HUT54306A - Process for producing proteins, vaccines and nucleic acids - Google Patents
Process for producing proteins, vaccines and nucleic acids Download PDFInfo
- Publication number
- HUT54306A HUT54306A HU903490A HU349090A HUT54306A HU T54306 A HUT54306 A HU T54306A HU 903490 A HU903490 A HU 903490A HU 349090 A HU349090 A HU 349090A HU T54306 A HUT54306 A HU T54306A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- sequence
- protein
- nucleic acid
- dna
- virus
- Prior art date
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 29
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 28
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 27
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 55
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 19
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 3
- 102100029241 Influenza virus NS1A-binding protein Human genes 0.000 claims abstract description 88
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 77
- 101000633984 Homo sapiens Influenza virus NS1A-binding protein Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 34
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 34
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 20
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 17
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 64
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 54
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 43
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 31
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 31
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 29
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 28
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 20
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 18
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 16
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 13
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 4
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 claims description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims 1
- 208000004006 Tick-borne encephalitis Diseases 0.000 abstract description 52
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 abstract description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 5
- 239000000470 constituent Substances 0.000 abstract 1
- 101710128560 Initiator protein NS1 Proteins 0.000 description 50
- 101710144127 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 description 50
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 45
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 22
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 18
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 18
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 16
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 16
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 9
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 9
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 9
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 8
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 8
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 8
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 8
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 8
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 7
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 7
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 4
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 4
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 4
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 4
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 3
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 3
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 101150033828 NS1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101800001030 Non-structural protein 2A Proteins 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 2
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108700016947 Bos taurus structural-GP Proteins 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 235000003385 Diospyros ebenum Nutrition 0.000 description 1
- 102220484358 E3 ubiquitin-protein ligase RNF168_C19S_mutation Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000792913 Ebenaceae Species 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000611764 Gordonia sp. (strain TY-5) Propane 2-monooxygenase, effector component Proteins 0.000 description 1
- 101001090095 Gordonia sp. (strain TY-5) Propane 2-monooxygenase, hydroxylase component large subunit Proteins 0.000 description 1
- 101001090278 Gordonia sp. (strain TY-5) Propane 2-monooxygenase, hydroxylase component small subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000701089 Gordonia sp. (strain TY-5) Propane 2-monooxygenase, reductase component Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- OWXMKDGYPWMGEB-UHFFFAOYSA-N HEPPS Chemical compound OCCN1CCN(CCCS(O)(=O)=O)CC1 OWXMKDGYPWMGEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 101000874241 Homo sapiens Sin3 histone deacetylase corepressor complex component SDS3 Proteins 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 241001480847 Ixodes persulcatus Species 0.000 description 1
- 241001480843 Ixodes ricinus Species 0.000 description 1
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 208000003140 Kyasanur forest disease Diseases 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- UEQUQVLFIPOEMF-UHFFFAOYSA-N Mianserin Chemical compound C1C2=CC=CC=C2N2CCN(C)CC2C2=CC=CC=C21 UEQUQVLFIPOEMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000710908 Murray Valley encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101800000512 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102000017143 RNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010013845 RNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 108091036333 Rapid DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 description 1
- 102100037968 Ribonuclease inhibitor Human genes 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 102400000827 Saposin-D Human genes 0.000 description 1
- 102100035738 Sin3 histone deacetylase corepressor complex component SDS3 Human genes 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 108010093857 Viral Hemagglutinins Proteins 0.000 description 1
- 108700022715 Viral Proteases Proteins 0.000 description 1
- 201000006449 West Nile encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 229940015043 glyoxal Drugs 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 201000009240 nasopharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 108010024226 placental ribonuclease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229940043517 specific immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 150000007944 thiolates Chemical class 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009447 viral pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 230000029302 virus maturation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/18—Togaviridae; Flaviviridae
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
AUSZTRIA * A bejelentés napja: 1990. 06. 05.
Elsőbbsége: 1989. 06. 06. (89305708.3) Európa
A jelen találmány a TBE vírus nyugati altípusa elleni vakcinákkal, a TBE vírus nyugati altípusához diagnosztikai szerekkel, valamint az ilyen vakcinákhoz és szerekhez alkalmazható nukleinsavakkal és fehérjékkel foglalkozik.
A nyugati típusú kullancs-eredetű enkefalitisz (TBE) vírus a Flaviviridae család egyik tagja, ahol a Flaviviridae vírusok gömbalakű, lipiddel burkolt RNS vírusok CWestaway és munkatársai: Intervirology 24, 183-192 (1985)3.’ A prototípus-vírus a sárgaláz vírus. Minden flavivirusnak meghatározott vírus szerológiai rokonságban van, amint ezt a hemagglutináció-gátlási vizsgálatok feltárják. Keresztsemlegesítési vizsgálatokkal azonban a család alcsoportokra osztható, sokféle szerokomplexbe CDeMadrid és Porterfield; J. Gén. Virol. 23, 91-96 (1974)3, amelyek szorosabb rokonságban levő flavivírusokat fognak össze, megkülönböztetve ezeket eltérő szerokomplexek szerolőgiailag távolabbi rokoni fokozatú vírusaitól és más nem csoportosított flavivirusoktól. A TBE vírus az úgynevezett kullancs-eredetű szerokomplex egyik tagja, amely tartalmazza még a Louping, Langat, omszki vérzéses láz, kyasanur-erdei betegség és Negiski nevű vírusokat is.
A TBE vírus törzset továbbá beoszthatjuk nyugati (európai) altípusba, amelyet elsősorban az Ixodes ricinus kullancs hordoz, és a távolkeleti altípusba, amelynek fő hordozója az Ixodes persulcatus kullancs CClarke: Bull. WHO 3JL_, 45-56 (1964)3.
Ezt az alcsoport! megkülönböztetést versengő RIA (radioimmunassay) mérések, a megfelelő szerkezeti glikoproteinek korlátozott proteolízisét alkalmazó peptidtérképezés CHeinz és Kunz: 3. Gén. Virol. 57, 263-274 (1981)3, valamint monoklonális antitesteket alkalmazó antigénelemzés CHeinz és munkatársai. Virology 126, 525-537 (1983)3 támasztja alá.
Az érett vírus-részecskék csak 3 szerkezeti fehérjét tartalmaznak, ezeket E, C és M fehérjéknek nevezik, és ezek molekulatömege 50-60000, illetve 15000, illetve 7000.
A flavivírusok genomja mintegy 11000 bázisos egyszálú RNSből áll; mRNS polaritással, és molekula tömege 4.10^ dalton. A C fehérjével együtt ez az RNS gömbalakú nukleokapszidot képez, amelyet az E és M fehérjékkel társult lipid-burkolat vesz körül. A vírus detergensekkel végzett szolubilizációja után kapott tisztított E fehérje készítményeket alkalmazó kísérletek feltárták, hogy az E fehérje képviseli a vírushemagglutinint, vagyis ez idézi elő bizonyos eritrociták agglutinálódását megfelelő körülmények között, amely azután immunizáláshoz hemagglutináció-gátló, semlegesítő· és védő antitesteket indukál, továbbá immunitást indukál élő, virulens vírusok fertőzése ellen CHeinz és munkatársai: Infect. Immun. 33, 250-257 (1981)3.
Ezeken a szerkezeti fehérjéken kívül számos nem szerkezeti, de vírus-eredetű fehérje található bizonyos flavivírusokkal fertőzött sejtekben.
A flavivírusok genom-szervezettségét nemrégiben határozták meg a sárgaláz-vírus (YF), valamint a nyugat-nílusi és murray-völgyi enkefalitisz vírus cDNS klónozásával és szekvenciaelemzésével ERice és munkatársai: Science 229, 726-733 (1985); Dalgarno és munkatársai: J. Mól. Bioi. 187, 309-323 (1986); Castle és munkatársai: Virology 147, 227-236 (1985); Castle és munkatársai: Virology 149, 10-26 (1986); Vengler és munkatársai: Virology 147, 264-274 (1985)3. Ezek szerint az elemzések szerint a flavivírusok genom RNS-e egy egyedi, mintegy 11000 nukleotidos hosszú, nyitott leolvasó keretet tartalmaz, amely az összes szerkezeti és nemszerkezeti fehérjét kódolja.
A gén-sorrend, amelyet az YF vírusnál állapították meg és számos más flavivírusnál igazoltak, az alábbi: 5 C-prM(M)E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5 3. A C, prM(M) és E képviselik az éretlen (C, prM, E) és érett (C, Μ, E) vírusrészecskékben található szerkezeti fehérjéket, míg a genom többi része a nem-szerkezeti fehérjéket kódolja. A szerkezeti fehérjéket és nem-szerkezeti fehérjéket pozitívan azonosították amino-terminális szekvenciaelemzéssel, ezek egyezésben vannak a megfelelő genom szegmensekkel. ·
Feltételezhető, hogy a vírus-fehérjék transzlációja az első AUG-nél indul be az RNS 5' végénél, és addig tart, amíg egy stop-kodonnal nem találkozik az RNS 3' végénél. Az egyes fehérjék képződéséről úgy gondoljuk, hogy ezek egy sor fajlagos proteolitikus hasítás eredményeként jönnek létre, ahol a proteolitikus enzimek lehetnek celluláris, valamint vírus-fajlagos proteázok.
Eddig mintegy 60 különböző flavivírust fedeztek fel, ezeknek mintegy kétharmadát fertőzött ízeltlábúak csípése viszi át, így ezek képviselik az ízeltlábú-eredetű (ARBO) vírusokat. Számos flavivírusról ismert, hogy humán patogén, ezek között találjuk a sárgaláz-vírust, a trópusi náthaláz vírusát, a japán enkefalitisz vírust, és a kullancs-eredetű enkefalitisz vírust (TBE) CShope: a The Togaviruses című szakkönyvben, 47-82. oldal, Academic Press, New York (1980)3.
A TBE vírus járványos több európai országban, valamint a Szovjetunióban és Kínában. A betegség jól dokumentálható több közép-európai országban, pl. Ausztriában, Csehszlovákiában és Magyarországon; évente több száz kórházi kezelésre szoruló esetet jegyeznek fel minden évben. Ez már jelentős közegészségügyi gondot jelent.
A betegséget vakcinálással hatékonyan meg lehet előzni, nagy mértékben tisztított, formaiinnal inaktivált teljes vírus vakcinával CKunz és munkatársai: J. Med. Virol. £, 103-109 (1980)3, amely immunválaszt indukál a vírus szerkezeti fehérjéi ellen. Ennek a vakcinának alapvető hátránya, hogy a fertőző és térfogatait kiterjedt szükségesek.
potenciálisan veszélyes vírus-szuszpenziók nagy kell kezelni a gyártási eljárás folyamán. így és költséges biztonsági óvintézkedések
Ezért kell új eljárásokat keresni vakcina előállítására, amely eljárások leküzdik a fentebb említett hátrányokat. Az
EP-A-0284791 számú európai szabadalmi közzétételi irat úgy • · · «
közelíti meg a problémát, hogy egy DNS molekulát hoz létre, amely egy nyugati altípusé TBE vírus-eredetű DNS-t tartalmaz, ahol ez a DNS a nyugati altípusé TBE vírus legalább egy szerkezeti fehérjéjének legalább egy részét kódolja, a szerkezeti fehérjéken a C, prM, M és E fehérjéket értve.
Egy ilyen DNS molekula megfelel a nyugati altípusé TBE vírus egyszálé RNS-ének, és alkalmasnak bizonyul a genetikai információ átadására olyan polipeptid kifejezéséhez, amely lehet a nyugati altípusé TBE vírus teljes C, prM, M vagy E fehérjéje, amint fentebb leírtuk, vagy lehet a fenti fehérjék valamelyikének egy része. Egy ilyen polipeptid diagnosztikai vagy gyógyászati célokra használható fel pl. vakcina előállításához.
A szekvenciaelemzés szintén igazolja a különbséget a távolkeleti altípustól, feltárva, hogy a szekvencia-eltérés akár a 14%-ot is elérheti (a fehérjétől függően) a távolkeleti altípussal összehasonlítva CYamschikov és Pletnov, Nucleic Acid Rés. 16, 7750 (1988)].
Bár az egy vagy több rekombináns szerkezeti fehérjén alapuló vakcina, mint amilyen az EP-A-0284791 számé európai szabadalmi közzétételi iratban szerepel, javítást jelent az inaktivált teljes vírus vakcinához képest gyártási szempontokból, ez is rendelkezik az inaktivált teljes vírus vakcina azon hátrányával, hogy ez sem tartalmaz nemszerkezeti fehérjéket, amelyek részt vehetnének a védő immunválaszban.
• »· * ·
A nem-szerkezeti fehérjéknek fontos szerepük van a flavivírusok életciklusában: érdekeltek a vírus érésében, a proteolitikus feldolgozási lépésekben és az RNS replikációban. Bár a nem-szerkezeti fehérjék egyikéről (NS 1) kimutatták a TBE-től eltérő bizonyos flavivírusoknál, hogy képes védő immunválaszt indukálni CSchlessinger és munkatársai: J. Gén. Virol. 68, 853-857 (1987); Zhang és munkatársai: 3. Virol. 62, 3027-3031 (1988)], a TBE nemszerkezeti fehérjéiről ilyen ismertetés eddig még nem jelent meg.
Ismeretes, ellen semlegesítő semlegesítési fertőzőképesség receptor-hordozó in Viral Pathogenesis közrejátszik a és a trópusi
EHalstead: Science hogy a flavivírus E antitestek koncentrációnál antitest-függő sejtekben
Concepts oldal), vérzéses patogenezisében fehérjéjében levő epitopok egyéb antitestek mennyiségei a közvetítik Fcés Cardosa: fejezet, 117.
náthaláz eredetű sokk szindróma 476-481-(1988)3.
vagy kisebb amely láz fokozódását (Porterf ield
I, 17.
trópusi náthaláz 239,
Bizonyos esetekben tehát előnyös lehet elkerülni a - flavivírus E fehérje alkalmazását a vakcinákban, vagy még inkább az NSl-et alkalmazni egyedüli vakcina-komponensként, nem építve be vírus szerkezeti fehérjéket.
A nyugati altípusú TBE vírus NS-1 fehérjéjét szekvenciájával azonosították. Ez a fehérje hasznos vakcina-komponens és könnyen elő lehet állítani rekombináns DNS technológiával.
··
A jelen találmány egyik szempontja szerint olyan peptidet vagy polipeptidet mutatunk be, amely a nyugati altípusú TBE vírus aminosavszekvenciájának legalább egy részét tartalmazza.
Ha a peptid vagy polipeptid a teljes fehérje aminosavszekvenciá jának csak egy részét tartalmazza, előnyös, ha az az immunogén részt tartalmazza. Előnyös azonban, ha a peptid vagy polipeptid a 4. ábrában bemutatott aminosavszekvenciával bír.
A jelen találmány határozottan magában foglal minden olyan aminosav-szekvenciát, amely ugyan különbözik a természetes NS-1 szekvencia aminosav szekvenciájától mutációk és/vagy felcserélődések miatt, de ez a különbözőség a nyugati altípusú TBE vírus természetes variációjának normális tartományán belül van. Ezek a szekvenciák ennél fogva még rendelkeznek a nyugati altípusú TBE vírus NS-1 nemszerkezeti fehérjéjének lényeges tulajdonságaival (különösen a nélkülözhetetlen antigén tulajdonságokkal).
Bár az előnyös út a jelen találmány peptidjeinek vagy • polipeptidjelnek előállítására a jelen találmány szerinti megfelelő nukleotid szekvenciák kifejezése, a jelen találmány szerinti peptidek vagy polipeptidek izolálhatok
vagy kémiai úton is szintetizálhatók. A peptideket és polipeptideket lényegében tiszta formában lehet előállítani és/vagy lényegében mentesen minden más olyan vegyülettől, amelyek a természetben ezekkel társulnak.
• · • · · •·« ··· • · • · ♦♦ ·
• · · · • · · • ♦ · · ·
A jelen találmány első szempontja szerinti peptidek vagy polipeptidek önmagukban vagy egy vagy több segédanyaggal együtt diagnosztikai szerként alkalmazhatók, vagy hatóanyagként alkalmazhatók vakcinák gyártásához. A peptidek vagy polipeptidek előnyösen olyan kompozíciók részei, amelyeket orvosi területen alkalmaznak.
A jelen találmány egy másik szempontja szerint vakcinakompozíciót ismertetünk, amely a jelen találmány első szempontja szerinti peptidből vagy polipeptidből és egy vagy több további, gyógyászatilag elfogadható komponensből áll. Az ilyen komponensek között találjuk a peptidekhez vagy polipeptidekhez illő, gyógyászatilag elfogadható hordozókat vagy adjuvánsokat. A további alkalmas komponensek között találjuk a puffereket.
A vakcina hordozó anyaga lehet bármely alkalmas hordozó és tartalmazhat egy vagy több adjuvánst, ha szükséges. A szokásos gyakorlatnak megfelelően az összes, jelen találmány szerinti vakcina-kompozíciónak sterilnek kell lenni.
Az antigén peptideket vagy polipeptideket tartalmazó
- vakcinák előnyös alkalmazása fajlagos immunglobulinok, pl. monoklonális vagy poliklonális antitestek kialakítása, amelyeket a szakterületen ismert eljárásokkal lehet előállítani. A peptidek és polipeptidek elleni antitesteket szintén úgy tekintjük, mint a találmány részeit.
Amint fentebb említettük, a jelen találmány szerinti peptidek vagy polipeptidek valamelyikét vagy ezekből többet • tartalmazó kompozíciókat diagnosztikus reagensként is
X alkalmazhatjuk.
A jelen találmány foglalkozik a találmány első szempontja szerinti peptideket vagy polipeptideket kódoló nukleinsavval is.
A jelen találmány egy harmadik szempontja szerint ismertetjük a nyugati altípusú TBE vírus NS-1 fehérjéjének legalább egy részét kódoló nukleinsavat. A nukleinsav, amely lehet rekombináns nukleinsav és leggyakrabban az is, főleg rekombináns DNS, kódolni tudja a teljes vagy lényegében teljes NS-1 fehérjét, vagy ha ez elegendő, annak egy részét.
Ezek a DNS és RNS molekulák nem csupán a találmány első \ szempontja szerinti peptidek vagy polipeptidek előállítására alkalmasak, hanem alkalmazhatók élő vakcina előállítására is. A DNS szekvenciákat előnyösen a Vaccinia vírus DNS-ével kombináljuk, amely jól bevezetett élő vakcinaként.
Az élő vakcinaként alkalmazáson kívül a jelen találmány szerinti DNS vagy RNS szekvenciák alkalmasak továbbá -vizsgáló mintaként is átvizsgálási célokra.
Delenleg nem áll rendelkezésre vírusellenes szer TBE-betegek speciális kezelésére. Számos lehetőség van azonban arra, hogy speciálisan beavatkozzunk ideértve az olyan folyamatokat, fehérjéket érintik, pl. az RNS utáni proteolitikus feldolgozást a vírus életciklusába, amelyek a nem-szerkezeti replikációt, transzláció és vírus-kialakítást. Az
NS-1 fehérjét vagy egy részét kódoló nukleinsav is hasznos lehet erre a célra. A vírus-fehérjék működési aktivitásaira beavatkozáson kívül ez a nukleinsav valószínűleg blokkolja a vírus replikációs folyamatot is az anti-sense RNS alkalmazásával.
A találmány oltalmi körén belül számos út van DNS molekulák előállítására. Az egyik lehetőség a DNS molekula nyerésére az, hogy először kivonjuk az RNS-t a nyugati altípusú' TBE vírusból és az RNS molekulát tisztítjuk, majd ezt ennek az RNS templátnak az átírása követi reverz transzkriptáz alkalmazásával DNS molekulává. További lehetőség a jelen találmány szerinti DNS molekulák kémiai szintézise, ha a DNS szekvenciát már felderítették.
Az egyik előnyös kiviteli formában a jelen találmány olyan DNS molekulákat foglal magában, amelyek hibridizálnak a jelen találmány első szempontjai szerinti DNS molekulákhoz, és különösen a 3. ábra szerinti DNS szekvenciához és/vagy a 4. ábrában bemutatott fehérje szekvenciát kódoló DNS szekvenciához szigorú körülmények között, vagyis olyan körülmények között, amely kiválasztásnál legalább 90¾ nukleotid-szekvencia homológiát biztosít. Az ilyen előnyös formájú DNS molekulák még olyan peptideket kódolhatnak, amelyek képesek antitest-válaszokat kialakítani, továbbá ezek a DNS molekulák alkalmasak DNS vizsgáló mintaként is.
A jelen találmány egyik kiviteli formája szerint az NS-1 nem-szerkezeti fehérjét kódoló, vad típusú, nyugati altípusú TBE vírus genom teljes szekvenciáját magában foglaló nukleinsavat mutatunk be, valamint a fehérje legalább egy
- 12 részét kódoló, genomiális RNS-ből származó DNS molekulákat. A jelen találmány oltalmi körén belül levő DNS molekulák megfelelhetnek a nyugati altípusú TBE vírus egyszálú RNSének vagy komplementerek lehetnek ezzel, és alkalmasak genetikai információ átadására a teljes NS-1 fehérjének vagy egy vagy több részének kifejezéséhez, ahol ezek a fehérjék hasznosan alkalmazhatók vakcina-komponensként vagy diagnosztikai és terápiás célra.
A jelen találmány határozottan magában foglalja mindazokat a DNS szekvenciákat, amelyek különböznek ugyan a természetes NS-1 RNS szekvenciának megfelelő vagy azzal komplementer DNS molekuláktól, a genetikai kód degenerációja és/vagy mutációk és/vagy átrendeződés miatt, de ezek a különbségek a nyugati altípusé TBE vírus természetes variációinak normális tartományán belül vannak. Ezek a szekvenciák ennél fogva még kódolják azokat a fehérjéket, amelyek a nyugati altípusú TBE vírus NS-1 nem-szerkezeti fehérjéjének lényeges tulajdonságaival bírnak (elsősorban a nélkülözhetetlen antigén-tulajdonságokkal).
A jelen találmány egyik előnyös kiviteli formája szerint az • igénypontok szerinti DNS molekulák más DNS szekvenciákkal vannak kombinálva.
Ezek a további szekvenciák lehetővé teszik a DNS molekula replikálódását és kifejezését sejttenyészetben. Erre a célra a legfontosabb DNS szekvenciák azok, amelyek promotorként, fokozóként, poliadenílező szignálként és összefonódási szignálként működnek. Ezek a további DNS szekvenciák a •··* · 4 ·* * ♦ · szakterületen ismert standard munkamenetek szerint kombinálhatok a jelen találmány első szempontja szerinti DNS molekulákkal.
A jelen találmány keretében a DNS molekulákra vonatkozó fentebb tárgyalt előnyök ugyanúgy igazak az RNS molekulákra is. A jelen találmány szerinti RNS molekulákat vagy a nyugati altípusú TBE vírus RNS vírus izolálásával és tisztításával, vagy rekombináns RNS/DNS technikákkal kaphatjuk meg. Nem csupán azokat az RNS molekulát értjük bele a találmány oltalmi körébe, amelyeket a nyugati altípusú TBE vírusjtisztításával kapunk meg, hanem azokat az RNS molekulákat is, amelyeket vagy úgy kapunk meg, hogy a tisztított és izolált vírus RNS-t átírjuk DNS-sé reverz transzkriptázzal, majd az így kapott DNS-t ismét RNS-sé írjuk át, vagy RNS függő RNS-átírással kapunk meg.
A jelen találmányban nem csupán a fentebb leírt DNS és RNS molekulákat mutatjuk be, hanem vektorokat is mutatunk be, amelyek beiktatásként jelen találmány szerinti DNS vagy RNS molekulákat tartalmaznak. A jelen találmány negyedik szempontja szerint olyan vektort mutatunk be, amely lehet klónozó vektor vagy kifejező vektor, és amely valamely, a találmány harmadik szempontja szerinti nukleinsav szekvenciát vírus Cpl.
foglal magában. A vektor pl. lehet plazmid, állati (mint Vaccinia vírus) vagy fágj, vagy kozmid. Amint a általában olyan szabályozzák a replikációját és szakterületen szekvenciákat beiktatott kifejezését;
ismert, is
RNS az ilyen vektorok tartalmaznak, amelyek szekvenciák szabályozó vagy DNS az ilyen szekvenciák között találjuk - más szekvenciák között - a promotort, továbbá esetleg valamely fokozót.
A jelen találmány negyedik szempontja szerint olyan gazdasejteket mutatunk be, amelyek valamely fentebb leírt vektort tartalmaznak. A legtöbb ilyen sejtet sejttenyészetben mutatjuk be.
A vektorok előnyösen olyan sejttenyészetbe vannak belefoglalva, amelyekben az RNS vagy DNS szekvenciák által kódolt polipeptidek kifejeződése a jelen találmány szerint végbemehet; a sejttenyészetek előnyösen emlős sejttenyészetek. Emlős sejttenyészetek alkalmazásával a legelőnyösebb feltételeket mutatjuk be olyan polipeptid kifejeződéséhez, amelyeket vakcinaként kívánunk alkalmazni emlősök védelmére nyugati altípusú TBE vírus fertőzésektől.
A jelen találmány jobb megértése céljából, és azért, hogy bemutassuk: ezt a találmányt hogyan lehet célszerűen kivitelezni, a jelen találmány előnyös kiviteli módjait a mellékelt ábrákra hivatkozással írjuk le.
*Az 1. ábra a nem emésztett BS 17-6 plazmid, amely az NS-1 fehérje teljes kódoló szekvenciáját tartalmazza, agaróz gélelektroforézisének fényképe (b. vonal). A c. vonal ugyanezen plazmid BamHI emésztését mutatja be, és a két a. vonal a 0,6 kb-s, 2 kb-s és 10 kb-s méret-markereket tartalmazza.
A 2. ábra a BS 17-6 plazmidban található 17-6 beiktatás ···· ···« .. ., , • · · β · · · • *- *··» ···' ··· · « <· ..,* · » ···» ·· ··· ·♦ ·· φ teljes nukleotid-szekvenciáját mutatja be.
A 3. ábra a 17-6 beiktatás RNS szekvenciáját és kódolt aminosav-szekvenciáját mutatja be. A helyzetjelző számok a TBE vírus teljes hosszúságú genomjára vonatkoznak.
A 4. ábra az NS1 fehérje aminosavszekvenciáját mutatja be, ahol ez a 17-6 klón szekvencia-információjából származik. A helyzetjelző számok az NS1 fehérje első aminosavától számítódnak.
Az 5. ábra, amely a későbbi 10. példához tartozik, az NS1 klónozási stratégiáját mutatja be a pUC19S prokarióta kifejező vektorba.
A 6A. és 6B. ábra, amelyek szintén a 10. példához tartoznak, a pNS1387 klón nukleotid-szekvenciáit mutatják be az 5' és 3' terminálisoknál. Egy NS1 beiktatás van a bakteriális lacZ génnel keretben. A kifejeződés a lacZ operátor/promotor rendszer szabályozása alatt történik. A 6A. ábrában a konstrukció általános szervezettsége van bemutatva. A 6B. ábrában a DNS és fehérje szekvenciák ismerhetők meg. Ebben a . konstrukcióban az NSl-nek 40 további nukleotidja van 5'végénél, amelyek a lacZ génből és a pUC19S polilinkerből származó 14 aminosavnak felelnek meg. Található itt további 27 nem-NSl nukleotid is a 3'-végénél. (amely 9 aminosavnak felel meg). A 3. ábrában található TBE genomhoz viszonyított nukleotid-helyzetek csillaggal vannak jelölve.
A 7A. ábra, amely a 11. példához tartozik, az NS1 ···· ««··
- ·* ···.
··· klónozásának stratégiáját mutatja be autentikus 5' szignál szekvenciájával együtt a pUC19S prokarióta kifejező vektorba.
A 7B. ábra, amely szintén a 11. példához tartozik, a ptSN1791 klón nukleotid szekvenciáját mutatja be 5' és 3' terminálisainál. Az kifejeződéssel van szabályozása alatt.
NS1 beiktatás a bakteriális lacZ gén keretben a lacZ promotor rendszer Az I. részben a konstrukció általános szervezettségét mutatjuk be. szekvenciák ismerhetők meg. nek 39 további nukleotidja
A II. részben a DNS és fehérje
Ebben a konstrukcióban az NS1van 5' végén, amelyek a lacZ génből és a pUC19S polilinkerből származó 13 aminosavnak felelnek meg. lalálható itt további 30 nem-NSl nukleotid is a 3' végnél (amely 10 aminosavnak felel meg). A 3. ábrában található TBE genomhoz viszonyított nukleotidhelyzetek csillaggal vannak jelölve.
A 8A. ábra, amely a 12. példához tartozik, az NS1 kódoló terület klónozását mutatja be a pTKgptFls transzfer vektorba, Vaccinia vírussal való rekombináláshoz.
* A 8B. ábra, amely szintén a 12. példához tartozik, a pAPNS1338 klón nukleotidszekvenciáját mutatja be 5' és 3' terminálisainál. Az NSl-nek 19 további nukleotidja van 5' végén, amelyek a polilinker területből várható transzlációs termékben levő 7 aminosavnak felelnek meg, és további 30 nukleotidja van 3' végén (amely 10 aminosavnak felel meg). A
3. ábrában található TBE genomhoz viszonyított nukleotidhelyzetek csillaggal vannak jelölve.
···* ···· • · • · ·· ··· ··· • < · · ··· «·· · · • ···· ·· · ··
A 9A és 9B. ábrák, amelyek a 13. példához tartoznak, az NS1 és vélt szignál szekvenciája klónozását mutatják be polimeráz láncreakcióval (PCR). A 9A. ábra a PCR általánosított stratégiáját mutatja be. A 9B. ábra a DNS kiegészítéséhez primerként alkalmazott, kémiai úton szintetizált oligonukleotidok szekvenciáját mutatja be. A csillagok a 3. ábra szerinti vírus genomban levő nukleotidhelyzeteket jelzik.
A 10. ábra, amely szintén a 13. példához tartozik, a PCR-rel szintetizált NS1 fragmentumot bemutató agaróz gél képe. Az agaróz gél etidium-bromiddal van megfestve. A DNS UV lámpa alatt mutatható ki. A nyíl azt a fragmentumot jelzi, amely mintegy 1130 bp hosszúságú.
A 11. ábra, amely szintén a 13. példához tartozik, az NS1 kódoló területének vélt szignálszekvenciával együtt történő klónozását mutatja be PCR-rel végzett szintézis után a pSCll-OrthDELTAO transzfer vektorba Vaccinia vírussal való rekombinációhoz.
* A 12. ábra, amely szintén a 13. példához tartozik, a pSCtSNS1444 klón szekvenciáját mutatja be 3' és 5' terminálisainál. Az autentikus NS1 kódoló terület szignál szekvenciájával együtt, várt transzlációs termékében 12 további nukleotidot vesz fel 5' végénél a polilinker területből, ez 4 aminosavnak felel meg. 3' végénél további 47 nukleotid található (amely 16 aminosavnak felel meg). A csillagok a 3. ábra szerinti vírus genomban levő nukleotid18 helyzeteket jelzik.
A 13. ábra, amely szintén a 13. példához tartozik, a pSCtSNS1444 plazmid elemzését mutatja be megfelelő restrikciós endonukleázokkal emésztve. A DNS minták a pSCllOrth vektorba beiktatott NS1 szekvencia korrekt orientációját jelzik és igazolják a 17-6 klón nukleotidszekvenciájából következtetett fragmentumok méretét.
A 14. ábra, amely a 14. példához tartozik, az NSl-nek vélt szignál szekvenciájával együtt történő klónozását mutatja be a pTKgptF3s vektorba Vakcinia vírussal való rekombinációhoz.
A 15. ábra, amely szintén a 14. példához tartozik, a pTKtSNS1556 plazmid nukleotid-szekvenciáját mutatja be 3' és 5' terminálisainál. Ebben a konstrukcióban az NSl-nek 5' végén 24 további nukleotidja van, amely a polilinker területből várható transzlációs termékben levő 8 aminosavnak felel meg. A 3' végén további 26 nukleotid található (amely 9 aminosavnak felel meg). A csillagok a 3. ábra szerinti vírus genomban levő nukleotid-helyzeteket jelzik.
- A 16. ábra, amely a 15. példához tartozik, a varecNS1444 és varecNS1556 NSl-Víccinia rekombinánsok Southern-folt elemzését mutatja be. CV-l sejteket fertőzünk meg rekombináns Vaccinia vírusokkal 5 tarfoltképző egység/sejt koncentrációban. A > fertőzés után két nappal a teljes celluláris DNS-t tisztítjuk, HindlII restrikciós endonukleázzal emésztjük és 1%-os agaróz gélen elkülönítést végzünk. A DNS-t nitrocellulóz szűrőre visszük és hibridizáljuk a radioaktívan jelzett pSCtSNS1444 plazmiddal, mint vizsgáló mintával a beiktatott NS1 fragmentum és a szomszédos vírus tk szekvenciák kimutatása céljából.
A varecNS1556-112, -124, -122 és varecNS1444-121 rekombinánsok összehasonlítása a vad típusú Vaccinia DNS-sel (lásd a 4. kivágatot) a HindlII fragmentum várt eltolódását mutatja egy nagyobb molekulatömeg felé. Csak a varecNS1556222 mutat egy kisebb csíkot, amely a molekulatömegfragmentumnak felel meg. Ez azt jelzi, hogy a tarfoltizolátum nem homogén. A 1556-122, stb. különböző tarfoltizolátumok azonos rekombinációs kísérletekből, három tarfolt-tisztítás után. Kontrollként és méret-markerként a pSCtSNS1444 különböző emésztményeit alkalmazzuk (6. és 7. kivágatok).
A 17. ábra, amely a 16. példához tartozik, egy denaturáló SDS gél autoradiogramját mutatja be, igazolva, hogy a varecNS1444 és varecNS1566 rekombináns vírusok NS1 fehérjét fejeznek ki. Mintegy 48 kD várt molekulatömegű fehérje mutatható ki, amely a vad típusú vagy a varecl342 (amely más fehérjét fejez ki) fertőzött sejtekben nem mutatható ki. A
- nagyon erős fehérje-csík, amely a 97 kD-s markercsík fölött vándorol, a β -galaktozidázt (116 kD) jelenti, amely a pSCll-Orth eredetű varecNS1444 és varecl342 rekombinánsokban a Pll promotor szabályozása alatt fejeződik ki.
A jelen találmány szerinti nukleinsavat az alábbiak szerint lehet elkészíteni és szekvenciáját az alábbiak szerint lehet meghatározni.
• ·
Először a vírus RNS-t kivonjuk a nyugati altípusű TBE vírusból vagy nyugati altípusú TBE vírussal fertőzött sejtekből. Ezt az RNS-t templátként használva kettős szálú cDNS-t szintetizálhatunk, pl. reverz transzkriptázzal. Rekombináns DNS technikák alkalmazásával ezt a cDNS-t beiktathatjuk valamely vektor DNS-be, pl. valamely Escherichia coli plazmid DNS-be, hogy rekombináns plazmidot kapjunk. A rekombináns plazmidot alkalmazhatjuk megfelelő gazdasejtek, pl. E.coli ΉΒ101 törzs transzformálására a plazmid szaporításához vagy a megfelelő fehérjék kifejezéséhez. A beiktatást tartalmazó plazmidok egyedi telepeit a mini-plazmid készítési módszerrel azonosíthatjuk Bimbóim és Doly szerint CNucleic Acids Research 1_, 11951204 (1979)]. A rekombináns plazmidban jelen levő, nyugati altípusú vírusra fajlagos DNS-t valamely gyors DNS szekvenciaelemzési módszerrel, pl. didezoxi-láncterminációs módszerrel határozhatjuk meg.
Az egyik adott eljárást cDNS, rekombináns plazmidok, ezekkel a plazmidokkal transzformált sejtek előállítására és a nukleotid-szekvencia meghatározására az alábbiakban adjuk - meg részletesen. Először nyugati altípusú TBE vírus eredetű RNS-t vonunk ki tisztított vírusokból. Ebből a célból nyugati altípusú TBE vírust növesztünk primer csirkeembrió sejteken, ezeket ultracentrifugálással koncentráljuk és két menetben szacharóz sűrűséggradiens-centrifugálással tisztítjuk. Miután a fehérjéket SDS-sel szolubilizáltuk K proteináz és RN-áz inhibitor jelenlétében pl. 1 órán át inkubálva 37°C hőmérsékleten, az RNS-t extraháljuk pl.
fenollal, és kicsapjuk etanollal. Ezt az RNS-t templátként alkalmazva ezután in vitro szintetizáljuk a vírus RNS-sel komplementer DNS-t reverz transzkriptázzal, pl. madár mieloblasztózis vírusból származó reverz transzkriptázzal, pl. Gubler és Hoffmann eljárásával CGene 25, 263-269 (1983)3. Primereket, pl. borjú tímusz DNS-ből kapott hexanukleotid primereket alkalmazva a vírus RNS-t megfelelő körülmények között inkubáljuk Cpl. úgy, ahogy az Amersham cég (Anglia) kézikönyve (cDNS Synthesis System) leírja)3 reverz transzkriptázzal dezoxi-adenozin trifoszfáttal (dATP), dezoxi-timidin trifoszfáttal (dTTP), dezoxi-guanidin trifoszfáttal (dGTP) és dezoxicitidin trifoszfáttal (dCTP), mint szubsztrátumokkal együtt, hibridet RN-áz között, amely ében. Ezután alkalmazhatjuk (nicked)
RNS-t
Az így kapott cDNS.RNS meghatározott körülmények ki a hibrid molekula RNSpolimeráz I-et hatékonyan az RNS szál helyettesítésére, a hézagolt hasznosítva primerként. Az így kapott kettős
H-val kezeljük hézagokat alakít az E.coli DNS
RNS szál helyettesítésére, szálú RNS-t fenol-kloroformos extrahálással fehérjementesítjük, etanollal kicsapjuk és a megmaradó RNS fragmentumokat RN-ázos kezeléssel (pl. TE pufferban 37°C hőmérsékleten 30 percen át) eltávolítjuk.
Elvégezzük kettős szálú (ds) DNS klónozását pl. szintetikus kapcsolók alkalmazásával. Ebből a célból a dsDNS-t az E.coli DNS polimeráz I Klenow fragmentumával kezeljük megfelelő körülmények között EManiatis és munkatársai. Molecular Cloning, CSH (1982)3, hogy biztosítsuk a klónozható tompa végek maximális mennyiségét, majd a fehérjementesítés érdekében fenolos extrahálást végzünk. A dsDNS-t megfelelő * · körülmények között BamHI kapcsolókkal inkubáljuk DNS ligáz • · · · · 9· • ·*· ·»· ····« • · ♦ ♦ · · · • · ··· « · · «· jelenlétében. terheljük és cDNS-eket a
A reakciókeveréket ezután 1%-os agaróz gélre azon futtatjuk, és a különböző méret-osztályú gélből kihasítjuk, majd tisztítjuk, pl.
elektroelucióval. Másrészt a vektor DNS-ként alkalmazandó plazmid DNS-t, pl. E.coli BLUESCRIPT SK-plazmidot BamHI restrikciós endonukleázzal hasítjuk és defoszforilezzük bakteriális alkálikus foszfatáz alkalmazásával. A cDNS-t
BamHI-gyel végzett emésztése után összekeverjük a BamHI-gyel hasított vektorral és megfelelő körülmények között inkubáljuk, hogy létrejöhessen a komplementer átfedő szekvenciák hibridizálása mindkét DNS molekula végein, és ligáljuk T4 DNS ligáz alkalmazásával. A rekombináns DNS molekulát valamely kompetens E.coli törzs (pl. E.coli XL 1blue törzs) transzformálására alkalmazzuk. A vírus fajlagos beiktatásokat tartalmazó rekombinánsokat szin-szelekciőval azonosítjuk. Plazmidokat izolálunk a mini-plazmid preparálási eljárással CBirnboim és Doly: Nucleic Acids Research 7_, 1195-1204 (1979)3, és a beiktatások méreteit BamHI-et alkalmazó restrikciós enzimes elemzéssel és a fragmentumok 1%-os agaróz gélen végzett elkülönítésével elemezzük.
Ezeknek a beiktatásoknak a bázisszekvenciáját a didezoxi láncterminációs eljárással határozzuk meg Sanger és munkatársai szerint EPNAS USA, 74, 5463-5467 (1977)3. A kapott szekvenciát homológiára vizsgáljuk más flavivírusok ismert szekvenciáihoz LRice és munkatársai. Science 229, 726-733 (1985); Dalgarno és munkatársai: 3. Mól. Bioi. 187, 309-323 (1986); Castle és munkatársai: Virology 147, 227-236 (1985); Castle és munkatársai: Virology 149, 10-26 (1986); Wengler és munkatársai: Virology 147, 264-274 (1985); Yamshchikov és Pletnev: Nucleic Acid Rés. 16, 7750 (1988)3 számítógépes program segítségével, abból a célból, hogy meghatározzuk a szekvencia elhelyezkedését a vizsgálat során a genom RNS teljes szekvenciájában. A 2. ábra a nyugati altípusű TBE vírus genom teljes nukleotid szekvenciáját, míg a 3. ábra az NS1 terület megfelelő aminosav szekvenciáját mutatja be.
A jelen találmány tehát először mutatja be a nyugati altípusú TBE vírus NS1 fehérjéjét kódoló gén nukleotidszekvenciáját. következésképpen bemutatja ezen fehérje aminosavszekvenciáját is.
A 2. ábra bázisszekvenciája előnyös példa olyan ONS-re amely a nyugati altípusú TBE vírus NS1 fehérjéjének jellemzőivel bíró polipeptidet kódol. A genetikai kód degeneráltsága miatt ugyanazt az aminosavat más bázis-triplett is kódolhatja, mint amelyet ebben az ábrában bemutatunk.
A jelen találmány oltalmi körén belül vannak azok a szekvenciák is, amelyek mutáció, átrendeződés vagy bomlás miatt megváltoztak, de amelyek mégis olyan aminosavszekvenciát kódolnak, amelyek még rendelkeznek az NS1 fehérje nélkülözhetetlen antigén-jellemzőivel.
A találmány nemcsak pontosan arra az aminosav-szekvenciára vonatkozik, amelyet a 3. ábrában bemutatunk; ez csak egy természetes nyugati altípusú TBE vírus izolátum NS1 • ··· ···· szekvenciájának példaként felhozott szekvenciáját képviseli. Ismert tény, hogy az RNS vírusok genomjai nagyobb gyakorisággal mutálódnak, mint a DNS vírusok genomjai vagy a celluláris gének, ez az RNS polimerázok nagy hibahányadosának és a leolvasást ellenőrző mechanizmus hiányának tulajdonítható EHolland és munkatársai: Science 215, 15771585 (1982); Reanney: Ann. Rév. Microbiol. 36, 47-73 (1982)]. A vírus jellemzőitől függően ezek a mutációk új vírus-típusok gyors kifejlődését idézhetik elő · az antigenikus elcsúszás (drift) miatt, amint ez az influenza vírusok esetében történik CBoth és munkatársai: az The Origin of Pandemic Influenza Viruses című kiadványban; szerkesztő: Laver W. G.,; kiadó: Elsevier (1983)]. Másrészt az RNS vírusok antigenikusan stabilabbak is lehetnek természetes ökológiai viszonyok között, valószínűleg a miatt a funkcionális kényszer miatt, amely nem tesz lehetővé kiterjedt szerkezeti változásokat antigenikusan aktív fehérjékben. A változásokat bizonyos mértékben mégis számításba kell venni és be is lehet mutatni különböző természetes izolátumok szekvenciáinak összehasonlításával.
Ezt pl. úgy lehet megtenni, hogy elvégezzük különböző izolátumok RNS-einek szekvenciaelemzését a didezoxi láncterminációs eljárást alkalmazva primerekként olyan szintetikus oligonukleotidokkal, amelyeket a 2.
ábrában bemutatott prototípus izolátum szekvenciája alapján készítünk.
Minden szekvencia, amely a prototípus szekvenciával összehasonlítva csekély mértékű variációt jelent, pl. azok, • · ···· ··«· ·· • · - · · · · · • ♦·· ··· ····· • ♦ · · · «·· ·· ·· · ·· ··
- 25 .
amelyek a nyugati altípusú TBE vírus más természetes izolátumaiban találhatók, a jelen találmány körébe tartozik. Ilyen változatokat kaphatunk a nukleinsav in vitro módosításával is. A találmány ennél fogva magában foglal minden olyan szekvenciát, amely szigorú körümények között (pl. amely csak a legalább 90% homológiájú nukleotidokat szelektálja) hibridizál a leírt szekvenciákkal vagy a szekvenciák egy részével, és amely előnyösen olyan peptideket vagy fehérjéket kódol, amelyek a nyugati altípusú TBE vírus szerkezeti fehérjék nélkülözhetetlen antigén determináns jellemzőivel bírnak.
Egy fehérjét, pl. az NSl-et kódoló nukleotid szekvencia beiktatása megfelelő vektorokba és gazdasejtekbe magasszintű kifejeződéshez hatékony technológia a fehérje szerkezetének és biológiai funkcióinak tanulmányozásához. Az alkalmazandó kifejező rendszer mindig függ bizonyos molekuláris jellemzőktől, pl. a szóban forgó fehérjemolekula transzláció utáni módosításától.
A kifejezés véghezvihető prokarióta vagy .eukarióta sejtrendszerekben. Glikoproteineknél, pl. az NS-l-nél a kifejeződés jobban végrehajtható olyan eukarióta gazdasejtben, amely képes a megfelelő glikozilezésre. Egy előnyös kifejező rendszer Vaccinia vírusból és valamely főemlős sejtből áll, amely tenyészetben folytonosan képes növekedni. Ez biztosítja vagy segít biztosítani azt, hogy elérjük a transzláció utáni korrekt módosításokat és a magas szintű szintézist.
·*·*»··· ·· » < , • · . · · · · · * · · · · · · ···· ' • · · · · ·» · ·· *«· ·· ·· |
Jelentős bizonyítékok vannak arra, hogy a Vaccinia vírus génszabályozó szekvenciái irányítani képesek csaknem bármely idegen fehérje szintézisét, vagy egy késői fázisú promotort alkalmazva, vagy egy konstruktív promotort alkalmazva a vírus-replikáció korai és késői fázisai során [Moss és Flexner: Ann. Rév. Immunoi. 305-324 (1987)1. Beszámoltak azonban arról, hogy a Vaccinia vírussal fertőzött sejtekben kifejezett idegen fehérjék stabilitását erősen befolyásolja a szóban forgó gén kifejeződését szabályozó promotor ECoupar és munkatársai: Eur. J. Immunoi. 16, 1479 (1986); Townsend és munkatársai: J. Exp-Med. 168, 1211-1224 (1988)3.
Az NS-l-fajlagos beiktatásokat tartalmazó megfelelő kifejező plazmid beiktatása kiterjedt DNS manipulációt igényel. Számításba kell venni, hogy az NS-1 egy poli-fehérje része, amely poli-fehérje a transzláció után dolgozódik fel egyedi fehérjékké, mégpedig celluláris- és vírus proteázuk révén CMandl és munkatársai: Virology 173, 291-301 (1989)3.
Természetes vírusfertőzés során az NS-1 szintézise érint egy belső szignál szekvenciát is az Nh^-terminálisnál. A szignál-szekvencia a naszcens polipeptid láncot az - endoplazmás retikulum belsejébe irányítja, amely azért szükséges, hogy a megfelelő, transzláció utáni módosítások, mint pl. a glikozilezés, végbemenjenek. Abból a célból, hogy egy korrektül feldolgozott kifejezett terméket kapjunk, erre vagy egy heterológ szignál szekvenciára szükség van a rekombináns molekulában.
Ezen kívül, mivel az NS-1 egy poli-fehérje része, nem ··«* ··<·« • · · • · · · · » · · » · ·· 9 • · . · · • ··♦ ··· • · · ·· ··· ·· tartalmaz start és stop kodonokat a transzlációhoz. Ezeket speciális rekombináns DNS manipulációk segítségével el kell látni ilyenekkel.
A 17-6 klón szekvenciájában (3. ábra) találhatók hidrofób (5') és horgony (31) szekvenciák. A megfelelő endonukleáz restrikciós helyek hiánya nem teszi lehetővé az NS-1 egyenes klónozását természetes szignál szekvenciáival beiktatásos vektorokba. Ennél fogva egy 1200 bázispár kiterjedésű láncot lehet szintetizálni pl. polimeráz láncreakcióval (PCR), amely lánc tartalmazza az NS-1 szignál szekvenciát és az érett NS-1 szekvenciáját. Ez a technika lehetővé teszi tetszés szerinti restrikciós helyek beépítését a megnyújtott DNS mindkét végébe, valamint lehetővé teszi start és szignál szekvenciák beépítését.
A kitérjesztéshez speciálisan tervezett primer-pár egy olyan NS-1 szekvencia terméket eredményez, amely EcoRI restrikciós endonukleáz felismerő helyekkel van szegélyezve. Ezt a metodikát alkalmazva mód van az autentikus NS-1 szignál szekvencia kicserélésére bármely természetben előforduló szignál szekvenciára vagy valamely szintetikus konszenzus • szignál szekvenciára v.Heinje javaslatai szerint ENAR 14, 4683-4690 (1986)1.
Minden plazmid, amely speciálisan NS-1 molekulák kifejezésére van kifejlesztve, áthelyezhető valamely szülő Vaccinia vírusba (pl. WR törzsbe vagy ennek valamely legyengített származékába) homológ rekombinációval ezt lehetővé tevő gazdasejtben, pl. főemlős CV-l sejtekben. A ·· · • · · • · · « · • ·· « · ·· «
. - 28 kísérleti munkamenet rekombináns Vaccinia vírusok kialakítására az általános ismeretek körébe tartozik, jól ismert azok számára, akik a szakterületen jártasak, és nem szükséges leírni Clásd pl. Mackett és munkatársai. DNA Cloning II; 191-211 oldal; szerkesztő: Glover D.M.; kiadó: 3RL Press (1985)3
A jelen találmány foglalkozik az NS-1 molekulák szintézisével valamely bakteriális gazdaszervezetben is. A bakteriális sejtekben kifejezett glikoproteinek általában nem glikozilezettek ugyanolyan mértékben, mint az eukarióta sejtekben. Az NS-1 szintézise azonban még nem glikozilezett formában is hasznos lehet különböző célokra. így pl- a HIV-1 160, burkolati glikoproteinjének (gp) származékai jelentősen hozzájárultak a HÍV diagnózisához és kísérleti vakcinálásához.
A Vaccinia vírusokkal való rekombináláshoz analóg módon egy NS-1 szekvenciát, amelybe beleértendő autentikus szignál szekvenciája is, szintetizálunk PCR-rel, és pl. pUC-19-be klónozzuk. Lehetséges a TBE szignál szekvencia helyettesítése valamely prokarióta szignál szekvenciával abból a célból, hogy az NS-1 molekulák hatékony kiválasztódását érjük el a bakteriális sejtekből. Ez utóbbi megakadályozza az NS-1 aggregálódását és zárványtestek kialakulását, amelyeket csak detergensekkel vagy más szolubilizáló szerekkel lehet feloldani.
A teljes és érett NS-1 szintézisén kívül ez a kísérleti munkamenet alkalmazható az NS-1 molekula megcsonkított ·· * · ·*· ·* ·· • · ··♦ *·
··♦« ··· ·«· ·· ·· » formáihoz is A megcsonkított molekulákat arra lehet használni, hogy a fehérje speciális helyei ellen irányuló immunválaszt indukáljanak. Az ilyen formák értékes eszközök lehetnek a helyre irányuló szerológia kivitelezéséhez. Az NS-l-en belül levő immunológiailag releváns epitópok beépíthetők hordozó molekulákba, mint adjuvánsokba (pl. HBbelső részecskékbe) vagy valamely immunstimuláló komplexbe (ISCOM) CMorein és munkatársai: Immunology Today 8_, (11), 333-338 (1987)3.
Bármely NS-1 molekula, amelyet a jelen bejelentésben leírt valamely prokarióta vagy eukarióta kifejező rendszerben szintetizálunk, olyan molekulát jelent, amely alkalmas jelölt lehet NS-1 vakcinához, akár önmagában, akár a TBE vírus rekombináns E glikoproteinjével együtt (EP-A-0284791 számú európai szabadalmi közzétételi irat), akár valamely már hozzáférhető, inaktivált TBE-vírust tartalmazó vakcinával együtt.
Ezen kívül az ez ellen a nem-szerkezeti fehérje vagy részei ellen kialakuló immunválasz kritikus lehet a TBE vírus és a Flavivírus család más tagjai patogenicitásának megértéséhez.
Idegen DNS vagy RNS szekvenciákat is beépíthetünk élő vírusok genomjaiba, így alakítva ki olyan rekombináns vírusokat, amelyeket élő vakcinaként alkalmazhatunk ^áttekintésként lásd: Mackett és Smith: 0. Gén. Virol. 67, 2067-2082 (1986)3.
Különböző gének, : pl. különböző vírusokból származó gének ···· ···· ·· «Α >
* · - · · » · · • ··· ·«· ··· « ν • ♦ · · · ··· ·· ·«· ·» φ9 >
kombinációit szimultán ki lehet fejezni rekombináns DNS technikával, és ezeket vakcinálásra lehet felhasználni CPerkus és munkatársai: Science 229, 981-984 (1985)3. A találmány ennél fogva magában foglalja a leírt szekvenciákon kívül az összes szekvencia-kombinációt más szekvenciákkal, pl. más fehérjéket kódoló génekkel vagy olyan szekvenciákkal, amelyek a fehérjék kifejeződésében részt vállalnak; ilyenek pl. a promotorok, fokozok, poliadenilező vagy összefonódási szignálok.
Azok számára, akik a szakterületen járatosak, ismeretes, hogy nem kell szükségszerűen a teljes természetben előforduló fehérjét alkalmazni immunizáláshoz vagy diagnosztikai célokra CLerner: Natúré 299, 592-596 (1982); Arnom: TIBS 1Λ, 521-524 (1986)3.
A vakcinaként vagy diagnosztikai reagensként alkalmazni kívánt fehérjéket vagy fehérje-részeket nem csupán a fentebb ismertetett rekombináns DNS technikákkal lehet előállítani, hanem a jelen találmányban leírt szekvencia-információk alapján alkalmazható szintézise is. Ezen áll rendelkezésre.
erre a célra az oligopeptidek kémiai a területen kiterjedt irodalmi háttér Különféle fehérjéket kódoló DNS szekvenciák alapján szintetizált peptideket sokan állítottak már elő és alkalmaztak sokféle célra, pl. molekuláris biológiai és immunológiai tanulmányokhoz CLerner és munkatársai: Cell 23, 309-310 (1981); Lerner: Natúré 299, 592-596 (1982)3 vagy vakcináláshoz LShinnick és munkatársai: Ann. Rév. Microbiol. 37, 425-446 (1983); DiMarchi és munkatársai: Science 232, 639-641 (1986)3. A jelen • V ···· találmányban leírt szekvenciáknak megfelelő peptidek és peptid-kombinációk elkészítése és alkalmazása a technika állása szerinti ismeretek területén belül van.
Azok számára, akik a szakterületen járatosak, az is ismeretes, hogyan kell a jelen találmány szerint előállított nukleinsavakat és szekvenciákat alkalmazni hibridizációs vizsgáló minták előállítására pl. vírus RNS meghatározásában való felhasználáshoz kullancsokban vagy vér-folyadékban EMeinkoth és Wahl: Anal. Biochem. 138, 267-284 (1984); Kulski és Norval: Arch. Virol. 83 , 3-15 (1985)3. Ezeket elő lehet állítani vagy rekombináns DNS technikákkal, vagy az oligonukleotidok kémiai szintézisével a leírt szekvencia alapján.
A találmányt az alábbiakban példákkal illusztráljuk. Ahol másképpen nem jelezzük, az alkalmazott munkamenetek a szakterületen hagyományosan alkalmazott munkameneteket követik. Ilyen munkamenetek számos standard munkában megtalálhatók, ilyen pl. az alábbi: Sambrook, Fritsch és Maniatis: Molecular Cloning: A Laboratory Manüal (2. kiadás); Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
KIVITELI PÉLDÁK
1. példa. A TBE vírus szaporítása és tisztítása
TBE vírussal fertőzött szopós egér agyának 10%-os szuszpenzióját alkalmazzuk primer csirkeemberió-sejt egyrétegének fertőzéséhez, amely 15 mmól/1 HEPES-sel és
mmól/1 EPPS-sel pH 7,6-on pufferolt egy-réteg minimál esszenciális tápközegen (MÉM) van fenntartva. 40 órás, 37°C hőmérsékleten végzett inkubálás után a felülúszőt 1000 >g-nél 30 percen át, 4°C hőmérsékleten végzett centrifugálással derítjük, és a vírust ultracentrifugálással (50000 xg, 3 óra; 4°C) üledékbe visszük. A vírust azután újra szuszpendáljuk megfelelő térfogatú TAN pufferban C0,05 mól/1 trietanol-amin, 0,1 mól/1 NaCl (pH 8,0)3 és sebességzónás centrifugálásnak vetjük alá 5 —>20% (tömeg/tömeg) szacharóz sűrűséggradiensbpn 170000 xg-nél 110 percen át, 4°C hőmérsékleten. A vírus csúcsot a gradiens 254 nm-nél végzett átvilágításával lokalizáljuk és kiegyensúlyozó sűrűséggradiens centrifugálásnak vetjük alá 20 —>50% (tömeg/tömeg) szacharóz gradiensben 18 órán át 150000 g-nál, 4°C hőmérsékleten. A vírus-csúcsot TAN (pH 8,0) ellen dializáljuk, hogy eltávolítsuk a fölösleges szacharózt.
2. példa. A vírus RNS előállítása
100,M.g tisztított vírust 400/tl-re hígítunk K proteináz reakciópufferrel C100 mmól/1 trisz (pH 7,8), 5 mmól/1 EDTA, 0,5% (tömeg/térfogat) SDS3. K proteinázt adunk hozzá 200 xg/ml végső koncentrációig, és a keveréket 1 órán át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezt követően az oldatot fehérjementesítjük kétszer extrahálva azonos térfogat (400,/41) fenollal és egyszer extrahálva azonos térfogat -kloroform: izoamil-alkohol keverékkel (24:1). Ezután 26/<1 3 mól/literes nátrium-acetát oldatot adunk hozzá és az RNS-t
2,5 térfogat etanollal kicsapjuk. További felhasználás előtt az RNS egy alikvotját glioxállal denaturáljuk és 1%-os agaróz gélen futtatjuk abból a célból, hogy ellenőrizzük a készítmény kitermelését és minőségét.
3. példa. Kettős szálú cDNS szintézise
5j<g, etanollal kicsapott RNS-t újra szuszpendálunk 40/'1 első szál szintézis pufferral (Amersham, Egyesült Királyság), amely 5 ^g véletlenszerű (random) oligonukleotid prímért tartalmaz, 70°C hőmérsékletre melegítjük, majd lassan hagyjuk lehűlni szoba hőmérséklet re. Mind a négy dezoxi-nukleotidból adunk hozzá, 1 mmól/1 végső koncentrációt állítva be ezekkel. Ezen kívül 5 egység humán placenta eredetű ribonukleáz inhibitort és 10 Ci cA-^Zp dCTP-t adunk a keverékhez. Az első szál szintézis 100 egység reverz transzkriptáz (Amersham) hozzáadásával indul be, ezt hagyjuk folyni 2 órán át 42°C hőmérsékleten. A reakciókeveréket ezután jégre helyezzük és hozzáadjuk a második szál szintéziséhez szükséges reagenseket az alábbi sorrendben: 93,5 ,/<1 második szál szintézis puffer (Amersham, Egyesült Királyság), 4 egység ribonukleáz H, 23 egység E.coli DNS polimeráz, és víz 250vm1 térfogat eléréséig. A második szál szintézist úgy hajtjuk végre, hogy 2-2 órán át inkubálunk előbb 12°C, majd 22°C hőmérsékleten és a reakciót az oldat melegítésével állítjuk le 70°C hőmérsékleten 20 percen át. A kettős szálú cDNS-t 10 egység T4 DNS polimerázzal kezeljük 30 percen át 37°C hőmérsékleten abból a célból, hogy tompa végeket alakítsunk ki. A cDNS-t végül fenolos és kloroformos extrakciókkal tisztítjuk és 2 térfogat etanollal kicsapjuk.
4. példa. Ligálás kapcsolókkal
Szintetikus, 5 '-foszforilezett BamHI kapcsolókat (New England Biolabs) adunk a cDNS-hez és egy éjszakán át reagáltatunk 12°C hőmérsékleten. A reakciókeverék végső térfogatában 20^,1 ligáló puffért Γ50 mmól/1 trisz (pH 7,5), 5 mmól/1 MgC12, 5 mmól/1 DTT, 1 mmól/1 ATP), mintegy 1 ^tg
| cDNS-t, England | 1jz.g kapcsoló DNS-t | és | 1^.1 T4 DNS | ligázt (New | |
| Biolabs) | tartalmaz. | ||||
| 5. példa | . A cDNS | méret szerinti | frakcionálása | ||
| A cDNS- | t 1%-os | agaróz gélen | f r | akciónáljuk. | A különböző |
| méretű | frakciókat kihasítjuk | a | gélből és | a DNS-t az |
agarózból analitikai elektro-eluáló berendezésben (IBI) extraháljuk a gyártó cég útmutatásai szerint. A kezelt DNS kis mennyiségei ellenére, amely etidiuniifíromidos festéssel alig mutatható ki, az extrakciós munkafolyamat könnyen követhető a cDNS-be beépített radioaktív jelzés következtében. A méret szerinti frakcionálás lépése eszközt nyújt a cDNS nagy fragmentumainak szelektív klónozásához és arra a célra is szolgál, hogy teljes mértékben elkülönítse a - cDNS-t a nem ligáit kapcsoló molekuláktól.
6. példa. Klónozás egy bakteriális fagemidba
A cDNS-t 10 egység BamHI restrikciós endonukleázzal emésztjük 1 órán át 37°C hőmérsékleten. Fenolos és kloroformos extrahálás után a DNS-t 2 térfogat etanollal kicsapjuk, és újra szuszpendáljuk kis térfogatnyi vízben.
« ♦
• · • · · ·
20-30 ng cDNS-t összekeverünk 50 ng BLUESCRIPT SKfagemiddel (Stratagene), amelyet előzőleg BamHI emésztéssel linearizáltunk. (A BLUESCRIPT név védjegyzett). Ezt a két komponenst T4 DNS ligázzal ligáljuk 10 1 ligáló pufferral (lásd korábban) egy éjszakán át 16°C hőmérsékleten. A következő reggelen a ligálási keveréket 65°C hőmérsékleten 5 percig melegítjük, vízzel százszorosára hígítjuk és E.coli XL1 Blue sejtek transzformálására használjuk fel. Ezek a kompetens baktériumok a Stratagene-től szerezhetők be. A transzformálást 3^1 hígított ligálási keverékkel végezzük, pontosan betartva a forgalmazó Stratagene cég útmutatásait. A baktériumokat LB agar lemezekre szélesztjük, amely tartalmaz ampicillint, tetraciklint, IPTG-t és X-Gal-t is.
7. példa. A beiktatást tartalmazó fagemidek azonosítása rendszerben a beiktatást tartalmazó alakítanak ki, míg az önidéz elő. így a fehér tartalmaz. 37°C hőmérsékleten mozgó napon gyors plazmid-preparálást ampicillint is egy éjszakán át 220 fordulat/perccel
A következő standard forralási eljárással CBirnboim és Doly:
Research 1_, 1195-1204 (1979)3. A plazmidokat emésztjük és 1%-os agaróz gélen klón, amelyet ilyen módon fagemid; ez egy mintegy 2000 bp beiktatást hordoz. Az 1. ábra enzimmel egyik BS 17-6
A BLUESCRIPT vektor fagemidek fehér baktériumtelepeket ligáit fagemid kék színreakciót telepeket kiemeljük és 2 ml olyan LB-tápközegbe inokuláljuk, amely növesztünk . rázógépen.
végzünk a
Nucleic Acids
BamHI restrikciós elemezzük. Az azonosítottunk, a hosszúságú, vírusspecifikus mutatja be a BS 17-6 gyors plazmid-preparátumának agaróz-gél képét mind a túltekercselt cirkuláris, mind a BamHI-vel • · · • ··< ··· * * · · ··»·· ·· ··· ·· ·· ,
- 36 · emésztett formában.
8. példa. A BS 17-6 beiktatásának szekvenciaelemzése
A BS 17-6 klón egyszálú DNS-ét úgy készítjük el, hogy a VCS segítő fágot (Stratagene) 20:1 M.O.I.-nál a BS 17-6-ot tartalmazó E.coli XL1 Blue baktérium exponenciális növekedési stádiumban levő tenyészetéhez adjuk. Miután a tenyészetet 37°C hőmérsékleten 16 órán át élénken kevertettük, a felülúszóból az egyszálú DNS-t (ssDNS) standard munkamenet szerint tisztítjuk. Az egyszálú DNS-t szekvenciaelemzésnek vetjük alá a beiktatás teljes területén Sanger és munkatársai didezoxi-módszerével CPNAS USA 74, 5463-5467 (1977)J, a SEQUENASE enzimet (United Stater
Biochemicals) és az enzim-előállító cég által szolgáltatott reagenseket alkalmazva. (A SEQUENASE szó védjegyzett). A szekvenciaelemzési reakciókhoz primerként vektor-fajlagos és vírus-szekvencia-fajlagos oligonukleotidok készletét alkalmazzuk. A 17-6 beiktatás teljes szekvenciáját a 2. ábrában mutatjuk be.
9. példa. Az NS1 fehérje aminosavszekvenciájának levezetése
A 17-6 nukleotid szekvencia transzlációja minden lehetséges leolvasó keretben csak egyetlen hosszú, nyitott leolvasó keretet tár fel. Az ebből a keretből származó aminosavszekvenciát összemérjük más flavivírusok szekveniáival CRice és munkatársai: Science 229, 726-733 (1985); Coia és munkatársai: J. Gén. Virol. 69, 1-21 (1988); Chambers és •·· · ···· ·· • · . · · « ♦ ·♦ ··· * ♦ · · • · · > · · ·
munkatársai: Virology 169, 100-109 (1989)3. Ezekhez az elemzésekhez a Beckman MICROGENIE Software (Version 4.0) programot alkalmazzuk IBM személyi számítógépen. A MICROGENIE szó védjegyzett. Az elemzés azt jelzi, hogy a 17-6 klón tartalmazza az NS1 fehérje teljes kódoló szekvenciáját, az E fehérje és az NS2A fehérje kódoló szekvenciáinak részeit, amelyek az NS1 gént szegélyezik a Flavivírus genomon belül.
A 3. ábra a 17-6 klónból származó RNS szekvenciát és a kódolt aminosavszekvenciát mutatja be. Feltételezhető, hogy az NS1 amino-terminálisa egy celluláris szignaláz enzim révén, míg a karboxi terminális egy szignaláz-szerű enzim révén szabadul fel. Az NS1 fehérje egy nagyobb formáját, amely tartalmazza az NS2A fehérje amino-terminális részét is, Mason és munkatársai figyelték meg CVirology 158, 361372 (1987)3. Az NS1 fehérje ezen formájának karboxiterminálisát egy vírus-fajlagos proteázzal vagy celluláris szignalázzal lehet felszabadítani ERice és munkatársai, Science 229, 726-733 (1985)3. Egy amino-terminálist és három lehetséges karboxi-terminálist mutatunk be a 3. ábrán. Azt a karboxi-terminálist, amely szignaláz-szerű enzimmel szabadul . fel EChambers és munkatársai: Virology 169, 100-109 (1988)3, COOH-Terminus l-nek jelöljük; azt a karboxi-terminálist, amely valószínűleg egy esetleg vírus-fajlagos proteáz segítségével keletkezik, COOH-Terminus 2-nek jelöljük; és a celluláris szignaláz segítségével felszabadított lehetséges karboxi-terminálist COOH-Terminus 3-nak jelöljük. A 3. ábrában alkalmazott helyzetjelölő számok a TBE vírus teljes hosszúságú genomjára vonatkoznak.
* · · ····
A 4. ábra az NS1 fehérjének azt az aminosav-szekvenciáját mutatja be, amely a 17-6 klón szekvencia-információjából ered. A helyzetjelző számok az NS1 fehérje első aminosavától számítódnak. A 4. ábra bemutatja az TBE vírus NS1 fehérjében jelen levő három lehetséges N-glikozilezési hely elhelyezkedését is.
10. példa. Az NS1 kódoló terület klónozása valamely prokarióta kifejező vektorba
A 17-6 kiónból származó, NSl-et kódoló nukleotid szekvenciát a pUC19S-be al-klónozzuk. A pUC19S vektor a pUC19 származéka, amely egy stop kapcsolót tartalmaz egy TAG stop kodonnal mindhárom leolvasó keretben, a BamHI helybe klónozva. Az NS1 szekvenciát, amely 3' végénél az NS2a egy kis részét is tartalmazza, Cfol restrikciós endonukleázzal kimetsszük, és tompa végeket alakítunk ki Sl-nukleázzal. A pl)C19S klónozó vektort polilinkerében linearizáljuk Sallgyel és a terminálisokat T4 DNS polimerázzal betöltjük (5. ábra). A vektor és a beiktatás ligálása helyreállítja a Sáli helyeket és keretben fuzionálja az NSl-et a lacZ génhez (6A. és 6B. ábrák). Az NS1 nukleotid szekvencia 31 terminálisánál a vektorban levő prokarióta transzkripciós és transzlációs stop szignálokkal van szegélyezve. A plazmidot pNS1387-nek nevezzük.
• · · · · · ·
11. példa. Az NS1 kódoló terület, amely magában foglalja 5' proximális hidrofób szignál szekvenciáját is, klónozása a polimeráz láncreakciót alkalmazva
Abból a célból, hogy az NS1 kódoló területet-beleértve autentikus szignál szekvenciáját is - tartalmazó, indukálható prokarióta kifejező plazmidot alkossunk meg, a pSCtSNS1444-ből (13. példa) származó Sáli fragmentumot pUC195-be visszük át; ez a ptSNS1682 kiónt eredményezi. Abból a célból, hogy az NS1 gént ugyanabba a leolvasó keretbe helyezzük, amelyben a lacZ van, a ptSNS1682 kiónt HindlII-mal emésztjük, SÍ nukleázzal tompa végeket alakítunk ki, és újra ligáljuk, így alakítva ki a ptSNS1791 kiónt 4 nukleotid kiiktatásával (7a és 7b ábrák).
12. példa. Plazmid megalkotása Vaccinia vírusba való rekombinációhoz: az NS-1 fehérje a VV-pll(L) promotor szabályozása alatt.
Az NS-1 kódoló területet (lásd a 10. példát) a pTKgptFls plazmid CFalkner G.F. és Moss B.: J. Virol. 62 , 1849-1854 (1988)3 Sáli helyébe szubklónozzuk. Az NS1 szekvencia a vektor ATG transzlációs start kodonjával keretben helyezkedik el. A vektor transzlációs stop szignálokat is szolgáltat. A vektor polilinker területe további 7 aminosavat ad az 5' véghez és 10 aminosavat a 3' véghez. A klónozási stratégiát és a fehérje szegélyező szekvenciáit a 8A. és 8B. ábrákban mutatjuk be. A plazmidot pAPN1338-nak nevezzük.
13. példa. Plazmid megalkotása Vaccinia vírusba való rekombinációhoz: az NS-1 fehérje - természetes szignál szekvenciájával együtt - a VV-p7.5 (E/L) promotor szabályozása alatt.
Az NS1 kódoló területét és ennek szignál szekvenciáját tartalmazó nukleotid szekvenciát polimeráz láncreakcióval (PCR) szintetizáljuk, templátként a 17-6 kiónt használva. Két olígonukleotidot szintetizálunk kémiai úton 5' végüknél EcoRI és Sáli restrikciós endonukleázos hasítási helyekkel és 3' végüknél Sáli és Hpal hasítási helyekkel, és ezeket primerként alkalmazzuk a PCR-ben (9A. és 9B. ábrák). A kibővített NS1 fragmentumokat agaróz gélen tisztítjuk (10. ábra), Sall-gyel hasítjuk és a pSCll-Orth vektor Sáli helyébe klónozzuk kisebb módosítások után. A pSCll-Orth a DSM-nél (Braunschweig, Németország) lett deponálva 1990. január 15-én. A klónozási stratégiát és az új konstrukció 5' és 3' terminálisának szekvenciáit a 11. 12. ábrákon mutatjuk be. A klón restrikciós emésztése utáni agaróz gél képét, amely igazolja a beiktatás korrekt orientációját, a 13. ábrán mutatjuk be. A plazmidot pSCtSNS1444-nek nevezzük.
14. példa. Plazmid megalkotása Vaccinia vírusba való rekombinációhoz: az NS-1 fehérje - természetes szignál szekvenciájával együtt - a VV-pll(L) promotor szabályozása alatt.
A pTKtSNS1556 plazmid a pSCtSNS1444 kiónból származó NS1 pTKgptF3s vektorba CFalkner és Moss: J. Virol. 62 , 1849-1854 (1988)] való szubklónozásának eredménye. Az NS1 szekvenciát Sall-gyel metsszük ki és beiktatjuk a pTKgptF3s Sáli ·* »· ····
helyébe. A klónozási stratégiát és a pTKtSNS1556 nukleotid szekvenciáit a 14. és 15. ábrákban mutatjuk be.
Az összes plazmidot ampicillin szelekciós koncentrációja mellett növesztjük valamely E.coli gazdaszervezetben, pl. DK1, BH1O1 vagy 3M (3M105, 3M83) törzsekben.
15. példa. Vaccinia rekombinánsok kialakítása NS1 fehérje kifejezéséhez
Standard munkamenetek szerint (Mackett M., Smith G. és Moss B.: a DNA Cloning: A Practical Approach című kiadványban, 191-221 oldal; szerkesztő: Glover D.M; kiadó: Oxford, IRL Press) rekombináns vírusokat alakítunk ki. A pSCtSNS1444 és pTKtSNS1556 plazmid DNS-eit vad típusú Vaccinia vírussal fertőzött CV-1 sejtekbe fertőzzük át. A pSCll-Orth-eredetű varecNS1444 rekombinánst BuDR-rel szelektáljuk ki 143tk sejteken. A pTKgptFs-eredetű varecNS1556 rekombinánst gpt szelekcióval izoláljuk CV-1 sejteken. A rekombinánsok korrekt szervezettségét Southern folt elemzéssel (16. ábra) elemezzük.
-yl6. példa. NS1 kifejezése Vaccinia vírus rekombinánsokkal fertőzött CV-1 sejtekben
CV-1 sejteket fertőzünk a varecNS1444 és varecNS1556 Vaccinia-vírus rekombinánsokkal. A fertőzés után két nappal a sejteket -^^S-metioninnal jelezzük 4 órán át. A fehérjéket 12%-os SDS denaturáló poliakrilamid gélen elválasztjuk és autoradiográfiával azonosítjuk. Kimutatható a mintegy 48 kd **#♦ 9999 ·· • * · · ♦ · · · · · • · · · • · · · · »» várt molekulatömegnek megfelelő fehérje-csík. Ez hiányzik azokban a sejtekben, amelyek vad típusú vírussal vagy nemNS1 rekombinánssal, pl. varecl342-vel vannak fertőzve (17. ábra) .
Claims (21)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Pepiid vagy polipeptid azzal jellemezve, hogy a nyugati altípusú TBE vírus NS-1 fehérje aminosav-szekvenciájának legalább egy részét tartalmazza.
- 2.Az 1. igénypont jellemezve, hogy szekvenciával bír.szerinti peptid vagy polipeptid azzal a 4. ábrában bemutatott aminosav
- 3.szerinti polipeptid azzal jellemezve,
- 4.
- 5.hogy ez igénypont a nyugati altípusú TBE vírus NS-1 fehérjéje.vagy polipeptid aminosav-szekvenciát és/vagy átrendeződés NS-1 szekvenciától, TBE vírus belül van.Pepiid azzal jellemezve, hogy olyan tartalmaz, amely ugyan mutáció következtében eltér a természetes de ez az eltérés a nyugati altípusú természetes variációinak normális tartományánAz 1-4. polipeptid gyógyászati igénypontok bármelyike vagy fehérje azzal felhasználásra alkalmazható .szerinti peptid, jellemezve, hogy
- 6. Vakcina-kompozíció azzal jellemezve, hogy valamely, az ΙΑ. igénypontok bármelyike szerinti pepiidet, polipeptidet vagy fehérjét tartalmaz egy vagy több további, gyógyászatilag elfogadható komponenssel együtt.• · · · · ··· ··· * « • · ···· • · ·· · • · » ··· ·· ·««
- 7. Diagnosztikai reagens azzal jellemezve, hogy valamely, az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti peptidet, polipeptidet vagy fehérjét tartalmaz.
- 8. Nuk^-leinsav azzal jellemezve, hogy valamely, az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti peptidet, polipeptidet vagy fehérjét kódol.
- 9. Élő vakcina azzal jellemezve, hogy valamely 8. igénypont szerinti nukleinsavat tartalmaz.
- 10. Vizsgáló minta azzal jellemezve, hogy valamely 8. igénypont szerinti nukleinsavat tartalmaz.
- 11. Nukleinsav azzal jellemezve, hogy valamely 8. igénypont szerinti nukleinsavhoz hibridizál.
- 12. A 11. igénypont szerinti nukleinsav azzal jellemezve, hogy a 3. ábrában szereplő DNS szekvenciához hibridizál.
- 13. Nukleinsav azzal jellemezve, hogy szekvenciája a genetikai kód degenerációja és/vagy mutáció és/vagy átrendeződés következtében eltér ugyan a természetes NS-1 RNS szekvenciának megfelelő vagy azzal komplementer DNS szekvenciától, de ez az eltérés a nyugati altípusú TBE vírus természetes variációinak normál tartományán belül van.
- 14. A 8-13. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav azzal jellemezve, hogy további nukleinsav-szekvenciákkal van • · ·*· « φ •45
- 15.15.
- 16.16.
- 17.17.
- 18.18.
- 19.19.
- 20.20.
- 21.21.kombinálva .A 14. igénypont szerinti nukleinsav azzal jellemezve, hogy ez egy DNS, és a további szekvenciák lehetővé teszik a DNS molekula replikációját és kifejeződését sejttenyészetben, és ezek a további szekvenciák előnyösen promotorként, fokozóként, poliadenilező szignálként és/vagy összeforródási szignálként működő szekvenciák.Vektor, mint plazmid, vírus vagy fág, azzal jellemezve, hogy valamely, 8.-15. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavat foglal magában.A 16. igénypont szerinti vektor azzal jellemezve, hogy Vaccinia vírusból származik.A 16. igénypont szerinti vektor azzal jellemezve, hogy valamely bakteriális plazmidból származik.Gazdasejt azzal jellemezve, hogy valamely, a 16.-18. igénypontok bármelyike szerinti vektort tartalmaz.Gazdasejt-tenyészet azzal jellemezve, hogy valamely 19. igénypont szerinti gazdasejt tenyészete.A 20. igénypont szerinti gazdasejt-tenyészet azzal jellemezve, hogy emlős sejttenyészet.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP89305708 | 1989-06-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU903490D0 HU903490D0 (en) | 1990-10-28 |
| HUT54306A true HUT54306A (en) | 1991-02-28 |
Family
ID=8202711
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU903490A HUT54306A (en) | 1989-06-06 | 1990-06-05 | Process for producing proteins, vaccines and nucleic acids |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0402116B1 (hu) |
| JP (1) | JPH03151878A (hu) |
| AT (1) | ATE143373T1 (hu) |
| CA (1) | CA2018332A1 (hu) |
| CZ (1) | CZ277921B6 (hu) |
| DD (1) | DD297997A5 (hu) |
| DE (1) | DE69028658T2 (hu) |
| FI (1) | FI902814A0 (hu) |
| HU (1) | HUT54306A (hu) |
| NO (1) | NO902491L (hu) |
| SK (1) | SK277781B6 (hu) |
| YU (1) | YU109590A (hu) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4224402A1 (de) * | 1992-07-21 | 1994-01-27 | Schering Ag | Neue Pyridin-Derivate mit Leukotrien-B¶4¶-antagonistischer Wirkung |
| FR2794865B1 (fr) | 1999-06-09 | 2003-04-18 | Pasteur Institut | Methode de detection precoce des flavivirus et ses applications |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3853693D1 (de) * | 1987-03-20 | 1995-06-08 | Immuno Ag | DNA- und RNA-Moleküle des westlichen Subtyps des FSME-Virus, Polypeptide, die von diesen Molekülen codiert werden, und deren Verwendung. |
| IL91304A0 (en) * | 1988-08-20 | 1990-03-19 | Us Health | Recombinant vaccinia virus for prevention of disease caused by flavivirus |
-
1990
- 1990-06-05 YU YU109590A patent/YU109590A/sh unknown
- 1990-06-05 DD DD90341327A patent/DD297997A5/de not_active IP Right Cessation
- 1990-06-05 CA CA002018332A patent/CA2018332A1/en not_active Abandoned
- 1990-06-05 HU HU903490A patent/HUT54306A/hu unknown
- 1990-06-05 FI FI902814A patent/FI902814A0/fi not_active Application Discontinuation
- 1990-06-05 NO NO90902491A patent/NO902491L/no unknown
- 1990-06-06 CZ CS902806A patent/CZ277921B6/cs unknown
- 1990-06-06 SK SK2806-90A patent/SK277781B6/sk unknown
- 1990-06-06 JP JP2146403A patent/JPH03151878A/ja active Pending
- 1990-06-06 AT AT90306154T patent/ATE143373T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-06-06 DE DE69028658T patent/DE69028658T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-06-06 EP EP90306154A patent/EP0402116B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0402116B1 (en) | 1996-09-25 |
| NO902491L (no) | 1990-12-07 |
| FI902814A0 (fi) | 1990-06-05 |
| YU109590A (sh) | 1992-07-20 |
| EP0402116A1 (en) | 1990-12-12 |
| SK277781B6 (en) | 1995-01-05 |
| NO902491D0 (no) | 1990-06-05 |
| JPH03151878A (ja) | 1991-06-28 |
| CA2018332A1 (en) | 1990-12-06 |
| DE69028658D1 (de) | 1996-10-31 |
| DE69028658T2 (de) | 1997-03-06 |
| DD297997A5 (de) | 1992-01-30 |
| CS9002806A2 (en) | 1991-11-12 |
| ATE143373T1 (de) | 1996-10-15 |
| HU903490D0 (en) | 1990-10-28 |
| CZ277921B6 (en) | 1993-06-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3531934B2 (ja) | キメラおよび／または増殖制限されたフラビウイルス | |
| Casais et al. | Reverse genetics system for the avian coronavirus infectious bronchitis virus | |
| US8088391B2 (en) | West nile virus vaccine | |
| US5741492A (en) | Preparation and use of viral vectors for mixed envelope protein vaccines against human immunodeficiency viruses | |
| Vennema et al. | Primary structure of the membrane and nucleocapsid protein genes of feline infectious peritonitis virus and immunogenicity of recombinant vaccinia viruses in kittens | |
| WO1996040933A1 (en) | Infectious dengue 2 virus pdk-53 as quadravalent vaccine | |
| Vennema et al. | Genomic organization and expression of the 3′ end of the canine and feline enteric coronaviruses | |
| JPH09511914A (ja) | ペスチウイルス株のヌクレオチド配列、それらの配列によりコードされるポリペプチド、ならびにペスチウイルス感染の診断および予防のためのそれらの使用 | |
| CA2639074C (en) | Marked bovine viral diarrhea virus vaccines | |
| JP3602759B2 (ja) | 弱毒型のウシウィルス性下痢性ウィルス | |
| US7521058B2 (en) | Non-spreading pestivirus | |
| Sato et al. | High-level expression of the Japanese encephalitis virus E protein by recombinant vaccinia virus and enhancement of its extracellular release by the NS3 gene product | |
| EP0518313A2 (en) | Gene of hepatitis C virus or fragment thereof, polypeptide encoded by the same | |
| JP4664072B2 (ja) | Ｃ及び／又はｅ１タンパク質を発現しないペスチウイルスのレプリコン及びワクチンに使用できる前記レプリコンを含む感染性ウイルス粒子 | |
| EP0479866B1 (en) | Pestivirus nucleotide sequences and polypeptides, in particular from hog cholera virus | |
| HUT54306A (en) | Process for producing proteins, vaccines and nucleic acids | |
| CA3202140A1 (en) | Genomic deletion in african swine fever vaccine allowing efficient growth in stable cell lines | |
| WO2010135054A2 (en) | Mutations in a toll-like receptor motif in the ns4b of classical swine fever virus skin brescia influences virulence in swine | |
| DK175515B1 (da) | DNA- og RNA-molekyler stammende fra den vestlige undertype af FSME-virus, vektorer svarende dertil, vaccinia-ekspressionsvektor, bærerbakterie, cellekultur, peptid eller polypeptid, præparat omfattende peptider eller polypeptider, l.... | |
| US6974575B2 (en) | Generation of type I/type II hybrid form of bovine viral diarrhea virus for use as vaccine | |
| FI102835B (fi) | FSME-viruksen läntisen alatyypin peptidejä ja polypeptidejä ja niitä s isältäviä diagnostisia aineita | |
| Carroll | Expression analysis and immunogenicity of human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in vaccinia virus | |
| Tellier | Immunogenicity and protective efficacy evaluation of canarypoxvirus (ALVAC)-based FIV vaccines in cats |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |