DK175515B1 - DNA- og RNA-molekyler stammende fra den vestlige undertype af FSME-virus, vektorer svarende dertil, vaccinia-ekspressionsvektor, bærerbakterie, cellekultur, peptid eller polypeptid, præparat omfattende peptider eller polypeptider, l.... - Google Patents

Description

i DK 175515 B1

Den foreliggende opfindelse angår DNA- og RNA-molekyler af den vestlige undertype af FSME-virus og polypeptider, der indkodes af disse molekyler, vektorer, en bærer, en cellekultur, et peptid eller polypeptid, et præparat af ét eller flere af disse peptider eller polypeptider, en levende vaccine, anvendelse af denne, 5 et diagnostisk middel samt en DNA- eller RNA-probe.

Den vestlige undertype af forårssommermeningoencephalitis-(FSME)-virus er et1 medlem af familien Flaviviridae, som er sfæriske lipid-omsluttede RNA-vira (Westaway et al., Intervirology 24, 183-192,1985). Prototypen for disse vira er gul 10 feber-virus. Med hensyn til definition er alle flavivira serologisk beslægtede, hvilket er påvist ved hæmagglutinations-inhiberingstests. Ved krydsneutralisering kan familien imidlertid underopdeles i flere serocomplexer (DeMadrid og Porterfield, J.Gen.Virol. 23, 91-96, 1974), der omfatter vira, som er nærmere beslægtede med hinanden end med medlemmer af andre serocom-plexer eller med ugrupperede 15 flavivira. FSME-virus er et medlem af de såkaldte "Tick-borne" serocomplexer, hvortil også hører Louping-III-, Langat-, Omsk hæmorrhagisk feber-, Kyasanur Forest Disease- og Negishi-virus.

FSME-virusstammer kan desuden underinddeles i en vestlig (europæisk) un-20 dertype, der hovedsagelig overføres af Ixodes ricinus, og en fjernøstlig type med Ixodes persulcatus som den væsentligste overfører (Clarke, 1964, Bull. WHO 31, 45-56).

Denne undertypeinddeling er blevet bekræftet både ved kompetitive radioimmu-25 noassays samt peptidkortlægning under anvendelse af begrænset proteolyse af de tilsvarende strukturglycoproteiner (Heinz og Kunz, J.Gen.Virol. 57, 263-274, 1981) og ved antigenanalyser under anvendelse af monoklonale antistoffer (Heinz et al.. Virology 126, 525-537, 1983).

I 30 Modne viruspartikler indeholder kun tre strukturproteiner, der betegnes E, C og M

I og har omtrentlige molekylvægte på henholdsvis 50.000-60.000, 15.000 og 7.000.

Genomet af flavivira består af enkeltstrenget RNA med ca. 11.000 baser med I mRNA-polaritet med en molekylvægt på 4xl0'/46 dalton. Dette RNA danner I DK 175515 B1 sammen med C-proteinet et sfærisk nukleokapsid, der er omgivet af en lipidmem- bran, som er associeret med proteinerne E og M.

Forsøg, hvor der anvendtes oprensede præparationer af E-proteinet, der blev 5 vundet efter solubilisering af viruset med detergenter, har vist, at E udgør det virale hæmagglutinin (dvs. at det forårsager agglutination af bestemte erythro- cytter under egnede betingelser), som efter immunisering inducerer hæmaggluti- H nationshæmmende, neutraliserende og beskyttende antistoffer samt immunitet mod infektioner med levende virulent virus (Heinz et al., Infect. Immun 33, 250- I 10 257, 1981).

Ud over disse strukturproteiner kan der findes flere virusspecifikke ikke-struktur- proteiner i flavivirusinficerede celler.

15 Flaviviras genomorganisation er for nylig blevet bestemt ved cDNA-kloning og sekventering af gul feber-, Vestnil- og Murray Valley-encephalitisvirus (Rice et al., I Science 229, 726-733, 1985; Dalgarno et al., J.Mol.Biol. 187, 309-323, 1986; I Castle et al., Virology 147, 227-236, 1985; Castle et al., Virology 149, 10-26, I 1986; Wengler et al., Virology 147, 264-274, 1985). Ifølge disse analyser inde-

20 holder flaviviras genom-RNA en enkelt lang åben læseramme på ca. 11.000 nukle- I

otider, som koder for alle struktur- og ikke-strukturproteiner.

Generne for strukturproteinerne er lokaliseret i 5'-delen af RNA'et; de omfatter ca.

I 1/4 af genomet i rækkefølgen C-prM(M)-E. prM betegner et precursorprotein for M, 25 som er til stede i umodne former af flavi-vira (Shapiro et al., Virology 56, 88-94, I 1973). Den proteolytiske spaltning deraf, som sandsynligvis udføres af en cellulær protease, der findes i det endoplasmatiske retikulum, fører til dannelse af M og udgør åbenbart en sen begivenhed under virusmodningen. 1 35

Det antages, at translationen af virale proteiner initieres og forløber ved det første eller muligvis det andet AUG ved 5'-enden af RNA’et, indtil den støder på en stop-kodon ved RNA’ets 3’-ende. Det formodes, at dannelsen af enkelte proteiner sker ved en række specifikke proteolytiske spaltningsbegivenheder, der omfatter både cellulære og virusspecificerede proteaser.

DK 175515 B1 I

Pletnev et al. (FEBS 3660, 200, nr. 2, 317-321, 1986) har klonet bestemte frag- I

menter af den fjernøstlige undertype af FSME-viruset og har påvist, at genomorga- I

nisationen af denne undertype af FSME-viruset svarer til organisationen af de

ovenfor nævnte vira, men de kunne ikke klone og sekventere den samlede sekvens I

5 af strukturgenerne for denne undertype af FSME-viruset. Desuden har det vist sig, I

at den publicerede protein E-sekvens, som er afledt af klonen Sofjin 2, ikke var

korrekt, fordi der på grund af en forskydning af læserammen blev afledt en forkert I

sekvens for det carboxyterminale område. I

10 Der kendes indtil videre over 60 forskellige flavivira, og omtrent 2/3 af dem over-

føres ved bid fra et inficeret leddyr og udgør således "arthropode-borne" (ARBO) I

vira. Flere flavivira er kendte humanpato-gener, herunder gul feber-virus, Dengue- I

virus, japansk encephalitis-virus og FSME-virus (Shope; i "The Togaviruses", s. 47- I

82, Academic Press, New York).

15 FSME-virus er endemisk i mange europæiske lande, i Rusland og i Kina. Sygdommen er veldokumenteret i nogle centraleuropæiske lande såsom Østrig, Tjekkoslovakiet eller Ungarn, og hvert år registreres flere hundrede tilfælde, der indlægges på sygehuse, hvilket udgør et betydeligt problem for folkesundheden.

2°

Sygdommen kan forebygges effektivt ved vaccination med en højoprenset, forma-I lin-inaktiveret helvirusvaccine (Kunz et al., J.Med.Virol. 6, 103-109, 1980), som I inducerer et immunrespons mod virusets strukturproteiner. Den betydeligste I ulempe ved denne vaccine er, at der skal håndteres store mængder af infektiøse I 25 og muligvis farlige virus-suspensioner under fremstillingen. Derfor er der behov for I omfattende og bekostelige sikkerhedsforanstaltninger.

I Det var derfor et formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe midler til I fremstilling af en vaccine for at afhjælpe ovennævnte ulemper.

I 30 I Ved den foreliggende opfindelse løses denne opgave ved, at der tilvejebringes et I DNA-molekyle, som omfatter DNA afledt fra den vestlige undertype af FSME-virus, I hvilket DNA koder for mindst en del af mindst ét protein valgt fra gruppen bestå- I ende af proteinerne C, prM, M eller E af den vestlige undertype af FSME-virus.

I 35 I DK 175515 B1 Η H Det beskrevne DNA-molekyle svarer til det enkeltstrengede RNA af den vestlige un- H dertype af FSME-virus og er egnet til at tilvejebringe genetisk information til H ekspression af et polypeptid, som kan være proteinerne C, prM, M eller E af den vestlige undertype af FSME-virus, alene eller i kombination som beskrevet ovenfor, H 5 eller dele af ét eller flere af ovennævnte proteiner, som med held kan anvendes H inden for diagnose, terapi eller profylakse.

Endvidere kan selve DNA-molekylet ifølge opfindelsen eller dele deraf anvendes til forskellige formål, hvilket beskrives nærmere nedenfor.

I 10 H DNA-molekylet ifølge opfindelsen kan anvendes som et helt molekyle, hvis sekvens H koder for strukturproteinerne af den vestlige undertype af FSME-virus, fortrinsvis som vist i fig. 1. Den DNA-sekvens, der er vist i fig. 1, udviser det klonede genom af den vestlige undertype af FSME-virus svarende til det RNA-molekyle, som er 15 indeholdt i den naturligt forekommende vestlige undertype af FSME-virus. Den DNA-sekvens, der er vist i fig. 1, omfatter området for strukturproteinerne og det 5'-ikke-translaterede område. Den undersøgte DNA-sekvens har kun én åben læse- I ramme; de aminoterminale startpunkter for proteinerne C, prM, M og E samt I grænserne for klonerne A5 og Pl-1 er vist med pile.

I Som en foretrukken udførelsesform for opfindelsen tilvejebringes DNA-molekyler, I der koder for et enkelt af stfukturproteinerne af den vestlige undertype af FSME- I virus, dvs. for hele C-, prM-, M- eller E-proteinet. De respektive dele af DNA-mole- I kylet ifølge opfindelsen kan anvendes direkte i egnede ekspressionssystemer til I 25 fremstilling af et af de ønskede ovenfor omtalte strukturproteiner.

I Det er et foretrukket formål med opfindelsen at tilvejebringe en del af det DNA- molekyle, der i det mindste koder for området af en anti-gendeterminant for et af I strukturproteinerne fra den vestlige undertype af FSME-virus, til fremstilling af 30 diagnostisk, terapeutisk eller profylaktisk virksomme midler. Det er velkendt, at områder med proteinets antigendeterminanter er ansvarlige for induktionen af et antistofrespons. Derfor behøver man ikke nødvendigvis anvende alle de proteiner, hvorom det er kendt, at de har antigene egenskaber, men man kan nøjes med at anvende disse proteiners antigendeterminantområde. Det er kendt, at en sekvens 35 på kun nogle få aminosyrer i nogle tilfælde kan fungere som antigen og forårsage DK 175515 B1 5 et antistofrespons. Det kan derfor være tilstrækkeligt til fremstilling af en vaccine at tilvejebringe en DNA-sekvens, som kun koder for de aminosyrer, der udviser funktioner som antigendeterminant. Der foretrækkes en DNA-sekvens, der koder for antigendeterminantområderne for E-strukturproteinet af den vestlige undertype 5 af FSME-virus.

Der findes to måder, hvorpå DNA-molekylet ifølge opfindelsen kan fremstilles. Én mulighed, hvorved DNA-molekylet kan fremstilles, er først at ekstrahere det virale RNA fra den vestlige undertype af FSME-virus og derefter at oprense RNA-moleky-10 let, efterfulgt af transkription af denne RNA-matrix i et DNA-molekyle under anvendelse af omvendt transkriptase. En anden mulighed er at syntetisere DNA-molekylet ifølge opfindelsen kemisk, så snart DNA-sekvensen er kendt.

Som en foretrukken udførelsesform omfatter opfindelsen DNA-molekyler, der hy-15 bridiserer med de i hovedkravet omhandlede DNA-molekyler under stringente betingelser. DNA-molekyler af denne foretrukne art kan også kode for peptider, der er i stand til at fremkalde et antistofrespons, og desuden er disse DNA-molekyler egnede som DNA-prober.

20 Den foreliggende opfindelse omfatter udtrykkeligt alle de DNA-sekvenser, der afviger fra de her omhandlede DNA-molekyler, og som er frembragt ved degenerering af den genetiske kode og/eller mutationer og/eller transpositioner, men som stadig koder for et protein med de væsentlige antigene egenskaber af i det mindste ét protein valgt fra gruppen bestående af proteinerne C, prM, M eller E af 25 den vestlige undertype af FSME-virus. Af ovennævnte grunde kan en DNA-sekvens, der er forskellig fra den i fig. 1 viste, i høj grad afvige fra DNA-molekyler, som er fremstillet, isoleret og oprenset i form af cDNA ved hjælp af omvendt transkriptase fra en RNA-matrix af den vestlige undertype af FSME-virus. Ikke desto mindre er de proteiner, der indkodes af dette DNA-molekyle, alligevel de samme.

30 I en foretrukken udførelsesform for opfindelsen kan DNA-molekylerne ifølge opfindelsen kombineres med yderligere DNA-sekvenser.

I Disse yderligere sekvenser kan muliggøre replikation og ekspression af DNA- 35 molekylet i en cellekultur. Til dette formål stammer de vigtigste DNA-sekvenser fra I DK 175515 B1 Η H enhancere, promotorer, polyadenyleringssignaler og splejsningssignaler. Disse yderligere DNA-sekvenser kan kombineres med DNA-molekylerne ifølge opfindel- sen ved standardmetoder, som er kendte for fagfolk.

5 De fordele, der er nævnt ovenfor for DNA-molekylerne ifølge opfindelsen, gælder ligeledes for RNA-molekyler. RNA-molekyler ifølge opfindelsen er ejendommelige ved, at de er afledt fra RNA fra den vestlige undertype af FSME-virus og koder for i

det mindste en del af i det mindste ét protein valgt blandt proteinerne C, prM, M

H eller E af den vestlige undertype af FSME-virus. RNA-molekylet er især et sådant, 10 som omfatter hele den RNA-sekvens, der koder for strukturproteinerne, fortrinsvis som vist i fig. 2. En særlig foretrukken variant går ud på, at det koder for ét af de proteiner, der er valgt blandt proteinerne C, prM, M eller E af den vestlige under- type af FSME-virus, eller at det koder for i det mindste et område fra en antigen-

- determinant for ét af de proteiner, der er valgt blandt proteinerne C, prM, M eller E

15 af den vestlige undertype af FSME-virus, fortrinsvis E-proteinet.

RNA-molekyler ifølge opfindelsen kan fås ved isolering og oprensning af RNA fra den vestlige undertype af FSME-virus eller ved rekombinant-RNA/DNA-teknikker.

Endvidere omfatter opfindelsen ikke blot RNA-molekyler, der er vundet ved 20 oprensning af den vestlige undertype af FSME-virus, men også RNA-molekyler, der I er vundet ved transkription af isoleret og oprenset virus-RNA i DNA ved hjælp af omvendt transkriptase og efterfølgende transkription af det således vundne DNA i I RNA. En særlig foretrukken variant i et RNA-molekyle, som er ejendommeligt ved, I at dets komplementære streng under stringente betingelser hybridiserer med et 25 RNA-molekyle som ovenfor angivet.

I Ved den foreliggende opfindelse tilvejebringes ikke blot de ovenfor beskrevne DNA- I og RNA-molekyler, men også vektorer, der som insertion omfatter de omhandlede DNA- eller RNA-molekyler, idet vektoren er valgt blandt plasmider, vira og cosmi- I 30 der. Det er kendt for fagfolk, at vektorerne ifølge opfindelsen kan omfatte DNA- I sekvenser, der styrer replikationen og ekspressionen af de indsatte RNA- eller DNA-sekvenser, såsom fx promotorer, enhancere, etc.

I Et i litteraturen godt beskrevet og egnet plasmid til kloning af de omhandlede DNA- I 35 sekvenser er plasmidet pBR322. Dette plasmid indeholder en DNA-sekvens, der DK 175515 B1 7 koder for et protein valgt blandt proteinerne C, prM, M eller E af den vestlige undertype af FSME-virus eller dele deraf.

Et foretrukket, på den ovennævnte måde fremstillet plasmid er plasmidet A5, der 5 er vist i fig. 5. Plasmidet A5 er afledt fra plasmidet pBR322 og indeholder den DNA-sekvens, der koder for E-proteinet. Et andet foretrukket plasmid er plasmidet Pl-1.

De omtalte foretrukne plasmider er deponeret i Deutsche Sammlung von Mikroorganismen i henhold til Budapest-traktaten og har følgende deponeringsnumre: 10 a) plasmidet A5 i E. coii HB101: DSM 4382 I b) plasmidet Pl-1 i E. coli HB101: DSM 4383 I 15 Ved at gå ud fra det beskrevne plasmid A5 kan der ifølge en foretrukken udfø- I relsesform for opfindelsen fremstilles insertionsplasmider, der indeholder dele af I den i plasmidet A5 klonede DNA-sekvens af FSME-virus, idet disse »nsertions- I plasmider indeholder den fremmede genetiske information på en sådan måde, at I den ved homolog rekombination overfører DNA-sekvensen for E-proteinet eller dele I 20 deraf til et Hindlll J-fragment af vacciniavirus. Underfragmenter af plasmidet A5 I skæres med forskellige restrik-tions-endonukleaser og klones i insertionsplasmider- I ne, hvilket fx giver former af E-proteinet, som enten kan eller ikke kan indeholde I hydrofobe aminosyresekvenser, dvs. signal- og membranforankringssekvenser.

I Rekombinante vira med integreret protein E-DNA kan isoleres fra plaques. Inte- I 25 gration af de FSME-DNA-sekvenser, der koder for ønskede dele af E-proteinet, I bekræftes ved skæring med egnede restriktionsendonukleaser og ved hybridisering I med 32P-mærket FSME cRNA og er synligt ved, at der kan påvises et karakteristisk I Hindlll J-fragment fra vaccinia. 1 30 Tre eksempler på plasmider, der er egnet til udførelse af rekombination i vacci- I niavira, er plasmiderne pSCll-Hl, som indeholder Haell-fragmentet af det klonede I FSME-DNA, plasmidet pSCll-F41, som indeholder FnuDII-fragmentet af det klone- I de FSME-DNA, samt plasmidet pSCll-P6, som indeholder PvuII-fragmentet af det I klonede FSME-DNA. De beskrevne plasmider er vist i fig. 7. Udgangsplasmidet I 35 pSCll er deponeret i Deutsche Sammlung von Mikroorganismen i henhold til I DK 175515 B1

I 8 I

Budapest-traktaten i E. coli med deponeringsnummeret DSM 4381.

H De beskrevne insertionsplasmider anvendes fortrinsvis til insertion af de ønskede sekvenser i vaccinia-ekspressionsvektorer. Således er et foretrukket aspekt af 5 opfindelsen en vaccinia-ekspressionsvektor, som ved homolog rekombination indeholder DNA-sekvenser for E-proteinet, fortrinsvis fra DNA-sekvenser indsat i et plasmid ifølge et hvilket som helst af kravene 22-25, og at den er i stand til at udtrykke protein E eller dele deraf, der indeholder de til de omtalte DNA-sekvenser svarende amino-syresekvenser.

I 10

Som bærer for sekvenserne kan der også anvendes bakterier. En foretrukken bak- terie er Salmonella typhi.

Vektorerne og bærerne ifølge opfindelsen er fortrinsvis indeholdt i cellekulturer, i 15 hvilke ekspressionen af de polypeptider, som indkodes af RNA- eller DNA-sekven- I serne ifølge opfindelsen, si vidt muligt finder sted under native betingelser, idet I cellekulturen fortrinsvis er en pattedyrcellekultur. Ved anvendelse af en pattedyr- cellekultur tilvejebringes de mest foretrukne betingelser for ekspressionen af et polypeptid, som skal anvendes som vaccine.

I 20 - I Særlig egnede cellekulturer til ekspression af de ønskede peptider eller polypep- I tider er Vero-cellekulturer eller hønsefoster-fibroblastcellekulturer, som indeholder I en vaccinia-ekspressionsvektor som beskrevet ovenfor, idet der udtrykkes de 1 I proteiner, som svarer til de i vaccinia-ekspressionsvektorerne indeholdte DNA- I 25 sekvenser. De rekombinante vacciniavira kan analyseres for tilstedeværelsen af det indsatte FSME-DNA ved Southern Blot-hybridisering.

I Ifølge opfindelsen tilvejebringes peptider eller polypeptider, der omfatter amino- I syresekvenser, som indkodes af en hvilken som helst af de ovenfor nævnte nukle- I 30 otidsekvenser. Fordelene ved tilvejebringelsen af disse peptider eller polypeptider I er de samme som de ovenfor nævnte fordele for DNA- og RNA-molekylerne. 2 2

Aminosyresekvenserne af peptiderne eller polypeptiderne ifølge opfindelsen svarer til de DNA- eller RNA-sekvenser, som er beskrevet ovenfor, og er fortrinsvis den I 35 aminosyresekvens, der er vist i fig. 3.

DK 175515 B1 9

Med de ovenfor beskrevne plasmider pSCll-Hl, pSCll-F41 og pSCll-P6 kan ekspressionen af de proteiner, der specificeres af dem, fortrinsvis udføres efter rekombination i tilsvarende vaccinia-ekspressionsvektorer.

5

Selv om det er foretrukket at fremstillet peptiderne eller polypeptiderne ifølge opfindelsen ved ekspression af én af nukleotidsekvenserne ifølge opfindelsen, især i en cellekultur som ovenfor beskrevet, er det også muligt at syntetisere peptiderne eller polypeptiderne ifølge opfindelsen kemisk.

10

Peptiderne eller polypeptiderne ifølge opfindelsen er fortrinsvis indeholdt i et præparat, som kan anvendes inden for det medicinske område.

DNA- og RNA-sekvenserne ifølge opfindelsen kan også fortrinsvis anvendes til 15 fremstilling af en levende vaccine; det foretrækkes især, at DNA-sekvenserne kombineres med DNA fra vacciniavirus, som er godt etableret som levende vaccine.

Det foretrækkes især, at vaccinen indeholder en vaccinia-ekspressionsvektor som ovenfor defineret. På den anden side kan der fremstilles en vaccine, som indeholder et præparat, der omfatter ét eller flere af de peptider eller polypeptider, 20 som indkodes af DNA- eller RNA-sekvenserne ifølge opfindelsen.

En yderligere foretrukken anvendelse af vacciner, der indeholder antigene peptider eller polypeptider, er til fremstilling af specifikke immunoglobuliner på en måde, som er kendt for fagfolk.

25

Præparatet indeholdende ét eller flere af peptiderne eller polypeptiderne ifølge opfindelsen kan også anvendes som diagnostisk middel.

DNA- eller RNA-sekvenserne ifølge opfindelsen er også egnede som prober til iden-30 tificeringsformål.

Opfindelsen forklares nærmere ved følgende detaljerede beskrivelse.

En foretrukken udførelsesform for opfindelsen er vist på tegningen, hvor 35 I DK 175515 B1 10 H fig. 1 viser DNA-sekvensen af det klonede genom af den vestlige undertype af FSME-virus, omfattende strukturområdet og det 5'-ikke-translaterede område. De aminoterminale startpunkter for proteinerne C, prM (M) og E samt grænserne for klonerne A5 og Pl-1 er vist med pile.

I .

Fig. 2 viser RNA-sekvensen af genomet af den vestlige undertype af FSME-virus, som koder for strukturproteiner. De aminoterminale startpunkter for proteinerne C, prM (M) og E er vist med pile.

10 Fig. 3 viser aminosyresekvensen af strukturproteinerne af den vestlige undertype af FSME-virus, således som den er afledt af den i fig. 1 viste DNA-sekvens. NH2- terminalerne af de forskellige proteiner er vist med pile.

Fig. 4 viser et fotografi af en agarosegelelektroforese af plasmider, som indeholder 15 insertioner, der er specifikke for den vestlige undertype af FSME-virus, efter skæ- I ring med restriktionsenzymet Smal (bane 2-6). Det øverste bånd repræsenterer I plasmid-DNA’et (4363 bp), det underste bånd specifikke insertions-DNA'er (i om- I rådet fra 2000 til 3500 bp). DNA-markøren i banerne 1 og 7 svarer til 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564 og 125 basepar (ovenfra og nedefter).

20 I Fig. 5 viser plasmidet A5, der er afledt af plasmidet pBR322, og hvor der er vist I restriktionsendonuklease-skæringssteder af udvalgte underfragmenter, idet de I tilsvarende områder, der koder for FSME-protein E, er vist. Pilen viser transkrip- tionsretningen for genomisk RNA.

I 25 I Fig· 6 viser insertionsplasmidet pSCll, i hvilket er indeholdt et enkelt Smal-inser- I tionssted, vacciniapromotoren, det prokaryote lacZ-gen og vaccinia-TK-rekombi- I nationssekvenser.

I 30 Fig. 7 viser tre konkrete eksempler på FSME-insertionsplasmider til in wVo-rekom- I bination i en vaccinia-ekspressionsvektor. Det unikke Smal-sted ved nukleotid I 6500 er vist i hvert plasmid.

I Den første base i de FSME-virusspecifikke sekvenser er i hvert af de viste plas- I 35 mider nukleotidet 6503.

DK 175515 B1 11

Fig. 8 viser karakteristika for de subklonede FSME-virusspecifikke sekvenser. I

Translationsiniteringskodonerne samt hydrofobe og hydrofile aminosyreområder, der er afledt fra en hydropatiplot, er vist. Disse områder blev identificeret ved 5 hjælp af et IBI-Pustell-computerprogram.

Hydrofobe sekvenser er angivet med □, de hydrofile sekvenser med .

Fig. 9 viser det fysiske kort over FSME-insertionsplasmider samt påvisning af de 10 plasmid-DNA-fragmenter, der indeholder FSME-specifikke sekvenser. I A) ses den med ethidiumbromid farvede agarosegel med DNA-fragmenterne, og i B) er vist resultatet af Southern Blot-hybridisering med en "FSME-Riboprobe".

A) Bane 1 λ DNA skåret med Hindlll som størrelsesmarkør 15 Bane 2 pSCll DNA skåret med Pvul

Bane 3 pSCll-P6 DNA skåret med Pvul Bane 4 pSCll-P6 DNA skåret med BamHI Bane 5 pSCll DNA skåret med BamHI Bane 6 pSCll-F41 DNA skåret med BamHI 20 Bane 7 pSCll-F41 DNA skåret med EcoRI

Bane 8 pSCl 1 DNA skåret med EcoRI

B) Efter hybridisering blev der påvist fragmenter indeholdende FSME-sekvenser ved 25 2,585 kb i bane 3 0,919 kb i bane 4 1,019 kb i bane 6 1,879 kb i bane 7 30

Disse fragmenter er forventet ud fra kloningen (se fig. 7). DNA i banerne 1, 2, 5 og 8 hybridiserer ikke, da det kun drejer sig om lambda DNA eller rent pSCll plas-mid-DNA.

I DK 175515 B1

I I

Fig. 10 viser en Slot Blot-hybridisering til påvisning af FSME-vacciniavirusrekom- I

binanter. Ikke-inficerede celler, celler, som var inficeret med virusrekombinanten I

H vSC8 (Dr. Moss), og celler, der var inficeret med 4 enkeltisolater fra virusrekombi- I

nanten P6, blev overført til nitrocellulosefilter og hybridiseret med 32P-mærket I

I 5 pSCll DNA (nick-repair) i A eller med en FSME-specifik "Riboprobe" i B. Der I

blev ikke fundet signaler med celler, der ikke var inficeret. Det rekombinante virus I

vSC8 hybridiserer med pSCll på grund af TK-sekvenserne. Den FSME-specifikke I

"Riboprobe" førte med vSC8 dog som forventet ikke til noget positivt signal. Celler, I

der var inficeret med enkeltisolater af virusrekombinanten P6 (1-4), udviser I

10 hybridisering både med "Riboproben" (på grund af FSME-sekvensen) og med I

H pSCll DNA (på grund af TK-sekvensen). I

Fig. 11 viser DNA-fragmentmønstre, der blev vundet efter skæring med Hindlll fra I

virion-DNA fra vildtypevirus og fra vacciniavirus-FSME-rekombinanter. Det fremgår, 15 at Hindlll J-fragmentet under rekombi-nationsprocessen forsvinder i skærings-

I mønstret fra DNA fra virus-rekombinanterne. Det oprindelige Hindlll J-fragment I

I med en størrelse på ca. 5 kb forekommer kun i bane 6 i agarosegelen. Alle andre DNA-præparationer indeholder ikke Hindlll J-fragmentet.

I 20 Bane 1 λ DNA skåret med BstEII som længdestandard I Bane 2 DNA fra FSME-rekombinanten F41 (insertionsplasmid pSCll-F41) I Bane 3 DNA fra FSME-rekombinanten P6 (insertionsplasmid pSCll-P6)

Bane 4 DNA fra virusrekombinanten PI (insertionsplasmid pSCll)

Bane 5 DNA fra virusrekombinanten vSC8 25 Bane 6 DNA fra virioner fra vildtypestammen WR.

I Fig. 12 viser en påvisning af FSME-specifikke sekvenser i Hindlll DNA-fragmenter I fra virusrekombinanter ved hybridisering med en 32P-maerket FSME "Riboprobe" · ” (A). Som kontrol blev samme filter hybridiseret endnu en gang med et 32P-(nick- | I 30 repair)-mærket pSCll plasmid-DNA (B).

I A) Den FSME-specifikke "Riboprobe" hybridiserer udelukkende med DNA

I fra virusrekombinanten F41 i banerne 1, 2 og 3 og med DNA fra rekom- I binanten P6 i bane 7. Der kan hverken fastslås hybridisering med rekom- DK 175515 B1 13 binanten PI i banerne 4, 5 og 6 eller med DNA fra rekombinanten vSC8 i bane 8 og DNA fra ikke-inficerede celler I bane 9.

B) Det radioaktivt mærkede pSCll DNA hybridiserer med alle DNA-præpa-5 rationer, der blev påvist med den FSME-specifikke "Riboprobe". Dette kan forklares ved, at pSCll DNA har de vaccinia-TK-sekvenser, der er nødvendige til rekombinationen. Dette pSCll plasmid-DNA hybridiserer imidlertid af denne grund også med DNA fra rekombinanten PI i banerne 4, 5 og 6 samt med DNA fra rekombinanten vSC8 i bane 8. DNA fra ikke-inficerede 10 celler hybridiserer ikke (bane 9).

Fig. 13 viser en Western Blot-analyse af FSME-specifikt protein i ekstrakter fra Vero-celler, som blev inficeret med virusrekombinanten P6. Proteinerne blev adskilt i en 15% polyacrylamidgel og præpareret til Western Blot ved standardmetoder.

15 Som kontrol blev proteinerne fra disse inficerede celler inkuberet med et negativt humanserum (bane 1 og 3). Med et positivt humanserum, som indeholder antistoffer mod FSME-virus, kunne der påvises det forventede FSME-specifikke antigen med en størrelse på ca. 38.000 D i banerne 2 og 4. Signalerne i banerne 1 og 3, som blev opnået med det negative serum, ser ud til at være uspecifikke.

20 DNA'et ifølge den foreliggende opfindelse fremstilles, og sekvensen bestemmes, ved følgende generelle fremgangsmåde: Først ekstraheres viralt RNA fra den vestlige undertype af FSME-virus eller fra 25 celler inficeret med den vestlige undertype af FSME-virus. Under anvendelse af dette RNA som matrix syntetiseres et dobbeltstrenget cDNA, fx under anvendelse af omvendt transkriptase. Ved rekombinant-DNA-teknikker indsættes dette cDNA i et vektor-DNA såsom Escherichia coli plasmid-DNA for at få et rekombinant plasmid. Der benyttes rekombinante plasmider til at transformere egnede værtsceller 30 såsom fx E. coli stamme HB101 til amplifikation af plasmiderne eller til ekspression af de tilsvarende proteiner. Enkelte kolonier med insertionsholdige plasmider identificeres ved plasmid-minipræparationsmetoden ifølge Birnboim og Doly (Nucleic Acids Research 7, 1195-1204, 1979). Basesekvensen af det DNA, der er specifikt for den vestlige undertype af viruset, og som findes i det rekombinante

I DK 175515 B1 I

I I

I plasmid, bestemmes ved en hurtig DNA-sekventeringsmetode såsom ved dideoxy- I

I kædeterminationsmetoden. I

I En detaljeret beskrivelse af fremgangsmåden til fremstilling af cDNA, rekombinante I

I 5 plasmider, celler, som er transformeret med disse plasmider, og bestemmelse af I

I nukleotidsekvensen er som følger: først kan viralt RNA fra den vestlige undertype I

I af FSME-virus fås ud fra oprenset virus. Til dette formål kan den vestlige undertype I

af FSME-virus dyrkes i primære hønsefosterceller, koncentreres ved ultracentrifu- I

gering og oprenses ved to cykler af saccharosedensitetsgradientacentrifugering. I

10 Efter solubilisering af proteinerne med SDS i nærværelse af proteinase K og I

I RNAse-inhibitor, fx ved inkubation i 1 time ved 37°C, ekstraheres RNA’et fx med I

phenol og udfældes med ethanol. Under anvendelse af dette RNA som matrix I syntetiseres det med virus-RNA’et komplementære DNA derefter in vitro ved hjælp af omvendt transkriptase (fx fra ’’Avian Myeloblastosis"-virus) ved fremgangsmå- 15 den ifølge Gubier og Hofmann (Gene 25, 263-269, 1983). Under anvendelse af primere såsom hexanukleotidprimere, der fås ud fra kalvethymus-DNA, inkuberes

I det virale RNA under egnede betingelser, fx som beskrevet i håndbogen "cDNA

Synthesis System" fra Amersham (England), med en omvendt transkriptase sam- I men med desoxyadenosintriphosphat (dATP), desoxythymidintriphosphat (dTTP), I 20 desoxyguanosintriphosphat (dGTP) og desoxycytidintriphosphat (dCTP) som sub-

I strater. Det således vundne cDNA.RNA-hybrid behandles derefter med RNAse H

under bestemte betingelser, under hvilke der produceres "nicks" i RNA’et fra hy-

I bridmolekylet. Derefter kan der anvendes E. coli DNA-polymerase I for at erstatte I

RNA-strengen effektivt, idet det nick-behandlede RNA tjener som primer. Det 25 således vundne dobbeltstrengede DNA (dsDNA) deproteiniseres ved phenol- I chloroform-ekstraktion og udfældes med ethanol, og tilbageblevne RNA-fragmenter I fjernes ved behandling med RNAse (fx i TE-puffer, 30 minutter ved 37°C).

Kloning af dsDNA'et udføres fx under anvendelse af syntetiske adaptorer. Til dette

I 30 formål behandles dsDNA’et med Klenow-fragmentet fra E. coli DNA-polymerase I

under hensigtsmæssige betingelser (Maniatis et al., Molecular Cloning, CSH 1982) I for at tilvejebringe et maksimalt antal stumpe ender, der kan klones, efterfulgt af I phenolekstraktioner til deproteiniseringen. Det stumpendede dsDNA phosphoryle- res ved 5’-enden med polynukleotidkinase ifølge standardmetoder (Maniatis et al., I 35 Molecular Cloning, 1982). Det phosphorylerede dsDNA inkuberes under hensigts- DK 175515 B1 15 mæssige betingelser med BamHI-Smal-adaptorer i nærværelse af DNA-ligase. Reaktionsblandingen anbringes på en 1% agarosegel og adskilles, og forskellige størelsesområder af med adaptorer forbundet cDNA skæres ud af gelen og oprenses, fx ved elektroeluering. Det således vundne DNA phosphoryleres på riy 5 med polynukleotidkinase som beskrevet ovenfor. På den anden side skæres det plasmid-DNA, der skal anvendes som vektor-DNA, fx E. coli plasmid pBR322-DNA, med restriktionsendonukleasen BamHI og dephosphoryleres under anvendelse af bakteriel alkalisk phosphatase. Det syntetiske dsDNA, der indeholder BamHI-adaptorer ved begge ender, og det BamHI-skårne vektor-DNA inkuberes under 10 hensigtsmæssige betingelser for at tillade hybridisering af komplementære sekvenser ved enderne af begge DNA-molekylerne og ligeres med T4-DNA-ligase.

Det rekombinante DNA-molekyle anvendes derefter til at transformere en kompetent E. co//-stamme (fx E. coli HB101) som beskrevet af Maniatis et al.

(Molecular Cloning, CSH, 1982). Det benyttede vektor-DNA indeholder to gener, 15 der meddeler resistens over for henholdsvis ampicillin og tetracydin. Ved den anvendte kloningsmetode ødelægges tetracydinresistensgenet. Til selektion af rekombinanter, der sandsynligvis indeholder virusspecifikke insertioner, dyrkes de transformerede bakterier i nærværelse af ampicillin og analyseres derpå for tetracyclinfølsomhed. Plasmider fra tetracyclinfølsomme kolonier isoleres ved 20 plasmidinipræparationsmetoden (Birnboim og Doly, Nucleic Acids Research 7, 1195-1204, 1979), og størrelsen af insertionerne analyseres ved restriktionsenzymanalyse under anvendelse af Smal og adskillelse af de vundne fragmenter på 1% agarosegeler. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 ___ _ - --—— -—^^

Disse insertioners basesekvens bestemmes ved dideoxykædeterminationsmetoden 2 ifølge Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467, 1977). Den vundne 3 sekvens undersøges for homologier med allerede kendte sekvenser af andre 4 flavivira (Rice et al., Science 229, 726-733, 1985; Dalgarno et al., J. Mol. Biol. 187, 5 309-323, 1986; Castle et al., Virology 147, 227-236, 1985; Castle et al., Virology 6 149, 10-26, 1986; Wengler et al., Virology 147, 264-274, 1985; Pletnev et al., 7 FEBS 3660 200, nr. 2, 317-321, 1986) ved hjælp af computerprogrammer for at 8 lokalisere den undersøgte sekvens i den samlede sekvens af det genomiske RNA.

9

Fig. 1 viser den fuldstændige nukleotidsekvens og fig. 3 den tilsvarende amino- 10 syresekvens af det strukturelle område af den vestlige undertype af FSME-virus- 11 genomet.

I DK 175515 B1 I

I 16 I

I De nøjagtige aminoterminaler af E og M bestemmes ved N-terminale aminosyre- I

I sekvensanalyser, fx under anvendelse af den manuelle fremgangsmåde, der er I

I beskrevet af Chang et al. (FEBS Letters 93, 205-214, 1978). Til dette formål iso- I

I 5 leres E-proteinet, fx ved præparativ SDS-PAGE, elektroelueres fra gelen og under- I

I kastes en N-terminal sekvensanalyse. Den resulterende sekvens er Ser-Arg-Cys, I

I og derfor ligger aminoterminalen for E i nøjagtig den samme position som andre I

I flaviviras, dvs. to aminosyrer før den første velbevarede cysteinrest (fig. 3). I

I 10 Der kan anvendes følgende metode for at bestemme M-proteinets aminoterminal. I

I Oprenset virus solubiliseres med et ikke-ionisk detergent (fx Triton X 100), og pro- I

I teincomplexer, der indeholder E og M, udvindes ved densitetsgradientcentrifu- I

I gering i en detergentfri saccharosegradient (Heinz og Kunz, J. Gen. Virol. 49, 125- I

I 132, 1980). Sekvensanalyse af disse proteincomplexer fører til følgende dobbelt- I

I 15 sekvens: I

I Ser-Arg-Cys- I

I Ser-Val-Leu- I

idet Ser-Arg-Cys svarer til sekvensen af E, og Ser-Val-Leu udgør den aminotermi- I

20 nåle ende af M-proteinet. Disse terminaler er angivet i de i fig. 1 og 3 viste sekven- I

I ser. I

I Den foreliggende opfindelse tilvejebringer således for første gang nukleotidsekven- I

sen af 5'-området af den vestlige undertype af FSME-virusgenomet, herunder de I

I 25 sekvenser, der koder for strukturproteiner, og som følge heraf tilvejebringer den I

desuden disse strukturproteiners aminosyresekvenser. I

I Basesekvensen vist i fig. 1 er et foretrukket eksempel på et DNA, der koder for po- I

I lypeptider med egenskaberne af strukturproteiner af den vestlige undertype af I

I 30 FSME-virus. Ifølge degenereringen af den genetiske kode kan den samme amino- I

I syresekvens også indkodes af andre basetripletter end dem, der er vist i figuren. I

I Den foreliggende opfindelse angår også sekvenser, der er ændret ved mutation, I

I transposition og degradation, men som ikke desto mindre koder for en amino- I

DK 175515 B1 17 syresekvens, der stadig udviser.de for strukturproteinerne væsentlige antigene karakteristika.

Desuden angår den foreliggende opfindelse ikke blot nøjagtig den samme 5 aminosyresekvens som den, der er vist i fig. 3, og som kun er et eksempel på en sekvens af et naturligt isolat af den vestlige undertype af FSME-virus. Det er et velkendt faktum, at genomerne af RNA-vira er underkastet højere mutationsfrekvenser end de, der er fundet for DNA-vira eller cellulære gener, som følge af den større fejlhyppighed hos RNA-polymeraser og manglen på en korrektionsmeka-10 nisme (Holland et al., Science 215, 1577-1585, 1982; Reanney, Ann. Rev.

Microbiol. 36, 47-73, 1982). Afhængigt af virusets karakteristika kan disse mutationer føre til en hurtig udvikling af en ny virustype som følge af antigendrift, således som det er tilfældet med influenzavirus (Both et al. i: "The Origin of Pandemic Influenza viruses", W.G. Laver (red.), Elsevier, 1983). Pa den anden side kan 15 RNA-vira være mere stabile med hensyn til deres antigenstruktur under naturlige økologiske betingelser, formodentlig som følge af funktionelle tvangsmekanismer, der ikke tillader nogle vidtgående strukturelle ændringer i antigenaktive proteiner.

Ikke desto mindre skal der tages hensyn til en vis grad af variation, og dette kan påvises ved sekvenssammenligninger mellem forskellige naturlige isolater.

20

Dette kan fx udføres ved sekventering af RNA fra forskellige isolater under anvendelse af dideoxykædeterminationsmetoden med syntetiske oligonukleotider som primere, som er fremstillet ifølge den i fig. 1 viste sekvens af prototype-isolatet. 1

Analyse af sådanne forskellige isolaters nukleotidsekvenser, som svarer til E-proteinet, har vist forskelligartede nukleotider. Følgende nukleotidudskiftninger blev fundet i RNA fra et naturligt isolat (ZZ-9) i sammenligning med Neudorfi:

I DK 175515 B1 I

I 18 I

I Position af FSME ZZ-9 Aminosyre- I

I nukleotidet udskiftning I

I 2375. A U Thr -- Ser I

I 23A7 U C I

I 2323 AG I

I 2317 AG I

I 2281 C U I

I 2266 U C I

I 2263 AG I

I 2021 C U — I

I 1876 C U I

I 1868 A G Met -- Val

I 1773 C U Ala — Val I

I 1668 A G Glu — Gly I

I 1663 C U I

I 1661 A G Asn -- Asp I

I 1660 C U I

I 1 A72 U C I

I 1451 A G Ile — Val I

I 1 3A8 C U I

I 1 11A u C I

I 1111 u c I

I 1090 C U I

I 1 0 A 8 u c I

I 99A U C I

DK 175515 B1 19

De iagttagne udskiftninger er et udtryk for den naturlige variationsgrad af FSME-viruset, der ikke fører til en ny serotype. Sekvenshomologier mellem E-proteiner-ne af flavivira, der ikke tilhører samme serocomplex, ligger i området 40-50%, fx 44,4% homologi mellem YF- og MVE-virus, og i området 70-80% blandt medlem-5 mer af samme flavivirus-serocomplex, fx 77,1% homologi mellem WN- og MVE-virus.

En sammenligning mellem de publicerede nukleotidsekvenser af den fjernøstlige undertype (Pletnev et al., FEBS 3660 200, nr. 2, 317-321, 1986) og den vestlige 10 undertype udviste en homologi på omtrent 85%.

Alle sekvenser, der udviser små variationer i forhold til prototype-sekvenserne, således som de optræder i andre naturlige isolater af den vestlige undertype af FSME-virus, er omfattet af den foreliggende opfindelse. Sådanne variationer kan 15 desuden opnås ved in v/'tro-modifikation af nukleinsyrerne. Opfindelsen omfatter derfor alle sekvenser, der hybridiserer under stringente betingelser, fx ved mindst 90% nukleotidsekvenshomologi med de tilvejebragte sekvenser eller dele af sekvenser, der fortrinsvis koder for proteiner eller peptider med de væsentlige karakteristika for antigendeterminanter for strukturproteiner af den vestlige underty-20 pe af FSME-virus.

Det er kendt for fagfolk at indsætte det tilvejebragte DNA eller dele deraf i egnede vektorer og at anvende de rekombinante vektorer til transformation af egnede celler, enten til amplifikation af DNA’et eller for at opnå ekspression af de tilsvarende 25 proteiner. Egnede værter, vektorer og betingelser for disse operationer er velkendte for fagfolk. Der findes mange publikationer, der beskriver syntesen af fremmede proteiner ved hjælp af rekombinant DNA-teknologi (en oversigt gives fx i "Maximizing Gene Expression" (Reznikoff og Gold, red.), Butterworths, 1986;

Harris, Gen. Eng. 4, 127-183 (Williamson, red.), Academic Press, 1983; Wetzel og 30 Goeddel, The Peptides 5, 1-64, 1983). Ved disse fremgangsmåder kan der udtrykkes proteiner, der er indkodet af klonet DNA, enten i bakterier, i gær eller i pattedyrceller. Det er endvidere almindeligt kendt at anvende sådanne udtrykte proteiner som vacciner til immuniseringsformål (Valenzuela et al., Nature 298, 347-350, 1982; McAleer et al., Nature 307, 178-180, 1984) eller som diagnostiske 35 antigener.

I DK 175515 B1 I

I 20 I

I Fremmede DNA- eller RNA-sekvenser kan også indføres i genomerne af levende I

I vira, hvorved der dannes rekombinante vira, som kan anvendes som levende I

I vaccine (oversigtsartikel af Mackett og Smith, J. Gen. Virol. 67, 2067-2082, 1986). I

I I

I Ligeledes kan en kombination af forskellige gener, der fx er afledt fra forskellige I

I vira, samtidig udtrykkes ved rekombinant DNA-teknologi og anvendes til vaccina- I

tion (Perkus et al., Science 229, 981-984, 1985). Opfindelsen omfatter således alle I

kombinationer af sekvenser af de tilvejebragte sekvenser med andre sekven-ser I

I 10 såsom fx gener, der koder for andre proteiner, eller sekvenser, der bidrager til I

I ekspression af proteinerne, såsom fx promotorer, enhancere, polyadenylerings- I

I eller splejsningssignaler. I

I Det er kendt for fagfolk, at man ikke nødvendigvis skal anvende hele de naturligt I

I 15 forekommende proteiner til immuniseringen eller diagnostiske formål (Lerner, I

I Nature 299, 592-596, 1982; Arnon, TIBS 11, 521-524, 1986). I tilfælde af den I

I vestlige undertype af FSME-virus E-proteinet er det fx påvist, at der ved immuni- I

I sering med et proteolytisk fragment på 9000 dalton kan induceres hæmagglutina- I

I tionshæmmende og neutraliserende antistoffer, hvilket fragment også reagerer I

I 20 med polyklonale immunsera, der er vundet ved immunisering med hele det natur- I

I lige protein (Heinz et al., J. Gen. Virol. 65, 1921-1929, 1984). Andre proteolytiske I

I fragmenter kan også være egnede til immunisering eller diagnostiske formål. I

I Proteiner eller dele af proteiner, der anvendes som vacciner eller diagnostiske I

25 midler, kan ikke kun fremstilles ved rekombinant-DNA-teknologier som beskrevet I

I ovenfor, men den ved den foreliggende opfindelse tilvejebragte sekvensinformation I

I kan også danne grundlag for den kemiske syntese af oligopeptider. Inden for dette I

I område findes der megen litteratur: syntetiserede peptider er blevet fremstillet I

I svarende til DNA-sekvenser, der koder for mange forskellige proteiner, og disse er I

I 30 blevet anvendt til en række formål såsom fx molekylærbiologiske og immunolo- I

I iske undersøgelser (Lerner et al., Cell 23, 309-310, 1981; Lerner, Nature 299, 592- I

i I

I 596, 1982) eller vaccinationer (Shinnick et al., Ann. Rev. Microbiol. 37, 425-446, I

I 1983; DiMarchi et al., Science 232, 639-641, 1986). Fremstilling og anvendelse af I

I peptider eller kombinationer af peptider, der svarer til de ved den foreliggende I

I 35 opfindelse tilvejebragte sekvenser, udgør derfor en del af den kendte teknik. I

DK 175515 B1 21

Det er desuden kendt for fagfolk at anvende de nukleinsyrer og sekvenser, der er tilvejebragt ved den foreliggende opfindelse, til fremstilling af hybridiseringsprober, fx til bestemmelse af virus-RNA i skovflåter eller legemsvæsker (Meinkoth og Wahl, S Anal. Biochem. 138, 267-284, 1984; Kulski og Norval, Arch. Virol. 83, 3-15, 1985).

Disse kan enten fremstilles ved rekombinant-DNA-teknologier eller ved kemisk syntese af oligonukleotider, som svarer til de tilvejebragte sekvenser.

Opfindelsen belyses ved nedenstående eksempler.

10 EKSEMPEL 1

Propagering og oprensning af FSME-virus .15

En 10% suspension af musehjerner inficeret med den vestlige undertype af FSME-virus blev anvendt til infektion af primære hønsefostercelle-enkeltlagskulturer, der blev holdt i med 15 mM HEPES og 15 mM EPPS ved pH 7,6 pufret minimalmedium (MEM). Efter 40 timers inkubation ved 37°C blev remanensen klaret i 30 minutter 20 ved 4°C og 10.000 x g, og viruset blev pelleteret ved 3 timers ultracentrifugering ved 4°C og 50.000 x g. Viruset blev derpå resuspenderet i et hensigtsmæssigt volumen TAN-puffer (0,05 M triethanolamin, 0,1 M NaCI, pH 8,0) og i 110 minutter underkastet en zonal-(rate-zonal) centrifugering i en 5-20% (w/w) saccharose-densitetsgradient ved 170.000 x g ved 4°C. Virus-toppen blev lokaliseret ved scan-25 ning af gradienten ved 254 nm og blev underkastet en ligevægts-densitetsgra-dientcentrifugering i en 20-50% (w/w) saccharosegradient i 18 timer ved 4°C og 150.000 x g. Virustoppen blev dialyseret mod TAN-puffer, pH 8,0, for at fjerne overskydende saccharose.

30 EKSEMPEL 2

Fremstilling af viralt RNA

100 ug oprenset virus blev fortyndet i 400 μΙ af en proteinase K-reaktionspuffer 35 (10 M Tris, pH 7,8, 5 mM EDTA, 0,5% w/v SDS). Proteinase K blev tilsat til en I DK 175515 B1

I 22 I

I slutkonceritration på 200 fig/ml, og blandingen blev inkuberet i 1 time ved 37°C. I

Derefter blev opløsningen deproteiniseret ved to ganges ekstraktion med samme I

volumen (400 μΙ) phenol og én gangs ekstraktion med chloroform/isoamylalkohol I

(24:1). Derefter blev der tilsat 26 μΙ af en 3 M natriumacetatopløsning, og RNA'et I

5 blev udfældet med 2,5 volumen ethanol. Før den videre anvendelse blev en alikvot I

af RNA’et denatureret med glyoxal og adskilt på en 1% agarosegel for at kontrol- I

lere udbyttet og kvaliteten af præparationen. I

I EKSEMPEL 3 I 10

Syntese af dobbeltstrenget cDNA

5 μg ethanoludfældet RNA blev resuspenderet i 40 μg af en enkeltstrenget syntese- puffer (Amersham, GB), som indeholdt 5 pg af en "Random',-oligonukleotidprimer, 15 opvarmet i 1 minut til 70°C og derpå langsomt afkølet til stuetemperatur. Alle Fire H desoxynukleotid-triphosphater blev tilsat til en slutkoncentration på 1 mM.

I Desuden blev 5 enheder human placenta-ribonukleaseinhibitor og 10 μΟ α-32Ρ dCTP sat til blandingen. Enkeltstrengsyntesen blev igangsat ved tilsætning af 100 enheder omvendt transkriptase (Amersham) og udført i 2 timer ved 42°C.

I 20 Derefter blev reaktionsblandingen anbragt på is, og reagenserne til dobbeltstreng- I syntesen blev tilsat i følgende rækkefølge: 93,5 μΙ af en dobbeltstrengsyntesepuffer I (Amersham, GB), 4 enheder ribonukleasé H, 23 enheder E. coli DNA-polymerase og vand til et slutvolumen på 250 μΙ. Dobbeltstrengsyntesen blev udført ved I successive inkubationer ved 12°C og 22°C (hver gang 2 timer) og standset ved

I 25 20 minutters opvarmning af opløsningen ved 70°C. Det dobbeltstrengede cDNA

I blev inkuberet med 10 enheder T4-DNA-polymerase i 30 minutter ved 37°C for at få stumpe ender. Endelig blev cDNA’et oprenset ved phenol- og chloroformekstrak- tioner og udfældet med 2 volumen ethanol.

I 30 EKSEMPEL 4 I Adaptorligation

I cDNA’et blev behandlet med polynukleotidkinase i nærværelse af 2 mM ATP

I 35 (Maniatis et al., Molecular Cloning, CSH 1982) for at sikre, at alle 5’-ender var DK 175515 B1 23 phosphoryleret og således kunne ligeres. BamHI-Smal-adaptorer blev leveret af Pharmacia. Disse adaptorer havde en S'-udragende, med BamHI kompatibel udragende (sticky) ende og en stump ende, og de indeholdt det fuldstændige Smalgenkendelsessted inden for deres sekvens. Først havde kun den stumpe ende en 5 5’-phosphatgruppe og kunne ligeres, mens den udragende ende var dephospho-ryleret. 5 ug af disse adaptorer blev blandet med cDNA'et i 20 μΙ af ligationspufferen (50 mM Tris, pH 7,5, 5 mM MgC^, 5 mM DTT, 1 mM ATP). Reaktionen blev katalyseret med T4-DNA-ligase (New England Biolabs) i en overnatsreaktion ved 14°C.

10 EKSEMPEL 5

Størrelsesadskillelse af cDNA'et 15 cDNA'et blev adskilt pi en 1% lavtsmeltende agarosegel. Forskellige størrelsesklasser blev skåret ud af gelen, og DNA'et blev ved standardmetoder ekstraheret fra agarosen med varm phenol. På trods af den ringe mængde tilgængeligt DNA, som knap kunne detekteres ved farvning med ethidiumbromid, kunne ekstraktionsforløbet let følges ved hjælp af den i cDNA'et inkorporerede radioaktive mærkning.

20 Størrelsesadskillelsestrinnet muliggjorde selektiv kloning af store cDNA-fragmenter og tjente desuden til at adskille cDNA'et fuldstændigt fra ikke-ligerede adaptormo-lekyler.

EKSEMPEL 6 25

Kloning i et bakterielt plasmid

De BamHI-kompatible ender af cDNA'et fra forskellige størrelsesklasser blev phosphoryleret med polynukleotidkinase, og deproteinisering blev udført ved 30 phenol- og chloroformekstraktioner. Derpå blev DNA'et udfældet med 2 volumen ethanol og resuspenderet i et lille volumen vand. 20-30 ng af cDNA'et blev blandet med 100 ng af Escherichia co//-plasmidet pBR322, som var blevet lineariseret og dephosphoryleret ved BamHI-skæring, for at forhindre selvligation. Disse to komponenter blev ligeret med T4-DNA-ligase i 5 μΙ af ligationspufferen (se ovenfor) i en 35 overnatsreaktion ved 16°C. Næste dag blev ligationsblandingen fortyndet fem

I DK 175515 B1 I

I 24 I

I gange med vand og derefter anvendt direkte til at transformere E. coli HB101- I

I celler. Kompetente bakterier blev leveret af BRL (Maryland, USA) og transformeret I

I med 5 μΙ af den fortyndede ligationsblanding som anbefalet af fabrikanten. Efter I

I udpladning på ampicillinholdige agarplader blev der typisk vundet flere hundrede I

I 5 transformerede celler. I

I EKSEMPEL 7 . I

I Identificering af insertionsholdige plasmider I

I 10 I

I Enkelte ampicillinresistente kolonier blev udstrøget på tetracyclinholdige agarpla- I

I der. For omtrent 5% af de testede kolonier blev der fastslået følsomhed over for I

I tetracyclin. Disse blev anvendt til inokulation af 2 ml ampicillinholdige LB-medier I

og inkuberet natten over ved 37°C i et rysteapparat ved 220 omdr./minut. Den I

I 15 næste dag blev der udført en plasmid-hurtigpræparation ifølge en standardmetode I

I (Birnboim og Doly, Nucleic Acids Research 7, 1195-1204, 1979). Plasmiderne blev I

I skåret med restriktionsenzymet Smal og analyseret på 1% agarosegeler (fig. 4).

I På denne måde blev der identificeret 21 plasmider, der indeholdt insertioner i I størrelsesområdet 2000-3500 bp.

I 20 j EKSEMPEL 8 I Foreløbig karakterisering af insertionerne I 25 Insertionsholdige plasmider blev fremstillet i stor målestok ved en standardmetode (Maniatis et al., Molecular Cloning, CSH, 1982) og oprenset ved ethidiumbromid- I densitetsgradientcentrifugering. Ca. 500 ng af plasmid-DNA'erne blev skåret med en række restriktionsenzymer og analyseret på 1% agarosegeler. Således opnåe- I des karakteristiske båndmønstre for hvert plasmid, hvilket muliggjorde en første I 30 forudsigelse af, hvilke insertioner der kunne indeholde overlappende eller for- I skellige sekvensområder.

I 35 25 DK 175515 B1 EKSEMPEL 9

Sekvensanalyse af insertionerne i klonen A5 5 Et af de insertionsholdige plasmider med betegnelsen plasmid A5 blev skåret med Smal og adskilt på en 0,7% agarosegel. Det bånd, der repræsenterer hele inserti-onen, blev skåret ud af gelen, og DNA’et blev oprenset ud fra agarosen ved elek-troeluering. Det isolerede fragment blev skåret ved forskellige reaktioner med hyppigt skærende restriktionsenzymer, der danner stumpe ender, såsom fx Rsal, Alul 10 og Haelll. Den dobbeltstrengede form af bakteriofagen M13mp8 blev skåret med Smal og dephosphoryleret. Blandingerne af DNA-fragmenter blev deproteiniseret, udfældet og ligeret med M13-vektoren som beskrevet ovenfor. Transformation af E. coli JM105-celler, identificering af rekombinante fager ved farveselekti-onsmetoden og fremstilling af enkeltstrenget DNA blev udført ved standardmeto-15 der. Der blev udvalgt enkelte kloner, der blev sekventeret ved dideoxysekvente-ringsmetoden beskrevet af Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467, 1977). Som primer benyttedes almindeligvis den kommercielt tilgængelige M13-universalprimer. Således blev sekvensen af et stort antal forskellige fragmenter af klonen A5 bestemt, hvilket sluttelig førte til den samlede DNA-sekvens af 20 denne klon. Ved sammenligning af denne sekvens med publicerede genomsekven-ser af forskellige flavivira blev det fastslået, at A5 indeholder det område af det virale genom, der koder for strukturproteinerne C, M og E med undtagelse af den aminoterminale halvdel af C-proteinet. Den nøjagtige lokalisering af A5 er vist i fig. 1.

25 EKSEMPEL 10 cDNA-syntese under anvendelse af en FSME-virusspecifik primer 30 Der blev anvendt en FSME-virusspecifik primer for at konstruere en cDNA-klon, der indeholdt hele 5'-området af det virale genom, herunder den samlede sekvensinformation om C-proteinet, samt det meste af det ikke-translaterede 5’-lederområ-de. Denne oligonukleotidprimer bestod af 14 nukleotider, der er komplementære med et område i FSME-genomet, som koder for de C-terminale aminosyrer i E-35 proteinet. Fremstilling af viralt RNA og syntese af dobbeltstrenget cDNA blev ud-

I DK 175515 B1 I

I 26 I

ført i det væsentlige som beskrevet ovenfor med den undtagelse, at der denne I

gang kun anvendtes 1 ug RNA og 0,5 ug af den syntetiske oligonukleotidprimer PI. I

Til slut blev inkubationstiderne for dobbeltstrengsyntesen og T4-DNA- I

H polymerasebehandlingen reduceret ti! henholdsvis 1 time og 3 minutter. I

I 5 I EKSEMPEL 11

Kloning i bluescript-vektoren under anvendelse af EcoRI-linkere 10 Ved at gå ud fra de på dette tidspunkt i forskningen forhåndenværende informati- oner kunne det antages, at hele det strukturelle område ikke indeholdt nogen

EcoRI-genkendelsessteder. Derfor kunne der anvendes syntetiske EcoRI-linkere (New England Biolabs) til kloningsprocessen. Ca. 1 pg cDNA blev ligeret med 1 pg ] linker-DNA i 6 timer ved 14°C under anvendelse af T4-DNA-ligase og et puffer - 15 system som beskrevet ovenfor. Efter oprensning af blandingen ved phenol- og chloroform-ekstraktioner og ethanoludfældning blev DNA'et resuspenderet i 40 pi af en "mediumsalt" restriktionsenzympuffer (CSH-håndbog) og skåret i 3 timer med en overskydende mængde EcoRI (80 enheder) ved 37°C. Derpå blev blanding- en adskilt på en 1% agarosegel, og cDNA i størrelsesområdet 1500-2500 bp blev I 20 udvundet fra gelen ved elektroeluering.

I Samtidig blev den nye alsidige vektor Bluescript KS M13+ (Stratagene) skåret med I EcoRI. 100 ng af dette lineariserede plasmid blev blandet med hele cDNA-præpara- tionen, og DNA’erne blev copræcipiteret med ethanol. Plasmid-cDNA-ligationen I 25 blev udført som beskrevet ovenfor. Ligationsblandinger blev trinvis fortyndet fra to I til hundrede gange og anvendt til transformation af E. coli XL-1 blue. Transforma- I tion og identificering af insertionsholdige plasmider ved farveselektion blev udført I præcis ifølge fabrikantens instruktioner (Stratagene). Således vandtes 4 plasmider, som indeholdt insertioner med en længde på ca. 2500 bp.

I 30 I 35 27 DK 175515 B1 EKSEMPEL 12

Sekvensbestemmelse af klonen Pl-1 5 Et af de insertionsholdige plasmider med betegnelsen Pl-1 blev anvendt til fremstilling af enkeltstrenget matrix-DNA. Dette blev udført ved tilføjelse af hjælper-fagen R408 til en eksponentielt voksende bakteriekultur indeholdende plasmidet Pl-1 i en M.O.I. på 20:1. Efter 8 timers inkubation ved 37°C i et rysteapparat ved 240 omdr./-minut blev den supernatant, der indeholdt fagpartikler, isoleret, og 10 enkeltstrenget Pl-l-DNA blev fremstillet ved standardmetoder. Idet det afviger fra det klassiske M13-system, tillader Bluescript-systemet fremstilling af enkeltstrenget matrix-DNA, der indeholder hele cDNA-sekvensen, og gør således den tidrøvende subkloningsproces overflødig. Sekvensbestemmelse af Pl-1 blev foretaget ved standarddideoxymetoden under anvendelse af både universal-M13-15 og syntetisk oligonukleotidprimer, som svarer til forskellige virale sekvenser, som primer. Det viste sig, at Pl-1 omfatter hele den region, der koder for strukturproteiner, og strækker sig 120 bp ud over C-proteinets startkodon. Den eksakte lokalisering af Pl-1 er også vist i fig. 1.

20 EKSEMPEL 13

Sekvensbestemmelse af forskellige naturlige isolater ved direkte sekventering af RNA’et 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

De for strukturproteinerne kodende sekvenser af forskellige naturlige isolater af 2 den vestlige undertype af FSME-virus blev udført ved direkte sekventering af 3 genomiske RNA'er med en modifikation af Sangers dideoxymetode, der i det 4 væsentlige er beskrevet af Zimmern og Kaesberg (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5 4257-4261, 1978). Forskellige syntetiske oligonukleotider, der svarer til forskellige 6 steder i genomet, blev anvendt som primer. Ca. 1 ug genomisk RNA og 0,5 ug af 7 den respektive primer blev blandet i et volumen på 10 μΙ, opvarmet i 3 minutter 8 ved 65°C og derpå langsomt afkølet til 42°C. Sekventeringsreaktionen blev kata 9 lyseret med omvendt transkriptase (Amersham) i 15 minutter ved 42°C. Som 10 kontrol blev FSME-virusprototypen Neudorfl samtidig sekventeret og analyseret på 11 den samme polyacrylamidgel. Dette muliggjorde en enkel og utvetydig identifice-

DK 175515 B1 I

ring af sekvensvariationer i forskellige naturlige isolater. Sekvensafvigelser blev I

fundet i positioner, som er beskrevet i beskrivelsens generelle del. I

EKSEMPEL 14 I

Aminoterminal sekvensanalyse af virale proteiner I

1 mg oprenset vestlig undertype af FSME-virus blev underkastet SDS-PAGE ifølge I

Laemmli og Favre (J. Mol. Biol. 80, 575-599, 1973) på 10% acrylamidgeler. E- I

10 proteinet blev lokaliseret, ved at man farvede et filterpapirblot af gelen med ami- I

dosort, og proteinet blev skåret ud af gelen og elektroelueret under anvendelse af H

et ISCO-eluerings-apparatur i 5 timer ved 3 W. Den N-terminale sekvensanalyse I

blev udført ved den af Chang et al. beskrevne fremgangsmåde (FEBS Letters

93, 205-214, 1978). Den opnåede sekvens var Ser-Arg-Cys og muliggjorde således H

15 fastslåelse af den nøjagtige position af E-proteinet i den i fig. 3 viste sekvens. I

Alternativt blev der fremstillet proteincomplexer, der både indeholdt E og M, ved I

solubilisering af oprensede FSME-vira af den vestlige undertype med Triton X 100, I

efterfulgt af densitetsgradientcentrifugering i detergentfrie densitetsgradienter som I

20 beskrevet af Heinz og Kunz (3. Gen. Virol. 49, 125-132, 1980). Som forventet gav I

den aminoterminale sekvensanalyse en dobbelt sekvens, nemlig H

Ser-Arg-Cys I

Ser-Val-Leu. I

25 I

Da det allerede var kendt, at Ser-Arg-Cys stammede fra E-proteinet, blev sekven- I

sen Ser-Val-Leu således identificeret som M’s aminoterminal (fig. 3). I

30 I 1 EKSEMPEL 15 29 DK 175515 B1

Fremstilling af insertionsplasmider, der indeholder fremmede gener ved homolog rekombination i vaccinia Hindlll J-fragmentet ved kloning 5 af 5'-endesekvenser af det klonede cDNA fra FSME-virus I fig. 5 er vist et plasmid A5, der blev fremstillet på kendt vis som et pBR322-afledt plasmid. Som vist i fig. 5 indeholder plasmidet A5 den DNA-sekvens, der koder for E-proteinet fra FSME-virus. I fig. 5 er endvidere vist restriktionsendonukleaseskæ-10 ringssteder af udvalgte underfragmenter, idet de for FSME's E-protein kodende områder er angivet. Pilen viser transkriptionsretningen i det genomiske RNA.

Yderligere virus- og plasmidmateriale samt de metoder, der blev anvendt til fremstilling af plasmider, som indeholder konkrete DNA-delafsnit, der koder for E-15 proteinet, er beskrevet i det følgende: 15.1. Virus- og cellekultur

En vacciniavirus-vildtypestamme WR er tilgængelig i deponeringsinstitutionen ATCC 20 med nummeret VR-119. Humane TK‘143-celler, der ikke producerer thymidinki-nase, er almindeligt tilgængelige og er deponeret i Institut Pasteur (deponeringsnummer 1-732). Vacciniavirus propageres i Veroceller ca. mellem passagerne 47 og 55. Cellerne dyrkes i MEM (minimalt essentielt medium) med 5% FCS (føtalt kalveserum), antibiotika og glutamin. Den virusstamme, der skal benyttes til re-25 kombinationen, ledes én gang gennem HAT-medium (hypoxanthin, aminopterin, thymidin) indeholdende 5% FCS for at selektere en TK+-vildtypevirus. Rekombinant TK -virus bestemmes på humane TK'143-celler, der er dyrket i MEM med 5% FCS indeholdende 25 pg/ml BUdR. Rekombinanterne kan findes ved, at celleenkeltlaget overlejres med lavtsmeltende agarose indeholdende MEM, 5% FCS, 25 μς/ιηΙ BUdR 30 samt 250 ng/ml X-gal. Cellekulturen holdes i 48-72 timer i en inkubator ved 37°C. Mængden af spontane TK'-virusmutanter bestemmes ved infektion af TK"-celle-enkeltlag i nærværelse eller fraværelse af 25 Mg/ml BUdR. Sædvanligvis kan der iagttages én mutant blandt 104 vira (Mackett et al. i "DNA cloning Vol. II, a practical approach", IRL Press, D.M. Glover (red.), 1985).

35

I DK 175515 B1 I

I 30 I

I 15.2. Plasmider og kloningsmetoder I

I Plasmidet A5, der er vist i fig. 5, og som er et pBR322-afledt plasmid, har det viste I

I restriktionsendonukleasekort. I

I . I

I I fig. 6 er vist plasmidet pSCll, som indeholder E. coli lacZ-genet for "blå farve"- I

I bestemmelse, de TK-flankerende sekvenser og en vacciniapromotor. Plasmidet I

I pSCll er kendt og almindeligt tilgængeligt og kan især fås fra National Institute of I

I Health. I

I 10 I

I Alle de restriktionsendonukleaser, der blev anvendt til modifikationen af DNA'et, I

I blev benyttet i henhold til fabrikantens brugsanvisninger. Southern Blot-analyse og I

I isolering af plasmid-DNA blev udført ved standardmetoder (Maniatis et al., I

I Molecular Cloning, CSH 1982). I

I 15 I

I Radioaktivt mærkede prober blev enten vundet ved ”nick-repair"-metoder eller ved I

I pSP6-"Riboprobe"-metoden (Green et al., Cell 32, 681-694, 1983). I

I "Riboproben”, der blev anvendt ved den foreliggende opfindelse, blev fremstillet I

I 20 ved ligation af en intern FSME-nukleotidsekvens på ca. 1,0 kb i plasmidet pSP64. I

I Før RNA-syntesen blev påbegyndt, blev plasmidet lineariseret med EcoRI. Et typisk I

I assay bestod af: I

I Tris-HCl pH 7,5 40 mM I

I MgCl2 6 rnM I

I 25 Spermidin 2 mM I

I NaCl 20 mM I

I DTT 10 mM I

I ATP, CTP, GTP hver 0,5 mM I

I Human placenta RNAse-inhibitor 20 U I

I 30 pSP64-P5 X EcoRI 2 Mg I

I o32P UTP (400 Ci/mmol) 100 /iCi I

I SP6 RNA-polymerase 4 U I

I op til et totalvoluraen på 20 μΐ I

I 35 Inkubation: 1 time ved 40°C. I

DK 175515 B1 31

De nukleotider, der ikke blev indbygget, blev adskilt fra det radioaktivt mærkede cRNA ved søjlechromatografi.

5 15.3. In vivo rekombinationsassay

Infektion og transfektion:

Rekombinationer blev udført i det væsentlige som beskrevet af Mackett 10 et al. (se 15.1). Ud over humane TK'-celler kunne der også anvendes Vero-celler eller hønsefosterfibroblastceller som værtsceller. Ca. 1-3 timer før transfektionen blev cellerne inficeret med en multiplicitet af infektionen (m.o.i.) af 0,01-0,05 pfu/celle med en vildtype-WR-stamme. HEPES-pufret saltopløsning til DNA-transfektionen blev fremstillet på følgende måde: 10 x HBS indeholdende 8,18% 15 NaCI (w/v), 5,94% HEPES (w/v) samt 0,2% Na'/zZHPOV^ (w/v) blev fortyndet i 2 x HBS før brug. pH-værdien blev indstillet til nøjagtig 7,05 med IN NaOH. Pufferen blev fortyndet med 1 x HBS og steriliseret ved filtrering. Til 1 ml af dette 1 x HBS sattes en opløsning af 1-5 ug plasmid-DNA og 10-20 pg bærer-DNA (enten vacciniavirus-vildtype eller laksesperm-DNA). Især tilsætningen af bærer-DNA'et 20 syntes at være væsentlig. Den besWevne blanding blev blandet grundigt i 1 minut på en vortexblander. Derefter blev der langsomt tilsat 2 M CaC^-opløsning til en slutkoncentration på 0,125 M. Et DNA-præcipitat blev synligt efter 20-30 minutter ved 25°C. Mediet blev fjernet fra de inficerede celler, enkeltlaget blev vasket én gang med celledyrkningsmediet, og efter fjernelse af al den resterende væske blev 25 DNA-præcipitatet langsomt tilsat. 30 minutter senere blev der ved 25°C tilsat frisk medium, og cellerne blev inkuberet ved 37°C. Efter 3-4 timer blev mediet på ny fjernet og udskiftet med frisk celledyrkningsmedium. Cellerne blev sædvanligvis høstet efter 24 eller 48 timer ved afskrabning og sedimenteret ved lav hastighed, og cellepelleten blev opsamlet i et samlet volumen på 500 μΙ medium.

30

Plaque-assay og oprensning af rekombinante vira:

Virussuspensionen blev frosset tre gange og pi ny tøet op; 60 μΙ af suspensionen blev inkuberet med 1/5 volumen 1,25% trypsin i 30 minutter ved 35 37°C. En serie på tre fortyndinger (1:10) blev sat til et konfluent enkeltlag af TK'

I DK 175515 B1 I

I 32 I

I 143-celler, der var dyrket i 10 cm2 plader. Efter 30-60 minutters inkubation ved I

I 37°C blev mediet fjernet, og dernæst blev 3 ml af mediet tilsat 25 pg/ml brom- I

I deoxyuridin. Efter 24 eller 48 timer ved 37°C blev mediet på ny fjernet og erstattet I

I med en agaroseoverlejring, der indeholdt 25 pg/ml bromdeoxyuridin og 125 pg/ml I

I 5 X-gal. Efter yderligere 24-48 timers inkubation kunne der fastslås blå plaques. I

I Enkelte af disse plaques blev taget ud og suspenderet i 500 μΙ medium. Denne I

I virusholdige suspension blev som beskrevet ovenfor behandlet med trypsin. I

I Plaque-oprensninger blev udført mindst to gange. I

I 10 15.4. Fremstilling og karakterisering både af vildtype og rekombinant I

I vaccinia-DNA I

I Inficerede celler blev skrabet af 175 cm2 kolber og vasket to gange med PBS- I

I Ca2+/Mg2+ ved en pH-værdi på 7,4. Efter centrifugering blev cellerne resuspenderet I

I 15 i 250 μΙ PBS. Gellerne blev frosset i kort tid tre gange og på ny tøet op. Et volumen I

I på 250 μΙ af en 2 x cellelyse-puffer (1% Triton X 100; 70 mM β-mercaptoethanol; I

I 40 mM EDTA) blev tilsat, og cellerne blev lyseret i 5 minutter på is. Kernen blev I

skilt fra cytoplasmaet i 1 minut ved 16.000 x g. Remanensen, der indeholdt I

I aggregerede viruspartikler, blev overført til et nyt rør og centrifugeret i 30 minutter I

I 20 ved 16.000 x g for at pelletere viruset. Derefter blev viruslysepuffer (10 mM Tris- I

HCI, pH 8; 1 mM EDTA; 5 mM β-mercaptoethanol; 200 mM NaCI; 1% SDS; I

150 pg/ml proteinase K) sat til pelleten i en mængde på 100 μΙ og inkuberet i I

I 30 minutter ved 56°C. Nukleinsyrerne blev derefter ekstraheret 3 x med Tris-HCI- I

I mættet phenol og dernæst genekstraheret med chloroform/isoamylalkohol (24:1).

I 25 Der blev draget omsorg for, at DNA'et ikke blev udsat for nogen forskydnings- I kræfter. Nukleinsyrerne blev udfældet med 0,1 M NaCI og et 2,5 gange volumen I ethanol ved -20"C natten over. Ca. 10-20 pg af DNA'et kunne isoleres fra 107 celler. Efter centrifugering (30 minutter ved 17.000 x g) blev DNA’et opløst i et lille volumen af 20-40 μΙ HjO. DNA'et blev skåret med restriktionsendonukleasen 30 Hindlll og fragmenterne adskilt på 0,6% agarosegeler i TA-puffer (Rice et al., J. Virol. 56, 227-239, 1985).

35 33 DK 175515 B1 15.5. Påvisning af nukleinsyrer ved hybridisering

Southern Blot 5 Efter overførsel af DNA'et fra gelerne (30’, 0,5N NaOH og 2 x 10’, 10 x SSC/0,5 M Tris-HCI pH 7,5) til nitrocellulosefiltre blev disse bagt i 4 timer ved 80°C. Filtrene blev præhybridiseret i 6 timer ved 65°C i 5 x Denhardtopløsning (1 x Denhardt = 0,02% Ficoll, 0,02% polyvinylpyrrolidon, 0,02% BSA). De våde filtre blev forseglet i plastposer og inkuberet i 18 timer ved 43°C med hybridiseringsopløsningen og 10 den radioaktive probe. Filtrene blev vasket ved 65°C tre gange, hver gang 30' med hver gang 2 x SSC, 1 x SSC og 0,1 x SSC med 0,1% SDS og 20 mM NaP04. Efter lufttørring af filtrene blev de udsat for Kodak X-omat AR-røntgenfilm.

En ”Riboprobe”-vektor (pSP6), der indeholdt et FSME-fragment fra det i fig. 5 viste 15 plasmid A5, blev anvendt til fremstilling af en FSME-virusspecifik "Riboprobe”. Radioaktivt maérket cRNA blev blandet med en hybridiseringsopløsning (50% formamid, Amberlit-oprenset; 5 x SSC, 1 x Denhardtopløsning, 0,1% SDS; 100 μ9/ηηΙ sildesperm-DNA). Det samlede volumen af hybridiseringsopløsningen blev bestemt, idet 50 μΙ. 100 μΙ/cm2 filter er nødvendig til optimale hybridiseringsbetingelser.

20 Mængden af radioaktivt cRNA var ca. 107 cpm/ml eller ca. 106 cpm/cm2 filter. Opløsningen blev opvarmet i 5 minutter ved 65°C.

Spot Blot 25 Disse eksperimenter blev udført ifølge Mackett et al (se 15.1.) med små modifikationer. Der blev anvendt materiale fra 1/4 af de isolerede plaques til infektion af en 35 mm Petri-skål. 48 timer efter infektionen blev cellerne høstet og vasket i en puffer indeholdende 50 mM Tris, pH 7,5, og 100 mM NaCI. Endelig blev cellerne resuspenderet i 500 μΙ af denne puffer. 100 μΙ alikvoter blev i vakuum suget op på 30 nitrocellulose. Efter tørring blev filtrene, der blev gennemblødt i 0,5 M IMaOH i 3 minutter, anbragt på chromatografipapir. Derefter blev filtrene neutraliseret på papirfiltre, der var gennemvædet med 2 x SSC/1 M Tris-HCI, pH 7,5 i 3 minutter. Filtrene blev dernæst bagt i mindst 2 timer og derefter behandlet på samme mide som beskrevet ovenfor for Southern Blot-hybridiseringen. .

35 I DK 175515 B1

I I

I 15.6. Proteinanalyse I

I Vero-celler eller TK'143-celler blev inficeret med en m.o.i. på 1 pfu/celle i et samlet I

I volumen på ca. 1-2 ml/25 cm2 kolber. I nogle forsøg blev cellerne mærket med I

I 5 100 μΟ 35S-methionin/ml. Når CPE var stærk, blev cellerne høstet, vasket 2 gange I

I i PBS og til slut resuspenderet i 100 μΙ RIPA-puffer (150 mM NaCl; 10 mM Tris-HCI, I

I pH 7,2; 1% natriumdesoxycholat; 1% Triton X 100; 0,1% SDS; 100 pg/ml PMSF) I

I (50-150 μΙ for 5 x 105 - 1,5 x 106 celler). Efter 10 minutter på is blev proberne ul- I

I tralydbehandlet i 30 sekunder. Til 8 μΙ af denne proteinblanding sattes 12 μΙ af en I

I 10 2 x kogepuffer (0,2 M DTT; 4% SDS; 0,16 M Tris-HCI, pH 6,8; 20% glycerol; 1/100 I

I volumen 5% BPB i ethanol); proteinerne blev denatureret i 10 minutter ved 100°C I

I og underkastet elektroforese på 15% SDS-polyacrylamidgeler (Bodemer et al., I

I Virology 103, 340-349, 1980). Proteinerne blev overført fra gelen til nitrocellulose- I

I filtre i en puffer indeholdende 0,192 M glycin, 0,025 M Tris, pH 8,3 og 20% I

I 15 methanol ved en strømstyrke på ca. 1,5 A i 2,5 timer. Nitrocellulosefiltrene blev I

I derefter inkuberet i en blokeringsopløsning "NET" (0,15 M NaCl, 5 mM EDTA, I

I 50 mM Tris, pH 7,4, 0,05% Triton X 100, 2% BSA). Humant serum og et enzym- I

I mærket andet mod humane immunoglobuliner rettet antistof blev tilsat i NET i en I

I fortynding på 1:500 og inkuberet i 2 timer. Båndene blev vasket med NET i 3 x 10 I

I 20 minutter og derefter gennemvædet med TBS (20 mM Tris, pH 7,5, 0,9% NaCl, 2% I

I BSA) i 3 x 10 minutter. Båndene blev fremkaldt i 50 ml TBS og det chromogene I

I substrat DAB og H202. I

I 15.7. Fremstilling af insertionsplasmider I

I 25 I

I Med de ovenfor beskrevne materialer og metoder blev der nu fremstillet plasmider, I

I der indeholder DNA-sekvenserne af E-proteinet. Først blev plasmidet A5 (fig. 5) I

I skåret med restriktionsendonukleaseme PvuII, FnuDII og Haell. Fragmenterne I

I blev indsat i det unikke Smal-sted i plasmidet pSCll (fig. 6). De tre FSME- I

I 30 fragmenter blev isoleret fra agarosegeler ved elektroeluering og ligeret med I

I plasmidet pSCll, idet sidstnævnte ligeledes blev lineariseret i det unikke Smal-

I sted. Det fysiske kort over disse plasmider er vist i fig. 7. De tre fragmenter har en H

I størrelse på 1022 bp (PvuII), 1485 bp (FnuDII) og 1553 bp (Haell). De omtalte tre I

I restriktionsendonukieaser blev anvendt, fordi den nukleotidsekvens, som koder for H

I 35 den indre del af E-proteinet, var blevet fundet både med og uden hydrofobe I

35 , DK 175515 B1 signaler eller membranforankringssekvenser ved en hydropatiplot udført med et IBI Pustell computerprogram (fig. 8). Orienteringen af de indsatte protein E-sekvenser med hensyn til p 7.5 E/l vacciniapromotoren blev bestemt ved Southern Blot-analyse. Skæring af pSCll-P6-plasmidet med Pvul eller BamHI gav klart et 5 2,585 kb eller et 0,919 kb langt fragment (fig. 9A, bane 3 og 4), som begge hybridiserede med en 32P-mærket "Riboprobe" (fig. 9B, bane 3 og 4). Plasmidet pSCll-F41 kunne skæres i fragmenter med BamHI eller EcoRI; fragmenter med en størrelse på 1,019 kb eller 1,879 kb hybridiserede begge udelukkende med "Riboproben" (fig. 9B, bane 6 og 7).

1° 15.8. In vivo rekombination med FSME-insertionsplasmider og vildtype-vacciniavirus

Vero-celleenkeltlag, der var blevet inficeret med vacciniastammen WR, blev 15 transficeret med plasmid-DNA. Efter 48-72 timer blev en stærk cytopatogen virkning synlig, og cellerne blev høstet. Viruset blev isoleret fra cellerne ved gentagen frysning og optøning samt trypsinbehandling som beskrevet. Derefter blev TK'-celleenkeltlag inficeret med denne virussuspension. Cellerne voksede i nærværelse af BUdR. Plaques under udvikling blev visualiseret under en agarose-20 overlejring indeholdende det chromogene substrat X-gal. Virusfortyndinger blev udført, således at dette gav 10-30 plaques pr. 35 mm plader. Enkelte blå plaques blev taget ud og anvendt til den videre infektion af TK'-celler til formål for en yderligere plaque-oprensning af infektionsselektionen eller af Vero-celler til analyse af virale makromolekyler.

25 15.9. Spot Blot-analyse for at finde rekombinante vira

Små prober (ca. 100 μΙ) af inficerede celleenkeltlag fra 35 mm plader eller 25 cm2 dyrkningskolber blev opdelt og hybridiseret med et "nick-repair"-mærket pSCll-30 plasmid (som ikke indeholdt FSME-sekvenser) eller med FSME^’Riboproben" (fig.

10). Skin-inficerede celler udviste intet signal med begge prober. Viruset vSC8, som indeholdt lacZ-genet og TK-vacciniasekvenser, men ingen FSME-sekvenser, gav et negativt resultat med FSME-"Riboproben". Som forventet var alle celler med vira fra fire forskellige individuelle plaque-isoleringer imidlertid positive med FSME-35 og pSCll-proben.

I DK 175515 B1 I

I 36 I

I 15.10. Analyse af DNA fra rekombinante vira I

I Vero-celleenkeltlag blev inficeret med en m.o.i. på 1-10 pfu/celle med plaqueop- I

I 5 rensede, propagerede vacciniarekombinanter. Virus-DNA'et blev isoleret fra virus- I

I partikler, der blev Qernet fra inficerede celler, og analyseret ved restriktionsendo- I

I nuklease-skæring samt Southern Blot-hybridisering. Det 5 kb lange Hindlll J-frag- I

I ment fra vildtype-DNA (som vist i fig. 11, bane 6) blev erstattet med et større I

I Hindlll-fragment, som bestod af det oprindelige Hindlll J-fragment og de DNA- I

I 10 sekvenser, som var blevet indsat i TK-genstedet ved in v/Vo-rekombination. vSC8- I

I viruset indeholdt et 3,5 kb langt lacZ-gen, og Hindlll J-fragmentet vandrede såle- I

I des ved en størrelse på ca. 8,5 kb (fig, 11, bane 5). Da større fragmenter imidlertid I

I ikke uden videre kunne adskilles i lavprocentsgeler, blev der udført en afsluttende I

I bestemmelse af det rekombinante virus-DNA ved Southern Blot-hybridisering (fig. I

I 15 12). Med 32P-mærkede prober kunne der ganske klart findes fragmenter, der havde I

I de størrelser, som var forudsagt ved kloningsstrategien. Det rekombinante virus, I

I der blev dannet ved rekombination af pSCll-P6, havde et ubetydeligt afvigende I

I (ca. 500 bp), mindre Hindlll-fragment end "pSCll-F41"-rekombinanterne (fig. I

I 12A og B). DNA'er fra uinficerede celler udviste hverken hybridisering med den I

I 20 pSCl 1 "nick-repair"-mærkede probe eller med "Riboproben” (fig. 12A og B, bane I

I 9). DNA fra viruset vSC8 hybridiserede kun med den pSCll "nick-repair"-mærkede I

I probe på grund af den fælles TK-sekvens og lacZ-genet (fig. 12B, bane 8). FSME- I

I "Riboproben" udviste som forventet ingen hybridisering. Bade "Riboproben” og den I

I "nick-repair"-mærkede probe identificerede imidlertid "rekombinante" Hindlll J- I

I 25 fragmenter med forskellig størrelse (fig. 12A og B, bane 1-3 og 7). DNA fra vacci- I

I niavirus, som var opstået efter rekombination med insertionsplasmidet pSCll og I

I vildtypevirus, er vist i fig. 12A og B, bane 4-6. Med "Riboproben" (fig. 12A) iagt- I

I toges ingen hybridisering, derimod med plasmidet pSCll (fig. 12B). I

I 30 15.11. Proteinanalyse I

I Celler blev inficeret med vildtype eller rekombinante vira med en m.o.i. på 1- I

I 10 pfu/celle. Cellerne blev mærket med 35S-methionin efter forskellige tidspunkter I

I efter infektionen, høstet og analyseret efter hinanden på denaturerende SDS-poly- I

35 acrylamidgeler. Protein E-variantmolekyler blev bestemt ved Western Blot-analyse I

Claims (38)

10 Tidsforløbet for syntesen af FSME-proteinerne i celler, der blev inficeret med vac-ciniavirusrekombinanter, blev bestemt ved mærkning af cellerne på forskellige tidspunkter efter infektionen i kort tid (4 timer) med 35S-methionin. Da p7.5-pro-motoren er aktiv både i en tidlig og i en sen fase af infektionscyklen, var det at forvente, at cellerne producerede FSME- proteiner på et tidligt og på et sent tids-15 punkt efter infektionen. I sammenligning hermed regulerer den sene pil-promotor syntesen af β-gal-proteinet, der har en molekylvægt på 116 Kd. Dette protein forekom derfor forholdsmæssigt sent efter infektionen. De beskrevne tidlige eller sene promotoraktiviteter gav sig udslag på tidspunktet for høst af cellerne, især når større mængder virus skulle tilvejebringes til oprensning og fremstilling af de 20 ønskede proteiner. EKSEMPEL 16 Vaccinefremstilling 25 Til fremstilling af en vaccine kan et ifølge opfindelsen fremstillet antigen fx suspenderes i ren og virksom form i en pufferopløsning og opløses i en adjuvans på kendt måde for at forbedre den immunogene aktivitet. 30

1. DNA-molekyle, kendetegnet ved, at det omfatter DNA stammende fra den vestlige under-35 type af FSME-virus, hvilket DNA koder for i det mindste en del af i det mindste ét I DK 175515 B1 I I 38 I I protein valgt blandt proteinerne C, prM, M eller E af den vestlige undertype af I I FSME-virus. I

2. DNA-molekyle ifølge krav 1, I I 5 kendetegnet ved, at det omfatter hele den DNA-sekvens, der koder for I I strukturproteinerne af FSME-virus, fortrinsvis som vist i fig. 1. I

3. DNA-molekyle ifølge krav 1 eller 2, I I kendetegnet ved, at det koder for ét af de proteiner, der er valgt blandt I I 10 proteinerne C, prM, M eller E af den vestlige undertype af FSME-virus. I

4. DNA-molekyle ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, I I kendetegnet ved, at det koder for i det mindste et område af en antigen- I I determinant for et af de proteiner, der er valgt blandt proteinerne C, prM, M eller E I I 15 af den vestlige undertype af FSME-virus, fortrinsvis E-proteinet. I

5. DNA-molekyle ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, I I kendetegnet ved, at det er vundet ved omvendt transkription med omvendt I I transkriptase ud fra et oprenset RNA-molekyle af den vestlige undertype af FSME- I I 20 virus. I

6. DNA-molekyle ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, I I kendetegnet ved, at det fremstilles ved kemisk DNA-syntese. I I 25 7. DNA-molekyle ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, I I kendetegnet ved, at det hybridiserer med et DNA-molekyle ifølge et hvilket I I som helst af kravene 1-6 under stringente betingelser. I

8. DNA-molekyle ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7, I I 30 kendetegnet ved, at det omfatter DNA-sekvenser, der afviger fra DNA- I I molekylerne ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7 som følge af degeneration af I I den genetiske kode og/eller mutationer og/eller transpositioner, men stadig koder I I for et protein med de væsentlige antigene egenskaber af i det mindste ét af de I I proteiner, som er valgt blandt proteinerne C, prM, M eller E af den vestlige under- I I 35 type af FSME-virus. I DK 175515 B1 39

9. DNA-molekyle ifølge et hvilket som helst af kravene 1-8, kendetegnet ved, at det er kombineret med yderligere DNA-sekvenser.

10. DNA-molekyle ifølge krav 9, kendetegnet ved, at de yderligere DNA-sekvenser tillader replication og ekspression af DNA-molekylet i en cellekultur, som omfatter sekvenser, der er valgt blandt promotorer, enhancere, polyadenyleringssignaler og spejsningssigna-ler. 10

11. RNA-molekyle, kendetegnet ved, at det er afledt fra RNA fra den vestlige undertype af FSME-virus og koder for i det mindste en del af i det mindste ét protein valgt blandt proteinerne C, prM, M eller E af den vestlige undertype af FSME-virus. 15

12. RNA-molekyle ifølge krav 11, kendetegnet ved, at det omfatter hele den RNA-sekvens, der koder for strukturproteinerne, fortrinsvis som vist i fig. 2.

13. RNA-molekyle ifølge krav 11, kendetegnet ved, at det koder for ét af de proteiner, der er valgt blandt proteinerne C, prM, M eller E af den vestlige undertype af FSME-virus.

14. RNA-molekyle ifølge et hvilket som helst af kravene 11-13, 25 kendetegnet ved, at det koder for i det mindste et område fra en antigen-determinant for ét af de proteiner, der er valgt blandt proteinerne C, prM, M eller E af den vestlige undertype af FSME-virus, fortrinsvis E-proteinet.

15. RNA-molekyle ifølge et hvilket som helst af kravene 11-14, 30 kendetegnet ved, at det er vundet ved isolering og oprensning af RNA fra den vestlige undertype af FSME-virus eller ved rekombinant-RNA/DNA-teknikker. 1 RNA-molekyle ifølge krav 15, I DK 175515 B1 I I I H kendetegnet ved, at det fås ved transkription af isoleret og oprenset virus- I RNA i DNA ved hjælp af omvendt transkriptase og efterfølgende transkription af I I dette DNA i RNA. I

17. RNA-molekyle ifølge et hvilket som helst af kravene 11-15, I kendetegnet ved, at dets komplementære streng under stringente betingel- I ser hybridiserer med et RNA-molekyle ifølge et hvilket som helst af kravene 11-15. I

18. Vektor, I 10 kendetegnet ved, at den omfatter insertioner af DNA-sekvenser ifølge et hvilket som helst af kravene 1-10 eller RNA-sekvenser ifølge et hvilket som helst af kravene 11-17, idet vektoren er valgt blandt plasmider, vira og cosmider. I

19. Vektor ifølge krav 18, I 15 kendetegnet ved, at den er plasmidet pBR322, som indeholder en DNA- sekvens, der koder for et protein valgt blandt proteinerne C, prM, M eller E af den vestlige undertype af FSME-virus eller dele deraf.

20. Vektor ifølge krav 19, I 20 kendetegnet ved, at den er plasmidet A5, som er vist i fig. 5, og som er deponeret i DSM med deponeringsnummeret DSM 4382.

21. Vektor ifølge krav 19, I kendetegnet ved, at den er plasmidet Pl-1, som er deponeret i DSM med I 25 deponeringsnummeret DSM 4383.

22. Vektor ifølge krav 18 eller 19, kendetegnet ved, at den er et insertionsplasmid, der ved homolog rekombi- nation overfører DNA-sekvenser for E-proteinet eller dele deraf til et Hindlll J-frag- 30 ment fra et vacciniavirus.

23. Vektor ifølge krav 22, I kendetegnet ved, at den er plasmidet pSCll-Hl ifølge fig. 7, som inde- holder nukleotiderne 6503-8051 af den DNA-sekvens, som koder for E-proteinet. I 35 DK 175515 B1 41

24. Vektor ifølge krav 22, kendetegnet ved, at den er plasmidet pSCll-F41 ifølge fig. 7, som indeholder nukleotiderne 6503-7998 af den DNA-sekvens, som koder for E-proteinet.

25. Vektor ifølge krav 22, kendetegnet ved, at den er plasmidet pSCll-P6 ifølge fig. 7, som indeholder nukleotiderne 6503-7524 af den DNA-sekvens, som koder for E-proteinet.

26. Vacciniaekspressionsvektor, 10 kendetegnet ved, at den ved homolog rekombination indeholder DNA-sekvenser for E-proteinet, fortrinsvis fra DNA-sekvenser indsat i et plasmid ifølge et hvilket som helst af kravene 22-25, og at den er i stand til at udtrykke protein E eller dele deraf, der indeholder de til de omtalte DNA-sekvenser svarende amino-syresekvenser. 15

27. Bærer, kendetegnet ved, at den omfatter insertioner af DNA-sekvenser ifølge et hvilket som helst af kravene 1-10 eller RNA-sekvenser ifølge et hvilket som helst af kravene 11-17, idet bæreren er et bakterie, fortrinsvis Salmonella typhi. 20

28. Cellekultur, kendetegnet ved, at den indeholder en hvilken som helst af sekvenserne ifølge et hvilket som helst af kravene 1-17.

29. Cellekultur ifølge krav 28, kendetegnet ved, at den tillader ekspression af polypeptider, der indkodes af RNA- eller DNA-sekvenserne ifølge et hvilket som helst af kravene 1-17, idet cellekulturen fortrinsvis er en pattedyr-cellekultur. 1 35

30. Cellekultur ifølge krav 28 eller 29, kendetegnet ved, at den er en Vero-cellekultur eller en hønsefosterfibro-blastcellekultur, der indeholder en vacciniaekspressionsvektor ifølge krav 26, og i hvilken der udtrykkes den del af E-proteinet, der svarer til de indsatte DNA-sekvenser. I DK 175515 B1 I I 42 I

31. Peptid eller polypeptid, I I kendetegnet ved, at det omfatter en aminosyresekvens, der indkodes af en I I hvilken som helst af nukleotidsekvenserne ifølge et hvilket som helst af kravene 1- I I 17 I I 5 i

32. Peptid eller polypeptid ifølge krav 31, I I kendetegnet ved, at det fremstilles ved ekspression af én af sekvenserne I I ifølge et hvilket som helst af kravene 1-17 i et egnet ekspressionssystem. I I 10 33. Peptid eller polypeptid ifølge krav 32, I I kendetegnet ved, at det fremstilles i en cellekultur ifølge krav 30. I

34. Peptid eller polypeptid ifølge krav 31, I kendetegnet ved, at det syntetiseres kemisk. I I 15 I

35. Præparat, I I kendetegnet ved, at det omfatter ét eller flere af peptiderne eller poly- I I peptiderne ifølge et hvilket som helst af kravene 31-34. I I 20 35. Levende vaccine, I I kendetegnet ved, at den omfatter DNA-sekvenser ifølge et hvilket som I I helst af kravene 1-10 og/eller RNA-sekvenser ifølge et hvilket som helst af kravene I I 11-17. I 25 37. Levende vaccine, I kendetegnet ved, at én eller flere DNA-sekvenser ifølge et hvilket som helst I af kravene 1-10 er kombineret med vacciniavirus-DNA.

38. Levende vaccine ifølge krav 37, I 30 kendetegnet ved, at den indeholder en vacciniavektor ifølge krav 26.

39. Vaccine, I kendetegnet ved, at den indeholder et præparat ifølge krav 35. DK 175515 B1 43

40. Anvendelse af en vaccine ifølge et hvilket som helst af kravene 36-39 til fremstilling af specifikke immunoglobuliner.

41. Diagnostisk middel, 5 kendetegnet ved, at dét indeholder et præparat ifølge krav 35.

42. DNA- eller RNA-probe, kendetegnet ved, at den hybridiserer med DNA- eller RNA-sekvenser ifølge et hvilket som helst af kravene 1-17. 10