、ＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩフラグメン
トの２５１８、３１１３、６４９８および６８７２ｂｐのＰｖｕＩＩ部位である
。イントロンの挿入は、ＰｖｕＩＩ（平滑末端カッター）で切断し、平滑末端β
−グロビンＩＩイントロン配列（図２）をこれら部位のいずれかに結紮すること
によって行った。
トの２５１８、３１１３、６４９８および６８７２ｂｐのＰｖｕＩＩ部位である
。イントロンの挿入は、ＰｖｕＩＩ（平滑末端カッター）で切断し、平滑末端β
−グロビンＩＩイントロン配列（図２）をこれら部位のいずれかに結紮すること
によって行った。
【００１４】 本発明は、別の側面で宿主細胞に異種ＤＮＡ配列を発現させる上で好適な、ア
ルファウイルスＲＮＡゲノムの少なくとも一部の補助ＤＮＡ分子からなり、ＤＮ
Ａ分子が完全なアルファウイルスＲＮＡゲノム領域の補体を構成し、宿主細胞で
発現される異種ＤＮＡ配列を挿入するためのクローニング部位を有し、前記クロ
ーニング部位がその複写には必須でないＤＮＡ分子の領域に存在し、プロモータ
配列が前記宿主細胞で機能し、前記ＤＮＡ分子を転写制御し、得られた転写が同
じ５′末端を有するように前記プロモータ配列がＤＮＡ分子の５′末端の上流に
配置され、少なくとも一つの異種スプライス部位がプライシング異常を防止する
ためにアルファウイルス中に完全なスプライス接合部位を形成するようにＤＮＡ
分子の補体に設けられ、別のＤＮＡ配列が得られたｍＲＮＡ転写の３′末端にお
ける適切なｉｎ ｖｉｖｏ解裂を指向するようにＤＮＡ分子の３′末端に設けら
れていることからなるクローニングベクターを提供する。
ルファウイルスＲＮＡゲノムの少なくとも一部の補助ＤＮＡ分子からなり、ＤＮ
Ａ分子が完全なアルファウイルスＲＮＡゲノム領域の補体を構成し、宿主細胞で
発現される異種ＤＮＡ配列を挿入するためのクローニング部位を有し、前記クロ
ーニング部位がその複写には必須でないＤＮＡ分子の領域に存在し、プロモータ
配列が前記宿主細胞で機能し、前記ＤＮＡ分子を転写制御し、得られた転写が同
じ５′末端を有するように前記プロモータ配列がＤＮＡ分子の５′末端の上流に
配置され、少なくとも一つの異種スプライス部位がプライシング異常を防止する
ためにアルファウイルス中に完全なスプライス接合部位を形成するようにＤＮＡ
分子の補体に設けられ、別のＤＮＡ配列が得られたｍＲＮＡ転写の３′末端にお
ける適切なｉｎ ｖｉｖｏ解裂を指向するようにＤＮＡ分子の３′末端に設けら
れていることからなるクローニングベクターを提供する。
【００１５】 （発明の一般的説明） 上記のように、本発明は変形アルファウイルスＤＮＡに関する。アルファウイ
ルスは、セムリキ森林ウイルスであることが好ましい。特に、本発明は動物また
はヒト等の宿主において異種遺伝子発現に用いるクローニングベクターを提供す
る。
ルスは、セムリキ森林ウイルスであることが好ましい。特に、本発明は動物また
はヒト等の宿主において異種遺伝子発現に用いるクローニングベクターを提供す
る。
【００１６】 プロモータ配列は、真核生物に由来するプロモータであってもよいし、原核生
物に由来するプロモータであってもよい。適切なプロモータはサイトメガロウイ
ルスのイミディエート・アーリー・プロモータ（ｐＣＭＶ）であるが、これらお
よびその他の類似プロモータの場合転写が宿主細胞のＤＮＡ−依存ＲＮＡポリメ
ラーゼによって行われるので、ラウス肉腫ウイルスのロングターミナル・リピー
ト・プロモータ（ｐＲＳＶ）等その他のプロモータであってもよい。さらに、Ｓ
Ｐ６、Ｔ３またはＴ７プロモータも、染色体に挿入されているか、エピソームに
残っているＳＰ６、Ｔ３またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ分子をコードした遺伝子
で細胞がまず形質変換されている限り使用することができる。これら（ＳＰ６、
Ｔ３、Ｔ７）ＲＮＡポリメラーゼをコードした遺伝子の発現は、宿主細胞のＤＮ
Ａ−依存ＲＮＡポリメラーゼに依存する。
物に由来するプロモータであってもよい。適切なプロモータはサイトメガロウイ
ルスのイミディエート・アーリー・プロモータ（ｐＣＭＶ）であるが、これらお
よびその他の類似プロモータの場合転写が宿主細胞のＤＮＡ−依存ＲＮＡポリメ
ラーゼによって行われるので、ラウス肉腫ウイルスのロングターミナル・リピー
ト・プロモータ（ｐＲＳＶ）等その他のプロモータであってもよい。さらに、Ｓ
Ｐ６、Ｔ３またはＴ７プロモータも、染色体に挿入されているか、エピソームに
残っているＳＰ６、Ｔ３またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ分子をコードした遺伝子
で細胞がまず形質変換されている限り使用することができる。これら（ＳＰ６、
Ｔ３、Ｔ７）ＲＮＡポリメラーゼをコードした遺伝子の発現は、宿主細胞のＤＮ
Ａ−依存ＲＮＡポリメラーゼに依存する。
【００１７】 異種ＤＮＡ挿入物は、生物学的に活性な蛋白またはポリペプチド等の望ましい
物質をコードした配列からなる。例えば、異種ＤＮＡ挿入物は、ＨＩＶ配列、例
えば免疫原性または抗原性の蛋白またはポリペプチド、または治療的活性を有す
る蛋白またはポリペプチドをコードしていてもよい。異種ＤＮＡは、自己解裂リ
ボザイム配列であるＲＮＡ配列補助配列等の追加配列を含んでいてもよい。
物質をコードした配列からなる。例えば、異種ＤＮＡ挿入物は、ＨＩＶ配列、例
えば免疫原性または抗原性の蛋白またはポリペプチド、または治療的活性を有す
る蛋白またはポリペプチドをコードしていてもよい。異種ＤＮＡは、自己解裂リ
ボザイム配列であるＲＮＡ配列補助配列等の追加配列を含んでいてもよい。
【００１８】 ここで提供するＤＮＡベクターは、本発明のさらに別の側面にしたがって、宿
主における防御免疫反応等の免疫反応を誘導するためにヒト宿主を含む宿主に投
与し、ｉｎ ｖｉｖｏで異種ＤＮＡ配列を発現させてもよい。さらに、ＤＮＡベ
クターは、当該投与のための免疫原性組成物に製剤してもよい。
主における防御免疫反応等の免疫反応を誘導するためにヒト宿主を含む宿主に投
与し、ｉｎ ｖｉｖｏで異種ＤＮＡ配列を発現させてもよい。さらに、ＤＮＡベ
クターは、当該投与のための免疫原性組成物に製剤してもよい。
【００１９】 （寄託） セムリキ森林ウイルスレプリコンを含み、ここで引用したいくつかのベクター
は、ブタペスト条約に従い、本発明の出願前にアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅ
ｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｅａｓ、ＶＡ ２０１１０−２２０９、米国に供託した。
は、ブタペスト条約に従い、本発明の出願前にアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅ
ｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｅａｓ、ＶＡ ２０１１０−２２０９、米国に供託した。
【００２０】 供託したプラスミドのサンプルは、本米国出願特許が成立し、全てのアクセス
制限が解除された段階で入手することができる。供託株が死滅した場合は、交換
される。供託した実施例は本発明の説明を目的としたに過ぎず、ここで記載し、
請求した発明は供託したプラスミドの範囲に限られるものではない。
制限が解除された段階で入手することができる。供託株が死滅した場合は、交換
される。供託した実施例は本発明の説明を目的としたに過ぎず、ここで記載し、
請求した発明は供託したプラスミドの範囲に限られるものではない。
【００２１】 （寄託の要約） プラスミド：ｐＭＰ７６ ＡＴＣＣ表示番号： 供託日： （実施例） 上記の開示は、本発明を一般的に記載したものである。以下の実施例によって
、本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は本発明を説明するために記
載したものであり、それによって本発明の範囲を制限するものではない。形態の
変更および等価物での置換は、本発明から容易に推察できるものとする。ここで
は特殊な用語を用いたが、これらの用語は説明のために用いたものであり、発明
の範囲を制限するためではない。
、本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は本発明を説明するために記
載したものであり、それによって本発明の範囲を制限するものではない。形態の
変更および等価物での置換は、本発明から容易に推察できるものとする。ここで
は特殊な用語を用いたが、これらの用語は説明のために用いたものであり、発明
の範囲を制限するためではない。
【００２２】 本開示に記載した分子遺伝学的、蛋白生化学的および免疫学的方法は、用いた
方法が明確に記載されているとは限らないが、これらの実施例は科学的文献に十
分記載されており、当該技術分野の専門家には容易に理解できるものと考える。 実施例１ この実施例は、図５、７、８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、８Ｄ、９Ａ、９Ｂ、１０、１１
Ａ、１１Ｂ、１２Ａおよび１２Ｂに示したプラスミドｐＭＰ７６の構築に関する
。
方法が明確に記載されているとは限らないが、これらの実施例は科学的文献に十
分記載されており、当該技術分野の専門家には容易に理解できるものと考える。 実施例１ この実施例は、図５、７、８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、８Ｄ、９Ａ、９Ｂ、１０、１１
Ａ、１１Ｂ、１２Ａおよび１２Ｂに示したプラスミドｐＭＰ７６の構築に関する
。
【００２３】 プラスミドｐＳＦＶ１（Ｇｉｂｃｏ）をＢａｍＨＩで制限し、プラスミドｐＳ
ＦＶリンクを調製した。ついで、このプラスミドをリンカー（配列番号：５およ
び６）で結紮し、プラスミドｐＳＦＶリンク（図４Ａ〜４Ｄ、図５）を調製した
。
ＦＶリンクを調製した。ついで、このプラスミドをリンカー（配列番号：５およ
び６）で結紮し、プラスミドｐＳＦＶリンク（図４Ａ〜４Ｄ、図５）を調製した
。
【００２４】 ｐＳＦＶリンクをＥｃｏＲＶおよびＳｐｅＩで制限し、８９０ｂｐのＥｃｏＲ
Ｖ−ＳｐｅＩフラグメントを分離することにより、一部のＳＦＶレプリコンフラ
グメントのサブクローニングを行った。ついで、このフラグメントをＥｃｏＲＩ
で制限し、１９０６ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ、１５７８ｂｐおよび３６２
７ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ、および８９９ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩフ
ラグメントを分離した（図７）。
Ｖ−ＳｐｅＩフラグメントを分離することにより、一部のＳＦＶレプリコンフラ
グメントのサブクローニングを行った。ついで、このフラグメントをＥｃｏＲＩ
で制限し、１９０６ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ、１５７８ｂｐおよび３６２
７ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ、および８９９ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩフ
ラグメントを分離した（図７）。
【００２５】 １９０９ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ SFVフラグメントをＥｃｏＲＶ−Ｅ ｃｏＲＩ制限プラスミドｐＭＰ５２にクローニングし、プラスミドｐＭＰ５３を
得た（図９Ａ）。８９９ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩ SFVフラグメントをＥｃ ｏＲＩ−ＳｐｅＩ制限プラスミドｐＭＰ５２にクローニングし、プラスミドｐＭ
Ｐ５４を得た（図９Ａ）。ついで、プラスミドｐＭＰ５４をＳｐｅＩで制限し、
マングビーンヌクレアーゼで平滑末端とした。ついで、プラスミドをＢｇｌＩＩ
で制限し、脱リン酸化し、デルタ肝炎ウイルスリボザイムリンカー（配列番号：
９および１０）に結紮し、それをリン酸化してｐＭＰ５５を得た（図９Ｂ）。
得た（図９Ａ）。８９９ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩ SFVフラグメントをＥｃ ｏＲＩ−ＳｐｅＩ制限プラスミドｐＭＰ５２にクローニングし、プラスミドｐＭ
Ｐ５４を得た（図９Ａ）。ついで、プラスミドｐＭＰ５４をＳｐｅＩで制限し、
マングビーンヌクレアーゼで平滑末端とした。ついで、プラスミドをＢｇｌＩＩ
で制限し、脱リン酸化し、デルタ肝炎ウイルスリボザイムリンカー（配列番号：
９および１０）に結紮し、それをリン酸化してｐＭＰ５５を得た（図９Ｂ）。
【００２６】 プラスミドｐＭＰ５２は、リンカー（配列番号：７および８）をｐＵＣ１９の
ＥｃｏＲＩ部位に結紮して調製した（図１０． １５７８ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳＦＶフラグメントをｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部
位にクローニングし、ｐＭＰ４６を得た（図１１Ａ）。ついで、このプラスミド
をＰｐｕＭ１で制限し、マングビーンのヌクレアーゼで平滑末端とした。ウサギ
β−グロビンイントロンＩＩ ＰＣＲフラグメント（図１）をマングビーンヌク
レアーゼで平滑末端とし、リン酸化し、ＰｐｕＭＩ制限ｐＭＰ４６に結紮し、プ
ラスミドｐＭＰ７０を得た（図１１Ｂ）。
ＥｃｏＲＩ部位に結紮して調製した（図１０． １５７８ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳＦＶフラグメントをｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部
位にクローニングし、ｐＭＰ４６を得た（図１１Ａ）。ついで、このプラスミド
をＰｐｕＭ１で制限し、マングビーンのヌクレアーゼで平滑末端とした。ウサギ
β−グロビンイントロンＩＩ ＰＣＲフラグメント（図１）をマングビーンヌク
レアーゼで平滑末端とし、リン酸化し、ＰｐｕＭＩ制限ｐＭＰ４６に結紮し、プ
ラスミドｐＭＰ７０を得た（図１１Ｂ）。
【００２７】 ３６２７ｂｐのＥｃｏＲＩ ＳＦＶフラグメントをｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部
位にクローニングし、ｐＭＰ４７を得た（図１１Ａ）。
位にクローニングし、ｐＭＰ４７を得た（図１１Ａ）。
【００２８】 ＣＭＶプロモータ、イントロンＡ配列、ＢＧＨポリＡ配列およびＳＵ４０ポリ
Ａ配列を含むプラスミドｐＣＭＶ３をＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＶで制限した。３
１９１ｂｐのＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを分離し、脱リン酸化した。１
３２１ｂｐのＥｄｅＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを分離し、ＳａｃＩで制限した
。３３４ｂｐのＮｄｅＩ−ＳａｃＩフラグメントを分離した（図１２Ａ）。分離
したＳＦＶの５′−末端を含むＳａｃＩ−ＥｃｏＲＶ ＰＣＲフラグメントをあ
らかじめ分離した３３４ｂｐのＮｓｅＩ−ＳａｃＩフラグメントおよび３１９１
ｂｐのＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントに結紮し、ｐＭＰ７１を得た（図１２
Ａおよび１２Ｂ）。
Ａ配列を含むプラスミドｐＣＭＶ３をＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＶで制限した。３
１９１ｂｐのＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを分離し、脱リン酸化した。１
３２１ｂｐのＥｄｅＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを分離し、ＳａｃＩで制限した
。３３４ｂｐのＮｄｅＩ−ＳａｃＩフラグメントを分離した（図１２Ａ）。分離
したＳＦＶの５′−末端を含むＳａｃＩ−ＥｃｏＲＶ ＰＣＲフラグメントをあ
らかじめ分離した３３４ｂｐのＮｓｅＩ−ＳａｃＩフラグメントおよび３１９１
ｂｐのＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントに結紮し、ｐＭＰ７１を得た（図１２
Ａおよび１２Ｂ）。
【００２９】 ついで、プラスミドｐＭＰ５３をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで制限し、ｐＭ
Ｐ７０から分離し、脱リン酸化した２１５１ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントに結
紮した（図８Ａ）。ついで、この結紮物をＥｃｏＲＶで制限し、４０５７ｂｐの
ＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩフラグメントを精製した（図８Ａ）。
Ｐ７０から分離し、脱リン酸化した２１５１ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントに結
紮した（図８Ａ）。ついで、この結紮物をＥｃｏＲＶで制限し、４０５７ｂｐの
ＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩフラグメントを精製した（図８Ａ）。
【００３０】 プラスミドｐＭＰ４７をＥｃｏＲＩおよび分離し、脱リン酸化した３６２７ｂ
ｐのＥｃｏＲＩフラグメントで制限した（図８Ｂ）。ついで、プラスミドｐＭＰ
５５をＢｇｌＩＩで制限し、脱リン酸化し、ＥｃｏＲＩで制限した。９８５ｂｐ
のＥｃｏＲＩ−ＢａｌＩＩフラグメントを分離し、ｐＭＰ４７からあらかじめ分
離したＥｃｏＥＩフラグメントに結紮した（図８Ｂ）。ついで、結紮反応物をリ
ン酸化し、４６１２ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントを分離した。
ｐのＥｃｏＲＩフラグメントで制限した（図８Ｂ）。ついで、プラスミドｐＭＰ
５５をＢｇｌＩＩで制限し、脱リン酸化し、ＥｃｏＲＩで制限した。９８５ｂｐ
のＥｃｏＲＩ−ＢａｌＩＩフラグメントを分離し、ｐＭＰ４７からあらかじめ分
離したＥｃｏＥＩフラグメントに結紮した（図８Ｂ）。ついで、結紮反応物をリ
ン酸化し、４６１２ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントを分離した。
【００３１】 プラスミドｐＭＰ７１をＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで制限し、ついで脱リン
酸化した。このフラグメントは、あらかじめｐＭＰ４７およびｐＭＰ５５から分
離した４６１２ｂｐのＥｃｏＲＩッＢｇｌＩＩフラグメント、ｐＭＰ５３および
ｐＭＰ７０から分離した４０５７ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩフラグメントで
３方結紮し、ｐＭＰ７６を得た（図８Ｂおよび８Ｃ）。
酸化した。このフラグメントは、あらかじめｐＭＰ４７およびｐＭＰ５５から分
離した４６１２ｂｐのＥｃｏＲＩッＢｇｌＩＩフラグメント、ｐＭＰ５３および
ｐＭＰ７０から分離した４０５７ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩフラグメントで
３方結紮し、ｐＭＰ７６を得た（図８Ｂおよび８Ｃ）。
【００３２】 ５′-ATCTATGAGCTCGTTTAGTGAACCGTATGGCGGATGTGTGACATACA−３′ の配列を有するプライマーＳＦＶ−５′−３と、 ５′−TCCACCTCCAAGGATATCCAAGATGAGTGTG−３′ の配列を有するプライマーＥｃｏＲ−ＳＰＥ（それぞれ配列番号：９および１０
）を用い、ＣＭＶプロモータとＳＦＶレプリコンの５′末端の間でｐＳＦＶ１の
ＰＣＲ増幅を行い、ＳＦＶレプリコンの５′末端を得た。得られたＰＣＲフラグ
メントをＳａｃＩおよびＥｃｏＲＶで制限し（図１３、配列番号：１１）、フラ
グメントを分離した。
）を用い、ＣＭＶプロモータとＳＦＶレプリコンの５′末端の間でｐＳＦＶ１の
ＰＣＲ増幅を行い、ＳＦＶレプリコンの５′末端を得た。得られたＰＣＲフラグ
メントをＳａｃＩおよびＥｃｏＲＶで制限し（図１３、配列番号：１１）、フラ
グメントを分離した。
【００３３】 （開示の要約） この開示を要約すると、本発明はアルファウイルスゲノムの異常スプライシン
グを防止し、核からのＲＮＡの運搬を改善するために少なくとも１個の最適スプ
ライス部位がアルファウイルスのレプリコンに導入されていることを特徴とする
変形アルファウイルス発現ベクターを提供する。本発明の範囲で、改良が可能で
ある。
グを防止し、核からのＲＮＡの運搬を改善するために少なくとも１個の最適スプ
ライス部位がアルファウイルスのレプリコンに導入されていることを特徴とする
変形アルファウイルス発現ベクターを提供する。本発明の範囲で、改良が可能で
ある。
【００３４】
【表１】
【図１】 β−グロビンイントロンＩＩのＤＮＡ配列およびその３′末端に付加した３つ
のヌクレオチド（配列番号：１）を示す。
のヌクレオチド（配列番号：１）を示す。
【図２】 β−グロビンイントロンＩＩのＤＮＡ配列（配列番号：２）を示す。
【図３Ａ】 図３Ａ〜３Ｃは、セムリキ森林ウイルスレプリコンのＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩフ
ラグメントのＤＮＡ配列（配列番号：３）を示す。
ラグメントのＤＮＡ配列（配列番号：３）を示す。
【図３Ｂ】 図３Ａ〜３Ｃは、セムリキ森林ウイルスレプリコンのＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩフ
ラグメントのＤＮＡ配列（配列番号：３）を示す。
ラグメントのＤＮＡ配列（配列番号：３）を示す。
【図３Ｃ】 図３Ａ〜３Ｃは、セムリキ森林ウイルスレプリコンのＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩフ
ラグメントのＤＮＡ配列（配列番号：３）を示す。
ラグメントのＤＮＡ配列（配列番号：３）を示す。
【図４Ａ】 図４Ａ〜４Ｄは、図５に示すように調製したｐＳＦＶリンクのＤＮＡ配列（配
列番号：４）を示す。
列番号：４）を示す。
【図４Ｂ】 図４Ａ〜４Ｄは、図５に示すように調製したｐＳＦＶリンクのＤＮＡ配列（配
列番号：４）を示す。
列番号：４）を示す。
【図４Ｃ】 図４Ａ〜４Ｄは、図５に示すように調製したｐＳＦＶリンクのＤＮＡ配列（配
列番号：４）を示す。
列番号：４）を示す。
【図４Ｄ】 図４Ａ〜４Ｄは、図５に示すように調製したｐＳＦＶリンクのＤＮＡ配列（配
列番号：４）を示す。
列番号：４）を示す。
【図５】 リンカー配列（配列番号：５、６）を用いたｐＳＦＶ１からのｐＳＦＶリンク
（１１０６０ｂｐ）の構築を示す。
（１１０６０ｂｐ）の構築を示す。
【図６Ａ】 図６Ａ〜６Ｄは、図８Ａ〜８Ｄに示すように調製したプラスミドｐＭＰ７６の
ヌクレオチド配列（配列番号：１１）を示す。
ヌクレオチド配列（配列番号：１１）を示す。
【図６Ｂ】 図６Ａ〜６Ｄは、図８Ａ〜８Ｄに示すように調製したプラスミドｐＭＰ７６の
ヌクレオチド配列（配列番号：１１）を示す。
ヌクレオチド配列（配列番号：１１）を示す。
【図６Ｃ】 図６Ａ〜６Ｄは、図８Ａ〜８Ｄに示すように調製したプラスミドｐＭＰ７６の
ヌクレオチド配列（配列番号：１１）を示す。
ヌクレオチド配列（配列番号：１１）を示す。
【図６Ｄ】 図６Ａ〜６Ｄは、図８Ａ〜８Ｄに示すように調製したプラスミドｐＭＰ７６の
ヌクレオチド配列（配列番号：１１）を示す。
ヌクレオチド配列（配列番号：１１）を示す。
【図７】 図７は、プラスミドｐＳＦＶリンクのサブセクションを示す（図５参照）。
【図８Ａ】 図８Ａ〜８Ｄは、プラスミドｐＭＰ５３、ｐＭＰ７０、ｐＭＰ４７、ｐＭＰ５
５およびｐＭＰ７１からのプラスミドｐＭＰ７６の構築を示す。
５およびｐＭＰ７１からのプラスミドｐＭＰ７６の構築を示す。
【図８Ｂ】 図８Ａ〜８Ｄは、プラスミドｐＭＰ５３、ｐＭＰ７０、ｐＭＰ４７、ｐＭＰ５
５およびｐＭＰ７１からのプラスミドｐＭＰ７６の構築を示す。
５およびｐＭＰ７１からのプラスミドｐＭＰ７６の構築を示す。
【図８Ｃ】 図８Ａ〜８Ｄは、プラスミドｐＭＰ５３、ｐＭＰ７０、ｐＭＰ４７、ｐＭＰ５
５およびｐＭＰ７１からのプラスミドｐＭＰ７６の構築を示す。
５およびｐＭＰ７１からのプラスミドｐＭＰ７６の構築を示す。
【図８Ｄ】 図８Ａ〜８Ｄは、プラスミドｐＭＰ５３、ｐＭＰ７０、ｐＭＰ４７、ｐＭＰ５
５およびｐＭＰ７１からのプラスミドｐＭＰ７６の構築を示す。
５およびｐＭＰ７１からのプラスミドｐＭＰ７６の構築を示す。
【図９Ａ】 図９Ａ〜９Ｂは、プラスミド５２からのプラスミドｐＭＰ５３、ｐＭＰ５４お
よびｐＭＰ５５の構築を示す。
よびｐＭＰ５５の構築を示す。
【図９Ｂ】 図９Ａ〜９Ｂは、プラスミド５２からのプラスミドｐＭＰ５３、ｐＭＰ５４お
よびｐＭＰ５５の構築を示す。
よびｐＭＰ５５の構築を示す。
【図１０】 図１０は、リンカー配列（配列番号：７，８）を用いたｐＵＣ１９からのプラ
スミドＭＰ５２の構築を示す。
スミドＭＰ５２の構築を示す。
【図１１Ａ】 図１１Ａ〜１１Ｂは、ｐＵＣ１９と図７に示したように調製したｐＳＦＶリンク
のフラグメントとからのプラスミドｐＭＰ４６、ｐＭＰ４７、ｐＭＰ７０の構築
を示す。
のフラグメントとからのプラスミドｐＭＰ４６、ｐＭＰ４７、ｐＭＰ７０の構築
を示す。
【図１１Ｂ】 図１１Ａ〜１１Ｂは、ｐＵＣ１９と図７に示したように調製したｐＳＦＶリンク
のフラグメントとからのプラスミドｐＭＰ４６、ｐＭＰ４７、ｐＭＰ７０の構築
を示す。
のフラグメントとからのプラスミドｐＭＰ４６、ｐＭＰ４７、ｐＭＰ７０の構築
を示す。
【図１２Ａ】 図１２Ａ〜１２Ｂは、プラスミドｐＣＭＶ３からのプラスミドｐＭＰ７１の構
築を示す。
築を示す。
【図１２Ｂ】 図１２Ａ〜１２Ｂは、プラスミドｐＣＭＶ３からのプラスミドｐＭＰ７１の構
築を示す。
築を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年７月１１日（２０００．７．１１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【化１】
を有するプラスミドｐＭＰ７６に特有の特性を有する請求項１０〜１４のいずれ
かに記載のクローニングベクター。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ
Claims (14)
- 【請求項１】 アルファウイルスＲＮＡゲノムの少なくとも一部の補助ＤＮ
Ａ分子からなり、ＤＮＡ分子が前記アルファウイルスＲＮＡの複写に必須である
完全なアルファウイルスＲＮＡゲノム領域の補体を構成し、さらに宿主でその複
写には必須でないＤＮＡ分子の領域に挿入されている異種ＤＮＡ配列を発現する
ことができる異種ＤＮＡ配列からなり、ＤＮＡ分子が前記ヒト宿主で機能するプ
ロモータ配列の転写制御のもとにあり、少なくとも一つの異種スプライス部位が
アルファウイルスのＲＮＡスプライシング異常を防止するためにＤＮＡ分子に設
けられていることを特徴とする発現ベクター。 - 【請求項２】 前記プロモータがＤＮＡ分子の５′末端の上流に設けられ、
得られた複写物が同4．じ５′末端を有することを特徴とする請求項１に記載の ベクター。 - 【請求項３】 前記プロモータがサイトメガロウイルスのイミディエート・
アーリー・プロモータであることを特徴とする請求項２に記載のベクター。 - 【請求項４】 ＤＮＡ分子の３′末端で適切なｉｎ ｖｉｖｏ解裂を指向す
るためにＤＮＡの３′末端に追加ＤＮＡ配列を有する請求項１に記載のベクター
。 - 【請求項５】 前記追加ＤＮＡ配列がデルタ肝炎リボザイム配列であること
を特徴とする請求項４に記載のベクター。 - 【請求項６】 異種スプライス部位配列がウサギβ−グロビンイントロンＩ
ＩのＤＮＡ配列によって提供されることを特徴とする請求項１に記載のベクター
。 - 【請求項７】 異種スプライス部位配列が完全なスプライス接合部位を形成
し、除去してもＳＦＶレプリコンの機能を保持するDNA分子の位置に挿入されて いることを特徴とする請求項６に記載のベクター。 - 【請求項８】 アルファウイルスがセムリキ森林ウイルスであることを特徴
とする請求項１に記載のベクター。 - 【請求項９】 宿主細胞内で異種ＤＮＡ配列を発現する上で適切なクローニ
ングベクターであって、 ＤＮＡ分子がアルファウイルスＲＮＡゲノムの少なくとも一部の補助ＤＮＡ分
子からなり、ＤＮＡ分子が完全なアルファウイルスＲＮＡゲノム領域の補体を構
成し、宿主で発現される異種ＤＮＡ配列の挿入のためのクローニング部位を有し
、前記クローニング部位が その複写には必須でないＤＮＡ分子の領域に存在するＤＮＡ分子と、 前記宿主で機能し、前記ＤＮＡ分子を転写制御し、得られた複写物が同じ５′
末端を有するようにＤＮＡ分子の５′末端の上流に設けられたプロモータ配列と
、 アルファウイルスの完全なスプライス接合部位を形成するようにＲＮＡスプラ
イシング異常をもたらすＤＮＡ分子の補体として設けられた少なくとも一つの異
種スプライス部と、 反応物ＲＮＡ分子の３′末端で適切なｉｎ ｖｉｖｏ解裂を指向するためにＤ
ＮＡの３′末端に設けた追加ＤＮＡ配列とからなるコローニングベクター。 - 【請求項１０】 前記異種スプライス部位配列がウサギβ−グロビンイント
ロンＩＩのＤＮＡ配列によって提供されることを特徴とする請求項９に記載のク
ローニングベクター。 - 【請求項１１】 前記追加配列がデルタ肝炎リボザイム配列であることを特
徴とする請求項９に記載のクローニングベクター。 - 【請求項１２】 アルファウイルスがセムリキ森林ウイルスであることを特
徴とする請求項８に記載のクローニングベクター。 - 【請求項１３】 図８Ｄに示すプラスミドｐＭＰ７６の識別特性を有する請
求項８に記載のクローニングベクター。 - 【請求項１４】 配列番号：１１で示される請求項８に記載のクローニング
ベクター。
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|---|---|---|---|
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