JP3835669B2 - アルファウイルス・ベクター - Google Patents
アルファウイルス・ベクター Download PDFInfo
- Publication number
- JP3835669B2 JP3835669B2 JP2000521222A JP2000521222A JP3835669B2 JP 3835669 B2 JP3835669 B2 JP 3835669B2 JP 2000521222 A JP2000521222 A JP 2000521222A JP 2000521222 A JP2000521222 A JP 2000521222A JP 3835669 B2 JP3835669 B2 JP 3835669B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sequence
- dna molecule
- complementary dna
- heterologous
- vector according
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 title claims abstract description 38
- 239000013598 vector Substances 0.000 title abstract description 10
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 claims abstract description 29
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 50
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 37
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 27
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 26
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 23
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 21
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 12
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 claims description 10
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 claims description 9
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 claims description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 6
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims description 5
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 5
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 3
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims 17
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims 17
- 208000005331 Hepatitis D Diseases 0.000 claims 2
- 208000037262 Hepatitis delta Diseases 0.000 claims 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 claims 2
- 208000029570 hepatitis D virus infection Diseases 0.000 claims 2
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 108010086093 Mung Bean Nuclease Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108091080980 Hepatitis delta virus ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101100133184 Caenorhabditis elegans nep-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 101000658546 Escherichia coli Type I restriction enzyme EcoEI endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010065868 RNA polymerase SP6 Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000710924 Togaviridae Species 0.000 description 1
- 101100472152 Trypanosoma brucei brucei (strain 927/4 GUTat10.1) REL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010028263 bacteriophage T3 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940065638 intron a Drugs 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/36011—Togaviridae
- C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
- C12N2770/36141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2770/36143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Superconductors And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
Description
【０００１】
（発明の分野）
本発明はDNAワクチンの分野に関し、特に当該ワクチンに用いる変形アルファウイルス・ベクターに関する。
【０００２】
（発明の背景）
セムリキ森林ウイルス（SFV）は、トガウイルス科のアルファウイルス属の１種である。成熟ウイルス粒子はプラス鎖のSSＲＮＡゲノムの単一コピーを有し、５′末端がキャップ付加され、３′末端がポリアデニル化されている。それはｍＲＮＡとして機能し、細胞に導入されると裸のＲＮＡが感染を開始する。感染／トランスフェクションにともなってゲノムの５′末端の２／３がポリ蛋白に翻訳され、それが自己解裂し、４種類の非構造蛋白が生成する（nsＰｌ→４）。一旦ｎｅ蛋白が合成されると、プラス鎖（４２Ｓ）ゲノムの完全長マイナス鎖への複写に関与する（参考文献１４）。ついで、これらのマイナス鎖はテンプレートとして新しいプラス鎖（４２Ｓ）ゲノムおよび２６ＳサブゲノムｍＲＮＡの合成に使用される（参考文献１−本出願では本発明に関連した技術水準を完全に記載するため各種の参考文献を括弧内に示す。参考文献の完全な情報は明細書の最後に記載する。これら参考文献で開示されている記述は、比較例として本明細書に引用する）。このサブゲノムｍＲＮＡはゲノムの最後の１／３と共直線性であり、ＳＦＶ構造蛋白をコードしている。１９９１年、ＬｉｌｊｅｓｔｒｏｍおよびＧａｒｏｆｆ（参考文献２）は、ＳＦＶ ＣＤＮＡレプリコンに基づいて一連の発現ベクターを設計した。これらのベクターは異種挿入が可能なようにウイルス構造蛋白遺伝子を欠失し、非構造コード領域を保持しているので、ｎｅＰｌ→４レプリカーゼ複合体が生成する。ＲＮＡ複写に必要な短い５′および３′配列因子も保存されている。３フレーム全ての２６９プロモータの下流にポリリンカー、ついで翻訳停止部位が挿入されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応に使用できるようにプラスミドを直線化するため、ＳＦＶ ＣＤＮＡの３′末端の直ぐ後にＳｐｅＩ部位が挿入されている。
