FI102835B - FSME-viruksen läntisen alatyypin peptidejä ja polypeptidejä ja niitä s isältäviä diagnostisia aineita - Google Patents

Description

1 102835 FSME-viruksen läntisen alatyypin peptidejä ja polypeptide-jä ja niitä sisältäviä diagnostisia aineita

Jakamalla erotettu hakemuksesta 881294 5

Kyseessä oleva keksintö koskee FSME-viruksen läntisen alatyypin peptidejä ja polypeptidejä ja niitä sisältäviä diagnostisia aineita.

Alkukesän meningoenkefaliitti-(FSME)-viruksen län-10 tinen alatyyppi kuuluu Flaviviridae-sukuun, johon kuuluvat virukset ovat pallomaisia, lipidien ympäröimiä RNAviruksia (Westaway et ai., Intervirology 24, 183 - 192, 1985). Näiden virusten prototyyppi on keltakuumevirus. Määritelmän mukaisesti kaikki Flavi-virukset ovat serologisesti sukua 15 toisilleen, kuten hemagglutinaatio-inhibitiotesti osoit taa. Ristineutralisaatiota käyttäen voidaan suku kuitenkin jakaa useampiin serokomplekseihin (DeMadrid and Porterfield, J. Gen. Virol. 23, 91 - 96, 1974), jotka käsittävät viruksia, jotka ovat keskenään lähemmin sukua kuin muiden 20 serokompleksien jäsenten kanssa tai ryhmittelemättömien

Flavi-virusten kanssa. FSME-virus on ns. "Tick-borne" -serokompleksin jäsen, johon kuuluvat sitä paitsi Loupung-111 -virus, Langat-virus, Omskerin hemorraginen kuume -virus, Kyasanur Forest-Disease -virus ja Negishi-virus. 25 FSME-viruskannat voitiin edelleen jaotella länti seen (eurooppalaiseen) alatyyppiin, joka tarttuu pääasiassa Ixodes ricinuksen välityksellä ja kaukoidän alatyyppiin, jonka pääasiallinen tartuttaja on Ixodes persulcatus (Clarke, 1964; Bull. WHO 31, 45 - 56).

30 Tämä alatyyppien erilaistuminen osoitettiin sekä « kompetitiivisen radioimmunoanalyysin ja peptidikartan avulla vastaavien rakenneglykoproteiinien rajoitettua pro-teolyysiä käyttäen (Heinz ja Kunz, J. Gen. Virol. 57, 263 - 274, 1981) että antigeenianalyysin avulla käyttäen • · = 102835 monoklonaalisia vasta-aineita (Heinz et al., Virology 126, 525 - 537, 1983).

Kypsät viruspartikkelit sisältävät vain kolme ra-kennusproteiinia, joita merkitään E:llä, C:llä ja M:llä, 5 likimääräisten molekyylipainojen ollessa 50 000 - 60 000, 15 000 ja 7 000.

Flavi-virusten genomi muodostuu yksisäikeisestä RNA:sta, jossa on noin 11 000 emästä, joilla on mRNA-suunta, molekyylipainon ollessa 4 x 106 daltonia. Tämä RNA muo-10 dostaa yhdessä C-proteiinin kanssa pallomaisen nukleokap-sidin, jota ympäröi lipidimembraani, joka on liittynyt yhteen proteiinien E ja M kanssa. Kokeet, jotka tehtiin käyttäen E-proteiinin puhdistettuja valmisteita, jotka saatiin viruksen detergenteillä solubilisaation jälkeen, 15 ovat osoittaneet, että E esittää viruksen hemagglutiniinia (ts., se aiheuttaa tiettyjen erytrosyyttien agglutinaation sopivissa olosuhteissa), joka indusoi immunisoinnin jälkeen hemagglutinaatiota estäviä, neutraloivia ja siltä suojaavia vasta-aineita sekä immuniteetin elävän, virulen-20 tin viruksen infektiota vastaan (Heinz et ai., Infect. Immun. 33, 250 - 257, 1981).

Näiden rakenneproteiinien lisäksi Flavi-virusten infektoimista soluista on löydettävissä useita virusspe-sifisiä proteiineja, jotka eivät ole rakenneproteiineja.

25 Flavi-virusten genomijärjestys on äskettäin määri tetty keltakuume-, West Nil - ja Murray Valley -enkefa-liittivirusten cDNA-kloonausta ja sekvensointia käyttäen (Rice et ai., Science 229, 726 - 733, 1985; Dalgarno et ai., J. Mol. Biol. 187, 309 - 323, 1986; Castle et ai., 30 Virology 147, 227 - 236, 1985; Castle et ai., Virology 149, 10 - 26, 1986; Wengler et ai., Virology 147, 264 - 274, 1985). Näiden analyysien mukaan Flavi-virusten genomi -RNA sisältää yksittäisen pitkän, avoimen lukukehyksen, jossa on noin 11 000 nukleotidia ja joka koodittaa kaikkia • · > 3 102835 t rakenneproteiineja ja proteiineja, jotka eivät ole raken-neproteiineja.

Rakenneproteiinien geenit ovat lokalisoituneet RNA:n 5'-osaan; ne käsittävät noin neljänneksen genomista 5 järjestyksessä C-prM(M)-E. prM on M:n esiaste, jota on läsnä Flavi-virusten kypsymättömissä muodoissa (Shapiro et ai., Virology 56, 88 - 94, 1973). Sen proteolyyttinen hajoaminen, joka todennäköisesti tapahtuu solun endoplas-maattisessa verkkojärjestelmässä läsnä olevan proteaasin 10 vaikutuksesta, johtaa M:n muodostumiseen ja on ilmeisesti myöhäinen tapahtuma viruksen kypsymisen kulussa.

Oletetaan, että viruksen proteiinien translaatio initioituu ja jatkuu ensimmäisestä tai mahdollisesti toisesta AUGrstä RNA:n 5'-päässä, kunnes se törmää lopetus-15 kodoniin RNA:n 3'-päässä. Uskotaan, että yksittäisten proteiinien muodostuminen tapahtuu sarjana spesifisiä proteo-lyyttisiä hajoamistapahtumia, joihin ottavat osaa sekä solun että virusspesifiset proteaasit.

Pletnev et ai. (FEBS 3660, 200, nro 2, 317 - 321, 20 1986) ovat kloonanneet FSME-viruksen kaukoidän alatyypin tiettyjä fragmentteja ja osoittaneet, että FSME-viruksen tämän alatyypin genomijärjestys vastaa edellä mainittujen virusten genomijärjestystä, mutta he eivät kyenneet kloonaamaan ja sekvensoimaan FSME-viruksen tämän alatyypin 25 rakennegeenien koko sekvenssiä. Lisäksi on osoittautunut, että julkaistu proteiini-E:n sekvenssi, joka on johdettu kloonista Sofjin 2, ei ole oikea, koska lukukehyksen siirtymisen vuoksi saatiin väärä sekvenssi karboksiterminaaliselle alueelle.

30 Tähän mennessä tunnetaan yli 60 eri Flavi-virusta w · ja noin kaksi kolmasosaa niistä tarttuu infektoituneen niveljalkaisen (Arthropoden) pureman välityksellä ja ovat siten "Arthropode-borne" (ARBO) -viruksia. Useat Flavi-virukset ovat tunnettuja humaanipatogeenejä, mukaan luet- 4 102835 tuna keltakuumevirus, Dengue-virus, japanilainen enkefa-liittivirus ja FSME-virus (Shope; "The Togaviruses", s. 47 - 82, Academic Press, New York).

FSME-virus on monissa Euroopan maissa, Venäjällä ja 5 Kiinassa endeeminen. Sairaus on hyvin dokumentoitu muutamissa Keski-Euroopan maissa, kuten Itävallassa, Tshekkoslovakiassa tai Unkarissa ja joka vuosi rekisteröidään useita satoja sairaalaan joutuneita tapauksia, jotka ovat merkittävä ongelma yleiselle terveydelle.

10 Sairaus voidaan estää tehokkaasti rokottamalla hy vin puhdistetulla, formaliinilla inaktivoidulla kokovirus-rokotteella (Kunz et ai., J. Med. Virol. 6, 103 - 109, 1980), joka indusoi immuunivasteen viruksen rakennepro-teiineja vastaan. Tämän rokoteaineen pääasiallisin hait-15 tapuoli on, että valmistuksen aikana on käsiteltävä suuria määriä tartuttavaa ja mahdollisesti vaarallista virussus-pensiota. Siksi ovat mittavat ja kalliit turvatoimenpiteet välttämättömiä.

Esillä oleva keksintö koskee peptidiä tai polypep-20 tidiä, jolle on tunnusomaista, että se käsittää osan proteiinista, joka on valittu ryhmästä, joka käsittää FSME-viruksen läntisen alatyypin proteiinin C, rpm, M tai E, ja aminohapposekvenssin, joka sisältyy kuviossa 3 esitettyyn .. aminohapposekvenssiin.

25 Esillä oleva keksintö koskee edelleen diagnostista ainetta, jolle on tunnusomaista, että se sisältää edellä mainittua peptidiä tai polypeptidiä.

Esillä olevassa keksinnön puitteissa on saatu käyttöön DNA-molekyyli, joka käsittää FSME-viruksen läntisestä . 30 alalajista johdettua DNArta, joka koodittaa vähintään yh den sellaisen proteiinin vähintään yhtä osaa, joka on valittu ryhmästä, joka käsittää FSME-viruksen läntisen ala-tyypin proteiinit C, M tai E.

Kuvattu DNA-molekyyli vastaa FSME-viruksen läntisen 35 alatyypin yksisäikeistä RNA:ta ja soveltuu geneettisen 5 102835 informaation valmistamiseen sellaisen polypeptidin ilmentämiseksi, joka voi olla FSME-viruksen läntisen alatyypin proteiini C, prM, M tai E yksittäisenä tai kombinaationa, kuten edellä on kuvattu tai osia yhdestä tai useammasta 5 mainitusta proteiinista, jota voidaan käyttää mielekkäästi diagnostiikassa.

DNA-molekyyliä voidaan käyttää kokonaisena molekyylinä, jonka sekvenssi koodittaa FSME-viruksen läntisen alatyypin rakenneproteiineja, edullilisesti siten kuin 10 kuviossa 1 on esitetty. DNA- sekvenssi, joka on ilmoitettu kuviossa 1, esittää FSME-viruksen läntisen alatyypin kloonattua genomia, vastaten RNAmolekyyliä, joka sisältyy FSME-viruksen luonnossa esiintyviin läntisiin alatyyppei-hin. DNA-sekvenssi, joka on esitetty kuviossa 1, käsittää 15 rakenneproteiinien alueen ja translatoitumattoman 5'-alueen. Tarkoin tutkittu DNA-sekvenssi osoittaa vain avoimen lukukehyksen; proteiinien C, prM, M ja E aminoterminaali-set lähtöpisteet sekä kloonien A5 ja Pl-1 rajat on osoitettu nuolilla.

20 Edullisesti DNA-molekyylit koodittavat FSME-viruk sen läntisen alatyypin rakenneproteiineista yhtä kerrallaan, ts. koko C-, prM-, M- tai E-proteiinia. Kyseessä olevan DNA-molekyylin kulloisetkin osat voidaan käyttää suoraan ilmentämissysteemeihin yhden mainituista halutuis-25 ta rakenneproteiineista valmistamiseksi.

Edullisesti käytetään osaa DNA-molekyylistä, joka koodittaa vähintään FSME-viruksen läntisen alatyypin jonkin rakenneproteiinin antigeenisen determinantin aluetta, diagnostisten aineiden valmistusta varten. On tunnettu 30 tosiasia, että proteiinin antigeenisiä determinantteja sisältävät alueet saavat aikaan vasta-aineen induktion. Siksi ei ole välttämätöntä käyttää koko proteiineja, joista tiedetään, että niillä on antigeenisiä ominaisuuksia, vaan voidaan käyttää ainoastaan näiden proteiinien anti- f β 102835 geenisen determinantin alue. On tunnettua, että joissakin tapauksissa vain muutamien aminohappojen sekvenssi voi vaikuttaa antigeeninä ja voi aiheuttaa vasta-ainevasteen. DNA-sekvenssi, joka koodittaa FSME-viruksen läntisen ala-5 tyypin rakenneproteiinin E antigeenisten determinanttien alueita, on edullinen.

DNA-molekyylin valmistamiseksi on kaksi tapaa. Yksi mahdollisuus DNA-molekyylin saamiseksi on virus-RNA:n ekstrahoiminen FSME-viruksen läntisestä alatyypistä ja 10 RNA-molekyylin puhdistaminen, mitä seuraa tämän RNA-mat- riisin käänteiskopiointi DNA-molekyyliksi käyttäen kään-teiskopioijaentsyymiä. Toinen mahdollisuus on syntetisoida DNA-molekyylejä kemiallisesti niin pian kuin DNA-sekvenssi on tunnettu.

15 Tämän keksinnön puitteissa käytettyjä DNA-molekyy lejä voidaan edullisessa suoritusmuodossa yhdistää ylimääräisten DNAsekvenssien kanssa.

Nämä ylimääräiset sekvenssit voivat mahdollistaa DNA-molekyylin replikaation ja ilmentämisen soluviljelmäs-20 sä. Tätä tarkoitusta varten ovat tärkeimpiä DNA-sekvenssejä enhansereiden (voimistajien) , promoottoreiden, polyade-nylointisignaalien ja silmukointisignaalien DNA-sekvens-sit. Nämä ylimääräiset DNA-sekvenssit voidaan yhdistää keksinnössä käytettävien DNA-molekyylien kanssa alan am-25 mattimiehen tuntemien standardimenetelmien mukaisesti.

Edellä DNA-molekyyleille esitetty pätee myös RNA-molekyyleille. Keksinnössä käyttökelpoisia RNA-molekyyle-jä voidaan saada eristämällä ja puhdistamalla FSME-viruksen läntisen alatyypin RNA:sta tai yhdistelmä-RNA/DNA-tek-, 30 niikoita käyttäen. Edelleen eivät ainoastaan RNA-molekyy- lit, jotka on saatu puhdistamalla FSME-viruksen läntistä alatyyppiä, ovat käyttökelpoisia, vaan samoin RNA-molekyy-lit, jotka saadaan käänteiskopioimalla eristetty ja puhdistettu virus-RNA DNA:ksi ja sen jälkeen käänteiskopioi-35 maila siten saatu DNA jälleen RNA:ksi.

•.

Ύ· v 102835 DNA- ja RNA-molekyylit voidaan insertoida vektorei-hin, jotka valitaan ryhmästä, joka käsittää plasmideja, viruksia ja kosmideja. Alan ammattimies tietää, että käytetyt vektorit voivat käsittää DNA-sekvenssejä, jotka oh-5 jaavat insertoitujen RNA tai DNA-sekvenssien replikaatiota ja ilmentämistä, kuten esim. promoottoreita, enhansereita (voimistajia) jne.

Kirjallisuudessa hyvin kuvattu ja mainittujen DNA-sekvenssien kloonaukseen soveltuva plasmidi on plasmidi 10 pBR322.

Edullinen, mainitulla tavalla valmistettu plasmidi on plasmidi A5, joka on esitetty kuviossa 5. Plasmidista pBR322 johdettu plasmidi A5 sisältää DNA-sekvenssin, joka koodittaa proteiini E:ta. Toinen edullinen plasmidi on 15 Pl-l. Mainitut edulliset plasmidit on talletettu talletus- laitokseen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Budapestin sopimuksen mukaisesti ja ovat saaneet seuraavat talle-tusnumerot: a) plasmidi A5 E. coli HB101:ssä 20 DSM 4382 b) plasmidi Pl-l E. coli HB101:ssä DSM 4383 Lähtien kuvatusta plasmidista A5 voidaan edullisesti valmistaa insertioplasmideja, jotka sisältävät osia 25 plasmidissa A5 kloonatusta FSME-viruksen DNA-sekvenssistä, jolloin nämä insertioplasmidit sisältävät vieraan geneettisen informaation sellaisella tavalla, että se homologista rekombinaatiota käyttäen on yhdistettävissä Vaccinia--viruksen Hindlll J -fragmenttiin. Plasmidin A5 alafragmen-30 tit hajotetaan erilaisilla restriktioendonukleaaseilla ja kloonataan insertioplasmideiksi, esimerkiksi sellaisten proteiini E:n muotojen saamiseksi, jotka voivat joko sisältää tai eivät sisällä hydrofobisia aminohapposekvenssejä, nimittäin signaali- ja membraaniankkurisekvenssejä.

• « 102835

Rekombinoidut virukset, joissa on integroitunutta proteii-ni-E -DNA:ta, voidaan eristää plakista. Proteiini E:n haluttuja osia koodittavien FSME-DNA -sekvenssien integraatio vahvistetaan käyttäen hajotusta sopivilla restriktio-5 endonukleaaseilla ja hybridisaatiota 32P:llä leimatun FSME-cRNA:n kanssa ja todetaan siitä, että karakteristinen Vaccinia Hindlll J -fragmentti voidaan osoittaa.

Kolme esimerkkiä plasmideista, jotka soveltuvat rekombinaation suorittamiseen Vaccinia-viruksissa, OVdt 10 pSCll-Hl, joka sisältää kloonatun FSME-DNA:n Haell-frag-mentin, plasmidi pSCll-F41, joka sisältää kloonatun FSME-DNA: n Fnu DII-fragmentin sekä plasmidi pSCl-P6, joka sisältää kloonatun FSME-DNA:n PvuII-fragmentin. Kuvatut plasmidit on esitetty kuviossa 7. Lähtöplasmidi pSCll E. 15 colissa on talletettu talletuslaitokseen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Budapestin sopimuksen mukaisesti tal-letusnumerolla DMS 4381.

Kuvatut insertioplasmidit käytetään edullisesti haluttujen sekvenssien insertoimiseksi Vaccinia-ilmentymis-20 vektoreihin.

Sekvenssien siirtovälineinä voidaan käyttää myös bakteereja. Edullinen baktee i on Salmonella typhi.

Käytetyt vektorit tai välineet sisältyvät siis edullisesti soluviljelmiin, joissa RNA- tai DNA-sekvens-25 sien koodittamien keksinnön mukaiseten polypeptidien il mentyminen tapahtuu mahdollisimman luonnollisissa olosuhteissa, jolloin soluviljelmä on edullisesti nisäkässolu-viljelmä.

Erityisen sopivia soluviljelmiä haluttujen pepti-30 dien tai polypeptidien ilmentymiselle ovat Vero-soluvil jelmät tai kanan sikiön fibroblastisoluviljelmät, jotka sisältävät Vaccinia-ilmentymisvektorin, jota kuvattiin edellä, jolloin ilmentyvät ne proteiinit, jotka vastaavat Vaccinia-ilmentymisvektoreihin sisältyviä DNA-sekvenssejä .

5 102835

Yhdistelmä-Vaccinia-virukset voidaan analysoida käyttäen Southern Blot -hybridisointia insertoituneen FSME-DNA:n läsnäolon toteamiseksi.

Keksinnön mukaisesti saadaan siis käyttöön pepti-5 dejä tai polypeptidejä, jotka käsittävät aminohapposekvenssejä, joita koodittaa jokin edellä esitetyistä nukle-otidisekvensseistä. Näiden peptidien tai polypeptidien valmistamisen edut ovat yhtäpitäviä edellä DNA- ja RNA -molekyyleille esitettyjen etujen kanssa.

10 Keksinnön mukaisesti saatavien peptidien tai poly peptidien aminohapposekvenssit vastaavat DNA- ja RNA-sekvenssejä, jotka on kuvattu edellä ja niillä on edullisesti aminohapposekvenssi, joka on esitetty kuviossa 3.

Edellä kuvattujen plasmidien pSCll-Hl, pSCll-F41 ja 15 pSCll-P6 avulla voidaan suorittaa niiden määrittämien proteiinien ilmentyminen edullisesti yhdistämällä vastaaviin Vaccinia-ilmentymisvektoreihin.

Vaikka on esullista valmistaa peptidejä tai polypeptide jä jonkin tämän keksinnön puitteissa aikaan saadun 20 nukleotidisekvenssin ilmentymisen kautta, on samoin mahdollista syntetisoida keksinnön mukaiset peptidit tai po-lypeptidit kemiallisesti.

Edullisesti keksinnön mukaiset peptidit tai poly-v peptidit sisältyvät koostumukseen, jota voidaan käyttää 25 diagnostiikan alalla.

Keksintöä valaistaan seuraavalla yksityiskohtaisella kuvauksella.

Keksinnön edullinen suoritusmuoto esitetään kuvioissa, kuten seuraavista kuvioiden selityksistä ilmenee: 30 Kuvio 1 esittää FSME-viruksen läntisen alatyypin kloonatun genomin DNA-sekvenssin käsittäen rakennealueen ja 5'-käänteiskopioimattoman alueen. Proteiinien C, prM (M) ja E aminoterminaaliset lähtöpisteet sekä kloonien A5 ja Pl-l rajat on osoitettu nuolilla.

• « !o 102835

Kuvio 2 esittää FSME-viruksen läntisen alatyypin genomin RNA-sekvenssin, joka koodittaa rakenneproteiineja. Proteiinien C, prM (M) ja E aminoterminaaliset lähtöpisteet on osoitettu nuolilla.

5 Kuvio 3 esittää FSME-viruksen läntisen alatyypin rakenneproteiinien aminohapposekvenssin, joka johdetaan kuviossa 1 esitetystä DNA-sekvenssistä. Eri proteiinien NH2-päät on osoitettu nuolilla.

Kuvio 4 esittää valokuvaa sellaisten plasmidien 10 agaroosigeelielektroforeesista, jotka sisältävät FSME-vi ruksen läntiselle alatyypille spesifisiä inserttejä, res-triktioentsyymillä Smal hajottamisen jälkeen (viivat 2 - 6) . Ylemmät vyöhykkeet edustavat plasmidi-DNA:ta (4363ep), alemmat vyöhykkeet spesifistä insertti-DNA:ta (alueella 15 2 000 - 3 500 ep). DNA-markkerit viivoissa 1 ja 7 vastaa vat emäspareja 23 130, 9 416, 6 557, 4 361, 2 322, 2 027, 564 ja 125 (ylhäältä alaspäin).

Kuvio 5 esittää plasmidista pBR322 johdettua plas-midia A5, jossa on esitetty valittujen alafragmenttien 20 restriktioendonukleaasikatkaisukohdat, jolloin vastaavat, FSME-proteiinia E koodittavat alueet on osoitettu. Nuoli osoittaa genomi-RNA:n transkription suunnan.

Kuvio 6 esittää insertioplasmidia pSCll, johon si-. sältyvät yksi ainoa Smal -insertiokohta, Vaccinia-promoot- 25 tori, prokaryoottinen lac Z -geeni ja Vaccinia-TK -rekom-binaatiosekvenssit.

Kuvio 7 esittää kolme konkreettista, esimerkinomaista FSME-insertioplasmidia in vivo -rekombinaatiota varten Vaccinia-ilmentymisvektorissa. Ainoa Smal-paikka 30 jokaisessa esitetyssä plasmidissa on nukleotidi 6 500.

FSME-virusspesifisten sekvenssien kulloinkin ensimmäinen emäs jokaisessa esitetyssä plasmidissa on nukleotidi 6 503.

Kuvio 8 esittää subkloonattujen FSME-virusspesifis-35 ten sekvenssien luonteenomaisia piirteitä. Translaatio- « » ^ 102835 aloituskodonit sekä hydrofiiliset aminohappoalueet, jotka on johdettu hydropatiaplotista, on kuvattu. Nämä alueet identifioitiin IBI-Pustell -tietokoneohjelmaa käyttäen.

Hydrofobiset sekvenssit on osoitettu □, hydrofiili-5 set sekvenssit I.

Kuvio 9 esittää FSME-insertioplasmidien fysikaalista kartoitusta sekä niiden plasmidi-DNA-fragmenttien osoitusta, jotka sisältävät FSME-spesifisiä sekvenssejä. A:ssa on etidiumbromidilla värjätty agaroosigeeli, jossa DNA-10 fragmentit ovat nähtävissä, ja B:ssä on esitetty "FSMERi-boprobe" -koettimella saadun Southern Blot -hybridisoinnin tulos.

Kohdassa A) esitetään

Signaali 1 HindIII:lla pilkottu lambda-DNA koko 15 standardina

Signaali 2 Pvul:lla pilkottu pSCll DNA Signaali 3 Pvul:lla pilkottu pSCll-P6 DNA Signaali 4 BamHI:lla pilkottu pSC22-P6 DNA Signaali 5 BamHI:lla pilkottu pSCll DNA

20 Signaali 6 BamHI:lla pilkottu pSCll-F41 DNA

Signaali 7 EcoRI:llä pilkottu pSCll-F41 DNA

Signaali 8 EcoRI:llä pilkottu pSCll DNA

Kohdassa B) esitetään hybridisoinnin jälkeen osoitetut FSME-sekvenssejä sisältävät fragmentit 25 2,585 ke signaalissa 3 0,919 ke signaalissa 4 1,019 ke signaalissa 6 1,879 ke signaalissa 7 Nämä fragmentit ovat odotettavissa kloonauksesta 30 (ks. kuvio 7). DNA signaaleissa 1, 2, 5 ja 8 ei hybridi-soidu, koska on kysymys vain lambda-DNA:sta tai puhtaasta pSCll plasmidi-DNA:sta.

Kuvio 10 esittää Slot Blot -hybridisaatiota FSME-Vaccinia -virusyhdistelmien osoittamiseksi. Infektoitumat- 12 102835 tomat solut, solut, jotka infektoitiin virusyhdistelmällä vSC8 (Dr. Moss) tai solut, jotka infektoitiin neljällä virusyhdistelmän P6 isolaatilla, siirrettiin nitrosellu-loosasuodattimille ja hybridisoitiin 32P-leimatun pSCll 5 DNA:n (nick-repair) kanssa A:ssa tai FSME-spesifisen "Ri-boprobe":n kanssa B:ssä. Solujen osalta, jotka eivät ole infektoituneet, ei havaita signaaleja. Yhdistelmävirus vSC8 hybridisoituu pSCll:n kanssa TK-sekvenssien vuoksi. FSME-spesifinen "Riboprobe" ei johtanut vSC8:lla kuiten-10 kaan odotusten mukaisesti positiiviseen signaaliin. Solut, jotka infektoitiin virusyhdistelmän P6 yksittäisillä iso-laateilla (1 - 4) osoittivat hybridisaatiota sekä "Riboprobe" :n kanssa (FSME-sekvenssin vuoksi) että pSCll DNA:n kanssa (TK-sekvenssin vuoksi).

15 Kuvio 11 esittää DNA-fragmenttimalleja, jotka saa tiin villistä viruksesta peräisin olevan virioni-DNA:n HindIII:lla pilkkomisen jälkeen tai Vaccinia-virus / FSME-yhdistelmistä. Tällöin tulee selväksi, että Hindlll J -fragmentti katoaa rekombinaatiotapahtuman vaikutuksesta 20 virusyhdistelmä-DNA:n pilkkoutumismalleista. Alkuperäinen

HindiII J -fragmentti, jonka suuruus on n. 5 ke, on nähtävissä vain agaroosigeelin signaalissa 6. Mitkään muut DNA-valmisteet eivät sisällä Hindlll J -fragmenttia.

. Signaali 1 BstEII:lla katkottu lambda-DNA pituus- 25 standardina

Signaali 2 FSME-yhdistelmän F41 DNA (insertioplas-midi pSCll-F4)

Signaali 3 FSME-yhdistelmän P6 DNA (insertioplas-midi pSCll-P6) 30 Signaali 4 virusyhdistelmän P1 DNA (insertioplas- midi pSCll)

Signaali 5 virusyhdistelmän vSC8 DNA

Signaali 6 villin tyypin lajin WR virioneista peräisin oleva DNA

▼· • « 13 102835

Kuvio 12 esittää FSME-spesifisten sekvenssien osoittamista virusyhdistelmien Hindlll DNA -fragmenteissa käyttäen hybridisaatiota 32P:llä leimatun FSME "Ribopro-be":n kanssa (A). Kontrolliksi hybridisoitiin sama suoda-5 tin toiseen kertaan 32P-(nick-repair):11a leimatun pSC22 plasmidi-DNA:n kanssa (B).

A) FSME-spesifinen "Riboprobe" hybridisoituu yksinomaan virusyhdistelmästä F41 peräisin olevan DNA:n kanssa signaaleissa 1, 2 ja 3 ja yhdistelmästä P6 peräisin olevan 10 DNA:n kanssa signaalissa 7. Hybridisaatiota ei ole osoitettavissa yhdistelmän P1 kanssa signaaleissa 4, 5 ja 6 eikä yhdistelmästä vSC8 peräisin olevan DNA:n kanssa signaalissa 8 ja infektoitumattomista soluista peräisin olevan DNA:n kanssa signaalissa 9.

15 B) Radioaktiivisella merkkiaineella leimattu pSCll DNA hybridisoituu kaikkien niiden DNA-valmisteiden kanssa, jotka voitiin osoittaa FSME-spesifisellä "Riboprobe":11a. Tämä on selitettävissä, koska pSCll DNA:ssa on rekombinaa-tioon välttämättömät Vaccinia-TK-sekvenssit. Tämä pSCll 20 plasmidi -DNA hybridisoituu sen vuoksi lisäksi myös yhdistelmän P1 DNA:n kanssa signaaleissa 4, 5 ja 6 sekä yhdistelmän vSC8 DNA:n kanssa signaalissa 8. Infektoitumattomista soluista peräisin oleva DNA ei hybridisoidu (signaali 9) .

25 Kuvio 13 esittää FSME-spesifisen proteiinin Western

Blot -analyysin Vero-soluista peräisin olevissa ekstrak-teissa, jotka infektoitiin virusyhdistelmällä P6. Proteiinit erotettiin 15-%:isella polyakryyliamidigeelillä ja valmistettiin standardimenetelmiä käyttäen Western Blotia 30 varten. Kontrolliksi inkuboitiin näistä infektoiduista soluista peräisin olevia proteiineja negatiivisen humaani-seerumin kanssa (signaalit 1 ja 3). Positiivisella humaa-niseerumilla, jossa on vasta-aineita FSME-virusta vastaan, voitiin osoittaa odotettavissa oleva FSMEspesifinen anti- • * „ 102835 geeni, jonka koko on n. 38 000, signaaleissa 2 ja 4. Signaalit 1 ja 3, jotka saatiin negatiivisella seerumilla, näyttävät olevan epäspesifisiä.

Esillä olevassa keksinnössä käyttökelpoinen DNA 5 valmistetaan ja sekvenssi määritetään käyttäen seuraavia yleisiä menetelmiä.

Ensin ekstrahoidaan viruksen RNA FSME-viruksen läntisestä alatyypistä tai FSME-viruksen läntisellä alatyypillä infektoiduista soluista. Käyttäen tätä RNA:ta mat-10 riisinä syntetisoidaan kaksisäikeinen cDNA, esimerkiksi käyttäen käänteiskopioijaentsyymiä. Käyttäen yhdistelmä-DNA-tekniikoita insertoidaan tämä cDNA vektori-DNA:hän, kuten Escherichia colin plasmidi-DNA:hän yhdistelmäplas-midin saamiseksi. Yhdistelmäplasmideja käytetään sopivien 15 isäntäsolujen, kuten esim. E. coli -laji HB101, transfor-moimiseksi, plasmidien monistamiseksi tai vastaavien proteiinien ilmentämiseksi. Yksittäiset pesäkkeet, joissa on inserttipitoisia plasmideja, identifioidaan Plasmid-Mini-Preparation -menetelmää käyttäen Birnboimin ja Dolyn muk-20 aan (Nucleic Acids Research 7, 1195 - 1204, 1979). Viruksen läntiselle alalajille spesifinen DNA:n emässekvenssi, joka on läsnä yhdistelmäplasmidissa, määritetään käyttäen nopeaa DNA-sekvensointimenetelmää, kuten dideoksi-ketjun-lopetusmenetelmää .

* 25 Yksityiskohtainen kuvaus cDNA:n, yhdistelmäplasmi- dien ja näillä plasmideilla transformoitujen solujen valmistusmenetelmästä ja nukleotidisekvenssin määrittämisestä on seuravanlainen: ensin voidaan FSME-viruksen läntisen alatyypin virus-RNA saada puhdistetusta viruksesta. Tähän 30 tarkoitukseen voidaan FSME-viruksen läntistä alatyyppiä viljellä kanan sikiön primaarisoluissa, konsentroida käyttäen ultrasentrifugointia ja puhdistaa käyttäen kahdesti toistettua sakkaroositiheysgradientti-sentrifugointia. Proteiinien hajottamisen jälkeen SDS:llä proteinaasi K:n • · 15 102835 ja RNAasi-inhibiittorin läsnä ollessa, esimerkiksi inku-boimalla tunnin ajan 37 °C:ssa, ekstrahoidaan RNA esimerkiksi fenolilla ja saostetaan etanolilla. Käyttäen tätä RNA:ta matriisina syntetisoidaan virus-RNA:lie komplemen-5 taarinen DNA sitten in vitro käyttäen käänteiskopioijaent-syymiä (esimerkiksi "Avian Myeloblastosis" -viruksesta peräisin olevaa) Gublerin ja Hofmännin menetelmän mukaan (Gene 25, 263 - 269, 1983). Käyttäen alukkeita, kuten hek-sanukleotidialukkeita, jotka on saatu vasikan kateenkorvan 10 DNA:sta, inkuboidaan viruksen RNA:ta sopivissa olosuhteissa, esimerkiksi sellaisissa kuin on kuvattu Amershamin (Englanti) käsikirjassa "cDNA Synthesis System", käänteiskopioi j aentsyymin kanssa ja käyttäen deoksiadenosiinitri-fosfaattia (dATP), deoksitymidiinitrifosfaattia (dTTP), 15 deoksiguanidiinitrifosfaattia (dGTP) ja deoksisytidiini-trifosfaattia (dCTP) substraatteina. Siten saatua cDNA.RNA-hybridiä käsitellään sitten RNAasi H:11a määrätyissä olosuhteissa, joissa hybridimolekyylin RNA:han muodostuu nikkejä. Sen jälkeen voidaan käyttää E. colin DNA-20 polymeraasi I: tä RNA-säikeen tehokkaaksi korvaamiseksi, jolloin nikattu RNA toimii alukkeena. Kaksisäikeinen, täten saatu DNA puhdistetaan proteiineista fenoli-klorofor-mi-ekstraktiota käyttäen, saostetaan etanolilla ja jäljelle jäävät RNA-fragmentit poistetaan käyttäen RNAasi käsit-25 telyä (esim. TE-puskurissa, 30 min 37 °C:ssa).

dsDNA:n kloonaus suoritetaan esimerkiksi käyttäen synteettisiä adaptoreita. Tätä tarkoitusta varten käsitellään dsDNA:ta E. colin DNApolymeraasi I:n Klenow-fragmentilla sopivissa olosuhteissa (Maniatis et ai. , Molecular 30 Cloning, CSH 1982) kloonaukseen soveltuvien tasaisten päiden maksimaalisen määrän varmistamiseksi käyttäen sen jälkeen fenoliekstraktiota proteiinien poistamiseksi. dsDNA, jossa on tasaisia päitä, fosforyloidaan 5'-päästä polynuk-leotidikinaasilla standardimenetelmän mukaisesti (Maniatis 1« 102835 et ai., Molecular Cloning, 1982). Fosforyloitua dsDNA:ta inkuboidaan sopivissa olosuhteissa BamHI-Smal -adaptorei-den kanssa DNA-ligaasin läsnä ollessa. Reaktioseos pannaan l-%:iselle agaroosigeelille, erotetaan ja erikokoiset 5 adaptoreihin sitoutuneet cDNA:t leikataan irti geelistä ja puhdistetaan, esimerkiksi käyttäen elektroeluutiota. Täten saatu DNA fosforyloidaan vielä kerran polynukleotidikinaa-silla edellä kuvatulla tavalla. Toisaalta hajotetaan vek-tori-DNA:na käytettävä plasmidi-DNA, esimerkiksi E. colin 10 plasmidin pBR322 DNA, restriktioendonukleaasilla BamHI ja defosforyloidaan käyttäen bakteerien alkaalista fosfataa-sia. Synteettistä dsDNA:ta, jossa on BamHI-adaptorit molemmissa päissä ja BamHI-pilkottua vektori-DNA:ta inkuboidaan sopivissa olosuhteissa komplementaaristen sekvenssien 15 hybridisaation mahdollistamiseksi molempien DNA-molekyy-lien päihin ja liitetään käyttäen T4-DNA -ligaasia. Yhdis-telmä-DNA -molekyyliä käytetään sitten kompetentin E. coli -kannan (esimerkiksi E. coli HB101) transformoimiseksi, kuten Maniatis et ai. ovat kuvanneet (Molecular Cloning 20 CSH, 1982) . Käytetty vektori-DNA sisältää kaksi geeniä, jotka saavat aikaan resistenssin ampisilliiniä tai tetrasykliiniä vastaan. Käytetyssä kloonausmenetelmässä hävitetään tetrasykliiniresistenssigeeni. Niiden yhdistelmien t valitsemiseksi, jotka todennäköisesti sisältävät virusspe- 25 sifisiä inserttejä, viljellään transformoituja bakteereja ampisilliinin läsnä ollessa ja analysoidaan sitten herkkyys tetrasykliinille. Plasmidit tetrasykliinille herkistä pesäkkeistä eristetään Plasmid-Mini-Preparation -menetelmää käyttäen (Birnboim ja Doly, Nucleic Acids Research 7, 30 1195 - 1204, 1979) ja inserttien koot analysoidaan res- triktioentsyymianalyysillä käyttäen Smal:tä ja saatujen fragmenttien erotusta l-%:isella agaroosigeelillä.

Näiden inserttien emässekvenssi määritettiin di-deoksi-ketjunlopetusmenetelmällä Sangerin et ai. mukaan • « 17 102835 (Prot. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463 - 5467, 1977).

Saatu sekvenssi tutkitaan homologioiden toteamiseksi muiden Flavi-virusten jo tunnettujen sekvenssien kanssa (Rice et ai., Science 229, 726 - 733, 1985; Dalgarno et ai., J.

5 Mol. Biol. 187, 309 - 323, 1986; Castle et ai., Virology 147, 227 - 236, 1985; Castle et ai., Virology 149, 10 - 26, 1986; Wengler et ai., Virology 147, 264 274, 1985;

Pletnev et ai., FEBS 3660 200, nro 2, 317 321, 1986) tietokoneohjelmien avulla tutkitun sekvenssin paikallistami-10 seksi genomisen RNA:n kokonaissekvenssissä. Kuvio l esittää FSME-virusgenomin läntisen alatyypin rakenteellisen alueen täydellisen nukleotidisekvenssin ja kuvio 3 vastaavan aminohapposekvenssin.

E:n ja M:n tarkat aminopäät määritetään N-terminaa-15 lisiä aminohapposekvenssianalyysejä käyttäen, esimerkiksi käyttäen manuaalista menetelmää, jonka Chang et ai. kuvaavat (FEBS Letters 93, 205 - 214, 1978). Tätä tarkoitusta varten eristetään E-proteiini, esimerkiksi käyttäen prepa-ratiivista SDS-PAGE:a, elektroeluoidaan geelistä ja suori-20 tetaan N-terminaalinen sekvenssianalyysi. Tuloksena oleva sekvenssi on Ser-Arg-Cys, täten on E:n aminopää täsmälleen samassa paikassa kuin muiden Flavi-virusten, ts. kaksi aminohappoa ennen ensimmäistä ja hyvin säilyvää kysteiini-ryhmää (kuvio 3).

25 Seuraavaa tapaa voidaan ehdottaa M-proteiinin ami- nopään määrittämiseksi. Puhdistettu virus solubilisoidaan ionittomalla detergentillä (esim. Triton X 100) ja proteiinikompleksit, jotka sisältävät E:n ja M:n, saadaan käyttäen tiheysgradienttisentrifugointia detergenttiä si-30 sältämättömässä sakkaroosigradientissa (Heinz ja Kunz J. Gen. Virol. 49, 125 - 132, 1980). Näiden proteiinikompleksien sekvenssianalyysi johtaa seuraavaan kaksoissekvens-siin:

Ser-Arg-Cys 35 Ser-Val-Leu is 102835 jolloin Ser-Arg-Cys vastaa E:n sekvenssiä ja Ser-Val-Leu M-proteiinin aminoterminaalista päätä. Nämä päät on merkitty-kuvioissa 1 ja 3 esitetyissä sekvensseissä.

Esillä olevan keksinnön puitteissa saadaan täten en-5 simmäisen kerran käyttöön FSME-virusgenomin läntisen alatyypin 5'- alueen nukleotidisekvenssi mukaan lukien sekvenssit, jotka koodittavat rakenneproteiineja, ja tämän seurauksena lisäksi näiden rakenneproteiinien aminohapposekvenssit.

Kuvion 1 emässekvenssi on edullinen esimerkki 10 DNA:sta, joka koodittaa polypeptidejä, joilla on FSME-viruk-sen läntisen alatyypin rakenneproteiinien ominaisuudet. Geneettisen koodin degeneraation seurauksena samaa aminohapposekvenssiä voivat koodittaa yhtälailla muut kuin kuviossa esitetyt emästripletit.

15 Tämän keksinnössä käyttökelpoisia ovat siten myös sekvenssit, jotka ovat muuntuneet mutaation, transposition ja degradaation johdosta, jotka yhtä hyvin koodittavat aminohapposekvenssiä, jolla vielä on rakenneproteiinien oleelliset antigeeniset ominaisuudet.

20 Sitä paitsi tämä keksintö ei koske ainoastaan täsmäl leen samaa aminohapposekvenssiä kuin se, joka on esitetty kuviossa 3, joka esittää vain FSME-viruksen läntisen alatyypin luonnollisen isolaation esimerkinomaista sekvenssiä. On , hyvin tunnettu tosiasia, että RNA-virusten genomit ovat alt-

V

25 tiina suuremmalle mutaatiotrekvenssille kuin ne, joita on löydetty DNA-viruksillä tai solujen geeneillä, RNA-polyme-raasien korkean virheasteen ja korjausmekanismin virheen seurauksena (Holland et ai., Science 215, 1577 - 1585, 1982; Reanney, Ann. Rev. Microbiol. 36, 47 - 73, 1982). Virukselle 30 ominaisista piirteistä riippumatta voivat nämä mutaatiot johtaa uuden virustyypin nopeaan kehittymiseen anti-geenisiirtymän seurauksena, kuten on laita influenssaviruksen ollessa kyseessä (Both et ai: "The Origin of Pandemic

Influenza Viruses", W.G. Laver (toim.), Elsevier, 1983).

35 Toisaalta voivat RNA-virukset olla stabiilimpia luonnolli-

• I

19 102835 sissa olosuhteissa suhteessa antigeenirakenteeseen, oletettavasti toiminnallisten pakotteiden seurauksena, jotka eivät salli laajoja rakenteellisia muutoksia antigeeniaktiivisissa proteiineissa. Yhtä hyvin täytyy tietty määrä variaatioita 5 ottaa huomioon ja tämä voidaan osoittaa käyttäen eri luonnollisten isolaattien sekvenssivertailua.

Tämä voidaan suorittaa esimerkiksi eri isolaattien RNA:n sekvensoinnin avulla käyttäen dideoksi-ketjunlopetus-menetelmää alukkeina synteettiset oligonukleotidit, jotka on 10 valmistettu kuviossa 1 esitetyn prototyyppi-isolaatin mukaan .

Tällaisten eri isolaattien E-proteiinia vastaavien nukleotidisekvenssien analyysi on tuonut ilmi eri nukleotidejä. Seuraavat nukleotidivaihdokset havaittiin luonnollisen 15 isolaatin (ZZ-9) RNA:ssa verrattaessa Neudörflin kanssa: • · 5 20 102835

Nukleotidin F S ME ZZ-9 Aminohapon paikka vaihdos 2375 A U Thr -- Ser

2347 U C

2323 AG

2317 AG

10

2281 CU

2266 U C

2263 AG

2021 C U

1876 CU

1868 A G Met — Vai 1773 C U Ala -- Vai 2Q 1668 A G Glu — Gly

1663 CU

1661 A G Asn--Aso

1660 CU

25

’ : 1 472 U C

1451 A G Ile -- Vai

1343 CU

30 1114 U C --

1111 U C

1090 C U

1048 U C

35 994 U C

2i 102835

Havaitut vaihdokset ovat FSME-viruksen luonnollisen variaatiotason ilmaus, joka ei johda uuteen serotyyppiin. Sekvenssihomologiat niiden Flavi-virusten välillä, jotka eivät kuulu samaan serokompleksiin, ovat 40 - 50 %, esimer-5 kiksi 44,4 %:n homologia YF- ja MVE-virusten välillä, ja 70 - 80 % saman Flavi-virusserokompleksin jäsenten välillä, ja esim. 77,1 %:n homologia WN- ja MVE-virusten välillä.

Vertailu kaukoidän alatyypin julkaistujen nukleoti-disekvenssien (Pletnev et ai., FEBS 3660 200, nro 2, 10 317-321, 1986) ja läntisen alatyypin nukleotidisekvenssien välillä osoitti noin 85 %:n homologiaa.

Kaikki sekvenssit, jotka osoittavat prototyyppisek-vensseihin verrattuna vähäisiä variaatioita, kuten ne, jotka esiintyvät FSME-viruksen läntisen alatyypin muissa luonnol-15 lisissä isolaateissa, sisältyvät tähän keksintöön. Sellaisia variaatioita voidaan sitä paitsi saada käyttäen nukleiinihapon in vitro -modifikaatiota. Keksinnössä käyttökelpoisia ovat täten kaikki sekvenssit, jotka ankarissa olosuhteissa hybridisoituvat, esimerkiksi vähintään 90 %:n nukleotidisek-20 venssihomologia ilmoitettujen sekvenssien tai sekvenssien osien kanssa, jotka edullisesti koodittavat proteiineja tai peptidejä, joilla on FSME-viruksen läntisen alatyypin raken-neproteiinien antigeenisten determinanttien oleelliset omi-, naisuudet.

v 25 Alan ammattimies osaa hyvin insertoida kuvatun DNA:n tai osia siitä soveltuviin vektoreihin ja käyttää yhdistel-mävektoreita sopivien solujen transformointiin, joko DNA:n monistusta varten tai vastaavien proteiinien ilmentymisen aikaansaamiseksi. Soveltuvat isännät, vektorit ja olosuhteet 30 näitä operaatioita varten ovat alan ammattimiehelle tuttuja.

On olemassa paljon julkaisuja, jotka kuvaavat vieraiden proteiinien synteesiä yhdistelmä- DNA -teknologiaa apuna käyttäen (yleiskatsauksen antaa esimerkiksi· "Maximizing Gene Expression", Reznikoff and Gold, toim., Butterworths, 1986; 35 Harris, Gen. Eng. 4, 127 - 183; Wetzel and Goeddel, The Pep- • « 22 102835 * tides 5, 1 - 64, 1983). Näitä menetelmiä apuna käyttäen voidaan kloonatusta DNA:sta koodattuja proteiineja ilmentää joko bakteereissa, hiivassa tai nisäkässoluissa. On edelleen tunnetun tekniikan mukaista käyttää sellaisia ilmentyneitä 5 proteiineja rokotusaineina immunisointitarkoituksiin (Valenzuela et ai., Nature 307, 178 - 180, 1984; McAleer et ai., Nature 307, 178 - 180, 1984) tai diagnostisina antigeeneinä.

Keksinnön mukaisesti käyttökelpoisia ovat täten kaikki kuvattujen sekvenssien sekvenssikombinaatiot, kuten esim. 10 geenit, jotka koodittavat muita proteiineja, tai sekvenssit, jotka auttavat osaltaan ilmentämistä, kuten esim. promoottorit, enhanserit (voimistajat), polyadenylointi- tai siImukointisignaalit.

Alan ammattimies tietää hyvin, että välttämättä ei 15 tarvitse käyttää koko luonnollista proteiinia diagnostisiin tarkoituksiin (Lerner, Nature 299, 592 - 596, 1982; Arnon, TIBS 11, 521 - 524, 1986). FSMEviruksen läntisen alatyypin E-proteiinin ollessa kyseessä osoitettiin esimerkiksi, että hemagglutinaatiota estäviä ja neutraloivia vasta-aineita 20 voidaan indusoida immunisoimalla 9 000 daltonin proteolyyt-tisellä fragmentilla, joka reagoi samoin polyklonaalisten immuuniseerumeiden kanssa, jotka on saatu immunisoimalla koko luonnollisella proteiinilla (Heinz et ai., J. Gen. Vi-: : rol. 65, 1921 - 1929, 1984). Muut proteolyyttiset fragmentit 25 voivat samoin soveltua diagnostisiin tarkoituksiin.

Proteiinit tai osia proteiineista, joita käytetään keksinnön mukaisesti diagnostisina aineina, voidaan valmistaa ei ainoastaan yhdistelmä-DNA -teknologioita käyttäen, kuten edellä on kuvattu, vaan annettu sekvenssi-informaatio 30 voi samoin olla perustana oligopeptidien kemialliselle syn-teesille. Tällä alueella on olemassa laaja kirjallisuus: syntetisoidut peptidit on valmistettu vastaten DNA-sekvens-sejä, jotka koodittavat monia eri proteiineja, ja näitä on käytetty moniin tarkoituksiin, kuten esim. molekyylibiologi-35 siin ja immunologisiin tutkimuksiin (Lerner et ai., Cell 23, 23 102835 309 310, 1981; Lerner, Nature 299, 592 - 596, 1982) tai rokotuksiin (Shinnick et al., Ann. Rev. Microbiol. 37, 425 -446, 1983; DiMarchi et al., Science 232, 639 - 641, 1986).

Niiden peptidien tai peptidiyhdistelmien valmistus ja käyt-5 tö, jotka vastaavat kyseessä olevassa keksinnössä ilmoitettuja sekvenssejä kuvaavat tekniikan tasoa.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.

Esimerkki 1 FSME-viruksen aikaansaaminen ja puhdistaminen 10 FSME-viruksen läntisellä alatyypillä infektoitujen vastasyntyneiden hiirien aivojen 10-%:ista suspensiota käytettiin kanan sikiön primaarisolujen monolayerviljelmien infektointiin, jotka pidettiin 15 mM HEPES:llä ja 15 mM EPPS:llä pH 7,6:een puskuroidussa minimal väliaineissa 15 (MEM). 40 tunnin inkubaation jälkeen 37 °C:ssa tehtiin päällä oleva liuos kirkkaaksi 4 °C:ssa kierrosnopeudella 10 000 g ja virus pelletoitiin käyttäen kolmen tunnin ult-rasentrifugointia 4 °C:ssa ja kierrosnopeudella 50 000 g. Virus suspendoitiin sitten uudelleen sopivaan tilavuuteen 20 TAN-puskuria (0,05 M trietanoliamiini, 0,1 M NaCl, pH 8,0) ja suoritettiin 110 minuutin Zonal(rate-Zonal)-sentrifugoin-ti 5 - 20-%:isessa sakkaroositiheysgradientissa kierrosnopeudella 170 000 g 4 °C:ssa. Viruspiikki paikallistettiin : skannaamalla gradientti 254 nm:ssä ja suoritettiin tasapai- 25 no-tiheysgradienttisentrifugointi 20 - 50-%:isessa (w/w) sakkaroosi-tiheysgradientissa 18 tuntia 4 °C:ssa ja kierros-nopeudella 150 000 g. Viruspiikki dialysoitiin TANpuskuria vastaan ylimääräisen sakkaroosin poistamiseksi.

Esimerkki 2 .! 30 Virus-RNA:n valmistaminen 100 μg puhdistettua virusta laimennettiin 400 μΙ-.ΆΆη proteinaasi K-reaktiopuskuria (10 mM Tris pH 7,8, 5 mM EDTA, 0,5 % w/v SDS). Proteinaasi K:ta lisättiin siten, että lop-pukonsentraatio oli 200 μg/ml ja seosta inkuboitiin yksi 35 tunti 37 °C:ssa. Sen jälkeen liuoksesta poistettiin prote- 24 102835 iinit ekstrahoimalla kaksi kertaa käyttäen samaa tilavuutta (400 μΐ) fenolia ja ekstrahoimalla kerran käyttäen kloroformi :isoamyylialkoholia (24:1). Sitten lisättiin 26 μΐ 3 M natriumasetaattiliuosta ja RNA saostettiin 2,5-kertaisella 5 tilavuudella etanolia. Ennen jatkokäyttöä denaturoitiin määräosa RNA:ta glyoksaalilla ja erotettiin l-%:isella aga-roosigeelillä valmisteen saannon ja laadun testaamiseksi.

Esimerkki 3

Kaksisäikeisen cDNA:n synteesi 10 5 μg etanolilla saostettua RNA:ta suspendoitiin uu delleen 40 μg:aan ensiluokkaista synteesipuskuria (Amersham, UK) , joka sisälsi 5 μg satunnaista "random"-oiigonukleoti-dialuketta, kuumennettiin minuutin ajan 70 °C:ssa ja annettiin jäähtyä hitaasti huoneen lämpötilaan. Kaikki neljä 15 deoksinukleotiditrifosfaattia lisättiin loppukonsentraatiok-si 1 mM. Edelleen lisättiin seokseen viisi yksikköä ihmisen istukan ribonukleaasi-inhibiittoria ja 10 uCi a-32P-dCTP:tä. Ensimmäisen säikeen synteesi aloitettiin lisäämällä 100 yksikköä käänteiskopioijaentsyymiä (Amersham) ja annettiin 20 reagoida kaksi tuntia 42 °C:ssa. Sitten reaktioseos pantiin jäihin ja lisättiin reagenssit kaksisäiesynteesiä varten seuraavassa järjestyksessä: 93,5 μΐ kaksisäiesynteesipusku-ria (Amersham, UK) , neljä yksikköä E. colin DNA-polymeraasia ; : ja vettä lopputilavuuteen 250 μΐ. Kaksisäiesynteesi suori- 25 tettiin toisiaan seuraavia inkubaatioita käyttäen 12 °C:ssa ja 22 °C:ssa (kulloinkin 2 tuntia) ja pysäytettiin kuumentamalla liuos 20 minuutin ajaksi 70 °C:seen. Kaksisäikeista cDNA:ta inkuboitiin 10 yksikön kanssa T4 DNA -polymeraasia 30 minuuttia 37 °C:ssa tasaisten päiden tuottamiseksi. Sen .! 30 jälkeen puhdistettiin cDNA käyttäen fenoli- ja klorofor- miekstraktioita ja saostettiin kahdella tilavuudella etanolia.

Esimerkki 4

Adaptoriligaatio 35 cDNA:ta käsiteltiin polynukleotidikinaasilla 2 mM:n 25 102835 ATP:tä läsnä ollessa (Maniatis et ai., Molecular Cloning, CSH 1982) sen varmistamiseksi, että kaikki 5'-päät olivat fosforyloituneita ja voitiin täten liittää. BamHI-Smal-adaptorit saatiin Pharmacialta. Näissä adaptoreissa on 5 5'-kohesiivinen, BamHI:n kanssa yhdistettävissä oleva ko- hesiivinen pää ja tasainen pää ja ne sisältävät täydellisen Smal-tunnistuspaikan sekvenssissään. Ensin oli vain tasaisessa päässä 5'-fosfaattiryhmä ja voitiin liittää, kun taas kohesiivinen pää oli defosforyloitunut. 5 μg tätä adaptoria 10 sekoitettiin cDNA:n kanssa 20 ^l:aan ligaatiopuskuria (50 mM Tris, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP) . Reaktiota katalysoitiin T4 DNA -ligaasilla (New England Biolabs) yli yön kestävässä reaktiossa 14 °C:ssa.

Esimerkki 5 15 cDNA:n erottaminen koon perusteella cDNA erotettiin l-%:isella, alhaisessa lämpötilassa sulavalla agaroosigeelillä. Eri kokoluokat leikattiin irti geelistä ja DNA ekstrahoitiin standardimenetelmän mukaisesti agaroosista kuumalla fenolilla. Huolimatta käsillä olevan 20 DNA:n vähäisestä määrästä, jota tuskin voitiin havaita eti-diumbromidivärjäyksellä, voitiin ekstraktiovaiheita seurata helposti cDNA:han inkorporoituneen radioaktiivisen leiman avulla. Erottamisvaihe koon perusteella mahdollisti suurten ; cDNA-fragmenttien selektiivisen kloonauksen ja palveli sen 25 lisäksi cDNA:n erottamista täydellisesti liittynättömistä adaptorimolekyyleistä.

Esimerkki 6

Kloonaus bakteeriplasmidiin cDNA:n eri kokoluokkien BamHI:n kanssa liitettävissä 30 olevat päät fosforyloitiin polynukleotidikinaasilla ja suoritettiin proteiinien poisto käyttäen fenoli- ja klorofor-miekstraktioita. Sitten saostettiin DNA kahdella tilavuudella etanolia ja suspendoitiin uudelleen pieneen tilavuuteen vettä. 20 - 30 ng cDNA:ta sekoitettiin 100 ng:n kanssa Es-35 cherichia colin plasmidia pBR322, joka oli linearisoitu 26 102835 käyttäen BamHI-hajotusta ja defosforyloitu itseligaation estämiseksi. Nämä molemmat komponentit liitettiin T4 DNA -ligaasilla 5 μΐ:ssa ligaatiopuskuria (ks. edellä) yön yli kestävässä reaktiossa 16 °C:ssa. Seuraavana päivänä laimen-5 nettiin ligaatioseos vedellä viisinkertaiseen tilavuuteen ja käytettiin sitten suoraan E. coli HB101 -solujen transfor-mointiin. Käyttökelpoisia bakteereita saatiin BRL:Itä (Maryland, USA) ja ne transformoitiin 5 ^l:lla laimennettua li-gaatioseosta käyttäen täsmälleen valmistajan antamia ohjei-10 ta. Tyypillisesti saatiin amplisilliinipitoisille agarle-vyille levittämisen jälkeen useita satoja transformoituja soluja.

Esimerkki 7

Insertin sisältävien plasmidien identifiointi 15 Yksittäiset ampisilliiniresistentit pesäkkeet levi tettiin tetrasykliinipitoisille agarlevyille. Noin 5 %:lla testatuista pesäkkeistä todettiin tetrasykliiniherkkyys. Nämä käytettiin siirrostamaan 2 ml ampisilliinipitoista LB-väliaineia ja inkuboitiin yli yön 37 °C:ssa ravistelijassa 20 kierrosnopeuden ollessa 220 rpm. Seuraavana päivänä suoritettiin plasmidipikavalmistus standardimenetelmän mukaisesti (Birnboim ja Doly, Nucleic Acid Research 7, 1195 - 1204, 1979). Plasmidit hajotettiin restriktioentsyymillä Smal ja : analysoitiin l-%:isella agaroosigeelillä (kuvio 4). Tällä 25 tavalla identifioitiin 21 plasmidia, jotka sisälsivät in-serttejä, joiden koko oli alueella 2 000 - 3 500 ep.

Esimerkki 8

Inserttien alkukarakterisointi

Insertin sisältävät plasmidit valmistettiin suuressa ,1 30 mittakaavassa standardimenetelmän mukaisesti (Maniatis et c ai., Molecular Cloning CSH, 1982) ja puhdistettiin etidium-bromiditiheysgradienttisentrifugointia käyttäen. Noin 500 ng plasmidi-DNA:ta hajotettiin joukolla restriktioentsyymejä ja analysoitiin l-%:isella agaroosigeelillä. Niin saatiin luon-35 teenomainen vyöhykemalli jokaiselle plasmidille, mikä mah- 27 1 0 2 8 3 5 dollisti ensimmäisen ennusteen siitä, mitkä insertit voivat sisältää yhteensopivia tai eri sekvenssialueita.

Esimerkki 9

Klooni A5:n insertin sekvenssianalyysi 5 Yksi insertin sisältävistä plasmideista, plasmidi A5:ksi nimitetty, hajotettiin Smalrllä ja erotettiin 0,7-%:isella agaroosigeelillä. Vyöhyke, joka käsittää koko insertin, leikattiin irti geelistä ja DNA puhdistettiin elektroeluutiota käyttäen agaroosista. Eristetty fragmentti 10 hajotettiin eri reaktioissa usein pilkkovilla restriktioent-syymeillä, jotka tuottavat tasaisia päitä, kuten esim. RsaI, AluI ja Haelll. Bakteriofagin M13mp8 kaksisäikeinen muoto hajotettiin Smal:llä ja defosforyloitiin. DNA-fragmenttien seoksista poistettiin proteiinit, saostettiin ja liitettiin 15 M13-vektorin kanssa, kuten edellä on kuvattu. Suoritettiin E. coli JM105 -solujen transformaatio, yhdistelmäfagien identifiointi värivalintamenetelmää käyttäen ja yksisäikei-sen DNA:n valmistus standardimenetelmien mukaisesti. Yksittäiset kloonit valittiin ja sekvensoitiin dideoksisekven-20 sointimenetelmän mukaisesti, kuten Sanger et ai. ovat kuvanneet (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 74, 5463 - 5467, 1977). Alukkeena käytettiin yleensä kaupallisesti saatavaa M13-yleisaluketta. Siten määritettiin sekvenssi suurelle : joukolle kloonin A5 fragmentteja, mikä lopulta johti tämän 25 kloonin kokonais-DNA-sekvenssiin. Vertaamalla tätä sekvenssiä eri Flavi-virusten julkaistuihin genomisekvensseihin, todettiin, että A5 sisältää sen genomin alueen, joka koodit-taa rakenneproteiineja C, M ja E, poikkeuksena C-proteiinin aminoterminaalinen puoli. A5:n tarkka lokalisaatio on esi-s; 30 tetty kuviossa 1.

Esimerkki 10 cDNA-synteesi käytettäessä FSME-virukselle spesifistä aluketta FSME-virukselle spesifistä aluketta käytettiin sel-35 laisen kloonin konstruoimiseksi, joka sisältää viruksen ge- 28 1 0 2 8 3 5 nomin koko 5'-alueen mukaan luettuna C-proteiinin koko sekvenssi-informaatio sekä suurimman osan translatoitumattomas-ta 51 -leader-alueesta. Tämä oligonukleotidialuke muodostui 14 nukleotidista, jotka ovat komplementaarisia sen FSME-ge-5 nomin alueen kanssa, joka koodittaa E-proteiinin C-terminaalisia aminohappoja. Viruksen RNA:n valmistus ja kaksisäikei-sen cDNA:n synteesi suoritettiin pääasiallisesti, kuten edellä on kuvattu, sillä poikkeuksella, että tällä kertaa •käytettiin vain 1 μg RNA:ta ja 0,5 /xg synteettistä oligonuk-10 leotidialuketta. Sen jälkeen vähennettiin kaksisäiesynteesin ja T4 DNA -polymeraasikäsittelyn inkubaatioajat yhteen tuntiin taikolmeen minuuttiin.

Esimerkki 11

Kloonaus Blue Script -vektoriin käytettäessä 15 EcoRI-linkkereitä Lähtien tutkimuksen tässä vaiheessa saatavilla olevasta informaatiosta voitiin olettaa, että koko rakenteellinen alue ei sisällä EcoRI-tunnistuskohtaa. Täten voitiin käyttää synteettisiä EcoRI-linkkereitä (New England Biolabs) 20 kloonausmenetelmään. Noin 1 μg cDNA:ta liitettiin 1 μg:n kanssa linkkeri-DNA:ta kuusi tuntia 14 °C:ssa käyttäen T4 DNA-ligaasia ja puskurisysteemiä, kuten edellä on kuvattu. Seoksen puhdistuksen jälkeen fenoli- ja kloroformiekstra-’ : hointeja käyttäen ja etanolisaostuksen jälkeen suspendoitiin 25 DNA uudelleen 40 μ1:ΆΆη "väliaine sait" -restriktioentsyymi-puskuria (CSH-käsikirja) ja hajotettiin kolme tuntia käyttäen ylimäärin EcoRIrtä (80 yksikköä) 37 °C:ssa. Sen jälkeen erotettiin seos l-%:isella agaroosigeelillä ja cDNA kokoalu-eilla 1 500 - 2 500 ep saatiin geelistä jälleen elektroeluu-.! 30 tiota käyttäen.

Samanaikaisesti pilkottiin uusi monikäyttövektori Bluescript KS M13+ (Stratagene) EcoRI:llä. 100 ng tätä li-nearisoitua plasmidia sekoitettiin koko cDNA-valmisteen kanssa ja DNA:t kerasaostettiin etanolilla. PlasmidicDNA:n 35 ligaatio suoritettiin, kuten edellä on kuvattu. Ligaatio- 29 102835 seokset laimennettiin asteittain kaksinkertaisista satakertaisiksi ja käytettiin E. coli XL-1 bluen transformoinein. Insertin sisältävien plasmidien transformaatio ja identifiointi suoritettiin käyttäen värivalintaa täsmälleen valmis-5 tajan ohjeiden mukaisesti (Stratagene). Siten saatiin neljä plasmidia, jotka sisälsivät inserttejä, joiden pituus oli likimain 2 500 ep.

Esimerkki 12

Kloonin Pl-1 sekvenssin määritys 10 Plasmidi Pl-l:ksi nimitettyä, insertin sisältävää plasmidia käytettiin yksisäikeisen matriisi-DNA:n valmistamiseksi. Tämä suoritettiin käyttäen auttajafagin R408 liittämistä eksponentiaalisesti kasvavaan, plasmidin Pl-1 sisältävään bakteeriviljelmään M.O.I:ssä 20:1. 8-tuntisen inku-15 baation jälkeen 37 °C:ssa ravistelijassa kierrosnopeupeuden ollessa 240 kierrosta/min kerättiin fagipartikkeleita sisältävä supernatantti ja valmistettiin yksisäikeistä Pl-1-DNA:ta standardimenetelmää käyttäen. Poiketen klassisesta M13-systeemistä Bluescriptsysteemi sallii sellaisen yk-20 sisäikeisen matriisi-DNA:n valmistamisen, joka sisältää koko cDNA-sekvenssin ja tekee siten aikaavievän alakloonaus-menetelmän tarpeettomaksi. Pl-1:n sekvenssin määritys suoritettiin standardideoksimenetelmällä käyttäen alukkeina sekä ’: yleis-M13- ja synteettistä oligonukleotidialuketta, jotka 25 vastaavat viruksen eri sekvenssejä. Siten havaittiin, että Pl-1 kattaa koko rakenneproteiineja koodittavan alueen ja ulottuu 120 ep yli C-proteiinin aloituskodonin. Pl-l:n tarkka sijainti on esitetty samoin kuviossa 1.

Esimerkki 13 30 Eri luonnollisten isolaattien sekvenssin määritys käyttäen RNA:n suoraa sekvensointia FSME-viruksen läntisen alatyypin eri luonnollisten isolaattien rakenneproteiineja koodattavat sekvenssit määritettiin käyttäen genomisen RNA:n suoraa sekvensointia San-35 gerin dideoksimenetelmän modifikaatiolla, jonka pääosiltaan 30 102835 kuvasivat Zimmer ja Kaesberg (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 75, 4257 - 4261, 1978). Eri synteettisiä oligonukleotidejä, jotka vastaavat genomin eri kohtia, käytettiin alukkeina. Likimain 1 μg genomista RNA:ta ja 0,5 μg kulloistakin alu-5 kettä sekoitettiin 10 μ1:η tilavuuteen, kuumennettiin kolme minuuttia 65 °C:ssa ja jäähdytettiin sitten hitaasti 42 °C:seen. Sekvensointireaktioita katalysoitiin käyttäen kään-teiskopioijaentsyymiä (Amersham) 15 minuuttia 42 °C:ssa. Kontrollina sekvensoitiin samanaikaisesti FSME-viruksen pro-10 totyyppi Neudörfl ja analysoitiin samalla polyakryyliamidi-geelillä. Tämä mahdollisti yksinkertaisen ja varman eri luonnollisten isolaattien sekvenssivaihteluiden identifioinnin. Sekvenssipoikkeamat löydettiin paikoista, jotka on kuvattu selityksen yleisessä osassa.

15 Esimerkki 14

Viruksen proteiinien aminoterminaalinen sekvenssi- analyysi 1 mg:lie puhdistettua FSME-viruksen.läntistä alatyyppiä suoritettiin SDS-PAGE Laemmlin ja Favren mukaan (J. Mol. 20 Biol. 80, 575 - 599, 1973) 10-%:isillä akryyliamidigeeleil-lä. E-proteiini paikallistettiin värjäämällä geelin suoda-tinpaperi-blot amidomustalla, proteiini leikattiin irti geelistä ja elektroeluoitiin käyttäen ISCOeluointilaitetta vii-si tuntia 3 W:n teholla. N-terminaalinen sekvenssianalyysi 25 suoritettiin Changin et ai. kuvaaman menetelmän mukaisesti (FEBS Letters 93, 205 - 214, 1978). Saatu sekvenssi oli

Ser-Arg-Cys ja mahdollisti täten E-proteiinin täsmällisen paikan määrittämisen kuviossa 3 esitetyssä sekvenssissä.

Vaihtoehtoisesti valmistettiin proteiinikomplekseja, 30 jotka sisälsivät sekä E-.n että M:n, solubilisoimalla länti- » sen alatyypin puhdistettuja FSME-viruksia Triton X 100:11a, mitä seurasi tiheysgradienttisentrifugointi detergentittö-mässä tiheysgradientissa, kuten Heinz ja Kunz ovat kuvanneet (J. Gen. Virol. 49, 125 - 132, 1980). Kuten odotettua, antoi _ _ _ 31 102835 aminoterminaalinen sekvenssianalyysi tulokseksi kaksoisse-kvenssin ja vieläpä

Ser-Arg-Cys 5 Ser-Val-Leu

Koska tiedettiin jo, että Ser-Arg-Cys oli peräisin E-proteiinista, identifioitiin sekvenssi Ser-Val-Leu siten M:n aminopääksi (kuvio 3).

10 Esimerkki 15

Homologista rekombinaatiota käyttäen Vaccinia Hindlll J -fragmentissa FSME-viruksen kloonatun cDNA:n5'pään sekvenssien kloonauksen kautta saatuja vieraita geenejä sisältävien insertioplasmidien valmistaminen 15 Kuviossa 5 on esitetty plasmidi A5, joka valmistet tiin alan ammattimiehen tuntemalla tavalla pBR322:stajohdettuna plasmidina. Kuten kuviossa 5 on esitetty, sisältää plasmidi A5 sen DNA-sekvenssin, joka koodittaa FSME-viruksen E-proteiinia. Kuviossa 5 on edelleen esitetty valittujen 20 alafragmenttien restriktioendonukleaasikatkaisukohdat, jolloin FSME-proteiinia E koodittavat alueet on kuvattu. Tran-skriptiosuunta genomisessa RNA:ssa on kuvattu nuolella.

Muu virus- ja plasmidimateriaali sekä menetelmät, : joita käytettiin niiden plasmidien valmistamiseksi, jotka 25 sisältävät E-proteiinia koodittavia konkreettisia DNA-osa-pätkiä, kuvataan seuraavassa: 15.1. Virus- ia soluviljelmä

Vaccinia-viruksen villin tyypin laji WR on mahdollista saada talletuslaitoksesta ATCC talletusnumerolla VR-119. 30 Ihmisen TK-143-soluja, jotka eivät tuota tymidiinikinaasia, on yleisesti saatavissa ja talletettuna Pasteur-instituutis-sa (talletusnumero 1-732). Vaccinia-virusten annetaan lisääntyä Vero-soluissa noin 47 - 55 syklin välillä. Soluja viljellään MEM:ssä (minimal essential väliaine), jossa on 32 102835 * 5 % FCS:ää (fetal calf serum), antibioottia ja glutamiinia. Sen viruslajin, jota on määrä käyttää rekombinaatioon, annetaan kasvaa kerran HAT (hypoksantiini, aminopteriini, tyrni-diini) -alustassa, joka sisältää 5 % FCSrää, TK+ villin tyy-5 pin viruksen valikoimiseksi. Yhdistelmä-TK -virus määritetään ihmisen TK~-143-soluilla, jotka ovat kasvaneet MEM:ssä, jossa on 5 % FCS ja joka sisältää 25 μg/ml BUdR. Yhdistelmät voidaan havaita päällystämällä solu-monolayer alhaisen sulamispisteen omaavalla agaroosilla, joka sisältää MEM, 5 % 10 FCS, 25 μg/ml BUdR sekä 250 μg/ml X-gali. Soluviljelmää pidetään 48 - 72 tuntia inkubaattorissa 37 °C:ssa. Spontaanien TK -virusmutanttien määrä määritetään infektoimalla TK~-solu-monolayer 25 μg/ml BUdR läsnä ollessa tai ilman sitä. Tavallisesti voidaan 104 viruksen joukosta löytää yksi mutantti 15 (Mackett et ai: "DNA cloning Voi. II, a practical approach", IRL Press, D.M. Glover (ed.), 1985).

15.2. Plasmidit ia kloonausmenetelmät

Plasmidilla A5, joka on pBR322:sta johdettu plasmidi, joka on esitetty kuviossa 5, on esitetty restriktioendonuk-20 leaasikartta.

Kuviossa 6 on esitetty plasmidi pSCll, joka sisältää E. colin lac Z geenin "siniväri"-määritystä varten, TK -suo-jaavat sekvenssit ja Vaccinia-promoottorin. Plasmidi pSCll on tunnettu ja yleisesti saatavissa, erityisesti kuitenkin 25 National Institute of Health:stä.

Kaikkia restriktioendonukleaaseja, joita käytettiin DNA:n modifiointiin, käytettiin valmistajan käyttöohjeiden mukaisesti. Southern Blot -analyysi ja plasmidi-DNA:n eristäminen suoritettiin standardimenetelmän mukaisesti (Mani-30 atis et ai. , Molecular Cloning, CSH, 1982).

Radioaktiivisella leimalla leimatut näytteet saatiin joko "nick-repair"-menetelmää tai pSP6-"Riboprobe"menetelmää käyttäen (Green et ai., Cell 32, 681 - 694, 1983).

"Riboprobe"-koetin, jota käytettiin esillä olevassa 33 102835 keksinnössä, valmistettiin liittämällä noin 1,0 ke:n sisäinen FSME-nukleotidisekvenssi plasmidiin pSP64. Ennen kuin RNA-synteesi initioitiin, linearisoitiin plasmidi EcoRI:llä. Tyypillinen analyysi oli:

5 Tris-HCl 7,5 40 mM

MgCl2 6 mM

Spermidiini 2 mM

NaCl 20 mM

DTT 10 mM

10 ATP, CTP, GTP kutakin 0,5 mM

ihmisen istukan RNAasi-inhibiittoria 20 U

pSP64-P5 X EcoRI 2 μg a32P-UTP 400 Ci/mmol 100 uCi

SP6 RNA -polymeraasi 4 U

15 Kokonaistilavuus 20 μΐ

Inkubaatio l tunti 40 °C:ssa

Nukleotidit, jotka eivät liittyneet, erotettiin radioaktiivisella leimalla leimatusta cRNA:sta käyttäen pylväs-kromatografiaa.

20 15.3. In vivo rekombinaatioanalwsi

Infektio ja transfektio:

Rekombinaatiot suoritettiin pääasiassa kuten Mackett et ai. (ks. 15.1.) ovat kuvanneet. Ihmisten TK”-solujen • ; ohella voitiin käyttää isäntäsoluina myös Vero-soluja tai 25 kanan sikiön fibroblastisoluja. Noin 1-3 tuntia ennen transfektiota infektoitiin solut infektiokertoimella (m.o.i.) 0,01 - 0,05 pfu/solu villillä WR-lajilla. HEPES-- puskuroitu suolaliuos DNA:n transfektiota varten valmistettiin seuraavasti: 10 x HBS, sisältäen 8,18 % NaCl (w/v) ; 30 5,94 % HEPES (w/v) sekä 0,2 % Na2HP04 (w/v) laimennettiin 2 x HBS ennen käyttöä. pH-arvo säädettiin 1 N NaOH:lla täsmälleen 7,05:een. Puskuri laimennettiin 1 x HBS ja steriloitiin suodattamalla. 1 ml:aan tätä 1 x HBS lisättiin liuos, jossa oli 1 - 5 ^g plasmidi-DNA:ta ja 10 - 20 /ug kantaja-DNA:ta 34 102835 (joko Vaccinia-viruksen villiä tyyppiä tai lohen sperman DNA:ta). Erityisesti kantaja-DNA:n lisääminen näytti olevan oleellista. Kuvattua seosta sekoitettiin perusteellisesti yhden minuutin ajan Vortex- sekoittajalla. Sen jälkeen li-5 sättlin hitaasti 2 M CaCl2- liuosta, kunnes loppukonsentraa-tio oli 0,125 M. DNA-saostuma tuli 25 °C:ssa näkyviin 20 -30 minuutin kuluttua. Väliaine erotettiin infektoituneilta soluilta, monolayer pestiin kerran soluviljelyväliaineella ja jäljelle jäänyt liuos poistettiin täysin, minkä jälkeen 10 lisättiin hitaasti DNA-saostuma. 30 minuuttia myöhemmin lisättiin 25 °C:ssa tuoretta väliainetta ja soluja inkuboitiin 37 °C:ssa. 3-4 tunnin kuluttua poistettiin väliaine jälleen ja vaihdettiin tuoreeseen soluviljelyväliaine. Solut kerättiin tavallisesti 24 tai 48 tunnin kuluttua raaputta-15 maila, sedimentoitiin alhaisella kierrosnopeudella ja solu-pelletti kerättiin väliaineeseen kokonaistilavuuden ollessa 500 μΐ.

Yhdistelmävirusten plakkianalvysi ia puhdistus Virussuspensio jäädytettiin ja sulatettiin jälleen 20 kolme kertaa; 60 μΐ suspensiota inkuboitiin 1/5 tilavuuden kanssa l,25-%:ista trypsiiniä 30 minuuttia 37 °C:ssa. Kolmen laimennoksen sarja (1:10) lisättiin yhtenäiselle TK -143so-lu-monolayerille, joka oli kasvanut 10 cm2:n levyillä. 30 -" 60 minuuttisen inkuboinnin jälkeen 37 °C:ssa poistettiin 25 väliaine, lisättiin sitten 3 ml väliainetta, joka sisälsi 25 μΐ/ml bromideoksiuridiinia. 24 tai 48 tunnin kuluttua 37 °C:ssa poistettiin väliaine jälleen ja korvattiin agaroosi-kerroksella, joka sisälsi 25 μg/ml bromideoksiuridiinia ja 125 μ9/τη1 X-galia. 24 - 48 tunnin lisäinkubaation jälkeen 30 voitiin havaita sinisiä plakkeja. Yksittäisiä plakkeja irrotettiin ja suspendoitiin 500 μl:aaΏ. väliainetta. Tätä virus-pitoista suspensiosta käsiteltiin trypsiinillä, kuten edellä on kuvattu. Plakkien puhdistus suoritettiin vähintään kaksi kertaa.

35 102835 15.4. Villin tyypin ia vhdistelmä-Vaccinia-DNA:n valmistus ia karakterisointi 175 cm2:n pulloista raaputettiin infektoituja soluja ja pestiin kaksi kertaa PBS-Ca2+/Mg2+: 11a pH-arvossa 7,4.

5 Sentrifugoinnin jälkeen solut suspendoitiin uudelleen 250 μΐ-.aan PBS. Lisättiin 250 μ1:η tilavuus 2 x solulyysipusku-ria (1 % Triton X 100; 70 mM β-merkaptoetanolia; 40 mM EDTA) ja soluja hajotettiin viisi minuuttia jäissä. Ytimet erotettiin sytoplasmasta yhden minuutin aikana kierrosnopeudella 10 16 000 x g. Päällä oleva liuos, joka sisälsi aggregoituneita viruspartikkeleita, siirrettiin uuteen putkeen ja sentrifu-goitiin 30 minuuttia kierrosnopeudella 16 000 x g viruksen pelletoimiseksi. Sitten lisättiin pellettiin viruslyysipus-kuria (10 mM Tris-HCl pH 8; 1 mM EDTA; 5 mM β-merkaptoeta-15 noli; 200 mM NaCl; 1 % SDS; 150 μg/ml proteinaasi K:ta) 100 μ1:η määrä ja inkuboitiin 30 minuuttia 56 °C:ssa. Nukleiinihapot ekstrahoitiin sitten 3 x Tris- HClrllä kyllästetyllä fenolilla, ekstrahoitiin sitten uudelleen kloroformi:-isoamyylialkoholilla (24:1). Pidettiin huoli siitä, että DNA 20 ei joutunut alttiiksi leikkaaville voimille. Nukleiinihappoa saostettiin 0,1 M NaCl:llä ja 2,5-kertaisella tilavuudella etanolia -20 °C:ssa yli yön. Noin 10 - 20 μg DNA:ta voitiin eristää 10 solusta. Sentrifugoinnin jälkeen (30 min 17 000 x ; g) liuotettiin DNA pieneen 20 - 40 μ1:η tilavuuteen H20:ta.

25 DNA katkottiin restriktioendonukleaasilla HindiII ja fragmentit erotettiin 0,6-%:isella agaroosigeelillä TA-puskuris-sa (Rice et ai., J. Virol. 56, 227 - 239, 1985).

15.5. Nukleiinihappojen havaitseminen hybridisointia käyttäen 30 Southern Blot DNA:n siirtämisen jälkeen geeliltä (30', 0,5 N NaOH ja 2 x 10', 10 x SSC/0,5 M Tris-HCl pH 7,5) nitroselluloo-sasuodattimille pidettiin niitä 80 °C:ssa neljän tunnin ajan. Suodattimia esihybridisoitiin kuusi tuntia 65 °C:ssa • · 36 102835 5 x Denhardt-liuoksessa (1 x Denhardt = 0,02- %:inen Ficoll, 0,02-%:inen polyvinyylipyrrolidoni, 0,02-%:inen BSA). Märät suodattimet suljettiin muovipusseihin ja inkuboitiin hybri-disaatioliuoksen sekä radioaktiivisen koettimen kanssa 18 5 tuntia 43 °C:ssa. Suodattimia pestiin 65 °C:ssa kolme kertaa kulloinkin 30' kulloinkin 2 x SSC:llä, 1 x SSCrllä ja 0,1 x SSCrllä, jossa oli 0,1 % SDS ja 20 mM NaP04. Suodattimien ilmakuivatuksen jälkeen nämä pantiin Kodakin X-omat AR -röntgenfilmeille.

10 "Riboprobe"-vektoria (pSP6), joka sisälsi FSME-frag- mentin kuviossa 5 esitetystä plasmidi A5:stä, käytettiin FSME-virukselle spesifisen "Riboproben" valmistamiseksi. Radioaktiivisella merkkiaineella leimattu cRNA sekoitettiin hybridisointiliuoksen kanssa (50-%:inen formamidi, Amberli-15 telia puhdistettu; 5 x SSC, 1 x Denhardtliuos, 0,l-%:inen SDS; 100 /xg/ml sillin sperman DNA:ta) . Hybridisointiliuoksen kokonaistilavuus määritettiin, koska 50 μΐ 100 ^l:lle/cm2-suodattiraet oli tarpeen optimaalisille hybridisointiolosuh-teille. Radioaktiivisen cDNA:n määrä oli noin 10 cpm/ml 20 tai noin 10 cpm/cm suodatinta. Liuosta kuumennettiin 5' 65 °C:ssa.

Spot Blot Nämä kokeet suoritettiin Mackettin et ai. mukaan (ks.

*: 15.1.) vähäisin muunnoksin. Käytettiin materiaali noin 1/4 25 eristetyistä plakeista 35 mm:n Petri-maljan infektoimiseksi. 48 tunnin infektion jälkeen kerättiin solut ja pestiin puskurissa, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl pH 7,5 ja 100 mM NaCl. Lopuksi solut suspendoitiin uudelleen 500 μΐ-.aan tätä puskuria. 100 μ1·.η eriä imettiin vakuumilla nitroselluloosalle. 30 Kuivauksen jälkeen pantiin suodattimet, joita oli pehmennetty 3' ajan 0,5 N NaOH:lla, kromatografiapaperille. Sen jälkeen neutraloitiin paperisuodattimilla olevat suodattimet, jotka oli upotettu 2 x SSC/l M Tris-HCl:ään, pH 7,5, kulloinkin 3' ajaksi. Suodattimia kuumennettiin sitten vähin- 37 102835 tään kaksi tuntia ja käsiteltiin jatkossa siten kuin edellä on esitetty Southern Blot -hybridisoinnin yhteydessä.

15.6. Proteiinianalyysi

Vero-solut tai KT -143-solut infektoitiin m.o.i:llä 1 5 pfu/solu kokonaistilavuuden ollessa noin 1 - 2 ml / 25 cm2-pullo. Muutamissa kokeissa leimattiin solut 100 μ0ί:1^ 35S-metioniinia/ml. Kun CPE oli voimakas, kerättiin solut, pestiin kaksi kertaa PBS:ssä ja suspendoitiin lopuksi 100 μl:aan RIPA-puskuria (150 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl pH 7,2; 10 l-%:inen natriumdeoksikolaatti; l-%:inen Triton X 100; 0,1 % SDS; 100 /xg/ml PMSF) (50 150 μΐ 5 x 105 - 1,5 x 106 solulle) 10 minuutin jäissä pitämisen jälkeen näytteitä sonikoitiin 20 sekuntia. 8 μΐ-.aan tätä proteiiniseosta lisättiin 12 μΐ 2 x keittopuskuria (0,2 M DDT; 4-%:inen SDS; 0,16 M Tris-HCl 15 pH 6,8; 20-%:inen glyseriini; 1/1 000 tilavuusosaa 5-%:ista BPBrtä etanolissa); proteiineja denaturoitiin 10 minuutin ajan 100 °C:ssa ja suoritettiin elektroforeesi 15-%:isella SDS-polyakryyliamidigeelillä (Bodemer et ai., Virology 103, 340 - 349, 1980). Proteiinit siirrettiin geeliltä nitrosel-20 luloosasuodattimille puskurissa, joka sisälsi 0,192 M gly-siiniä, 0,025 M Tris:ä pH 8,3 ja 20 % metanolia, virranvoi-makkuuden ollessa noin 1,5 A 2,5 tunnin ajan. Nit-roselluloosasuodattimia inkuboitiin sitten "blokkaus"-liuoksi sessa "MET" (0,15 M NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 7,4, 25 0,05-%:inen Triton X 100, 2-%:inen BSA). Ihmisen seerumia ja toinen, ihmisen immunoglobuliineja vastaan suunnattu vasta-aine lisättiin NET:iin laimennoksena 1:500 ja inkuboitiin kulloinkin kaksi tuntia. Suikaleita pestiin sitten NET:llä 3 x 10 minuuttia ja pehmennettiin sitten TBS:llä (20 mM Tris 30 pH 7,5, 0,9-%:inen NaCl, 2-%:inen BSA) 3 x 10 minuutin ajan. Vyöhykkeet kehitettiin 50 ml:ssa TBS ja kromogeenistä substraattia DAB ja H202 : ta .

15.7. Insertioplasmidien valmistus

Edellä kuvattujen materiaalien ja menetelmien avulla 38 102835 valmistettiin nyt plasmideja, jotka sisältävät E-proteiinin DNA-sekvenssit. Ensin hajotettiin plasmidi A5 (kuvio 5) restriktioendonukleaaseilla PvuII, FnuDII ja Haell. Fragmentit insertoitiin plasmidin pSCll (kuvio 6) ainoaan Smal--5 paikkaan. Kolme FSME-fragmenttia eristettiin agaroosigee-leistä elektroeluutiota käyttäen ja liitettiin plasmidiin pSCll, jolloin viimeksi mainittu linearisoitui samoin ainoaan Smal-paikkaan. Näiden plasmidien fysikaalinen kartta on esitetty kuviossa 7. Kolme fragmenttia ovat 1 022 ep:n (Pvu-10 II), 1 485 ep:n (FnuDII) ja 1 553 ep:n (Haell) suuruisia. Mainittuja kolmea restriktioendonukleaasia käytettiin, koska nukleotidisekvenssi, joka koodittaa E-proteiinin sisäosaa sekä hydrofobisen signaalin tai membraaniankkurisekvenssin kanssa että myös ilman niitä, oli löydetty käyttäen hydropa-15 tiaplotia suoritettuna IBI Pustell -tietokoneohjelmaa käyttäen (kuvio 8) . Insertoitujen proteiini E:n sekvenssien orientoituminen määritettiin käyttäen Southern Blot -analyysiä ottaen huomioon 7,5 E/l Vaccinia-promoottori. pSCll-plasmidin pilkkominen PvuII:11a tai BamHIrllä tuotti 20 selvästi 2,585 ke:n tai 0,919 ke:n fragmentit (kuvio 9A rivit 3 ja 4) , jotka kulloinkin hybridisoituivat P-leimatun "Riboprobe"-koettimen kanssa (kuvio 9B, rivit 3 ja 4) . Plasmidi pSCll-F41 voitiin pilkkoa BamHI:llä tai EcoRI:llä frag-·; menteiksi; 1,019 ke:n tai 1,879 ke-.n fragmentit hybri- 25 disoituivat kulloinkin yksinomaan "Riboprobe"-koettimen kanssa (kuvio 9B, rivit 6 ja 7) .

15.8. In vivo rekombinaatio FSME-insertioplasmi dien ia Vaccinia-viruksen villin tyypin kanssa Vero-solu-monolayer, joka oli infektoitu Vaccinia- I . 30 lajilla WR, transfektoitiin plasmidi-DNA:11a. 48 - 72 tunnin kuluttua ilmeni voimakas sytopatogeeninen vaikutus ja solut kerättiin. Virus vapautettiin soluista käyttäen toistettua jäädyttämistä ja sulatusta sekä trypsiinikäsittelyä, kuten on kuvattu. Sitten infektoitiin TK -solu-monolayer tällä 39

--1. A

102835 virussuspensiolla. Solut kasvoivat ilman BUdR:ää. Kehittyvät plakit tehtiin näkyviksi kromogeenisen substraatin, X-galin sisältävän agaroosikerroksen alla. Viruslaimennokset suoritettiin siten, että saatiin tulokseksi 10 - 30 plakkia 35 5 mm:n levyä kohti. Yksittäiset siniset plakit leikattiin irti ja käytettiin TK -solujen edelleen infektoimiseen tarkoituksena infektiovalinnan jatkopuhdistus tai Vero-solujen infektointiin viruksen makromolekyylien analyysiä varten.

15.9. Snot Blot -analyysi yhdistelmävirusten loy- 10 tämiseksi

Otettiin pieniä näytteitä (noin 100 μΐ) infektoitua solu-monolayeria 35 mm:n levyiltä tai 25 cm2:n viljely-pulloista ja hybridisoitiin "nick-repair"-leimatun pSCll-plasmidin kanssa (joka ei sisältänyt FSME-sekvenssejä) 15 tai FSME-"Riboproben" kanssa (kuvio 10). Valeinfektoidut solut eivät antaneet signaalia kummankaan koettimen kanssa.

Virus pSC8, joka sisälsi lac Z -geenin ja TK-Vaccinia-sek-venssejä, ei kuitenkaan FSME-sekveenssejä, antoi FSME-"Riboproben" kanssa negatiivisen tuloksen. Kaikki solut, joissa 20 oli viruksia neljästä eri yksittäisestä plakki-isolaatista, olivat kuitenkin, kuten odotettua, positiivisia FSME- ja pSCll-koettimen kanssa.

15.10. Yhdistelmävirusten DNA:n analyysi ·: Vero-solu-monolayer infektoitiin m.o.i -arvolla 1 - 25 10 pfu/solu plakkipuhdistettuja, lisättyjä Vacciniayhdistel- miä. Virus-DNA eristettiin viruspartikkeleista, jotka oli vapautettu infektoiduista soluista, ja analysoitiin käyttäen restriktioendonukleaasihajotusta sekä Southern Blot -hybridisaatiota. Villin tyypin DNA:n 5 ke:n HindiII J -fragmentti . 30 (kuten on esitetty kuviossa il rivillä 6) korvattiin suurem malla Hindlll-fragmentilla, joka muodostui alkuperäisestä Hindlll J-fragmentista ja niistä DNA-sekvensseistä, jotka oli insertoitu TK-geenilokukseen käyttäen in vivo -rekom-binaatiota. vSC8-virus sisälsi 3,5 ke:n lac Z -geenin, Hin- 40 102835 dill J -fragmentti muutettiin täten noin 8,5 ke:n kokoiseksi (kuvio 11, rivi 5) . Koska suurempia fragmentteja ei edes alhaisprosenttisissa geeleissä voitu ilman muuta erottaa, suoritettiin yhdistelmävirus-DNA:n lopullinen määritys käyt-5 täen Southern Blot -hybridisaatiota (kuvio 12) . 32P-leima-tuilla koettimilla voitiin löytää aivan selvästi fragmentteja, jotka olivat kloonausstrategian ennusteen kokoisia. Yh-distelmäviruksessa, joka muodostui pSCll-P6:n rekombinaation kautta, oli merkityksettömästi poikkeava (noin 500 ep) , pie-10 nempi Hindlll-fragmentti "pSCll-F41"-yhdistelmänä (kuviot 12A ja B). DNA:t, jotka olivat peräisin infektoitumattomista soluista, eivät osoittaneet hybridisaatiota pSCll "nickre-pair"-leimatun koettimen eikä "Riboproben" kanssa (kuviot 12A ja B, rivi 9). Viruksesta vSC8 peräisin oleva DNA hybri-15 disoitui vain pSCll "nick-repair"-leimattuun koettimeen yhteisen TK-sekvenssin ja lac Z -geenin vuoksi (kuvio 12B, rivi 8) . FSME "Riboprobe" ei osoittanut, kuten odotettua, mitään hybridisaatiota. Sekä "Riboprobe" että "nick-repair" -leimattu koetin identifioivat kuitenkin eri kokoa ole-20 van "yhdistelmä"-Hindlll J -fragmentin (kuviot 12A ja B, rivit 1 - 3 ja 7). Vaccinia-viruksen DNA, joka oli muodostunut rekombinaation mukaisesti insertioplasmidin pSCll ja villin viruksen kanssa, on esitetty kuvioissa 12A ja B, ri-·; vit 4-6. "Riboproben" (kuvio 12A) kanssa ei havaittu hyb- 25 ridisaatiota, plasmidi pSCll:n kanssa kylläkin (kuvio 12B).

15.11. Proteiinianalyysi

Infektoitiin soluja, villillä tai yhdistelmäviruksel-la, m.o.i -arvolla 1-10 pfu/solu. Solut leimattiin 35S-me-tioniinilla eri aikojen kuluttua infektiosta, kerättiin ja . 30 analysoitiin peräkkäin denaturoivilla SDS-polyakryyliamidi- geeleillä. Proteiini E:n muunnosmolekyylit määritettiin käyttäen Western Blot -analyysiä ihmisen antiseerumilla. Soluista, jotka oli infektoitu yhdistelmävirus P6:lla, voitiin osoittaa FSME-virusspesifinen proteiini, jonka molekyy- 4i 102835 lipaino oli noin 38 000 daltonia. Tällä proteiinilla oli primaarisekvenssin perusteella laskettu koko ja se muodostui 335 aminohaposta, jotka olivat peräisin FSME-proteiinista E, ja 87 Vaccinia TK -geenin aminohaposta. Koska FSME-sekvenssi 5 ei sisällä sisäisiä lopetuskodoneja, oli tämä fuusio odotettavissa. Toisella yhdistelmäviruksella, joka käsittää FSME-proteiinin E sekvenssin FnuDIII-fragmentin, on odotettavissa noin 42 kd:n proteiini.

FSME-proteiinien synteesiaika soluissa, jotka infek-10 toitiin Vaccinia-virusyhdistelmillä, määritettiin leimaamalla solut eri aikoina infektion jälkeen lyhyen ajan kuluessa (4 tuntia) 35S-metioniinilla. Koska p7,5-promoottori on aktiivinen sekä aikaisessa että myöhäisemmässä infektiosyklin faasissa, oli odotettavissa, että solut tuottivat FSME-pro-15 teiineja aikaisempana ja myöhäisempänä ajankohtana infektion jälkeen. Suhteessa tähän säätelee myöhäinen pll-promoottori β-gal-proteiinin synteesiä, jonka molekyylipaino on 116 kd. Tämä proteiini ilmestyi täten suhteellisen myöhään infektion jälkeen. Kuvatut promoottoreiden aikaiset ja myöhäiset ak-20 tiivisuudet vaikuttivat solujen kypsymisajankohtaan, erityisesti kun oli käytettävä suurempia määriä virusta haluttujen proteiinien puhdistamiseksi ja valmistamiseksi.

• · «

Claims (5)

42 102835

1. Peptidi tai polypeptidi, tunnettu siitä, että se käsittää osan proteiinista, joka on valittu 5 ryhmästä, joka käsittää FSME-viruksen läntisen alatyypin proteiinin C, rpm, M tai E, ja aminohapposekvenssin, joka sisältyy kuviossa 3 esitettyyn aminohapposekvenssiin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidi tai po-lypeptidi, tunnettu siitä, että se käsittää pro- 10 teiinin, joka on valittu ryhmästä, joka käsittää FSME-viruksen läntisen alatyypin proteiinin C, rpm, M tai E.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen peptidi tai polypeptidi, tunnettu siitä, että se käsittää vähintään sellaisen proteiinin antigeenisen determinantin 15 alueen, joka proteiini on valittu ryhmästä, joka käsittää FSME-viruksen läntisen alatyypin proteiinin C, rpm, M tai E, edullisesti proteiinin E.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen peptidi tai polypeptidi, tunnettu siitä, että se on 20 valmistettu saattamalla sitä koodaava nukleotidisekvenssi ilmentymään sopivassa ilmentymissysteemissä.

5. Diagnostinen aine, tunnettu siitä, että se sisältää jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukaista peptidiä tai polypeptidiä. 25 3 * « 102835