ES2268797T3 - Vectores alvirus. - Google Patents
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Abstract
Vector de expresión, que comprende una molécula de ADN que comprende el complemento de las regiones del genoma ARN completo de alfavirus que resultan esenciales para la replicación de dicho ARN de alfavirus y que comprende además una secuencia de ADN heteróloga capaz de expresarse en un huésped, insertando dicha secuencia de ADN heterólogo en una región de la molécula de ADN que no resulta esencial para la replicación de la misma, y situando la molécula de ADN bajo control transcripcional de una secuencia promotora funcional en dicho huésped, en el que se inserta por lo menos un intrón heterólogo en la secuencia replicón del alfavirus en una localización que genera uniones de corte y empalme perfectas y que evita la replicación del vector alfavirus excepto en el caso que se extraiga auténticamente el intrón por corte y empalme.
Description
Vectores alfavirus.
La presente invención se refiere al campo de las
vacunas de ADN y particularmente se refiere a los vectores
alfavirus modificados para la utilización en dichas vacunas.
El virus Semliki Forest (SFV) es un miembro del
género alfavirus, en la familia Togaviridae. La partícula
vírica madura contiene una sola copia de un genoma de ARNss con una
polaridad positiva con una caperuza en el extremo 5' y
poliadenilación en el extremo 3'. Funciona como ARNm y el ARN
desnudo puede iniciar una infección cuando se introduce dentro de
una célula. Tras la infección/transfección, los dos tercios del lado
5' del genoma se traducen en una poliproteína que se procesa para
formar cuatro proteínas no estructurales (nsP1 a 4) mediante corte
y empalme autógenos. Tras la síntesis de las proteínas ns, éstas son
responsables de replicar el genoma de cadena positiva (42S)
formando cadenas negativas de longitud completa (ref. 14). Estas
cadenas negativas seguidamente sirven como moldes para la síntesis
de nuevos genomas de cadena positiva (42S) y del ARNm subgenómico
de 26S. A lo largo de toda la presente solicitud se citan diversas
referencias en paréntesis para describir más completamente el
estado de la técnica a la que pertenece la presente invención. Puede
hallarse información bibliográfica completa para cada citación al
final de la especificación. Este ARNm subgenómico, que es colineal
con el último tercio del genoma, codifica las proteínas
estructurales del SFV. En 1991, Liljestrom y Garoff (ref. 2)
diseñaron una serie de vectores de expresión basados en el replicón
de ADNc del SFV. Estos vectores presentaban deleciones de los genes
víricos de proteína estructural para facilitar la entrada de las
inserciones heterólogas, aunque conservaban la región codificante no
estructural para la producción del complejo replicasa nsP1 a 4.
También se conservaban elementos de secuencia cortos 5' y 3'
requeridos para la replicación del ARN. En los tres marcos se
insertó un sitio polienlace corriente abajo del promotor de 26S,
seguido de los sitios de parada de traducción. Se insertó un sitio
SpeI inmediatamente después del extremo 3' del ADNc de SFV para la
linearización del plásmido para su utilización en reacciones in
vitro de
transcripción.
transcripción.
La inyección de ARN de SFV codificante de una
proteína heteróloga se ha demostrado que resulta en la expresión de
la proteína foránea y la inducción de anticuerpo en varios estudios
(refs. 3, 4). La utilización de inoculación de ARN de SFV para
expresar proteínas foráneas para el fin de inmunización presentaría
varias ventajas asociadas con la inmunización con plásmido de ADN.
Por ejemplo, el ARN de SFV codificante de un antígeno vírico puede
introducirse en presencia de anticuerpo contra el virus sin pérdida
de potencia debida a la neutralización por anticuerpos contra el
virus. Además, debido a que la proteína se expresa in vivo,
la proteína presentaría la misma conformación que la proteína
expresada por el virus mismo. Por lo tanto, podrían evitarse
problemas relacionados con que los cambios de conformación que
podrían producirse durante la purificación de proteínas condujesen
a una pérdida de inmunogenicidad, de epítopos protectores y
posiblemente de inmunopotenciación, mediante la inmunización con
plásmido de ADN.