【０００３】
異種蛋白をコードしたＳＦＶ ＲＮＡを注射することにより、異種蛋白の発現および抗体の誘導が多くの試験で認められている（参考文献３，４）。免疫賦与を目的として異種蛋白を発現させるためにＳＦＶ ＲＮＡ接種を用いることは、プラスミドＤＮＡ免疫化に関していくつかの利点がある。例えば、ウイルス抗原をコードしたＳＦＶ ＲＮＡは、ウイルスに対する抗体による中和により、力価を低下させることなく抗体の存在下でそのウイルスに導入することができる。また、蛋白はｉｎ ｖｉｖｏで発現されるため、ウイルス自体により発現される蛋白と構造が同じである。したがって、プラスミドＤＮＡ免疫化では、蛋白の精製の過程で起こりうる免疫原性、防御エピトープおよび多分免疫強化の喪失につながるような構造的変化を心配する必要がない。
【０００４】
ここで参考例として引用したＷＯ９５／２７０４４では、アルファウイルスＲＮＡ配列の補助ｃＤＮＡに基づくアルファウイルスｃＤＮＡベクターの利用が開示されている。異種プロモータの転写制御のもとでｃＤＮＡから転写されると、アルファウイルスＲＮＡはそれ自体のレプリカーゼによって自己複写が可能であり、したがって転写された組み換えＲＮＡ分子のコピー数が単純化する。
【０００５】
（発明の要約）
本発明は、アルファウイルスの複写を促進するために前記ＷＯ９５／２７０４４に記載されているアルファウイルスcDNAベクターの変形に関する。本発明では、異種スプライス部位をアルファウイルス、特にセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）のレプリコン配列に導入する。
【０００６】
したがって、本発明は一側面でアルファウイルスＲＮＡゲノムの少なくとも一部の補助ＤＮＡ分子からなり、ＤＮＡ分子が前記アルファウイルスＲＮＡの複写に必須である完全なアルファウイルスＲＮＡゲノム領域の補体を構成し、さらにヒトまたは動物宿主等の適切な宿主でその複写には必須でないＤＮＡ分子の領域に挿入されている異種ＤＮＡ配列を発現することができる異種ＤＮＡ配列からなり、ＤＮＡ分子が前記動物またはヒト宿主で機能するプロモータ配列の転写制御のもとにあり、少なくとも一つの異種スプライス部位がアルファウイルスのＲＮＡスプライシング異常を防止するためにＤＮＡ分子に設けられている。
【０００７】
アルファウイルス分子は巨大分子であり、したがって潜在スプライス部位である可能性が高く、それによってアルファウイルスの複写障害が起こり、異種ＤＮＡ発現能力が損なわれる。本発明にしたがって少なくとも一つの最適異種スプライス部位をアルファウイルスのレプリコン配列に導入することによって、スプライシングが潜在スプライス部位ではなく異種スプライス部位に指向され、除去してもＳＦＶレプリコンの機能が保存され、核からのＲＮＡの運搬が改善される（参考文献６）。
【０００８】
ここで提供する構成物で、プロモータはアルファウイルスＲＮＡレプリコンの効果的な複写に必要な同一５′末端を有する複写が得られるようにアルファウイルス配列の５′末端の上流に配置されている。
【０００９】
さらに、配列の３′末端で適切なｉｎ ｖｉｖｏ解裂が起こるように、セムリキ森林ウイルスセグメントの３′末端にデルタ型肝炎ウイルスリボザイム配列を設けてもよい。その他の配列を用いても、同じ効果が得られる。
【００１０】
異種スプライス部位配列は、参考文献５に記載されているように、ウサギβ−グロビンイントロンＩＩのヌクレオチド配列によって提供してもよい。当該異種スプライス部位配列は、完全なスプライスジャンクションが得られるように完全な配列のいずれの位置に挿入してもよい。スプライシングによって確実に除去しない限り、これによってアルファウイルスの複写が排除される。
【００１１】
私はＳＦＶレプリコン中に５カ所の適切な部位を同定した。これらの部位は、レプリコンのＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩフラグメント（長さ８０１０ｂｐ）内に含まれている（図３）。これら部位の最初の部位は、ＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩフラグメント内の２７１９の位置に存在するＰｐｕ−ＭＩ部位である。
【００１２】
ここで提供する変形ベクターを構築するにあたって、ＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩフラグメントを位置２７１９のＰｐｕ−ＭＩで切断し、マングビーンのヌクレアーゼでＳＦＶ配列から塩基３個を除去して末端を平滑とする。長さ５３６ｂｐの平滑末端β−グロビンＩＩイントロンを部位に結紮し、除去した３塩基の代わりにβ−グロビンイントロン配列の３′末端に付加した配列を挿入する（図１）。
【００１３】
残りのイントロンの挿入に適した４部位は、ＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩフラグメントの２５１８、３１１３、６４９８および６８７２ｂｐのＰｖｕＩＩ部位である。イントロンの挿入は、ＰｖｕＩＩ（平滑末端カッター）で切断し、平滑末端β−グロビンＩＩイントロン配列（図２）をこれら部位のいずれかに結紮することによって行った。
【００１４】
本発明は、別の側面で宿主細胞に異種ＤＮＡ配列を発現させる上で好適な、アルファウイルスＲＮＡゲノムの少なくとも一部の補助ＤＮＡ分子からなり、ＤＮＡ分子が完全なアルファウイルスＲＮＡゲノム領域の補体を構成し、宿主細胞で発現される異種ＤＮＡ配列を挿入するためのクローニング部位を有し、前記クローニング部位がその複写には必須でないＤＮＡ分子の領域に存在し、プロモータ配列が前記宿主細胞で機能し、前記ＤＮＡ分子を転写制御し、得られた転写が同じ５′末端を有するように前記プロモータ配列がＤＮＡ分子の５′末端の上流に配置され、少なくとも一つの異種スプライス部位がプライシング異常を防止するためにアルファウイルス中に完全なスプライス接合部位を形成するようにＤＮＡ分子の補体に設けられ、別のＤＮＡ配列が得られたｍＲＮＡ転写の３′末端における適切なｉｎ ｖｉｖｏ解裂を指向するようにＤＮＡ分子の３′末端に設けられていることからなるクローニングベクターを提供する。
【００１５】
（発明の一般的説明）
上記のように、本発明は変形アルファウイルスＤＮＡに関する。アルファウイルスは、セムリキ森林ウイルスであることが好ましい。特に、本発明は動物またはヒト等の宿主において異種遺伝子発現に用いるクローニングベクターを提供する。
【００１６】
プロモータ配列は、真核生物に由来するプロモータであってもよいし、原核生物に由来するプロモータであってもよい。適切なプロモータはサイトメガロウイルスのイミディエート・アーリー・プロモータ（ｐＣＭＶ）であるが、これらおよびその他の類似プロモータの場合転写が宿主細胞のＤＮＡ−依存ＲＮＡポリメラーゼによって行われるので、ラウス肉腫ウイルスのロングターミナル・リピート・プロモータ（ｐＲＳＶ）等その他のプロモータであってもよい。さらに、ＳＰ６、Ｔ３またはＴ７プロモータも、染色体に挿入されているか、エピソームに残っているＳＰ６、Ｔ３またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ分子をコードした遺伝子で細胞がまず形質変換されている限り使用することができる。これら（ＳＰ６、Ｔ３、Ｔ７）ＲＮＡポリメラーゼをコードした遺伝子の発現は、宿主細胞のＤＮＡ−依存ＲＮＡポリメラーゼに依存する。
【００１７】
異種ＤＮＡ挿入物は、生物学的に活性な蛋白またはポリペプチド等の望ましい物質をコードした配列からなる。例えば、異種ＤＮＡ挿入物は、ＨＩＶ配列、例えば免疫原性または抗原性の蛋白またはポリペプチド、または治療的活性を有する蛋白またはポリペプチドをコードしていてもよい。異種ＤＮＡは、自己解裂リボザイム配列であるＲＮＡ配列補助配列等の追加配列を含んでいてもよい。
【００１８】
ここで提供するＤＮＡベクターは、本発明のさらに別の側面にしたがって、宿主における防御免疫反応等の免疫反応を誘導するためにヒト宿主を含む宿主に投与し、ｉｎ ｖｉｖｏで異種ＤＮＡ配列を発現させてもよい。さらに、ＤＮＡベクターは、当該投与のための免疫原性組成物に製剤してもよい。
【００１９】
（寄託）
セムリキ森林ウイルスレプリコンを含み、ここで引用したいくつかのベクターは、ブタペスト条約に従い、本発明の出願前にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｅａｓ、ＶＡ ２０１１０−２２０９、米国に供託した。
【００２０】
供託したプラスミドのサンプルは、本米国出願特許が成立し、全てのアクセス制限が解除された段階で入手することができる。供託株が死滅した場合は、交換される。供託した実施例は本発明の説明を目的としたに過ぎず、ここで記載し、請求した発明は供託したプラスミドの範囲に限られるものではない。
【００２１】
（寄託の要約）
プラスミド：ｐＭＰ７６
ＡＴＣＣ表示番号：
供託日：
（実施例）
上記の開示は、本発明を一般的に記載したものである。以下の実施例によって、本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は本発明を説明するために記載したものであり、それによって本発明の範囲を制限するものではない。形態の変更および等価物での置換は、本発明から容易に推察できるものとする。ここでは特殊な用語を用いたが、これらの用語は説明のために用いたものであり、発明の範囲を制限するためではない。
【００２２】
本開示に記載した分子遺伝学的、蛋白生化学的および免疫学的方法は、用いた方法が明確に記載されているとは限らないが、これらの実施例は科学的文献に十分記載されており、当該技術分野の専門家には容易に理解できるものと考える。
実施例１
この実施例は、図５、７、８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、８Ｄ、９Ａ、９Ｂ、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１２Ａおよび１２Ｂに示したプラスミドｐＭＰ７６の構築に関する。
【００２３】
プラスミドｐＳＦＶ１（Ｇｉｂｃｏ）をＢａｍＨＩで制限し、プラスミドｐＳＦＶリンクを調製した。ついで、このプラスミドをリンカー（配列番号：５および６）で結紮し、プラスミドｐＳＦＶリンク（図４Ａ〜４Ｄ、図５）を調製した。
【００２４】
ｐＳＦＶリンクをＥｃｏＲＶおよびＳｐｅＩで制限し、８９０ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩフラグメントを分離することにより、一部のＳＦＶレプリコンフラグメントのサブクローニングを行った。ついで、このフラグメントをＥｃｏＲＩで制限し、１９０６ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ、１５７８ｂｐおよび３６２７ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ、および８９９ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩフラグメントを分離した（図７）。
【００２５】
１９０９ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ SFVフラグメントをＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ制限プラスミドｐＭＰ５２にクローニングし、プラスミドｐＭＰ５３を得た（図９Ａ）。８９９ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩ SFVフラグメントをＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩ制限プラスミドｐＭＰ５２にクローニングし、プラスミドｐＭＰ５４を得た（図９Ａ）。ついで、プラスミドｐＭＰ５４をＳｐｅＩで制限し、マングビーンヌクレアーゼで平滑末端とした。ついで、プラスミドをＢｇｌＩＩで制限し、脱リン酸化し、デルタ肝炎ウイルスリボザイムリンカー（配列番号：９および１０）に結紮し、それをリン酸化してｐＭＰ５５を得た（図９Ｂ）。
【００２６】
プラスミドｐＭＰ５２は、リンカー（配列番号：７および８）をｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位に結紮して調製した（図１０．
１５７８ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳＦＶフラグメントをｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、ｐＭＰ４６を得た（図１１Ａ）。ついで、このプラスミドをＰｐｕＭ１で制限し、マングビーンのヌクレアーゼで平滑末端とした。ウサギβ−グロビンイントロンＩＩ ＰＣＲフラグメント（図１）をマングビーンヌクレアーゼで平滑末端とし、リン酸化し、ＰｐｕＭＩ制限ｐＭＰ４６に結紮し、プラスミドｐＭＰ７０を得た（図１１Ｂ）。
【００２７】
３６２７ｂｐのＥｃｏＲＩ ＳＦＶフラグメントをｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、ｐＭＰ４７を得た（図１１Ａ）。
【００２８】
ＣＭＶプロモータ、イントロンＡ配列、ＢＧＨポリＡ配列およびＳＵ４０ポリＡ配列を含むプラスミドｐＣＭＶ３をＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＶで制限した。３１９１ｂｐのＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを分離し、脱リン酸化した。１３２１ｂｐのＥｄｅＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを分離し、ＳａｃＩで制限した。３３４ｂｐのＮｄｅＩ−ＳａｃＩフラグメントを分離した（図１２Ａ）。分離したＳＦＶの５′−末端を含むＳａｃＩ−ＥｃｏＲＶ ＰＣＲフラグメントをあらかじめ分離した３３４ｂｐのＮｓｅＩ−ＳａｃＩフラグメントおよび３１９１ｂｐのＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントに結紮し、ｐＭＰ７１を得た（図１２Ａおよび１２Ｂ）。
【００２９】
ついで、プラスミドｐＭＰ５３をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで制限し、ｐＭＰ７０から分離し、脱リン酸化した２１５１ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントに結紮した（図８Ａ）。ついで、この結紮物をＥｃｏＲＶで制限し、４０５７ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩフラグメントを精製した（図８Ａ）。
【００３０】
プラスミドｐＭＰ４７をＥｃｏＲＩおよび分離し、脱リン酸化した３６２７ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントで制限した（図８Ｂ）。ついで、プラスミドｐＭＰ５５をＢｇｌＩＩで制限し、脱リン酸化し、ＥｃｏＲＩで制限した。９８５ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｌＩＩフラグメントを分離し、ｐＭＰ４７からあらかじめ分離したＥｃｏＥＩフラグメントに結紮した（図８Ｂ）。ついで、結紮反応物をリン酸化し、４６１２ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントを分離した。
【００３１】
プラスミドｐＭＰ７１をＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで制限し、ついで脱リン酸化した。このフラグメントは、あらかじめｐＭＰ４７およびｐＭＰ５５から分離した４６１２ｂｐのＥｃｏＲＩッＢｇｌＩＩフラグメント、ｐＭＰ５３およびｐＭＰ７０から分離した４０５７ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩフラグメントで３方結紮し、ｐＭＰ７６を得た（図８Ｂおよび８Ｃ）。
【００３２】
５′-ATCTATGAGCTCGTTTAGTGAACCGTATGGCGGATGTGTGACATACA−３′
の配列を有するプライマーＳＦＶ−５′−３と、
５′−TCCACCTCCAAGGATATCCAAGATGAGTGTG−３′
の配列を有するプライマーＥｃｏＲ−ＳＰＥ（それぞれ配列番号：９および１０）を用い、ＣＭＶプロモータとＳＦＶレプリコンの５′末端の間でｐＳＦＶ１のＰＣＲ増幅を行い、ＳＦＶレプリコンの５′末端を得た。得られたＰＣＲフラグメントをＳａｃＩおよびＥｃｏＲＶで制限し（図１３、配列番号：１１）、フラグメントを分離した。
【００３３】
（開示の要約）
この開示を要約すると、本発明はアルファウイルスゲノムの異常スプライシングを防止し、核からのＲＮＡの運搬を改善するために少なくとも１個の最適スプライス部位がアルファウイルスのレプリコンに導入されていることを特徴とする変形アルファウイルス発現ベクターを提供する。本発明の範囲で、改良が可能である。
【００３４】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【図１】 β−グロビンイントロンＩＩのＤＮＡ配列およびその３′末端に付加した３つのヌクレオチド（配列番号：１）を示す。
【図２】 β−グロビンイントロンＩＩのＤＮＡ配列（配列番号：２）を示す。
【図３Ａ】 図３Ａ〜３Ｃは、セムリキ森林ウイルスレプリコンのＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩフラグメントのＤＮＡ配列（配列番号：３）を示す。
【図３Ｂ】 図３Ａ〜３Ｃは、セムリキ森林ウイルスレプリコンのＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩフラグメントのＤＮＡ配列（配列番号：３）を示す。
【図３Ｃ】 図３Ａ〜３Ｃは、セムリキ森林ウイルスレプリコンのＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩフラグメントのＤＮＡ配列（配列番号：３）を示す。
【図４Ａ】 図４Ａ〜４Ｄは、図５に示すように調製したｐＳＦＶリンクのＤＮＡ配列（配列番号：４）を示す。
【図４Ｂ】 図４Ａ〜４Ｄは、図５に示すように調製したｐＳＦＶリンクのＤＮＡ配列（配列番号：４）を示す。
【図４Ｃ】 図４Ａ〜４Ｄは、図５に示すように調製したｐＳＦＶリンクのＤＮＡ配列（配列番号：４）を示す。
【図４Ｄ】 図４Ａ〜４Ｄは、図５に示すように調製したｐＳＦＶリンクのＤＮＡ配列（配列番号：４）を示す。
【図５】 リンカー配列（配列番号：５、６）を用いたｐＳＦＶ１からのｐＳＦＶリンク（１１０６０ｂｐ）の構築を示す。
【図６Ａ】 図６Ａ〜６Ｄは、図８Ａ〜８Ｄに示すように調製したプラスミドｐＭＰ７６のヌクレオチド配列（配列番号：１１）を示す。
【図６Ｂ】 図６Ａ〜６Ｄは、図８Ａ〜８Ｄに示すように調製したプラスミドｐＭＰ７６のヌクレオチド配列（配列番号：１１）を示す。
【図６Ｃ】 図６Ａ〜６Ｄは、図８Ａ〜８Ｄに示すように調製したプラスミドｐＭＰ７６のヌクレオチド配列（配列番号：１１）を示す。
【図６Ｄ】 図６Ａ〜６Ｄは、図８Ａ〜８Ｄに示すように調製したプラスミドｐＭＰ７６のヌクレオチド配列（配列番号：１１）を示す。
【図７】 図７は、プラスミドｐＳＦＶリンクのサブセクションを示す（図５参照）。
【図８Ａ】 図８Ａ〜８Ｄは、プラスミドｐＭＰ５３、ｐＭＰ７０、ｐＭＰ４７、ｐＭＰ５５およびｐＭＰ７１からのプラスミドｐＭＰ７６の構築を示す。
【図８Ｂ】 図８Ａ〜８Ｄは、プラスミドｐＭＰ５３、ｐＭＰ７０、ｐＭＰ４７、ｐＭＰ５５およびｐＭＰ７１からのプラスミドｐＭＰ７６の構築を示す。
【図８Ｃ】 図８Ａ〜８Ｄは、プラスミドｐＭＰ５３、ｐＭＰ７０、ｐＭＰ４７、ｐＭＰ５５およびｐＭＰ７１からのプラスミドｐＭＰ７６の構築を示す。
【図８Ｄ】 図８Ａ〜８Ｄは、プラスミドｐＭＰ５３、ｐＭＰ７０、ｐＭＰ４７、ｐＭＰ５５およびｐＭＰ７１からのプラスミドｐＭＰ７６の構築を示す。
【図９Ａ】 図９Ａ〜９Ｂは、プラスミド５２からのプラスミドｐＭＰ５３、ｐＭＰ５４およびｐＭＰ５５の構築を示す。
【図９Ｂ】 図９Ａ〜９Ｂは、プラスミド５２からのプラスミドｐＭＰ５３、ｐＭＰ５４およびｐＭＰ５５の構築を示す。
【図１０】 図１０は、リンカー配列（配列番号：７，８）を用いたｐＵＣ１９からのプラスミドＭＰ５２の構築を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｂは、ｐＵＣ１９と図７に示したように調製したｐＳＦＶリンクのフラグメントとからのプラスミドｐＭＰ４６、ｐＭＰ４７、ｐＭＰ７０の構築を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｂは、ｐＵＣ１９と図７に示したように調製したｐＳＦＶリンクのフラグメントとからのプラスミドｐＭＰ４６、ｐＭＰ４７、ｐＭＰ７０の構築を示す。
【図１２Ａ】 図１２Ａ〜１２Ｂは、プラスミドｐＣＭＶ３からのプラスミドｐＭＰ７１の構築を示す。
【図１２Ｂ】 図１２Ａ〜１２Ｂは、プラスミドｐＣＭＶ３からのプラスミドｐＭＰ７１の構築を示す。
（発明の分野）
本発明はDNAワクチンの分野に関し、特に当該ワクチンに用いる変形アルファウイルス・ベクターに関する。
【０００２】
（発明の背景）
セムリキ森林ウイルス（SFV）は、トガウイルス科のアルファウイルス属の１種である。成熟ウイルス粒子はプラス鎖のSSＲＮＡゲノムの単一コピーを有し、５′末端がキャップ付加され、３′末端がポリアデニル化されている。それはｍＲＮＡとして機能し、細胞に導入されると裸のＲＮＡが感染を開始する。感染／トランスフェクションにともなってゲノムの５′末端の２／３がポリ蛋白に翻訳され、それが自己解裂し、４種類の非構造蛋白が生成する（nsＰｌ→４）。一旦ｎｅ蛋白が合成されると、プラス鎖（４２Ｓ）ゲノムの完全長マイナス鎖への複写に関与する（参考文献１４）。ついで、これらのマイナス鎖はテンプレートとして新しいプラス鎖（４２Ｓ）ゲノムおよび２６ＳサブゲノムｍＲＮＡの合成に使用される（参考文献１−本出願では本発明に関連した技術水準を完全に記載するため各種の参考文献を括弧内に示す。参考文献の完全な情報は明細書の最後に記載する。これら参考文献で開示されている記述は、比較例として本明細書に引用する）。このサブゲノムｍＲＮＡはゲノムの最後の１／３と共直線性であり、ＳＦＶ構造蛋白をコードしている。１９９１年、ＬｉｌｊｅｓｔｒｏｍおよびＧａｒｏｆｆ（参考文献２）は、ＳＦＶ ＣＤＮＡレプリコンに基づいて一連の発現ベクターを設計した。これらのベクターは異種挿入が可能なようにウイルス構造蛋白遺伝子を欠失し、非構造コード領域を保持しているので、ｎｅＰｌ→４レプリカーゼ複合体が生成する。ＲＮＡ複写に必要な短い５′および３′配列因子も保存されている。３フレーム全ての２６９プロモータの下流にポリリンカー、ついで翻訳停止部位が挿入されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応に使用できるようにプラスミドを直線化するため、ＳＦＶ ＣＤＮＡの３′末端の直ぐ後にＳｐｅＩ部位が挿入されている。
【０００３】
異種蛋白をコードしたＳＦＶ ＲＮＡを注射することにより、異種蛋白の発現および抗体の誘導が多くの試験で認められている（参考文献３，４）。免疫賦与を目的として異種蛋白を発現させるためにＳＦＶ ＲＮＡ接種を用いることは、プラスミドＤＮＡ免疫化に関していくつかの利点がある。例えば、ウイルス抗原をコードしたＳＦＶ ＲＮＡは、ウイルスに対する抗体による中和により、力価を低下させることなく抗体の存在下でそのウイルスに導入することができる。また、蛋白はｉｎ ｖｉｖｏで発現されるため、ウイルス自体により発現される蛋白と構造が同じである。したがって、プラスミドＤＮＡ免疫化では、蛋白の精製の過程で起こりうる免疫原性、防御エピトープおよび多分免疫強化の喪失につながるような構造的変化を心配する必要がない。
【０００４】
ここで参考例として引用したＷＯ９５／２７０４４では、アルファウイルスＲＮＡ配列の補助ｃＤＮＡに基づくアルファウイルスｃＤＮＡベクターの利用が開示されている。異種プロモータの転写制御のもとでｃＤＮＡから転写されると、アルファウイルスＲＮＡはそれ自体のレプリカーゼによって自己複写が可能であり、したがって転写された組み換えＲＮＡ分子のコピー数が単純化する。
【０００５】
（発明の要約）
本発明は、アルファウイルスの複写を促進するために前記ＷＯ９５／２７０４４に記載されているアルファウイルスcDNAベクターの変形に関する。本発明では、異種スプライス部位をアルファウイルス、特にセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）のレプリコン配列に導入する。
【０００６】
したがって、本発明は一側面でアルファウイルスＲＮＡゲノムの少なくとも一部の補助ＤＮＡ分子からなり、ＤＮＡ分子が前記アルファウイルスＲＮＡの複写に必須である完全なアルファウイルスＲＮＡゲノム領域の補体を構成し、さらにヒトまたは動物宿主等の適切な宿主でその複写には必須でないＤＮＡ分子の領域に挿入されている異種ＤＮＡ配列を発現することができる異種ＤＮＡ配列からなり、ＤＮＡ分子が前記動物またはヒト宿主で機能するプロモータ配列の転写制御のもとにあり、少なくとも一つの異種スプライス部位がアルファウイルスのＲＮＡスプライシング異常を防止するためにＤＮＡ分子に設けられている。
【０００７】
アルファウイルス分子は巨大分子であり、したがって潜在スプライス部位である可能性が高く、それによってアルファウイルスの複写障害が起こり、異種ＤＮＡ発現能力が損なわれる。本発明にしたがって少なくとも一つの最適異種スプライス部位をアルファウイルスのレプリコン配列に導入することによって、スプライシングが潜在スプライス部位ではなく異種スプライス部位に指向され、除去してもＳＦＶレプリコンの機能が保存され、核からのＲＮＡの運搬が改善される（参考文献６）。
【０００８】
ここで提供する構成物で、プロモータはアルファウイルスＲＮＡレプリコンの効果的な複写に必要な同一５′末端を有する複写が得られるようにアルファウイルス配列の５′末端の上流に配置されている。
【０００９】
さらに、配列の３′末端で適切なｉｎ ｖｉｖｏ解裂が起こるように、セムリキ森林ウイルスセグメントの３′末端にデルタ型肝炎ウイルスリボザイム配列を設けてもよい。その他の配列を用いても、同じ効果が得られる。
【００１０】
異種スプライス部位配列は、参考文献５に記載されているように、ウサギβ−グロビンイントロンＩＩのヌクレオチド配列によって提供してもよい。当該異種スプライス部位配列は、完全なスプライスジャンクションが得られるように完全な配列のいずれの位置に挿入してもよい。スプライシングによって確実に除去しない限り、これによってアルファウイルスの複写が排除される。
【００１１】
私はＳＦＶレプリコン中に５カ所の適切な部位を同定した。これらの部位は、レプリコンのＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩフラグメント（長さ８０１０ｂｐ）内に含まれている（図３）。これら部位の最初の部位は、ＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩフラグメント内の２７１９の位置に存在するＰｐｕ−ＭＩ部位である。
【００１２】
ここで提供する変形ベクターを構築するにあたって、ＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩフラグメントを位置２７１９のＰｐｕ−ＭＩで切断し、マングビーンのヌクレアーゼでＳＦＶ配列から塩基３個を除去して末端を平滑とする。長さ５３６ｂｐの平滑末端β−グロビンＩＩイントロンを部位に結紮し、除去した３塩基の代わりにβ−グロビンイントロン配列の３′末端に付加した配列を挿入する（図１）。
【００１３】
残りのイントロンの挿入に適した４部位は、ＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩフラグメントの２５１８、３１１３、６４９８および６８７２ｂｐのＰｖｕＩＩ部位である。イントロンの挿入は、ＰｖｕＩＩ（平滑末端カッター）で切断し、平滑末端β−グロビンＩＩイントロン配列（図２）をこれら部位のいずれかに結紮することによって行った。
【００１４】
本発明は、別の側面で宿主細胞に異種ＤＮＡ配列を発現させる上で好適な、アルファウイルスＲＮＡゲノムの少なくとも一部の補助ＤＮＡ分子からなり、ＤＮＡ分子が完全なアルファウイルスＲＮＡゲノム領域の補体を構成し、宿主細胞で発現される異種ＤＮＡ配列を挿入するためのクローニング部位を有し、前記クローニング部位がその複写には必須でないＤＮＡ分子の領域に存在し、プロモータ配列が前記宿主細胞で機能し、前記ＤＮＡ分子を転写制御し、得られた転写が同じ５′末端を有するように前記プロモータ配列がＤＮＡ分子の５′末端の上流に配置され、少なくとも一つの異種スプライス部位がプライシング異常を防止するためにアルファウイルス中に完全なスプライス接合部位を形成するようにＤＮＡ分子の補体に設けられ、別のＤＮＡ配列が得られたｍＲＮＡ転写の３′末端における適切なｉｎ ｖｉｖｏ解裂を指向するようにＤＮＡ分子の３′末端に設けられていることからなるクローニングベクターを提供する。
【００１５】
（発明の一般的説明）
上記のように、本発明は変形アルファウイルスＤＮＡに関する。アルファウイルスは、セムリキ森林ウイルスであることが好ましい。特に、本発明は動物またはヒト等の宿主において異種遺伝子発現に用いるクローニングベクターを提供する。
【００１６】
プロモータ配列は、真核生物に由来するプロモータであってもよいし、原核生物に由来するプロモータであってもよい。適切なプロモータはサイトメガロウイルスのイミディエート・アーリー・プロモータ（ｐＣＭＶ）であるが、これらおよびその他の類似プロモータの場合転写が宿主細胞のＤＮＡ−依存ＲＮＡポリメラーゼによって行われるので、ラウス肉腫ウイルスのロングターミナル・リピート・プロモータ（ｐＲＳＶ）等その他のプロモータであってもよい。さらに、ＳＰ６、Ｔ３またはＴ７プロモータも、染色体に挿入されているか、エピソームに残っているＳＰ６、Ｔ３またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ分子をコードした遺伝子で細胞がまず形質変換されている限り使用することができる。これら（ＳＰ６、Ｔ３、Ｔ７）ＲＮＡポリメラーゼをコードした遺伝子の発現は、宿主細胞のＤＮＡ−依存ＲＮＡポリメラーゼに依存する。
【００１７】
異種ＤＮＡ挿入物は、生物学的に活性な蛋白またはポリペプチド等の望ましい物質をコードした配列からなる。例えば、異種ＤＮＡ挿入物は、ＨＩＶ配列、例えば免疫原性または抗原性の蛋白またはポリペプチド、または治療的活性を有する蛋白またはポリペプチドをコードしていてもよい。異種ＤＮＡは、自己解裂リボザイム配列であるＲＮＡ配列補助配列等の追加配列を含んでいてもよい。
【００１８】
ここで提供するＤＮＡベクターは、本発明のさらに別の側面にしたがって、宿主における防御免疫反応等の免疫反応を誘導するためにヒト宿主を含む宿主に投与し、ｉｎ ｖｉｖｏで異種ＤＮＡ配列を発現させてもよい。さらに、ＤＮＡベクターは、当該投与のための免疫原性組成物に製剤してもよい。
【００１９】
（寄託）
セムリキ森林ウイルスレプリコンを含み、ここで引用したいくつかのベクターは、ブタペスト条約に従い、本発明の出願前にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｅａｓ、ＶＡ ２０１１０−２２０９、米国に供託した。
【００２０】
供託したプラスミドのサンプルは、本米国出願特許が成立し、全てのアクセス制限が解除された段階で入手することができる。供託株が死滅した場合は、交換される。供託した実施例は本発明の説明を目的としたに過ぎず、ここで記載し、請求した発明は供託したプラスミドの範囲に限られるものではない。
【００２１】
（寄託の要約）
プラスミド：ｐＭＰ７６
ＡＴＣＣ表示番号：
供託日：
（実施例）
上記の開示は、本発明を一般的に記載したものである。以下の実施例によって、本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は本発明を説明するために記載したものであり、それによって本発明の範囲を制限するものではない。形態の変更および等価物での置換は、本発明から容易に推察できるものとする。ここでは特殊な用語を用いたが、これらの用語は説明のために用いたものであり、発明の範囲を制限するためではない。
【００２２】
本開示に記載した分子遺伝学的、蛋白生化学的および免疫学的方法は、用いた方法が明確に記載されているとは限らないが、これらの実施例は科学的文献に十分記載されており、当該技術分野の専門家には容易に理解できるものと考える。
実施例１
この実施例は、図５、７、８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、８Ｄ、９Ａ、９Ｂ、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１２Ａおよび１２Ｂに示したプラスミドｐＭＰ７６の構築に関する。
【００２３】
プラスミドｐＳＦＶ１（Ｇｉｂｃｏ）をＢａｍＨＩで制限し、プラスミドｐＳＦＶリンクを調製した。ついで、このプラスミドをリンカー（配列番号：５および６）で結紮し、プラスミドｐＳＦＶリンク（図４Ａ〜４Ｄ、図５）を調製した。
【００２４】
ｐＳＦＶリンクをＥｃｏＲＶおよびＳｐｅＩで制限し、８９０ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩフラグメントを分離することにより、一部のＳＦＶレプリコンフラグメントのサブクローニングを行った。ついで、このフラグメントをＥｃｏＲＩで制限し、１９０６ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ、１５７８ｂｐおよび３６２７ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ、および８９９ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩフラグメントを分離した（図７）。
【００２５】
１９０９ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ SFVフラグメントをＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ制限プラスミドｐＭＰ５２にクローニングし、プラスミドｐＭＰ５３を得た（図９Ａ）。８９９ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩ SFVフラグメントをＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩ制限プラスミドｐＭＰ５２にクローニングし、プラスミドｐＭＰ５４を得た（図９Ａ）。ついで、プラスミドｐＭＰ５４をＳｐｅＩで制限し、マングビーンヌクレアーゼで平滑末端とした。ついで、プラスミドをＢｇｌＩＩで制限し、脱リン酸化し、デルタ肝炎ウイルスリボザイムリンカー（配列番号：９および１０）に結紮し、それをリン酸化してｐＭＰ５５を得た（図９Ｂ）。
【００２６】
プラスミドｐＭＰ５２は、リンカー（配列番号：７および８）をｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位に結紮して調製した（図１０．
１５７８ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳＦＶフラグメントをｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、ｐＭＰ４６を得た（図１１Ａ）。ついで、このプラスミドをＰｐｕＭ１で制限し、マングビーンのヌクレアーゼで平滑末端とした。ウサギβ−グロビンイントロンＩＩ ＰＣＲフラグメント（図１）をマングビーンヌクレアーゼで平滑末端とし、リン酸化し、ＰｐｕＭＩ制限ｐＭＰ４６に結紮し、プラスミドｐＭＰ７０を得た（図１１Ｂ）。
【００２７】
３６２７ｂｐのＥｃｏＲＩ ＳＦＶフラグメントをｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、ｐＭＰ４７を得た（図１１Ａ）。
【００２８】
ＣＭＶプロモータ、イントロンＡ配列、ＢＧＨポリＡ配列およびＳＵ４０ポリＡ配列を含むプラスミドｐＣＭＶ３をＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＶで制限した。３１９１ｂｐのＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを分離し、脱リン酸化した。１３２１ｂｐのＥｄｅＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを分離し、ＳａｃＩで制限した。３３４ｂｐのＮｄｅＩ−ＳａｃＩフラグメントを分離した（図１２Ａ）。分離したＳＦＶの５′−末端を含むＳａｃＩ−ＥｃｏＲＶ ＰＣＲフラグメントをあらかじめ分離した３３４ｂｐのＮｓｅＩ−ＳａｃＩフラグメントおよび３１９１ｂｐのＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントに結紮し、ｐＭＰ７１を得た（図１２Ａおよび１２Ｂ）。
【００２９】
ついで、プラスミドｐＭＰ５３をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで制限し、ｐＭＰ７０から分離し、脱リン酸化した２１５１ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントに結紮した（図８Ａ）。ついで、この結紮物をＥｃｏＲＶで制限し、４０５７ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩフラグメントを精製した（図８Ａ）。
【００３０】
プラスミドｐＭＰ４７をＥｃｏＲＩおよび分離し、脱リン酸化した３６２７ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントで制限した（図８Ｂ）。ついで、プラスミドｐＭＰ５５をＢｇｌＩＩで制限し、脱リン酸化し、ＥｃｏＲＩで制限した。９８５ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｌＩＩフラグメントを分離し、ｐＭＰ４７からあらかじめ分離したＥｃｏＥＩフラグメントに結紮した（図８Ｂ）。ついで、結紮反応物をリン酸化し、４６１２ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントを分離した。
【００３１】
プラスミドｐＭＰ７１をＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで制限し、ついで脱リン酸化した。このフラグメントは、あらかじめｐＭＰ４７およびｐＭＰ５５から分離した４６１２ｂｐのＥｃｏＲＩッＢｇｌＩＩフラグメント、ｐＭＰ５３およびｐＭＰ７０から分離した４０５７ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩフラグメントで３方結紮し、ｐＭＰ７６を得た（図８Ｂおよび８Ｃ）。
【００３２】
５′-ATCTATGAGCTCGTTTAGTGAACCGTATGGCGGATGTGTGACATACA−３′
の配列を有するプライマーＳＦＶ−５′−３と、
５′−TCCACCTCCAAGGATATCCAAGATGAGTGTG−３′
の配列を有するプライマーＥｃｏＲ−ＳＰＥ（それぞれ配列番号：９および１０）を用い、ＣＭＶプロモータとＳＦＶレプリコンの５′末端の間でｐＳＦＶ１のＰＣＲ増幅を行い、ＳＦＶレプリコンの５′末端を得た。得られたＰＣＲフラグメントをＳａｃＩおよびＥｃｏＲＶで制限し（図１３、配列番号：１１）、フラグメントを分離した。
【００３３】
（開示の要約）
この開示を要約すると、本発明はアルファウイルスゲノムの異常スプライシングを防止し、核からのＲＮＡの運搬を改善するために少なくとも１個の最適スプライス部位がアルファウイルスのレプリコンに導入されていることを特徴とする変形アルファウイルス発現ベクターを提供する。本発明の範囲で、改良が可能である。
【００３４】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【図１】 β−グロビンイントロンＩＩのＤＮＡ配列およびその３′末端に付加した３つのヌクレオチド（配列番号：１）を示す。
【図２】 β−グロビンイントロンＩＩのＤＮＡ配列（配列番号：２）を示す。
【図３Ａ】 図３Ａ〜３Ｃは、セムリキ森林ウイルスレプリコンのＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩフラグメントのＤＮＡ配列（配列番号：３）を示す。
【図３Ｂ】 図３Ａ〜３Ｃは、セムリキ森林ウイルスレプリコンのＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩフラグメントのＤＮＡ配列（配列番号：３）を示す。
【図３Ｃ】 図３Ａ〜３Ｃは、セムリキ森林ウイルスレプリコンのＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩフラグメントのＤＮＡ配列（配列番号：３）を示す。
【図４Ａ】 図４Ａ〜４Ｄは、図５に示すように調製したｐＳＦＶリンクのＤＮＡ配列（配列番号：４）を示す。
【図４Ｂ】 図４Ａ〜４Ｄは、図５に示すように調製したｐＳＦＶリンクのＤＮＡ配列（配列番号：４）を示す。
【図４Ｃ】 図４Ａ〜４Ｄは、図５に示すように調製したｐＳＦＶリンクのＤＮＡ配列（配列番号：４）を示す。
【図４Ｄ】 図４Ａ〜４Ｄは、図５に示すように調製したｐＳＦＶリンクのＤＮＡ配列（配列番号：４）を示す。
【図５】 リンカー配列（配列番号：５、６）を用いたｐＳＦＶ１からのｐＳＦＶリンク（１１０６０ｂｐ）の構築を示す。
【図６Ａ】 図６Ａ〜６Ｄは、図８Ａ〜８Ｄに示すように調製したプラスミドｐＭＰ７６のヌクレオチド配列（配列番号：１１）を示す。
【図６Ｂ】 図６Ａ〜６Ｄは、図８Ａ〜８Ｄに示すように調製したプラスミドｐＭＰ７６のヌクレオチド配列（配列番号：１１）を示す。
【図６Ｃ】 図６Ａ〜６Ｄは、図８Ａ〜８Ｄに示すように調製したプラスミドｐＭＰ７６のヌクレオチド配列（配列番号：１１）を示す。
【図６Ｄ】 図６Ａ〜６Ｄは、図８Ａ〜８Ｄに示すように調製したプラスミドｐＭＰ７６のヌクレオチド配列（配列番号：１１）を示す。
【図７】 図７は、プラスミドｐＳＦＶリンクのサブセクションを示す（図５参照）。
【図８Ａ】 図８Ａ〜８Ｄは、プラスミドｐＭＰ５３、ｐＭＰ７０、ｐＭＰ４７、ｐＭＰ５５およびｐＭＰ７１からのプラスミドｐＭＰ７６の構築を示す。
【図８Ｂ】 図８Ａ〜８Ｄは、プラスミドｐＭＰ５３、ｐＭＰ７０、ｐＭＰ４７、ｐＭＰ５５およびｐＭＰ７１からのプラスミドｐＭＰ７６の構築を示す。
【図８Ｃ】 図８Ａ〜８Ｄは、プラスミドｐＭＰ５３、ｐＭＰ７０、ｐＭＰ４７、ｐＭＰ５５およびｐＭＰ７１からのプラスミドｐＭＰ７６の構築を示す。
【図８Ｄ】 図８Ａ〜８Ｄは、プラスミドｐＭＰ５３、ｐＭＰ７０、ｐＭＰ４７、ｐＭＰ５５およびｐＭＰ７１からのプラスミドｐＭＰ７６の構築を示す。
【図９Ａ】 図９Ａ〜９Ｂは、プラスミド５２からのプラスミドｐＭＰ５３、ｐＭＰ５４およびｐＭＰ５５の構築を示す。
【図９Ｂ】 図９Ａ〜９Ｂは、プラスミド５２からのプラスミドｐＭＰ５３、ｐＭＰ５４およびｐＭＰ５５の構築を示す。
【図１０】 図１０は、リンカー配列（配列番号：７，８）を用いたｐＵＣ１９からのプラスミドＭＰ５２の構築を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｂは、ｐＵＣ１９と図７に示したように調製したｐＳＦＶリンクのフラグメントとからのプラスミドｐＭＰ４６、ｐＭＰ４７、ｐＭＰ７０の構築を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｂは、ｐＵＣ１９と図７に示したように調製したｐＳＦＶリンクのフラグメントとからのプラスミドｐＭＰ４６、ｐＭＰ４７、ｐＭＰ７０の構築を示す。
【図１２Ａ】 図１２Ａ〜１２Ｂは、プラスミドｐＣＭＶ３からのプラスミドｐＭＰ７１の構築を示す。
【図１２Ｂ】 図１２Ａ〜１２Ｂは、プラスミドｐＣＭＶ３からのプラスミドｐＭＰ７１の構築を示す。
Claims (16)
- アルファウイルスＲＮＡゲノムの少なくとも一部と相補的な相補ＤＮＡ分子を含む発現ベクターであって、
該相補ＤＮＡ分子が前記アルファウイルスＲＮＡの複製に必須である完全なアルファウイルスＲＮＡゲノム領域の相補体と、宿主中での発現が可能な異種ＤＮＡ分子とを含み、
該異種ＤＮＡ分子は該相補ＤＮＡ分子中の該相補ＤＮＡ分子の複製には必須でない領域に挿入されており、
更に、該相補ＤＮＡ分子は該宿主中で機能し得るプロモーター配列による転写制御下に置かれており、
かつ、異常なＲＮＡスプライシングを防止するために少なくとも１つの異種スプライス部位が該相補ＤＮＡ分子に設けられている
ことを特徴とする発現ベクター。 - 前記プロモーター配列が、前記相補ＤＮＡ分子の５′末端の上流に設けられ、得られた転写物が対応する５′末端をそのまま有する請求項１に記載の発現ベクター。
- 前記プロモーター配列が、サイトメガロウイルスのイミディエート・アーリー・プロモータである請求項１または２に記載の発現ベクター。
- 前記相補ＤＮＡ分子の３′末端での適切なｉｎ ｖｉｖｏ解裂を指示するための追加ＤＮＡ配列を、該相補ＤＮＡの３′末端に有し、該追加ＤＮＡ配列がリボザイム配列である請求項１〜３のいずれかに記載の発現ベクター。
- 前記追加ＤＮＡ配列がデルタ肝炎リボザイム配列である請求項４に記載の発現ベクター。
- 前記異種スプライス部位配列がウサギβ−グロビンイントロンＩＩのＤＮＡ配列によって提供されたものである請求項１〜５のいずれかに記載の発現ベクター。
- 前記異種スプライス部位配列が、完全なスプライス接合部位を形成し、除去してもＳＦＶレプリコンの機能を保持する位置で前記相補ＤＮＡ分子中に挿入されている請求項１〜６のいずれかに記載の発現ベクター。
- アルファウイルスがセムリキ森林ウイルス（Ｓｉｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）である請求項１〜７のいずれかに記載の発現ベクター。
- 前記少なくとも１つの異種スプライス部位が、前記ＳＦＶレプリコンのＥｃｏＲＶ−Ｓｐｅｌ断片中の位置２７１９のＰｐｕ−ＭＩ部位、位置２５１８、３１１３、６４９８及び６８７２のＰｖｕ II 部位の少なくとも１つである請求項８に記載の発現ベクター。
- 宿主細胞内で異種ＤＮＡ配列を発現するのに好適なクローニングベクターであって、
（１）アルファウイルスＲＮＡゲノムの少なくとも１部に相補的な相補ＤＮＡ配列であって、完全なアルファウイルスＲＮＡの複製領域の相補体と、前記宿主細胞中で発現し得る異種ＤＮＡ配列を挿入するためのクローニング部位と、を有し、該クローニング部位が該相補ＤＮＡ分子のそれ自身の複製に必須ではない領域に位置する相補ＤＮＡ配列と、
（２）前記宿主細胞中で機能することができ、前記相補ＤＮＡ分子の転写を制御するプロモーター配列であって、該プロモーター配列は、転写により得られる転写物が、対応する５′末端をそのまま有するように前記相補ＤＮＡ分子の５′末端の上流に位置するプロモーター配列と、
（３）異常なＲＮＡスプライシングを防止し、アルファウイルス中の完全なスプライス結合を形成するために前記相補ＤＮＡ分子の有する前記相補体中に供給された少なくとも１つの異種スプライス部位と、
（４）形成されるＲＮＡ分子の３′末端における適切なｉｎ ｖｉｖｏ開裂を指示するための、前記相補ＤＮＡ分子の３′末端に位置する追加ＤＮＡ配列と、
を有し、
該追加ＤＮＡ配列がリボザイム配列である
ことを特徴とするクローニングベクター。 - 前記異種スプライス部位が、ウサギβ−グロビンイントロンＩＩのＤＮＡ配列によって提供されたものである請求項１０に記載のクローニングベクター。
- 前記追加ＤＮＡ配列がデルタ肝炎リボザイム配列である請求項１０または１１に記載のクローニングベクター。
- 前記アルファウイルスが、セムリキ森林ウイルスである請求項１０〜１２のいずれかに記載のクローニングベクター。
- 前記異種スプライス部位の少なくとも１つが、前記ＳＦＶレプリコンのＥｃｏＲＶ−Ｓｐｅｌ断片中の位置２７１９のＰｐｕ−ＭＩ部位、位置２５１８、３１１３、６４９８及び６８７２のＰｖｕ II 部位の少なくとも１つにある請求項１３に記載のクローニングベクター。
- 以下の構成：
- 配列番号：１１で示される配列を有する請求項１０〜１５のいずれかに記載のクローニングベクター。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US6579397P | 1997-11-14 | 1997-11-14 | |
| US60/065,793 | 1997-11-14 | ||
| PCT/CA1998/001065 WO1999025859A1 (en) | 1997-11-14 | 1998-11-13 | Alphavirus vectors |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002508925A JP2002508925A (ja) | 2002-03-26 |
| JP3835669B2 true JP3835669B2 (ja) | 2006-10-18 |
Family
ID=22065156
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000521222A Expired - Fee Related JP3835669B2 (ja) | 1997-11-14 | 1998-11-13 | アルファウイルス・ベクター |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1029069B9 (ja) |
| JP (1) | JP3835669B2 (ja) |
| AT (1) | ATE334217T1 (ja) |
| AU (1) | AU753729B2 (ja) |
| BR (1) | BR9814171A (ja) |
| CA (1) | CA2309835A1 (ja) |
| DE (1) | DE69835369T2 (ja) |
| DK (1) | DK1029069T3 (ja) |
| ES (1) | ES2268797T3 (ja) |
| PT (1) | PT1029069E (ja) |
| WO (1) | WO1999025859A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6015686A (en) | 1993-09-15 | 2000-01-18 | Chiron Viagene, Inc. | Eukaryotic layered vector initiation systems |
| US6451592B1 (en) | 1996-04-05 | 2002-09-17 | Chiron Corporation | Recombinant alphavirus-based vectors with reduced inhibition of cellular macromolecular synthesis |
| US8647864B2 (en) | 1999-04-14 | 2014-02-11 | Novartis Ag | Compositions and methods for generating an immune response utilizing alphavirus-based vector systems |
| AU2001275191A1 (en) | 2000-05-31 | 2001-12-11 | Chiron Corporation | Method for the purification of alphavirus replicon particles |
| ES2292271B1 (es) * | 2004-05-20 | 2009-02-16 | Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. | Un vector hibrido adenovirus-alfavirus para la administracion eficaz y expresion de genes terapeuticos en celulas tumorales. |
| CN1927403B (zh) * | 2006-09-29 | 2010-09-29 | 张永亮 | 用于促进仔猪生长、提高仔猪免疫力的药物及制备方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE9401091D0 (sv) * | 1994-03-31 | 1994-03-31 | Bioption Ab | Alphavirus cDNA vectors |
| AU4594996A (en) * | 1994-11-30 | 1996-06-19 | Chiron Viagene, Inc. | Recombinant alphavirus vectors |
| US6019980A (en) * | 1995-06-07 | 2000-02-01 | Connaught Laboratories Limited | Nucleic acid respiratory syncytial virus vaccines |
-
1998
- 1998-11-13 DK DK98954098T patent/DK1029069T3/da active
- 1998-11-13 EP EP98954098A patent/EP1029069B9/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-13 CA CA002309835A patent/CA2309835A1/en not_active Abandoned
- 1998-11-13 AT AT98954098T patent/ATE334217T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-11-13 WO PCT/CA1998/001065 patent/WO1999025859A1/en active IP Right Grant
- 1998-11-13 ES ES98954098T patent/ES2268797T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-13 DE DE69835369T patent/DE69835369T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-13 JP JP2000521222A patent/JP3835669B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-13 PT PT98954098T patent/PT1029069E/pt unknown
- 1998-11-13 AU AU11391/99A patent/AU753729B2/en not_active Ceased
- 1998-11-13 BR BR9814171-6A patent/BR9814171A/pt not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2268797T3 (es) | 2007-03-16 |
| DE69835369T2 (de) | 2007-08-23 |
| DE69835369D1 (de) | 2006-09-07 |
| EP1029069B9 (en) | 2006-12-27 |
| CA2309835A1 (en) | 1999-05-27 |
| BR9814171A (pt) | 2001-10-30 |
| ATE334217T1 (de) | 2006-08-15 |
| AU1139199A (en) | 1999-06-07 |
| EP1029069A1 (en) | 2000-08-23 |
| WO1999025859A1 (en) | 1999-05-27 |
| JP2002508925A (ja) | 2002-03-26 |
| DK1029069T3 (da) | 2006-12-18 |
| PT1029069E (pt) | 2006-12-29 |
| EP1029069B1 (en) | 2006-07-26 |
| AU753729B2 (en) | 2002-10-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0753053B1 (en) | ALPHAVIRUS cDNA VECTORS | |
| JP3946768B2 (ja) | アルファウイルスｒｎａレプリコン系 | |
| US7572628B2 (en) | Eukaryotic layered vector initiation systems | |
| EP0814154B1 (en) | Recombinant alphavirus vectors | |
| US6692750B1 (en) | Alphavirus expression vector | |
| WO2008119827A1 (en) | Transreplicase constructs | |
| JP2004501646A5 (ja) | ||
| AU2021374174A9 (en) | Production of virus vector plasmid in bacillus subtilis | |
| AU2021374174A1 (en) | Production of virus vector plasmid in bacillus subtilis | |
| JP3835669B2 (ja) | アルファウイルス・ベクター | |
| MXPA00004707A (es) | Vectores de alfa virus | |
| JPH11504802A (ja) | 組換えアルファウイルスベクター | |
| US6255104B1 (en) | Recombinant poliovirus vector and method of preparing the same | |
| KR20230044631A (ko) | 자가 증폭이 가능하고 단백질을 합성하는 mRNA/DNA 하이브리드 시스템 및 이의 조성물 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20060621 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20060720 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |