JP2011135897A - 遺伝子送達のための改変ノダウイルスrna - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、改変されたノダウイルスRNA1分子を提供する。この改変されたノダウイルスRNA1分子は、そのレプリカーゼORFの下流に(好ましくはそのB2 ORFの下流に)異種挿入を含む。この挿入は、好ましくは、1つ以上のタンパク質コード領域を含む。改変RNA1は、VLP(例えば、パピローマウイスルVLP)にパッケージされ得る。小さいサイズのノダウイルスRNA1は、このノダウイルスRNA1をHPVパッケージングに理想的にする。
【選択図】なし
Description
本発明は、遺伝子送達の分野、より詳細にはウイルス様粒子(VLP)にパッケージされた改変ノダウイルスRNAを用いた、発現のための遺伝子の送達の分野である。
Nodaviridaeは、二分節のRNAゲノムを有する。換言すれば、Nodaviridaeゲノムは、RNA1およびRNA2と命名された、2つの別個の一本鎖RNA分子からなる。これらは両方とも、同一のビリオン中にパッケージされている。RNA1はRNAレプリカーゼをコードし、RNA2はビリオンキャプシドタンパク質をコードする。フロックハウスウイルス(FHV)において、RNA1は3.1kb長であり、RNA2は1.4kbである。
本発明は、改変ノダウイルスRNA1分子を提供し、この改変ノダウイルスRNA1分子は、このRNA1のレプリカーゼORFの下流に異種挿入を含む。この挿入は、好ましくは、上記RNA1のレプリカーゼORFおよびB2 ORFの下流である。
本発明は、ノダウイルスのRNA1分子に基づく。RNA1は、ノダウイルスゲノムを特異的に複製するRNAレプリカーゼをコードし、そしていくつかのノダウイルス(例えば、フロックハウスウイルス(登録番号X77156)、ゴキブリウイルス(登録番号X02396およびK02560)、シマアジ神経壊死ウイルス(AB025018)、パリアコト(pariacoto)ウイルス(AF171942)、ノダムラウイルス(AF174533)、ゴキブリウイルス(NC_001411)およびオヒョウ神経壊死ウイルス(AJ401165))由来の配列が利用可能である。
ノダウイルスの利用可能なRNA1配列(上記を参照のこと)は、レプリカーゼ(または「A」)および「B2」ORFの位置を示す。本発明の分子における挿入は、レプリカーゼORFの下流であり、好ましくはB2 ORFの下流でもある。
本発明の改変RNA1は、異種挿入を保有する。この挿入は、好ましくはそれ自体の開始コドンおよび終止コドンを有する1つ以上のタンパク質コード領域を含む。
改変RNA1を細胞に送達するために、例えば、ウイルス様粒子(VLP)または偽ビリオン(pseudovirion)中にそれをパッケージングすることが好ましい。
本発明の改変RNA1は、代表的に、正のセンス方向であり、そして一本鎖である。本発明はまた、以下を提供する:(i)本発明のRNA1に相補的な一本鎖核酸;(ii)(i)に相補的な一本鎖核酸;(iii)本発明のRNA1に相補的な配列を含む一本鎖核酸;(iv)(i)に相補的な核酸を含む一本鎖核酸;および(v)鎖の1つが(i)、(ii)、(iii)、または(iv)である二本鎖核酸。用語「核酸」は、RNA、DNA、ならびにPNA(ペプチド核酸)および骨格改変DNA(backbone−modified DNA)またはRNA(例えば、ホスホロチオエートなど)のようなアナログを含む。核酸は、インビトロかまたはインビボでRNAポリメラーゼにより転写されて、本発明の改変RNA1を生成し得ることが理解される。
ノダウイルスは、アルファノダウイルスとベータノダウイルスに分けられ、そしてノダムラウイルス、ゴキブリウイルス、Boolarraウイルス、フロックハウスウイルス(FHV)、マイマイガウイスル、マナワトゥウイルス、太西洋オヒョウウイルス、トラフグ神経壊死ウイルス、マツカワ神経壊死ウイルス、日本ヒラメ神経壊死ウイルス、Dicentrachus labrax脳炎ウイルス、パリアコトウイルス、アロワナ(Dragon)神経壊死ウイルス、オヒョウ神経壊死ウイルス、Malabaricus神経壊死ウイルス、Redspotted grouper神経壊死ウイルス、Umbrina cirrosaノダウイルス、およびシマアジ神経壊死ウイスルを含む。これらのウイルスのいずれか由来のRNA1分子が、本発明に従い用いられ得る。しかし、分子レベルで最も研究されているノダウイルスであるという理由で、FHVおよびノダムラウイルスが好ましい。ノダウイルスのさらなる詳細は、Garzon & Charpentier(Atlas of invertebrate viruses(Adams & Bonami編)の351−370頁、CRC press(1992))およびHendry(Viruses of invertebrates(Kurstak編)の227−276頁、Marcel Deker(1991))に見出され得る。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1) RNA1のレプリカーゼORFの下流に異種挿入を含む、改変ノダウイルスRNA1分子。
(項目2) 前記異種挿入がまた、前記RNA1のB2 ORFの下流でもある、項目1に記載のRNA1分子。
(項目3) 前記異種挿入が、前記レプリカーゼORFおよびB2 ORFの5ヌクレオチドよりも下流である、項目2に記載のRNA1分子。
(項目4) 前記異種挿入が、RNA1の3’末端の5ヌクレオチドよりも上流である、項目1〜3のいずれかに記載のRNA1分子。
(項目5) 前記異種挿入が、タンパク質コード領域を含む、項目1〜4のいずれかに記載のRNA1分子。
(項目6) 前記異種挿入が前記タンパク質コード領域の上流にIRESを含む、項目5に記載のRNA1分子。
(項目7) 前記RNA1がタンパク質配列と特異的に相互作用し得る配列を含む、項目1〜6のいずれかに記載のRNA1分子。
(項目8) 前記タンパク質配列と特異的に相互作用し得る配列がTAR配列である、項目7に記載のRNA1分子。
(項目9) 前記TAR配列が前記異種挿入内に存在する、項目8に記載のRNA1分子。
(項目10) 項目1〜9のいずれかに記載のRNA1分子を含む、VLP。
(項目11) 前記VLPがパピローマウイルスVLPである、項目10に記載のVLP。
(項目12) 前記VLP L1タンパク質がtat配列を含み、キャプシドに包まれたRNA1分子が項目6〜8のいずれか1項に記載のRNA1分子である、項目11に記載のVLP。
(項目13) tatおよびTARがHIVまたはBIV由来である、項目12に記載のVLP。
(項目14) 項目1〜9のいずれか1項に記載のRNA1に相補的である、一本鎖核酸。
(項目15) 項目14に記載の核酸に相補的である、一本鎖核酸。
(項目16) 項目1〜9のいずれか1項に記載のRNA1に相補的である配列を含む、一本鎖核酸。
(項目17) 二本鎖核酸であって、該鎖のうちの1つが項目14〜16のいずれか1項に記載の一本鎖核酸である、二本鎖核酸。
(項目18) 項目1〜9のいずれか1項に記載のRNA1を産生するためのプロセスであって、(a)ノダウイルスRNA1配列を含むかまたはこれをコードする核酸を得る工程;および(b)該RNA1配列内のレプリカーゼORFの下流に異種配列を挿入する工程を包含する、プロセス。
(項目19) 項目18に記載のプロセスであって、工程(b)が、前記RNA1配列内の前記レプリカーゼおよびB2 ORFの下流に異種配列を挿入する工程を包含する、プロセス。
(項目20) 項目10〜13のいずれか1項に記載のVLPを産生するためのプロセスであって、該プロセスは、細胞を項目14〜17のいずれか1項に記載の核酸でトランスフェクトする工程;細胞をVLPキャプシドタンパク質をコードする核酸でトランスフェクトする工程であって、該タンパク質は、必要に応じて改変されて改変RNA1に特異的なモチーフを含む、工程;ならびにVLPを該細胞から精製する工程を包含する、プロセス。
(項目21) 目的の核酸配列を細胞に送達するためのプロセスであって、該プロセスは、項目10〜13のいずれか1項に記載のVLPを該細胞に導入する工程を包含し、該目的の核酸配列は、該VLP中に含まれる改変RNA1分子である、プロセス。
(項目22) 医薬としての使用のための、項目1〜9のいずれか1項に記載のRNA1。
(項目23) 医薬としての使用のための、項目10〜13のいずれか1項に記載のVLP。
(項目24) 項目10〜13のいずれか1項に記載のVLPを前記細胞に導入する工程を包含する、核酸配列を細胞に送達するためのプロセス。
(項目25) インビトロで実行される、項目23に記載のプロセス。
(項目26) インビボで実行される、項目23に記載のプロセス。
(項目27) VLP内に核酸をパッケージングするための、tat/TAR相互作用の使用。
(項目28) ノダウイルス由来のRNA1配列を含むRNAであって、該RNA1配列がそのレプリカーゼORFの下流に異種挿入を含むという点で特徴的である、RNA。
(項目29) 前記異種挿入がB2 ORFの下流である、項目28に記載のRNA。
(FHVのRNA1)
FHVゲノム由来のRNA1の配列は、GenBankにおいて登録番号X77156として与えられる。このRNA1に対応する二本鎖cDNA(3107bp)が、図1に示される。
クローニングを容易にするために、RNA1に対して種々の変更がなされた。
−プライマーApaI−fおよびDRS−r(表I)は、ApaI部位(2349位)と3101位との間のRNA1のフラグメントを増幅した。SacIIおよびNotI制限部位の導入を、DRS−rプライマー中に2つの配列を導入することにより達成した(図6a)。
−プライマーDRS−f(DRS−rの相補鎖)およびRI−KpnI−rは、ヌクレオチド3039からKpnI部位(3368位)までの領域にわたるフラグメントを増幅した(図6a)。
酵母においてRNA1(およびその改変バージョン)を発現させるために、cDNAを酵母ベクターの、酵母特異的プロモーターの下流にクローン化した。このベクターは、レプリカーゼをコードし、そして(リボザイム開裂後に)自己複製に適合する5’および3’末端を有するRNA1分子の転写を指向する。全体的なアプローチは、図7に示される。
異種挿入をRNA1配列の内部に作製した。緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するための遺伝子(Chalfie et al.(1994)Science 263:802−806)を、HIV由来のTAR配列と共に、レプリカーゼおよびB2のオープンリーディングフレームの下流に挿入した。
ポリシストロン性RNAは、目的の2つの遺伝子間への内部リボソーム侵入部位(IRES)の挿入によって哺乳動物において翻訳され得(Parksら(1986)J.Virol.60:376−384)、これによって、第2の(下流)遺伝子のcap非依存性翻訳を可能にする。従って、異種挿入からの発現を促進するために、脳心筋炎ウイルス由来のIRESを、EGFP−1遺伝子の前に挿入した。このIRESは、代表的に、哺乳動物細胞においてのみEGFPタンパク質の翻訳を提供する。なぜなら、IRES媒介翻訳は、酵母において選択的に阻害されるからである。(Venkatesanら(1999)Nucl.Acids Res.27:562−572)。
4つの酵母発現プラスミドを、以下の基本的な5’から3’の配置を用いて構築した:酵母特異的プロモーター;改変RNA1;HDVリボザイム;T7ターミネーター;酵母ポリA部位。
1.BsshII−SalI L1フラグメントを、pFHV−EGFP−1/TARΔ由来のBsshII−SalIフラグメントと置換して、pBS−ADH2−RNA1−EGFP−1/TARΔ(図15)を得た。
2.BsshII−SalI L1フラグメントを、pFHV−MutΔ由来のBsshII−SalIフラグメントと置換して、pBS−ADH2−RNA1−MutΔ(図16)を得た。
3.pBS−ADH2−RNA1−MutΔ中の特有のBsshII部位(1273)を充填し(レプリカーゼORFの妨害を伴う)、pBS−ADH2−RNA1−MutΔ(−)(図17)を作製した。
4.pBS−ADH2−RNA1−MutΔ中のBsshII−SalIフラグメント(改変RNA1 cDNA配列の一部を含む)の、pFHV−IRES−EGFP−1/b−TAR由来の対応するBsshII−SalIフラグメント(IRES−EGFP−1/b−TARを含む)での置換によって、pBS−ADH2−RNA1−IRES−EGFP−1/b−TAR(図18)という名のプラスミドを作製した。
プラスミドpBS−ADH2−RNA1−EGFP−1/TARΔ、pBS−ADH2−RNA1−MutΔ、pBS−ADH2−RNA1−MutΔ(−)およびpBS−ADH2−RNA1−IRES−EGFP−1/b−TAR(図15〜18)を、実験室において以前に得たHPV−16 L2タンパク質を発現するAB110菌株(WO00/09699)に形質転換することによって導入した。生じた菌株を、それぞれ、pBS−RI−G/TΔ(選択したクローン4および5)、pBS−RI−MutΔ(選択したクローン1および3)、pBS−RI−MutΔ(−)(選択したクローン5および7)およびpBS−RI−IRES−G/b−TAR(選択したクローン5および9)と命名した。
(RNA複製の確認)総RNAを、菌株pBS−RI−MutΔ、pBS−RI−MutΔ(−)およびpBS−RI−IRES−G/b−TARから抽出して、それぞれ、RepA(+)、RepA(−)およびRepA(+)−GFPと標識した。これらのRNAを、c−と標識したAB110菌株由来のネガティブコントロールRNAと一緒に、プライマーApaI−fおよびrepA−Revを用いてpFHV[1,0]に対して実行したPCRによって得た非放射性DNAプローブ(BrighStar Psoralen−Biotin標識キット,Ambion)(600bp)を用いて、ノーザンブロットによって分析した。
approach(Powell & Newman編)Plenum Press]。免疫前血清を、免疫の前に収集し、そして血清サンプルを、各免疫後に2週間で採取した。
1)R1−revを用いた逆転写
2)キットで供給される外部RNAアダプタープライマーおよび逆方向プライマーAZ−9rev(RNA1上のnt426)を用いた外部PCR
3)キットで供給される内部RNAアダプタープライマーおよびR1−120を用いた内部PCR。
1)AZ−5rev(RNA1のnt 3101)を用いた逆転写
2)キットで供給される外部RNAアダプタープライマーおよび逆方向プライマーAZ−5revを用いた外部PCR
3)キットで供給される内部RNAアダプタープライマーおよびR3−2809rev(RNA1上のnt 2830)を用いた内部PCR。
TAR挿入物を保有する改変RNA1のパッケージングを促進するために、HPV−6のL1コートタンパク質を、相補的なtatモチーフをそのC末端に含むように改変した。
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