En el documento WO nº 95/27044 se describe la
utilización de vectores de ADNc de alfavirus basados en la
complementariedad de ADNc a la secuencia de ARN del alfavirus. Tras
la transcripción del ADNc bajo control transcripcional de un
promotor heterólogo, el ARN de alfavirus es capaz de autorreplicarse
por medio de su propia replicada y de esta manera amplificar el
número de copia de las moléculas de ARN recombinante
transcritas.
El documento WO nº 96/40945 describe vacunas de
ácidos nucleicos para la inmunización frente al virus sincitial
respiratorio. Se describen constructores de vector recombinante que
resultan adecuados para la expresión de proteínas víricas. Los
constructos opcionalmente pueden comprender, inter alia, un
intrón. La especificación enseña la inserción general del intrón
(por ejemplo el intrón II de la \beta-globina de
conejo) dentro del vector, por ejemplo entre secuencias promotoras
y secuencias que codifican la proteína vírica.
En el documento WO nº 96/17072 se describen
constructores de vector de expresión de alfavirus recombinante que
opcionalmente comprenden, inter alia, por lo menos un intrón.
La especificación enseña la inserción del intrón o intrones dentro
del vector entre las regiones génicas Sindbis (vírica) y
heteróloga.
La presente invención se refiere a
modificaciones de los vectores de ADNc de alfavirus descritas en el
documento WO nº 95/27044 anteriormente indicado que permiten la
replicación incrementada del alfavirus. En la presente invención,
se introduce un sitio de corte y empalme heterólogo en la secuencia
replicón del alfavirus, particularmente la del virus Semliki Forest
(SFV).
De acuerdo con lo expuesto anteriormente, en un
aspecto la presente invención proporciona un vector de expresión
que comprende una molécula de ADN complementaria a por lo menos
parte de un genoma de ARN de alfavirus, la molécula de ADN del cual
comprende el complemento de las regiones del genoma completo de ARN
del alfavirus que resultan esenciales para la replicación de dicho
ARN de alfavirus, y que además comprende una secuencia de ADN
heterólogo capaz de expresarse en un huésped adecuado, tal como un
huésped humano o animal, insertando dicha secuencia de ADN
heterólogo en una región de la molécula de ADN que no es esencial
para la replicación de la misma, y situando la molécula de ADN bajo
control transcripcional de una secuencia promotora funcional en
dicho huésped animal o humano, en la que se proporciona por lo menos
un sitio de corte y empalme heterólogo en la molécula de ADN para
evitar el corte y empalme aberrante del ARN del alfavirus.
La molécula del alfavirus es una molécula grande
y, de acuerdo con ello, existe una probabilidad elevada de que
existan sitios de corte y empalme crípticos, perjudicando de esta
manera la replicación del alfavirus y por lo tanto resulta
perjudicada su capacidad de expresar el ADN heterólogo. Mediante la
introducción de por lo menos un sitio de corte y empalme heterólogo
óptimo de acuerdo con la presente invención en la secuencia
replicón del alfavirus, es probable que cualquier corte y empalme se
concentre en el sitio de corte y empalme heterólogo y no en los
sitios de corte y empalme crípticos, que restaure la función del
replicón del SFV cuando se extrae, y puede mejorar el transporte
del ARN desde el núcleo (ref. 6).
En los constructos proporcionados en la presente
invención, el promotor se sitúa corriente abajo del extremo 5' de
la secuencia del alfavirus, de manera que el transcrito resultante
presenta un auténtico extremo 5', que resulta necesario para la
replicación eficiente del replicón de ARN del alfavirus.
Además, puede proporcionarse en el extremo 3'
del segmento del virus Semliki Forest, una secuencia de ribozima
del virus delta de la hepatitis para garantizar un corte y empalme
in vitro apropiados en el extremo 3' de la secuencia. Puede
utilizarse cualquier otra secuencia conveniente para conseguir este
efecto.
La secuencia heteróloga de sitio de corte y
empalme puede proporcionarla la secuencia de nucleótidos del intrón
II de la \beta-globina de conejo, tal como se
describe en la referencia 5. Esta secuencia heteróloga de sitio de
corte y empalme puede insertarse en la secuencia del complemento en
cualquier localización conveniente que genere uniones de corte y
empalme perfectas. Esto no resulta esencial para la replicación de
la misma; una secuencia promotora funcional en dicha célula huésped
y que controla transcripcionalmente dicha molécula de ADN, situando
dicha secuencia promotora corriente arriba del extremo 5' de la
molécula de ADN de manera que el transcrito resultante presente un
auténtico extremo 5'; por lo menos un sitio heterólogo de corte y
empalme proporcionado en el complemento de la molécula de ADN para
generar uniones de corte y empalme perfectas en el alfavirus con el
fin de evitar el corte y empalme aberrantes, y una secuencia
adicional de ADN en el extremo 3' de la molécula de ADN para
dirigir el corte in vivo correcto en el extremo 3' del
transcrito reactivo de ARNm.
La figura 1 muestra la secuencia de ADN del
intrón II de la \beta-globina, que comprende tres
nucleótidos adicionales en el extremo 3' de la misma (SEC ID nº
1);
la figura 2 muestra la secuencia de ADN del
intrón II de la \beta-globina (SEC ID nº 2);
las figuras 3A a 3C muestran la secuencia de ADN
del fragmento EcoRV-SpeI del replicón del virus
Semliki Forest (SEC ID nº 3);
las figuras 4A a 4D muestran la secuencia de ADN
del enlace pSFV (SEC ID nº 4) preparada tal como se ilustra en la
figura 5;
la figura 5 muestra la construcción del enlace
pSFV (11.060 pb) a partir de pSFV1 utilizando una secuencia de
enlace (SEC ID nº 5,6);
las figuras 6A a 6D muestran la secuencia de
nucleótidos del plásmido pMP76 (SEC ID nº 11, preparada tal como se
ilustra en las figuras 8A a 8D);
la figura 7 ilustra subsecciones del enlace del
plásmido pSFV (ver la figura 5);
las figuras 8A a 8D muestran la construcción de
los plásmidos pMP53, pMP70, pMP74, pMP55 y pMP71;
las figuras 9A a 9B muestran la construcción de
los plásmidos pMP53, pMP54 y pMP55 a partir del plásmido pMP52;
la figura 10 muestra la construcción del
plásmido MP52 a partir de pUC19 utilizando una secuencia de enlace
(SEC ID nº 7, 8)
las figuras 11A a 11B muestran la construcción
de los plásmidos pMP46, pMP47 y pMP70 a partir de pUC19 y un
fragmento del enlace pSFV, preparados tal como se observa en la
figura 7; y
las figuras 12A a 12B muestran la construcción
del plásmido pMP71 a partir del plásmido pCMV3.
Tal como se ha descrito anteriormente, la
presente invención proporciona un ADN modificado de alfavirus. El
alfavirus es el virus Semliki Forest. En particular, la presente
invención proporciona un vector de clonación para la expresión de
genes heterólogos en un huésped, tal como un animal o un ser
humano.
La secuencia promotora puede comprender un
promotor de origen eucariótico o procariótico. Son promotores
adecuados el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (pCMV),
aunque pueden utilizarse otros promotores, tales como el promotor
de repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous (pRSV)
debido a que, en el caso de éste y de otros promotores similares,
la transcripción es llevada a cabo por la ARN polimerasa dependiente
de ADN de la célula huésped. Además, pueden utilizarse los
promotores de SP6, T3 o T7, con la condición de que la célula haya
sido transformada en primer lugar con los genes codificantes de las
moléculas de ARN polimerasa de SP6, T3 o T7, las cuales se insertan
en el cromosoma o permanecen en estado episómico. La expresión de
estos genes codificantes de ARN polimerasa (de SP6, de T3 o de T7)
depende de la ARN polimerasa dependiente de ADN de la célula
huésped.
huésped.
La inserción de ADN heterólogo puede comprender
la secuencia codificante de un producto deseado, que puede ser una
proteína o polipéptido biológicamente activo, por ejemplo la
inserción de ADN heterólogo puede codificar las secuencias del VIH,
por ejemplo una proteína o polipéptido inmunogénico o antigénico, o
una proteína o polipéptido terapéuticamente efectivo. El ADN
heterólogo también puede comprender secuencias adicionales, tales
como una secuencia complementaria a una secuencia de ARN que es una
secuencia de ribozima de corte y empalme
autógenos.
autógenos.
Los vectores de ADN proporcionados en la
presente invención pueden administrarse a un huésped, incluyendo un
huésped humano, para la expresión in vivo de la secuencia de
ADN heterólogo, de acuerdo con un aspecto adicional de la
invención, con el fin de generar una respuesta inmunológica en el
huésped, que puede ser una respuesta inmunológica protectora. Los
vectores de ADN pueden formularse además en composiciones
inmunogénicas para esta administración.
Determinados vectores que contienen el replicón
del virus Semliki Forest y a los que se hace referencia en la
presente memoria han sido depositados en la American Type Culture
Collection (ATCC), situada en 10801 University Boulevard, Manassas,
VA 20110-2209, U.S.A., de acuerdo con el Tratado de
Budapest y previamente a la presentación de la presente
solicitud.
Se pondrán a disposición del público muestras de
los plásmidos depositados tras la concesión de una patente basada
en la presente solicitud de patente estadounidense y todas las
restricciones de acceso a los depósitos se retirarán en ese
momento. Se sustituirán los depósitos no viables. La invención
descrita y reivindicada en la presente memoria no debe limitarse en
su alcance a los plásmidos depositados, debido a que la forma de
realización depositada pretende únicamente ser una ilustración de la
invención.
| Sumario del depósito | ||
| Plásmido | Denominación en la ATCC | Fecha de depósito |
| pMP76 | 203462 | 12 de noviembre de 1998 |
La exposición anterior describe de manera
general la presente invención. Puede obtenerse una comprensión más
completa haciendo referencia a los Ejemplos específicos siguientes.
Estos Ejemplos se describen únicamente a título ilustrativo y no
pretenden limitar el alcance de la invención. Se contemplan cambios
en la forma y la sustitución de los equivalentes, según sugieran o
hagan conveniente las circunstancias. Aunque se han utilizado
términos específicos en la presente memoria, estos términos se
utilizan en un sentido descriptivo y no con fines limitativos.
Los procedimientos de genética molecular, de
bioquímica e inmunología aplicada a proteínas que se utilizan pero
que no se describen explícitamente en la presente exposición y en
los presentes Ejemplos se describen ampliamente en la literatura
científica y se encuentran perfectamente comprendidos dentro de los
conocimientos de un experto en la materia.
El presente Ejemplo describe la construcción del
plásmido pMP76, tal como se describe de manera general en las
figuras 5, 7, 8A, 8B, 8C, 8D, 9A, 9B, 10, 11A, 11B, 12A y 12B.
\newpage
El enlace de plásmido pSFV se creó cortando el
plásmido pSFV1 (Gibco) con BamHI. A continuación, este plásmido se
ligó con un enlace (SEC ID nº 5 y 6), produciendo el enlace de
plásmido pSFV (figuras 4A a 4D, figura 5).
Algunos de los fragmentos del replicón de SFV se
subclonaron cortando el enlace de pSFV con EcoRV y SpeI, y aislando
el fragmento EcoRV-SpeI de 890 pb. A continuación,
este fragmento se cortó con EcoRI y se aislaron los fragmentos
EcoRV-EcoRI de 1.906 pb, los fragmentos
EcoRI-EcoRI de 1.578 pb y de 3.627 pb, y el
fragmento EcoRI-SpeI de 899 pb (fig. 7).
El fragmento EcoRV-EcoRI de SFV
de 1.909 pb se clonó en el plásmido pMP52 cortado con
EcoRV-EcoRI, para producir el plásmido pMP53 (fig.
9A). El fragmento EcoRI-SpeI de SFV de 899 pb se
clonó en pMP52 cortado con EcoRI-SpeI, para
producir pMP54 (fig. 9A). A continuación, el plásmido pMP54 se cortó
con SpeI y se crearon extremos romos con la nucleasa Mung Bean.
Seguidamente, el plásmido se cortó con BgIII, se desfosforiló y se
ligó al enlace ribozima del virus delta de la hepatitis (SEC ID nº
9 y 10) que había sido fosforilado, produciendo pMP55 (fig.
9B).
Se creó el plásmido pMP52 ligando un enlace (SEC
ID nº 7, 8) en el sitio EcoRI de pUC19 (fig. 10).
El fragmento EcoRI-SFV de 1.578
pb se clonó en el sitio EcoRI de pUC19, produciendo pMP46 (fig.
11A). A continuación, este plásmido se cortó con PpuM1 y se crearon
extremos romos con la nucleasa Mung Bean. Se crearon extremos romos
en el fragmento PCR del intrón II de la
\beta-globina de conejo (fig. 1) con la nucleasa
Mung Bean, se fosforiló y se ligó a pMP46 cortada con PpuMI,
produciendo el plásmido pMP70 (fig. 11B).
Se clonó el fragmento EcoRI de 3.627 pb de SFV
en el sitio EcoRI de pUC19, produciendo pMP47 (fig. 11A).
El plásmido pCMV3, que contiene el promotor de
CMV, la secuencia de intrón A, la secuencia poliA de BGH y la
secuencia poliA de SU40, se cortó con NdeI y con EcoRV. El fragmento
NdeI-EcoRV de 3.191 pb se aisló y se desfosforiló.
El fragmento NdeI-EcoRV de 1.321 pb se aisló y se
cortó con SacI. Se aisló el fragmento NdeI-SacI de
334 pb (fig. 12A). El fragmento PCR SacI-EcoRV
aislado que contenía el extremo 5' de SFV se ligó al fragmento
NdeI-SacI de 334 pb previamente aislado y al
fragmento NdeI-EcoRV de 3.191 pb, produciendo pMP71
(fig. 12A y 12B).
A continuación, se cortó el plásmido pMP53 con
EcoRI y BamHI y se ligó al fragmento EcoRI de 2.151 pb aislado y
desfosforilado a partir de pMP70 (fig. 8A). Después, se cortó esta
ligación con EcoRV y se purificó el fragmento
EcoRV-EcoRI de 4.057 pb (fig. 8A).
Se cortó el plásmido pMP47 con EcoRI y el
fragmento EcoRI de 3.627 pb se aisló y se desfosforiló (fig. 8B). A
continuación, se cortó el plásmido pMP55 con BgIII, se desfosforiló
y se cortó con EcoRI. El fragmento EcoRI-BgIII de
985 pb se aisló y se ligó al fragmento EcoRI previamente aislado a
partir de pMP47 (fig. 8B). Seguidamente la reacción de ligación se
fosforiló y se aisló el fragmento EcoRI-BgIII de
4.612 pb.
El plásmido pMP71 se cortó con EcoRV y con BamHI
y después se desfosforiló. Este fragmento se utilizó en una
ligación a 3 vías con el fragmento EcoRI-SgIII de
4.612 pb previamente aislado de pMP47 y de pMP55, y con el
fragmento EcoRV-EcoRI de 4.057 pb de pMP53 y de
pMP70, produciendo pMP76 (figs. 8B y 8C).
Se produjo el extremo 5' del replicón de SFV
mediante amplificación por PCR de pSFVI utilizando los cebadores
SFV-5'-3 con la secuencia
5'-ATCTATGAGCTCGrrrAGTGAACCGTATGGCGGATGTGTGACATACA-3
y EcoR-SPE con la secuencia
5'-TCCACCTCCAAGGATATCCAAGATGAGTGTG-3'
(SEC ID nº 9 y SEC ID nº 10, respectivamente) entre el promotor de
CMV y el extremo 5' del replicón de SFV. El fragmento PCR resultante
se cortó con SacI y con EcoRV (fig. 13; SEC ID nº 11) y se aisló el
fragmento.
Como resumen de la presente descripción, la
presente invención proporciona un vector de expresión basado en un
alfavirus modificado, en el que se introduce por lo menos un sitio
de corte y empalme óptimo en el replicón del alfavirus para evitar
el corte y empalme aberrantes del genoma del alfavirus, y para
mejorar el transporte del ARN hacia afuera del núcleo.
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<212> ADN
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<400> 12
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Claims (11)
1. Vector de expresión, que comprende una
molécula de ADN que comprende el complemento de las regiones del
genoma ARN completo de alfavirus que resultan esenciales para la
replicación de dicho ARN de alfavirus y que comprende además una
secuencia de ADN heteróloga capaz de expresarse en un huésped,
insertando dicha secuencia de ADN heterólogo en una región de la
molécula de ADN que no resulta esencial para la replicación de la
misma, y situando la molécula de ADN bajo control transcripcional de
una secuencia promotora funcional en dicho huésped, en el que se
inserta por lo menos un intrón heterólogo en la secuencia replicón
del alfavirus en una localización que genera uniones de corte y
empalme perfectas y que evita la replicación del vector alfavirus
excepto en el caso que se extraiga auténticamente el intrón por
corte y empalme.
2. Vector según la reivindicación 1, en el
que dicho promotor se sitúa corriente arriba del extremo 5' de la
molécula de ADN de manera que el transcrito resultante presenta un
extremo 5' auténtico.
3. Vector según la reivindicación 1 ó 2, en el
que dicho promotor es el promotor temprano inmediato del
citomegalovirus.
4. Vector según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, que comprende además una secuencia adicional
de ADN en el extremo 3' de la molécula de ADN y que es
complementaria a una secuencia de ARN que es un ribozima de corte y
empalme autógenos.
5. Vector según la reivindicación 4, en el que
la secuencia adicional de ADN es una secuencia de ADN complementaria
a una secuencia de ribozima del virus delta de la hepatitis.
6. Vector según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el intrón heterólogo es
proporcionado por la secuencia de ADN del intrón II de la
\beta-globina de conejo.
7. Vector según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el alfavirus es un virus Semliki
Forest y estando localizado por lo menos un sitio de corte y
empalme heterólogo en un sitio Ppu-MI en la posición
2.719 y/o en un sitio PvuII en la posición 2.518, 3.113, 6.498 y/o
6.872 dentro de un fragmento EcoRV-SpeI del
replicón SFV, tal como se muestra en la figura 3.
8. Vector de clonación adecuado para la
expresión en una célula huésped de una secuencia de ADN heterólogo,
que comprende:
una molécula de ADN que comprende el complemento
de las regiones completas de replicación del genoma de ARN de
alfavirus y presenta un sitio de clonación para la inserción en el
mismo de una secuencia de ADN heterólogo capaz de expresarse en una
célula huésped, estando localizado dicho sitio de clonación en una
región de la molécula de ADN que no resulta esencial para la
replicación de la misma;
una secuencia promotora funcional en dicha
célula huésped y que controla transcripcionalmente dicha molécula
de ADN, estando situada dicha secuencia promotora corriente arriba
del extremo 5' de la molécula de ADN de manera que el transcrito
resultante presenta un extremo 5' auténtico;
por lo menos un intrón heterólogo que se
proporciona en el complemento de la molécula de ADN y que se inserta
en la secuencia replicón del alfavirus en una localización que
genera uniones de corte y empalme perfectas y que evita la
replicación del vector alfavirus excepto en el caso que el intrón
sea auténticamente extraído por corte y empalme; y
una secuencia de ADN adicional en el extremo 3'
de la molécula de ADN y complementaria a una secuencia de ARN que
es un ribozima de corte y empalme autógenos.
9. Vector de clonación según la reivindicación
8, en el que dicho alfavirus es un virus Semliki Forest y en el que
por lo menos un sitio de corte y empalme heterólogo se encuentra
localizado en el sitio Ppu-MI en la posición 2.719
y/o en un sitio PvuII en la posición 2.518, 3.113, 6.498 y/o 6.872
dentro de un fragmento EcoRV-SpeI del replicón SFV,
tal como se muestra en la figura 3.
10. Vector de clonación según la reivindicación
8 ó 9, en el que la secuencia de ADN adicional es una secuencia de
ADN complementaria a una secuencia de ribozima del virus delta de la
hepatitis.
11. Vector de clonación según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 10, que es el plásmido pMP76 (nº de acceso
ATTCC 203462).
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