JPH03151878A - タンパク質、ワクチンおよび核酸 - Google Patents
タンパク質、ワクチンおよび核酸Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、ウェスタン サブタイプ（亜型）ＴＢＥウィ
ルス用のワクチンおよび診断試薬、並びにかかるワクチ
ンおよび試薬に有効な核酸およびタンパク質に関する。
ルス用のワクチンおよび診断試薬、並びにかかるワクチ
ンおよび試薬に有効な核酸およびタンパク質に関する。
（従来の技術および解決すべき課ＷＪ）ウェスタン サ
ブタイプ ダニ媒介脳炎（１’Ｂｌ：）ウィルスは、フ
ラビビリダ（ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）科の一種であ
り、特殊な脂質被ｌＲＮＡウィルスである（Ｗｅｓｔａ
ｗａｙ ｅｔ ａｌ、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ２
４．１８３−１９２．１９８５）。そのプロトタイプウ
ィルスは黄熱病ウィルスである。定義によれば、全ての
ワラビウイルス類は、血球凝集阻止検定法で示されるよ
うに、血清学的に関連している。しかじなか、ら、交差
中和によれば、その科は、異なる血清複合体または非グ
ループ化ワラビウイルス類の血清学的により明確に関連
したウィルスとは対照的により密接に関連したワラビウ
イルス類を含む各種の血清複合体に分類できる（ＤｅＭ
ａｄｒｉｄ ａｎｄ Ｐｏｒｔｅｒｆｉｅｌｄ、Ｊ、Ｇ
ｅｎ。
ブタイプ ダニ媒介脳炎（１’Ｂｌ：）ウィルスは、フ
ラビビリダ（ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）科の一種であ
り、特殊な脂質被ｌＲＮＡウィルスである（Ｗｅｓｔａ
ｗａｙ ｅｔ ａｌ、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ２
４．１８３−１９２．１９８５）。そのプロトタイプウ
ィルスは黄熱病ウィルスである。定義によれば、全ての
ワラビウイルス類は、血球凝集阻止検定法で示されるよ
うに、血清学的に関連している。しかじなか、ら、交差
中和によれば、その科は、異なる血清複合体または非グ
ループ化ワラビウイルス類の血清学的により明確に関連
したウィルスとは対照的により密接に関連したワラビウ
イルス類を含む各種の血清複合体に分類できる（ＤｅＭ
ａｄｒｉｄ ａｎｄ Ｐｏｒｔｅｒｆｉｅｌｄ、Ｊ、Ｇ
ｅｎ。
Ｖｉｒｏｌ、２３．９１−９６．１９７４）、 Ｔ Ｂ
Ｅウィルスは、いわゆるダニ媒介血清複合体の１種で
あり、加えて、その複合体にはロービング イル（Ｌｏ
ｕｐｉｎｇ ｔｌｌ）、ランガツト（Ｌａｎｇａｔ）、
オムスク出血性発熱（Ｏｍｓｋｈｃｍｏｒｒｈａｇｉｅ
ｆｅｖｅｒ ） 、キアサヌア ホレスト障害（Ｋｙ
ａｓａｎｕｒ ［’ｏｒｃｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ）およ
びネギシ（Ｎａｇｉｓｈｌ）と称するウィルス類も含ま
れる。
Ｅウィルスは、いわゆるダニ媒介血清複合体の１種で
あり、加えて、その複合体にはロービング イル（Ｌｏ
ｕｐｉｎｇ ｔｌｌ）、ランガツト（Ｌａｎｇａｔ）、
オムスク出血性発熱（Ｏｍｓｋｈｃｍｏｒｒｈａｇｉｅ
ｆｅｖｅｒ ） 、キアサヌア ホレスト障害（Ｋｙ
ａｓａｎｕｒ ［’ｏｒｃｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ）およ
びネギシ（Ｎａｇｉｓｈｌ）と称するウィルス類も含ま
れる。
さらに、ＴＢＥウィルス株は、アイゾデス リシヌス（
ｌｘｏｄｃｓ ｒｉｅｉｎｕｓ） によって主に伝染
するウェスタン（ヨーロッパ）サブタイプおよび主ベク
ターとしてアイゾデス パースルケイタス（ｌｘ。
ｌｘｏｄｃｓ ｒｉｅｉｎｕｓ） によって主に伝染
するウェスタン（ヨーロッパ）サブタイプおよび主ベク
ターとしてアイゾデス パースルケイタス（ｌｘ。
ｄｅｓ ｐｅｒｓｕｌｃａｔｕｓ）を有する極東サブタ
イプが割り当てられる（Ｃ１ａｒｋ、１９８４；Ｂｕｌ
ｌ、ＷＩＩｏ ３１．４５−５６ ）。
イプが割り当てられる（Ｃ１ａｒｋ、１９８４；Ｂｕｌ
ｌ、ＷＩＩｏ ３１．４５−５６ ）。
このサブタイプの相異は、競争ＲＩＡおよび対応する構
造グリコプロティンの制限タンパク分解を使用するペプ
チド地図化法（ｌ１ｅｉｎｚ ａｎｄ Ｋｕｎｚ、１９
８１；Ｊ、Ｇｃｎ Ｖｉｒｏｌ、５７．２６３−２７４
） 、それに加えてモノクローナル抗体使用抗原分析法
（ＩＩｃｉｒ＋ｚ ａｔ ａｌ、Ｖｉｒｏ１ｏｇｙ１２
６．５２５−５３７．１９８３）によって確認された。
造グリコプロティンの制限タンパク分解を使用するペプ
チド地図化法（ｌ１ｅｉｎｚ ａｎｄ Ｋｕｎｚ、１９
８１；Ｊ、Ｇｃｎ Ｖｉｒｏｌ、５７．２６３−２７４
） 、それに加えてモノクローナル抗体使用抗原分析法
（ＩＩｃｉｒ＋ｚ ａｔ ａｌ、Ｖｉｒｏ１ｏｇｙ１２
６．５２５−５３７．１９８３）によって確認された。
成熟ウィルス粒子は、各々約５０〜６０，０００．１５
０００および７０００の分子量をＨし、Ｅ、 Ｃおよび
Ｍと称するわずか３つの構造タンパク質を含んでいる。
０００および７０００の分子量をＨし、Ｅ、 Ｃおよび
Ｍと称するわずか３つの構造タンパク質を含んでいる。
フラビウイルス類ゲノムは、分子ｆｆ１４ ｘ １０ｓ
ダルトンのｍＲＮＡ極性を有する約１１０００塩基の一
本鎖ＲＮＡから成る。Ｃ−タンパク質とともにこのＲＮ
Ａは、タンパク質ＥとＭで会合した脂質膜に包まれてい
る特殊なヌクレオカプシドを形成する。洗浄剤でウィル
スを可溶化後、得られたＥタンパク質精製製剤を使用す
る実験では、Ｅがウィルス性血球凝集を示す、即ち、適
当な条件下である種の赤血球を凝集させ、免疫処置する
と、血球凝集阻止、中和および保護抗体、それに加えて
生きたｈ“害ウィルスの免疫テストに対して免疫性を誘
導する（Ｉｌｃｉｎｚ ａｔ ａｌ、Ｉｎｆｃｅｔ、Ｉ
ｍｍｕｍ、３３．２５０−２５７．１９８１）。
ダルトンのｍＲＮＡ極性を有する約１１０００塩基の一
本鎖ＲＮＡから成る。Ｃ−タンパク質とともにこのＲＮ
Ａは、タンパク質ＥとＭで会合した脂質膜に包まれてい
る特殊なヌクレオカプシドを形成する。洗浄剤でウィル
スを可溶化後、得られたＥタンパク質精製製剤を使用す
る実験では、Ｅがウィルス性血球凝集を示す、即ち、適
当な条件下である種の赤血球を凝集させ、免疫処置する
と、血球凝集阻止、中和および保護抗体、それに加えて
生きたｈ“害ウィルスの免疫テストに対して免疫性を誘
導する（Ｉｌｃｉｎｚ ａｔ ａｌ、Ｉｎｆｃｅｔ、Ｉ
ｍｍｕｍ、３３．２５０−２５７．１９８１）。
これらの構造タンパク質に加えて、種々の非構造ウィル
ス特定化タンパク質は、ある種のワラビウイルス類感染
細胞中で見い出されている。
ス特定化タンパク質は、ある種のワラビウイルス類感染
細胞中で見い出されている。
最近、フラビウイルス ゲノム構造は、黄熱病、ウェス
ドナイルとマツレイ バレイ エンセファリティス ウ
ィルスのＣＤＮＡクローニングと配列化によって決定さ
れた（１？１ｃｅ ａｔ ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ ２２
９．７２８−７３３．１９８５；Ｄａｌｇａｒｎｏ ａ
ｔ ａｌ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１８７３０９−３２
３．１９８６；Ｃａ５ｔｌｅ ａｔ ａｌ、Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ、１４７．２２７−２３６．１９８５：Ｃａ５ｔ
ｌｅ ｅｔ ａｌ、 Ｖｌｒｏｌｏｇｙ、１４９．１０
−２６．１９８６：Ｖｅｎｇｌｃｒ ｅｔ ａｌ、Ｖｌ
ｒｏｌｏｇｙ １４７．２６４−２７４．１９８５）。
ドナイルとマツレイ バレイ エンセファリティス ウ
ィルスのＣＤＮＡクローニングと配列化によって決定さ
れた（１？１ｃｅ ａｔ ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ ２２
９．７２８−７３３．１９８５；Ｄａｌｇａｒｎｏ ａ
ｔ ａｌ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１８７３０９−３２
３．１９８６；Ｃａ５ｔｌｅ ａｔ ａｌ、Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ、１４７．２２７−２３６．１９８５：Ｃａ５ｔ
ｌｅ ｅｔ ａｌ、 Ｖｌｒｏｌｏｇｙ、１４９．１０
−２６．１９８６：Ｖｅｎｇｌｃｒ ｅｔ ａｌ、Ｖｌ
ｒｏｌｏｇｙ １４７．２６４−２７４．１９８５）。
これらの分析によれば、フラビウイルス ゲノムは、全
ての構造および非構造タンパク質をコードする約１１，
０００ヌクレオチドの単一の長い読み取り枠を有してい
る。
ての構造および非構造タンパク質をコードする約１１，
０００ヌクレオチドの単一の長い読み取り枠を有してい
る。
遺伝子順序はＹＦウィルスを作り、各種の他のフラビウ
イルスが５ ； Ｃ−ｐ ｒＭ（Ｍ） −Ｅ−ＮＳ１−
ＮＳ２Ａ−ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−Ｎ
Ｓ５ ３．Ｃ，ｐｒＭ（Ｍ）であり、Ｅが未熟（Ｃ，ｐ
ｒＭ、Ｃ）および成熟（Ｃ，Ｍ、Ｌ：）ウィルス粒子中
で見い出された構造タンパク質を現わし、−方、ゲノム
の残部は非構造タンパク質をコードすることが確認され
た。構造タンパク質および非構造タンパク質は、アミノ
末端分析によって確かに確認されており、このように対
応するゲノム セグメントと関連づけられた。
イルスが５ ； Ｃ−ｐ ｒＭ（Ｍ） −Ｅ−ＮＳ１−
ＮＳ２Ａ−ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−Ｎ
Ｓ５ ３．Ｃ，ｐｒＭ（Ｍ）であり、Ｅが未熟（Ｃ，ｐ
ｒＭ、Ｃ）および成熟（Ｃ，Ｍ、Ｌ：）ウィルス粒子中
で見い出された構造タンパク質を現わし、−方、ゲノム
の残部は非構造タンパク質をコードすることが確認され
た。構造タンパク質および非構造タンパク質は、アミノ
末端分析によって確かに確認されており、このように対
応するゲノム セグメントと関連づけられた。
ウィルス性タンパク質の翻訳はＲＮＡ５＝端の最初のＡ
ＵＧから始まり、ＲＮＡ３”端の停止コドンに遭遇する
まで進むと仮定される。個々のタンパク質の形成は、細
胞およびウィルス特異プロテアーゼを含む一連の特異タ
ンパク分解性開裂によって生ずると考えられる。
ＵＧから始まり、ＲＮＡ３”端の停止コドンに遭遇する
まで進むと仮定される。個々のタンパク質の形成は、細
胞およびウィルス特異プロテアーゼを含む一連の特異タ
ンパク分解性開裂によって生ずると考えられる。
約６０の異種ワラビウイルスが現在までに確認されてお
り、その２／３は感染節足動物の傷によって伝染し、節
足動物−ボーン（ｂｏｒｎｅ） （ＡＲＢＯ）ウィルス
を現わす。種々のフラビウイルスは既知ヒト病原体であ
り、黄熱病ウィルス、テング熱ウィルス、日本脳炎ウィ
ルスまたはダニ媒介脳炎ウィルスが含まれる（Ｓｈｏｐ
ｃ、 １ｎ；”Ｔｈｅ ］”ｏｇａｖｉ ｒｕｓｅｓ”
、 ｐｐ４７−８２．Ａｅａｄｃｍｉｅ ｐｒｃｓｓ
、Ｎｃｗ Ｙｏｒｋ、１９８０）。
り、その２／３は感染節足動物の傷によって伝染し、節
足動物−ボーン（ｂｏｒｎｅ） （ＡＲＢＯ）ウィルス
を現わす。種々のフラビウイルスは既知ヒト病原体であ
り、黄熱病ウィルス、テング熱ウィルス、日本脳炎ウィ
ルスまたはダニ媒介脳炎ウィルスが含まれる（Ｓｈｏｐ
ｃ、 １ｎ；”Ｔｈｅ ］”ｏｇａｖｉ ｒｕｓｅｓ”
、 ｐｐ４７−８２．Ａｅａｄｃｍｉｅ ｐｒｃｓｓ
、Ｎｃｗ Ｙｏｒｋ、１９８０）。
ＴＢＥウィルスは、多くのヨーロッパ諸国、ソ連および
中国において風土病である。この病気は、オーストリア
、チェコおよびハンガリー等の中央ヨーロッパ諸国にお
いて十分に立証されており、毎年数百の入院例が記録さ
れている。これは、重大な公衆衛生上の問題を示してい
る。
中国において風土病である。この病気は、オーストリア
、チェコおよびハンガリー等の中央ヨーロッパ諸国にお
いて十分に立証されており、毎年数百の入院例が記録さ
れている。これは、重大な公衆衛生上の問題を示してい
る。
この病気は、ウィルスの構造タンパク質に対する免疫応
答を誘導する高純度ホルマリンー不活性化全ウィルス
ワクチンのワクチン接種によってｈ゛効に防止できる（
Ｋｕｎｚ ａｔ ａｌ、Ｊ、Ｍｃｄ、Ｖｉｒｏｌ ６．
１０３−１０９．１９８０）。このワクチンの基本的な
不利益は、感染性が強いことであり、明らかに危険なウ
ィルス懸濁液を製造工程中に取り扱わなければならない
ことである。このように、広範、かつ、不経済であり、
安全な予防対策が必要である。
答を誘導する高純度ホルマリンー不活性化全ウィルス
ワクチンのワクチン接種によってｈ゛効に防止できる（
Ｋｕｎｚ ａｔ ａｌ、Ｊ、Ｍｃｄ、Ｖｉｒｏｌ ６．
１０３−１０９．１９８０）。このワクチンの基本的な
不利益は、感染性が強いことであり、明らかに危険なウ
ィルス懸濁液を製造工程中に取り扱わなければならない
ことである。このように、広範、かつ、不経済であり、
安全な予防対策が必要である。
従って、前記不利益を解消するワクチンの調製手段が探
し求められた。ＥＰ−Ａ−０２８４７９１は、ＤｐＪ
Ａ ｇ導つェスタン サブタイプ ＴＢＥ ウィルスを
含み、ウェスタン サブタイプＴＢＥ ウィルスのタ
ンパクＣ，ｐｒＭ、ＭまたはＥよりなる群から選ばれた
少なくとも１種の構造タンパク質の少なくとも一部をコ
ードするＤＮＡ分子を提供することによって前記問題と
取りくんでいる。
し求められた。ＥＰ−Ａ−０２８４７９１は、ＤｐＪ
Ａ ｇ導つェスタン サブタイプ ＴＢＥ ウィルスを
含み、ウェスタン サブタイプＴＢＥ ウィルスのタ
ンパクＣ，ｐｒＭ、ＭまたはＥよりなる群から選ばれた
少なくとも１種の構造タンパク質の少なくとも一部をコ
ードするＤＮＡ分子を提供することによって前記問題と
取りくんでいる。
かかるＤＮＡ分子は、ウェスタン サブタイプＴＢＥ
ウィルスの一本鎖ＲＮＡに対応し、前記のようにウェ
スタン サブタイプ ＴＢＥ ウィルスの全タンパク
質ＣＳｐｒＭ、Ｍ若しくはＥｌまたは前記タンパク質の
１つの１部であるポリペプチド発現用の遺伝的情報提供
に適していることを示した。かかるポリペプチドは、例
えばワクチン調製に診断または治療的に使用し得る。
ウィルスの一本鎖ＲＮＡに対応し、前記のようにウェ
スタン サブタイプ ＴＢＥ ウィルスの全タンパク
質ＣＳｐｒＭ、Ｍ若しくはＥｌまたは前記タンパク質の
１つの１部であるポリペプチド発現用の遺伝的情報提供
に適していることを示した。かかるポリペプチドは、例
えばワクチン調製に診断または治療的に使用し得る。
同様に、配列分析では、極東サブタイプとの相異は極東
タイプと比較してアミノ酸配列多様性が１４％まで（タ
ンパク質に対して）であることを現わすことによって確
認された（Ｙａｍｓｈｅｈｉｋｏｖ ａｎｄＰＩｃｔｎ
ｏｖ、Ｎｕｅｌａｉｅ Ａｃ１ｄ Ｒｃｓ、１６７７５
０（１９８８））。
タイプと比較してアミノ酸配列多様性が１４％まで（タ
ンパク質に対して）であることを現わすことによって確
認された（Ｙａｍｓｈｅｈｉｋｏｖ ａｎｄＰＩｃｔｎ
ｏｖ、Ｎｕｅｌａｉｅ Ａｃ１ｄ Ｒｃｓ、１６７７５
０（１９８８））。
ＥＰ−Ａ−０２８４７９１に記載されているように、１
またはそれ以上の組換え構造タンパク質に基づくワクチ
ンが製造上の観点から不活性全つイルス ワクチンを越
える改良を十分に示すけれども、それは不活性全ウィル
ス ワクチンとともに非構造タンパク質を含まない、即
ち保護免疫応答によるものである、という不利益を−Ｕ
する。
またはそれ以上の組換え構造タンパク質に基づくワクチ
ンが製造上の観点から不活性全つイルス ワクチンを越
える改良を十分に示すけれども、それは不活性全ウィル
ス ワクチンとともに非構造タンパク質を含まない、即
ち保護免疫応答によるものである、という不利益を−Ｕ
する。
非構造タンパク質は、ウィルス成熟、タンパク質分解工
程および複製に含まれるワラビウイルスのライフサイク
ルに重要な機能を６している。実験動物においてＴＢＥ
以外のあるワラビウイルスの非構造タンパク質（ＮＳＩ
）の１つが保護免疫応答を誘くことが示されているが（
Ｓｃｈｌｃｓｓｉｎｇａｒ ａｔ ａｌ、Ｊ、Ｇｃｎ、
Ｖｉｒｏｌ ６８８５３−８５７（１９８７）：Ｚｈａ
ｎｇ ａｔ ａｔ。
程および複製に含まれるワラビウイルスのライフサイク
ルに重要な機能を６している。実験動物においてＴＢＥ
以外のあるワラビウイルスの非構造タンパク質（ＮＳＩ
）の１つが保護免疫応答を誘くことが示されているが（
Ｓｃｈｌｃｓｓｉｎｇａｒ ａｔ ａｌ、Ｊ、Ｇｃｎ、
Ｖｉｒｏｌ ６８８５３−８５７（１９８７）：Ｚｈａ
ｎｇ ａｔ ａｔ。
Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、８２３０２７−３０３１（１９８８）
） 、Ｔ Ｂ Ｅの非構造タンパク質にはかかる開示は
ない。
） 、Ｔ Ｂ Ｅの非構造タンパク質にはかかる開示は
ない。
中和抗体またはワラビウィルスＥタンパク雪中のエピト
ープに対する他の抗体の亜中和濃縮物は、テング熱出血
性発熱およびテング熱ＦＪ！Ｔ撃症候群の病因の含まれ
る（Ｉｌａｌｓｔｃａｄ、 ５ｃｉｅｎｃｅ ２３９４
７Ｂ−４８１（１９８８）） Ｆ Ｃ−レセプター発生
細胞中の感染の抗体依存増強を仲介し得る（Ｐｏｒｔｃ
ｒｆｉｃｌｄ、 Ｃａｒｄ。
ープに対する他の抗体の亜中和濃縮物は、テング熱出血
性発熱およびテング熱ＦＪ！Ｔ撃症候群の病因の含まれ
る（Ｉｌａｌｓｔｃａｄ、 ５ｃｉｅｎｃｅ ２３９４
７Ｂ−４８１（１９８８）） Ｆ Ｃ−レセプター発生
細胞中の感染の抗体依存増強を仲介し得る（Ｐｏｒｔｃ
ｒｆｉｃｌｄ、 Ｃａｒｄ。
ｓａ： ”Ｃｏｎｃｅｐｔ ｉｎ Ｖｉｒａｌ Ｐａｔ
ｈｏｇｃｎｃｓｌｓ Ｉ”、 Ｃｈａｐｔｃｒ １７Ｐ
、 １１７）ｏそれ故に、ある場合に、ワクチン中のフ
ラビウィスルＥタンパク質の使用を避け、または平衡に
なるまで唯一のワクチン成分としてＮＳＩを使用し、そ
してウィルス構造タンパク質を組み込まないことが有効
である。
ｈｏｇｃｎｃｓｌｓ Ｉ”、 Ｃｈａｐｔｃｒ １７Ｐ
、 １１７）ｏそれ故に、ある場合に、ワクチン中のフ
ラビウィスルＥタンパク質の使用を避け、または平衡に
なるまで唯一のワクチン成分としてＮＳＩを使用し、そ
してウィルス構造タンパク質を組み込まないことが有効
である。
ＴＢＥウィスル ウェスタン サブタイプのＮＳ−１タ
ンパク質は、その配列によって確認された。このタンパ
ク質は有効なワクチン成分であり、組換えＤＮＡ技術に
よって容易に産生される。
ンパク質は、その配列によって確認された。このタンパ
ク質は有効なワクチン成分であり、組換えＤＮＡ技術に
よって容易に産生される。
（課題を解決するための手段）
本発明の第１態様によれば、ウェスタン サブタイプＴ
ＢＥウィルスのＮＳ−１タンパク質のアミノ酸配列の少
な（とも１部を含むペプチドまたはポリペプチドが提供
される。
ＢＥウィルスのＮＳ−１タンパク質のアミノ酸配列の少
な（とも１部を含むペプチドまたはポリペプチドが提供
される。
ペプチドまたはポリペプチドが全タンパク質のアミノ酸
配列の一部だけを含むのであれば、免疫抗原性タンパク
質を念むことか好ましい。しかしながら、ペプチドまた
はポリペプチドは第４図に示されるアミノ酸配列を有す
ることが好ましい。
配列の一部だけを含むのであれば、免疫抗原性タンパク
質を念むことか好ましい。しかしながら、ペプチドまた
はポリペプチドは第４図に示されるアミノ酸配列を有す
ることが好ましい。
本発明は、明らかに、突然変異および／またはウェスタ
ンサブタイプＴＢＥウィルスの通常の範囲である天然変
異である転置であるうとなかろうと、天然ＮＳ−１配列
のアミノ酸配列と異なる全アミノ酸配列を含んでいる。
ンサブタイプＴＢＥウィルスの通常の範囲である天然変
異である転置であるうとなかろうと、天然ＮＳ−１配列
のアミノ酸配列と異なる全アミノ酸配列を含んでいる。
従って、これらの配列は、ウェスタン サブタイプＴＢ
ＥウィルスのＮＳ−１非構造タンパク質の必須特性（特
に必須抗原性特性）をまだ含んでいる。
ＥウィルスのＮＳ−１非構造タンパク質の必須特性（特
に必須抗原性特性）をまだ含んでいる。
本発明のペプチドまたはポリペプチドは本発明の適当な
核酸配列の発現によって産生ずることが好ましいけれど
も、本発明のペプチドまたはポリペプチドを単離、また
は好ましくは化学合成することも可能である。従って、
ペプチドまたはポリペプチドは、実質的に純粋な形体で
ありおよび／または天然に会合した他の物質を実質的に
含んでいない。
核酸配列の発現によって産生ずることが好ましいけれど
も、本発明のペプチドまたはポリペプチドを単離、また
は好ましくは化学合成することも可能である。従って、
ペプチドまたはポリペプチドは、実質的に純粋な形体で
ありおよび／または天然に会合した他の物質を実質的に
含んでいない。
本発明の第１の態様によるペプチドまたはポリペプチド
は、単独でまたは診断試薬およびワクチン製造時の成分
としての１若しくはそれ以１−の適当なエキシピエント
と組み合わせてｈ゛効である。
は、単独でまたは診断試薬およびワクチン製造時の成分
としての１若しくはそれ以１−の適当なエキシピエント
と組み合わせてｈ゛効である。
ペプチドまたはポリペプチドは、薬剤分野で使用し得る
組成物であることが好ましい。
組成物であることが好ましい。
本発明の第２態様によれば、本発明の第１態様によるペ
プチドまたはポリペプチドおよび１若しくはそれ以１−
の付加的で薬理１−許容可能な成分を含むワクチン組成
物が提供される。ががる成分には、ペプチドまたはポリ
ペプチド用の薬理１−許容可能なキャリヤーまたはアジ
ュバントが含まれる。
プチドまたはポリペプチドおよび１若しくはそれ以１−
の付加的で薬理１−許容可能な成分を含むワクチン組成
物が提供される。ががる成分には、ペプチドまたはポリ
ペプチド用の薬理１−許容可能なキャリヤーまたはアジ
ュバントが含まれる。
その他の好ましい成分にはバッフγ−がある。
ワクチンキャリヤーは任意の適当なキャリヤーであり、
かつ、必要により、１若しくはそれ以上のアジュバント
を念んでもよい。通常の実務によれば、本発明の全ての
ワクチン組成物は無菌状態である。
かつ、必要により、１若しくはそれ以上のアジュバント
を念んでもよい。通常の実務によれば、本発明の全ての
ワクチン組成物は無菌状態である。
抗原性ペプチドまたはポリペプチド念白゛ワクチンのさ
らに好ましい用途は、特殊免疫グロブリン、例えば、他
の公知のｈ゛法でも産生されるモノクローナル抗体また
はポリクローナル抗体の調製である。ペプチドおよびポ
リペプチドに対する抗体は本５′コ明の一部を形成する
とみなされる。
らに好ましい用途は、特殊免疫グロブリン、例えば、他
の公知のｈ゛法でも産生されるモノクローナル抗体また
はポリクローナル抗体の調製である。ペプチドおよびポ
リペプチドに対する抗体は本５′コ明の一部を形成する
とみなされる。
前記の如く、本発明の１若しくはそれ以１−のべブチド
またはポリペプチドを含む組成物は診断薬としても使用
される。
またはポリペプチドを含む組成物は診断薬としても使用
される。
また、本発明は、第１態様によるペプチドまたはポリペ
プチドをコードする核酸に関する。
プチドをコードする核酸に関する。
本発明の第３態様によれば、ウェスタン サブタイプＴ
ＢＥウィルスのＮＳ−１タンパク質の少なくとも１部を
コードする核酸が提供される。組換え型核酸、特に組換
えＤＮＡである核酸は、全体またはＮＳ−１タンパク質
の実質的な全体若しくは適切ならばその一部をコードで
きる。
ＢＥウィルスのＮＳ−１タンパク質の少なくとも１部を
コードする核酸が提供される。組換え型核酸、特に組換
えＤＮＡである核酸は、全体またはＮＳ−１タンパク質
の実質的な全体若しくは適切ならばその一部をコードで
きる。
これらのＤＮＡおよびＲＮＡ分子は第１態様によるペプ
チドまたはポリペプチドの提供にｈ°効であるばかりで
なく、生ワクチンの調製にも使用しえる。ＤＮＡ配列は
、生ワクチンとして十分にｌｆｆ１立されているワクシ
ニアウィルスＤＮＡと組み合わせることが好ましい。
チドまたはポリペプチドの提供にｈ°効であるばかりで
なく、生ワクチンの調製にも使用しえる。ＤＮＡ配列は
、生ワクチンとして十分にｌｆｆ１立されているワクシ
ニアウィルスＤＮＡと組み合わせることが好ましい。
生ワクチンとしての用途は別として、本発明のＤＮＡま
たはＲＮＡ配列は、さらにスクリーニング目的用プロー
ブとしても好ましい。
たはＲＮＡ配列は、さらにスクリーニング目的用プロー
ブとしても好ましい。
現在、抗ウイルス試薬は、ＴＢＥ患者の特殊処置にｈ゛
効ではない。しかしながら、ＲＮＡ複製、翻訳後タンパ
ク分解プロセスおよびウィルス組立ての如き非構造タン
パク質を含むプロセスを念むウィルス生命サイクルを特
に妨げる種々の潜在的可能性がある。タンパク質ＮＳ−
１またはその１部をコードする核酸もこの目的に白゛効
である。ウィルス性タンパク質の機能活性の妨害に加え
て、抗センスＲＮＡの使用によってウィルス性複製プロ
セスをじゃますることが適している。
効ではない。しかしながら、ＲＮＡ複製、翻訳後タンパ
ク分解プロセスおよびウィルス組立ての如き非構造タン
パク質を含むプロセスを念むウィルス生命サイクルを特
に妨げる種々の潜在的可能性がある。タンパク質ＮＳ−
１またはその１部をコードする核酸もこの目的に白゛効
である。ウィルス性タンパク質の機能活性の妨害に加え
て、抗センスＲＮＡの使用によってウィルス性複製プロ
セスをじゃますることが適している。
本発明の範囲内でＤＮＡ分子を調製する多くの方法があ
る。ＤＮＡ分子を得る１つの可能な方法は、最初にウェ
スタン サブタイプＴＢＥウィルスからウィルス性ＲＮ
Ａを抽出し、ＲＮＡ分子を精製し、その後、逆転写酵素
を用いてこのＲＮＡ鋳型をＤＮＡ分子へ転写することで
ある。曲の方法は、ＤＮＡ配列が調べられると直ちに本
発明に従ってＤＮＡ分子を化学的に合成することである
。
る。ＤＮＡ分子を得る１つの可能な方法は、最初にウェ
スタン サブタイプＴＢＥウィルスからウィルス性ＲＮ
Ａを抽出し、ＲＮＡ分子を精製し、その後、逆転写酵素
を用いてこのＲＮＡ鋳型をＤＮＡ分子へ転写することで
ある。曲の方法は、ＤＮＡ配列が調べられると直ちに本
発明に従ってＤＮＡ分子を化学的に合成することである
。
好適な実施態様として、本発明は、第１態様によるＤＮ
Ａ分子、特に厳しい条件下で、例えば少なくとも９０％
ヌクレオチド配列相同性を選択して、第３図に示される
ＤＮＡ配列および／または第４図に示されるタンパク質
配列をコードするＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮ
Ａ分子を含んでいる。また、この好適な種類のＤＮＡ分
子抗体応答を起こすペプチドのコードが可能であり、そ
の１−１それらのＤＮＡ分子はＤＮＡプローブとしても
好適である。
Ａ分子、特に厳しい条件下で、例えば少なくとも９０％
ヌクレオチド配列相同性を選択して、第３図に示される
ＤＮＡ配列および／または第４図に示されるタンパク質
配列をコードするＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮ
Ａ分子を含んでいる。また、この好適な種類のＤＮＡ分
子抗体応答を起こすペプチドのコードが可能であり、そ
の１−１それらのＤＮＡ分子はＤＮＡプローブとしても
好適である。
本発明の１実施態様によって、非構造タンパク質ＮＳ−
１をコードする野生型ウェスタン サブタイプ ＴＢＥ
ウィルスゲノムの完全配列をへむ核酸は、タンパク質の
少な（とも一部をコードするゲノムＲＮＡ誘導ＤＮＡ分
子と同様に提供される。本発明の範囲内のＤＮＡ分子−
は、ウェスタンサブタイプ ＴＢＥウィルス単一ｓ（＞
ＲＮ Ａに対応または相捕的であり、全ＮＳ−１タン
パク質またはワクチン成分として診断および治療目的に
白゛効に使用される１若しくはそれ以」−の部分を発現
する遺伝情報の提供に適している。
１をコードする野生型ウェスタン サブタイプ ＴＢＥ
ウィルスゲノムの完全配列をへむ核酸は、タンパク質の
少な（とも一部をコードするゲノムＲＮＡ誘導ＤＮＡ分
子と同様に提供される。本発明の範囲内のＤＮＡ分子−
は、ウェスタンサブタイプ ＴＢＥウィルス単一ｓ（＞
ＲＮ Ａに対応または相捕的であり、全ＮＳ−１タン
パク質またはワクチン成分として診断および治療目的に
白゛効に使用される１若しくはそれ以」−の部分を発現
する遺伝情報の提供に適している。
本発明は、明らかに、遺伝コードの変性および／または
突然変異および／または転１−γであって、ウェスタン
ザブタイプ ＴＢＥ ウィルスの天然変異の通常の
範囲内のものがあろうとなかろうと、天然ＮＳ−Ｉ
ＲＮＡ配列に対応または相捕的なＤＮＡ分丁と相違する
全てのＤＮＡ配列を含んでいる。従って、これらの配列
は、ウェスタンサブタイプ ＴＢＥウィルスＮＳ−１非
描造タンパク質の必須特性（特に、必須抗原性特性）を
具備するタンパク質をコードする。
突然変異および／または転１−γであって、ウェスタン
ザブタイプ ＴＢＥ ウィルスの天然変異の通常の
範囲内のものがあろうとなかろうと、天然ＮＳ−Ｉ
ＲＮＡ配列に対応または相捕的なＤＮＡ分丁と相違する
全てのＤＮＡ配列を含んでいる。従って、これらの配列
は、ウェスタンサブタイプ ＴＢＥウィルスＮＳ−１非
描造タンパク質の必須特性（特に、必須抗原性特性）を
具備するタンパク質をコードする。
本発明の好適な実施態様において、請求の範囲に記載の
ＤＮＡ分子は追加のＤＮＡ配列と組合わせられる。
ＤＮＡ分子は追加のＤＮＡ配列と組合わせられる。
これらの追加配列は、細胞培養におけるＤＮＡ分子の複
製および発現を許容する。この目的に最も重要なＤＮＡ
配列は、プロモーター、促進剤（ｅｎｈａｎｅｃｒｓ）
、ポリアデニル化シグナル（（ハ号）およびスプライス
シグナルとして機能するものである。これらの追加ＤＮ
Ａ配列は、当業古に公知の標準的な方法によって本発明
の第１態様に基づ＜ＤＮＡ分子−と組合せられる。
製および発現を許容する。この目的に最も重要なＤＮＡ
配列は、プロモーター、促進剤（ｅｎｈａｎｅｃｒｓ）
、ポリアデニル化シグナル（（ハ号）およびスプライス
シグナルとして機能するものである。これらの追加ＤＮ
Ａ配列は、当業古に公知の標準的な方法によって本発明
の第１態様に基づ＜ＤＮＡ分子−と組合せられる。
前記の如く、本発明の範囲内のＤ Ｎ Ａ分子の利益は
、同一方法のＲＮＡ分子に対しても真実である。本発明
によるＲＮＡ分子は、ウェスタン サブタイプ ＴＢＥ
ウィルスＲＮＡの単離と精製または組換えＲＮＡ／ＤＮ
Ａ技術によって得られる。
、同一方法のＲＮＡ分子に対しても真実である。本発明
によるＲＮＡ分子は、ウェスタン サブタイプ ＴＢＥ
ウィルスＲＮＡの単離と精製または組換えＲＮＡ／ＤＮ
Ａ技術によって得られる。
そのヒ、ウェスタン サブタイプ ＴＢＥウィルスの精
製によって得られたＲＮＡ分子ばかりでなく、単離・精
製ウィルス性ＲＮＡの逆転写酵素によるＤＮＡの転写お
よび得られたＤＮＡのＲＮＡへの再度の転写またはＲＮ
Ａ依存ＲＮＡ転写によって得られたＲＮＡ分子も本発明
に含まれる。
製によって得られたＲＮＡ分子ばかりでなく、単離・精
製ウィルス性ＲＮＡの逆転写酵素によるＤＮＡの転写お
よび得られたＤＮＡのＲＮＡへの再度の転写またはＲＮ
Ａ依存ＲＮＡ転写によって得られたＲＮＡ分子も本発明
に含まれる。
本発明において、前記の如く、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子
ばかりでなく、挿入物として本発明の範囲内のＤＮＡま
たはＲＮＡ分子を含むベクターも提供される。本発明の
第４態様によれば、第３態様による核酸配列を含み、ク
ローニングベクターかまたは発現ベクターであるベクタ
ーが提供される。例えば、ベクターは、プラスミド、ウ
ィルス（例えば、動物（例えばワクシニア）ライスルま
たはファージ）またはコスミドである。当分前で公知の
ように、一般にかかるベクターは、抑大ＲＮＡまたはＤ
ＮＡ配列の複製と発現を制御する配列を＾んでおり、か
かる制御配列はプロモーターおよび他の配列の中でも明
らかに追加の促進剤を含んでもよい。
ばかりでなく、挿入物として本発明の範囲内のＤＮＡま
たはＲＮＡ分子を含むベクターも提供される。本発明の
第４態様によれば、第３態様による核酸配列を含み、ク
ローニングベクターかまたは発現ベクターであるベクタ
ーが提供される。例えば、ベクターは、プラスミド、ウ
ィルス（例えば、動物（例えばワクシニア）ライスルま
たはファージ）またはコスミドである。当分前で公知の
ように、一般にかかるベクターは、抑大ＲＮＡまたはＤ
ＮＡ配列の複製と発現を制御する配列を＾んでおり、か
かる制御配列はプロモーターおよび他の配列の中でも明
らかに追加の促進剤を含んでもよい。
本発明の第４態様にによれば、前記ベクターを含む宿主
細胞が提供できる。かかる細胞の多くは、細胞培養によ
って提供される。
細胞が提供できる。かかる細胞の多くは、細胞培養によ
って提供される。
ベクターは、細胞培養中に含まれることが好ましく、そ
の中でＲＮＡまたはＤＮＡ配列によるコード化ポリペプ
チドの発現は本発明に従っており、細胞培養は哺乳類細
胞培養が好ましい。哺乳類細胞培養を使用することによ
って、ウェスタン サブタイプ ＴＢＥ ウィルス感
染から哺乳動物を護るワクチンとして使用されるポリペ
プチド発現に最も好ましい条件が与えられる。
の中でＲＮＡまたはＤＮＡ配列によるコード化ポリペプ
チドの発現は本発明に従っており、細胞培養は哺乳類細
胞培養が好ましい。哺乳類細胞培養を使用することによ
って、ウェスタン サブタイプ ＴＢＥ ウィルス感
染から哺乳動物を護るワクチンとして使用されるポリペ
プチド発現に最も好ましい条件が与えられる。
（作用）
本発明のよりよき理解と、その効果を示すために、本発
明の好適な実施態様は図面を引用して記載される。
明の好適な実施態様は図面を引用して記載される。
第１図は消化していないプラスミド Ｂ５１７−６（レ
ーンｂ）アガロースゲル電気泳動写真を示しており、Ｎ
ＳＩタンパク質用の全コード配列を含んでいる。レーン
Ｃは同一プラスミドのＢａｍＨｌ消化物を示し、２つの
レーンａは０．６ｋｂ。
ーンｂ）アガロースゲル電気泳動写真を示しており、Ｎ
ＳＩタンパク質用の全コード配列を含んでいる。レーン
Ｃは同一プラスミドのＢａｍＨｌ消化物を示し、２つの
レーンａは０．６ｋｂ。
２１（ｂおよび１０ ｋ ｂのサイズマーカーを含んで
いる。
いる。
第２図はプラスミドＢ５１７−６中に含まれる挿入物１
７−６の完全ヌクレオチド配列を示す。
７−６の完全ヌクレオチド配列を示す。
第３図は挿入物１７−６のＲＮＡ配列およびエンコード
化アミノ酸配列を示す。位置数はＴＢＥウィルスの全長
ゲノムに関係する。
化アミノ酸配列を示す。位置数はＴＢＥウィルスの全長
ゲノムに関係する。
第４図はタンパク質ＮＳＩのアミノ酸配列を示しており
、それはクローン１７−６配列情報から誘導されたもの
である。位置数はタンパク質ＮＳ１の最初のアミノ酸か
ら始められている。
、それはクローン１７−６配列情報から誘導されたもの
である。位置数はタンパク質ＮＳ１の最初のアミノ酸か
ら始められている。
第５図は、下記実施例１０で引用されるが、ＮＳ１を原
核生物発現ベクターｐＵｃ１９ｓにクロニングする方策
を示す。
核生物発現ベクターｐＵｃ１９ｓにクロニングする方策
を示す。
第６Ａと６Ｂ図は、同様に実施例１０で引用されるが、
５′および３′末端にｈけるクローンｐＮＳ１３８７の
ヌクレオチド配列を示す。ＮＳＩ挿入物は、細菌１ａｃ
Ｚ遺伝子を白゛する枠内にある。発現は、１ａｃＺオペ
レーター／プロモーター系の制御下にある。第６Ａ図に
おいて、構成の一般的な機構が示される。第６Ｂ図にお
いて、ＤＮＡおよびタンパク質の配列が示される。この
構造において、ＮＳＩは、１ ａｃＺ遺伝子からの１４
アミノ酸に対応する４０個の付加ヌクレオチドおよび５
′端におけるｐＵＣ１９Ｓポリリンカーを何する。３′
端に付加的な２７個の非ＮＳＩヌクレオチド（９個のア
ミノ酸に対応する）がある。
５′および３′末端にｈけるクローンｐＮＳ１３８７の
ヌクレオチド配列を示す。ＮＳＩ挿入物は、細菌１ａｃ
Ｚ遺伝子を白゛する枠内にある。発現は、１ａｃＺオペ
レーター／プロモーター系の制御下にある。第６Ａ図に
おいて、構成の一般的な機構が示される。第６Ｂ図にお
いて、ＤＮＡおよびタンパク質の配列が示される。この
構造において、ＮＳＩは、１ ａｃＺ遺伝子からの１４
アミノ酸に対応する４０個の付加ヌクレオチドおよび５
′端におけるｐＵＣ１９Ｓポリリンカーを何する。３′
端に付加的な２７個の非ＮＳＩヌクレオチド（９個のア
ミノ酸に対応する）がある。
ＴＢＥゲノｔ、に対するヌクレオチドの位置は、第３図
から取られ、アステリスクで示される。
から取られ、アステリスクで示される。
第７Ａ図は、実施例１１で引用されるが、確かな５′信
号配列を白゛するＮＳＩを原核生物発現ベクターｐＵｃ
１９ｓにクローニングする方策を示す。
号配列を白゛するＮＳＩを原核生物発現ベクターｐＵｃ
１９ｓにクローニングする方策を示す。
第７Ｂ図は、実施例１１で引用されるが、５′および３
′末端のクローンｐｔｓＮｓ１７９１のヌクレオチド配
列を示す。ＮＳＩ挿入物は、細菌１ａｃＺ遺伝子を白°
する枠内にあり、発現は１ａｃＺプロモーター系の制御
下にある。１部において構成の一般的な機構が示される
。■部においてＤＮＡおよびタンパク質配列が示される
。この構成において、ＮＳＩは、１ａｃＺ遺伝子からの
１３のアミノ酸に対応する３９個の付加ヌクレオチドお
よび５′端のｐＵｃ１９ｓポリリンカーを有する。３′
端において１０個のアミノ酸に対応する３０個の付加的
な非ＮＳ１ヌクレオチドがある。
′末端のクローンｐｔｓＮｓ１７９１のヌクレオチド配
列を示す。ＮＳＩ挿入物は、細菌１ａｃＺ遺伝子を白°
する枠内にあり、発現は１ａｃＺプロモーター系の制御
下にある。１部において構成の一般的な機構が示される
。■部においてＤＮＡおよびタンパク質配列が示される
。この構成において、ＮＳＩは、１ａｃＺ遺伝子からの
１３のアミノ酸に対応する３９個の付加ヌクレオチドお
よび５′端のｐＵｃ１９ｓポリリンカーを有する。３′
端において１０個のアミノ酸に対応する３０個の付加的
な非ＮＳ１ヌクレオチドがある。
ＴＢＥゲノｔ、に対するヌクレオチドの位置は、第３図
から取られ、アステリスクで示される。
から取られ、アステリスクで示される。
第８Ａ図は、実施例１２で引用されるが、ワクシニアウ
ィルスで組換えるためにＮＳＩコード域をトランスファ
ーベクター ｐ７ＫｇｐｔＦ１ｓにクローニングするこ
とを示す。
ィルスで組換えるためにＮＳＩコード域をトランスファ
ーベクター ｐ７ＫｇｐｔＦ１ｓにクローニングするこ
とを示す。
第８Ｂ図は、同様に実施例１ｚで引用されるが、５′お
よび３′末端のクローンｐＡＰＮ８１３３８のヌクレオ
チド配列を示す。ＮＳＩは５′末端においてポリリンカ
ー域からの期待翻訳生成物に７個のアミノ酸に対応する
１９個の付加ヌクレオチドを有し、１０個のアミノ酸に
対応する３０個の付加ヌクレオチドは３′端に見い出さ
れる。アステリスクは、第３図からのＴＢＥウィルスゲ
ノｔ、中の核酸の位置を示す。
よび３′末端のクローンｐＡＰＮ８１３３８のヌクレオ
チド配列を示す。ＮＳＩは５′末端においてポリリンカ
ー域からの期待翻訳生成物に７個のアミノ酸に対応する
１９個の付加ヌクレオチドを有し、１０個のアミノ酸に
対応する３０個の付加ヌクレオチドは３′端に見い出さ
れる。アステリスクは、第３図からのＴＢＥウィルスゲ
ノｔ、中の核酸の位置を示す。
第１０図は、実施例１３で引用されるが、ＰＣＲ法で合
成したＮＳＩフラグメントを示すアガロースゲルを示す
図面である。アガロースゲルはエチジウｔ１ ブロマ
イド染色される。ＤＮＡはＵＺＶ線で検出される。矢印
は約１１３０ｂｐ長のフラグメントを示す。
成したＮＳＩフラグメントを示すアガロースゲルを示す
図面である。アガロースゲルはエチジウｔ１ ブロマ
イド染色される。ＤＮＡはＵＺＶ線で検出される。矢印
は約１１３０ｂｐ長のフラグメントを示す。
第１１図は、同様に実施例１３で引用されるが、ＰＣＲ
法で合成後想像上の信号配列をｈ”するＮＳ１コード域
の、ワクシニアウィルスを用いる組換えのために、トラ
ンスファーベクターｐｓｃ１１−オルソＤＥＬＴＡＯへ
のクローニングを示す。
法で合成後想像上の信号配列をｈ”するＮＳ１コード域
の、ワクシニアウィルスを用いる組換えのために、トラ
ンスファーベクターｐｓｃ１１−オルソＤＥＬＴＡＯへ
のクローニングを示す。
第１２図は、同様に実施例１３で引用されるが、３′お
よび５′末端のクローンｐＳＣｔ ＳＮＳ １４４４の
配列を示す。信す・配列を含むｔ′ＣかなＮＳ１コード
域は、その基体翻訳生成物中に、５′末端においてポリ
リンカー域からの４個のアミノ酸に対応する１２個の１
−Ｊ加ヌクレオチドを要する。
よび５′末端のクローンｐＳＣｔ ＳＮＳ １４４４の
配列を示す。信す・配列を含むｔ′ＣかなＮＳ１コード
域は、その基体翻訳生成物中に、５′末端においてポリ
リンカー域からの４個のアミノ酸に対応する１２個の１
−Ｊ加ヌクレオチドを要する。
さらに４７個のヌクレオチド（即ち、１６個のアミノ酸
）は３′末端において見い出される。アステリスクは、
第３図に従って、ＴＢＥウィルスゲノム中のヌクレオチ
ドの位置を示す。
）は３′末端において見い出される。アステリスクは、
第３図に従って、ＴＢＥウィルスゲノム中のヌクレオチ
ドの位置を示す。
第１３図は、同様に実施例１３で引用されるが、適切な
制限エンドヌクレアーゼ消化によるプラスミドｐｓｃｔ
ｓＮｓ１４４４の分析を示す。ＤＮＡのパターンは、挿
入ＮＳＩ配列のｐＳＣｌｌ−オルソベクターへの正確な
配向性を示し、クローン１７−６のヌクレオチド配列か
ら導き出されるように、フラグメントの大きさを確認す
る。
制限エンドヌクレアーゼ消化によるプラスミドｐｓｃｔ
ｓＮｓ１４４４の分析を示す。ＤＮＡのパターンは、挿
入ＮＳＩ配列のｐＳＣｌｌ−オルソベクターへの正確な
配向性を示し、クローン１７−６のヌクレオチド配列か
ら導き出されるように、フラグメントの大きさを確認す
る。
第１４図は、実施例１４で引用されるが、想像上の信号
配列を−ＨするＮＳＩを、ワクシニアウィルスを用いて
組換えるために、トランスファーベクターｐＴＫｇｐｔ
Ｆ３Ｓへクローニングすることを示す。
配列を−ＨするＮＳＩを、ワクシニアウィルスを用いて
組換えるために、トランスファーベクターｐＴＫｇｐｔ
Ｆ３Ｓへクローニングすることを示す。
第１５図は、同様に実施例１４で引用されるが、５′お
よび３′末端のプラスミドｐＴＫｔＳＮＳ１５５６のヌ
クレオチド配列を示す。この構成において、ＮＳ１は、
５′末端においてポリリンカー域からの期待翻訳生成物
中に８個のアミノ酸に対応する２４個の付加ヌクレオチ
ドを有する。さらに２６個のヌクレオチド（即ち９個の
アミノ酸）は３′末端に見い出される。アステリスクは
、第３図に従って、ＴＢＥウィルスゲノム中のヌクレオ
チドの位置を示す。
よび３′末端のプラスミドｐＴＫｔＳＮＳ１５５６のヌ
クレオチド配列を示す。この構成において、ＮＳ１は、
５′末端においてポリリンカー域からの期待翻訳生成物
中に８個のアミノ酸に対応する２４個の付加ヌクレオチ
ドを有する。さらに２６個のヌクレオチド（即ち９個の
アミノ酸）は３′末端に見い出される。アステリスクは
、第３図に従って、ＴＢＥウィルスゲノム中のヌクレオ
チドの位置を示す。
第１６図は、実施例１５で引用されるが、ＮＳ１ワクシ
ニア組換えｖａ ｒ ｅｃＮｓ１４４４とＶａ ｒｅｃ
Ｎｓ１５５６のサザンプロット分析を示す。ＣＶ−１細
胞は、多数の５ｐｆｕ／細胞で組換えワクシニアウィル
スで感染した。感染２０後、すべての細胞ＤＮＡを生成
し、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩ［Ｉで消化し、
１％アガロースゲルで分離した。そのＤＮＡをニトロセ
ルロースフィルターに移し、挿入ＮＳＩフラグメントお
よび隣接ウィルス性ｔ Ｋ配列検出用プローブとして放
射性ラベルプラスミドｐＳＣｔ ５ＮＳ１４４４でハイ
ブリダイズした。組換えｖａｒｅｃＮｓ１５５６−１１
２、−１２４．−１２２およびｖａｒｅｃＮｓ１４４４
−１２１と野生型ワタシニアＤＮＡ（スロット４）を比
較すると、ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの高分子量側へ
の期待された上昇移動を示す。ｖ ａ ｒ ｅ ｃＮｓ
１５５６−２２２だけが重量フラグメントに対応する
小さなバンドを示す。
ニア組換えｖａ ｒ ｅｃＮｓ１４４４とＶａ ｒｅｃ
Ｎｓ１５５６のサザンプロット分析を示す。ＣＶ−１細
胞は、多数の５ｐｆｕ／細胞で組換えワクシニアウィル
スで感染した。感染２０後、すべての細胞ＤＮＡを生成
し、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩ［Ｉで消化し、
１％アガロースゲルで分離した。そのＤＮＡをニトロセ
ルロースフィルターに移し、挿入ＮＳＩフラグメントお
よび隣接ウィルス性ｔ Ｋ配列検出用プローブとして放
射性ラベルプラスミドｐＳＣｔ ５ＮＳ１４４４でハイ
ブリダイズした。組換えｖａｒｅｃＮｓ１５５６−１１
２、−１２４．−１２２およびｖａｒｅｃＮｓ１４４４
−１２１と野生型ワタシニアＤＮＡ（スロット４）を比
較すると、ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの高分子量側へ
の期待された上昇移動を示す。ｖ ａ ｒ ｅ ｃＮｓ
１５５６−２２２だけが重量フラグメントに対応する
小さなバンドを示す。
このことは、プラーク単離が均質でないことを示す。１
５５６−１２２等は、３種のプラーク精製後置−組換え
実験と異なるブラヘク単離体である。
５５６−１２２等は、３種のプラーク精製後置−組換え
実験と異なるブラヘク単離体である。
対照として、およびサイズマーカーとして、プラスミド
ｐｓｃｔｓＮｓ１４４の異なる消化物が使用された（ス
ロット６と７）。
ｐｓｃｔｓＮｓ１４４の異なる消化物が使用された（ス
ロット６と７）。
第１７図は、実施例１６で引用されるが、組換えウィル
スｖａｒｅｃＮｓ１４４４とｖａ ｒｅｃ１５５６の発
現ＮＳＩタンパク質を示す変成ＳＤＳゲルオートラジオ
グラフを示す。約４８ＫＤの期待分子量を−Ｈするタン
パク質が、野生型またはｖａｒｅｃ１３４２ （異種タ
ンパク質の発現）感染細胞中では見い出されなかったが
、検出された。
スｖａｒｅｃＮｓ１４４４とｖａ ｒｅｃ１５５６の発
現ＮＳＩタンパク質を示す変成ＳＤＳゲルオートラジオ
グラフを示す。約４８ＫＤの期待分子量を−Ｈするタン
パク質が、野生型またはｖａｒｅｃ１３４２ （異種タ
ンパク質の発現）感染細胞中では見い出されなかったが
、検出された。
９７ＫＤマーカーバンド上を移動する極めて強力なタン
パク質バンドは、ｐｓｃｌｌ−オルソ（Ｏｒｔｈ）誘導
組み換えｖａｒｅｃＮｓ１４４４とｖａｒｅｃ１３４２
中でｐＨプロモーター制御のもとで発現されるβ−ガラ
クトシダーゼ（１１６ＫＤ）を示す。
パク質バンドは、ｐｓｃｌｌ−オルソ（Ｏｒｔｈ）誘導
組み換えｖａｒｅｃＮｓ１４４４とｖａｒｅｃ１３４２
中でｐＨプロモーター制御のもとで発現されるβ−ガラ
クトシダーゼ（１１６ＫＤ）を示す。
本発明に係わる核酸は以下の一般的な手法によって調製
され、また配列決定される。
され、また配列決定される。
第１に、ウィルス性ＲＮＡが、ウェスタンサブタイプＴ
ＢＥウィルスまたはウェスタンサブタイプＴＢＥウィル
ス感染細胞から抽出される。このＲＮＡをテンプレート
として用いて、例えば逆点転写酵素によって、二重鎖ｃ
ＤＮＡが合成される。
ＢＥウィルスまたはウェスタンサブタイプＴＢＥウィル
ス感染細胞から抽出される。このＲＮＡをテンプレート
として用いて、例えば逆点転写酵素によって、二重鎖ｃ
ＤＮＡが合成される。
組換ＤＮＡ技術の使用によって、このｃＤＮＡは例えば
エシェリキア・コリプラスミドＤＮＡなどのようなベク
ターＤＮＡ中に組込まれ、組換プラスミドを得る。組換
プラスミドは、該プラスミドあるいは相当するタンパク
質の発現の増強に関して適当な、例えばエシェリキア・
コリ（Ｃ，（、：ｏｆｆ）株ＨＢ １０１のような宿主
細胞を形質転換するために用いられ得る。挿入され含Ｕ
されるプラスミドを何する個々のコロニーは、ビルンボ
イムとトリ［Ｂｌｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ Ｄｏｌｙ］
（Ｎｕｅｌｃｉｅ Ａｃ１ｄｓ ｌ？ｃｓｃａｒｃｈ
、 ７．１１９５−１２０４．１９７９）によるミニ−
プラスミド調製法［ｍｌｎｌ−ｐｌａｓｍｉｄ ｐｒａ
ｐａｒａｔｌｏｎ ｍｅｔｈｏｄ］によって同定され得
る。この組換プラスミド中に存在するウェスタンサブタ
イプウィルス特異性ＤＮＡは、チエインターミネータ−
法［ｄｃｄｃｏｘｙ ｃｈａｉｎｔｅｒｍｉｎａｔｉｏ
ｎ ｍｅｔｈｏｄ］などのような迅速なＤＮＡ配列決定
法によって測定されることができる。
エシェリキア・コリプラスミドＤＮＡなどのようなベク
ターＤＮＡ中に組込まれ、組換プラスミドを得る。組換
プラスミドは、該プラスミドあるいは相当するタンパク
質の発現の増強に関して適当な、例えばエシェリキア・
コリ（Ｃ，（、：ｏｆｆ）株ＨＢ １０１のような宿主
細胞を形質転換するために用いられ得る。挿入され含Ｕ
されるプラスミドを何する個々のコロニーは、ビルンボ
イムとトリ［Ｂｌｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ Ｄｏｌｙ］
（Ｎｕｅｌｃｉｅ Ａｃ１ｄｓ ｌ？ｃｓｃａｒｃｈ
、 ７．１１９５−１２０４．１９７９）によるミニ−
プラスミド調製法［ｍｌｎｌ−ｐｌａｓｍｉｄ ｐｒａ
ｐａｒａｔｌｏｎ ｍｅｔｈｏｄ］によって同定され得
る。この組換プラスミド中に存在するウェスタンサブタ
イプウィルス特異性ＤＮＡは、チエインターミネータ−
法［ｄｃｄｃｏｘｙ ｃｈａｉｎｔｅｒｍｉｎａｔｉｏ
ｎ ｍｅｔｈｏｄ］などのような迅速なＤＮＡ配列決定
法によって測定されることができる。
ｃＤＮＡ、組換プラスミド、およびこれらのプラスミド
で形質転換された細胞の製造、ならびにヌクレオチド配
列の決定の１つの特定のプロセスのより詳細な記述は次
の通りである。まず最初に、ウェスタンサブタイプＴＢ
Ｅウィルス性ＲＮＡが純化ウィルスから得られる。この
目的のため、ウェスタンサブタイプＴＢＥウィルスは一
次ニワトリ胚細胞中で育成され、超遠心分離によって濃
縮され、そして２サイクルのショ糖密度勾配遠心分離に
よって純化される。プロテイナーゼＩくおよびリボヌク
レアーゼインヒビターの存在下にＳＤＳで該タンパク質
を可溶化（例えは３７℃で１時間インキュベー１・する
。）した後に、該ＲＮＡは例えばフェノールを用いて抽
出され、そしてエタノールで沈澱される。このＲＮＡを
テンプレートとして用いて、次に、該ウィルス性ＲＮＡ
に対し相補性を白°するＤＮＡが、例えばガブリエルと
ホフマンの方法［Ｇｕｂｌｃｒ ａｎｄ ｌ１ｏｆ’ｍ
ａｎｎ］ ＜Ｇａｎａ ２５．２６３−２６９．１９８
３）によって、例えばトリ骨髄芽球ウィルスからの逆転
写酵素によって試験官内において合成される。子ウシ胸
腺ＤＮＡから寿られたヘキサヌクレオチドブライマーな
どのようなブライマーを用いて、ウィルス性ＲＮＡは、
例えば英国アメルシャン社［Ａｍｃｒｓｈａｍ、 ＩＥ
ｎｇｌａｎｄ］から出版された’ ｃ Ｄ Ｎ Ａ
５ｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ”にお（１て述べら
れるような適当な条件下において、基質としてのデオキ
シアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ） 、デオキシチミジ
ン三リン酸（ｄＴＴＰ） 、デオキシグアノシン三リン
酸（ｄＧＴＰ）およびデオキンサイチジン三リン酸（ｄ
ＣＴＰ）と共に逆転写酵素とインキュベ−１・される。
で形質転換された細胞の製造、ならびにヌクレオチド配
列の決定の１つの特定のプロセスのより詳細な記述は次
の通りである。まず最初に、ウェスタンサブタイプＴＢ
Ｅウィルス性ＲＮＡが純化ウィルスから得られる。この
目的のため、ウェスタンサブタイプＴＢＥウィルスは一
次ニワトリ胚細胞中で育成され、超遠心分離によって濃
縮され、そして２サイクルのショ糖密度勾配遠心分離に
よって純化される。プロテイナーゼＩくおよびリボヌク
レアーゼインヒビターの存在下にＳＤＳで該タンパク質
を可溶化（例えは３７℃で１時間インキュベー１・する
。）した後に、該ＲＮＡは例えばフェノールを用いて抽
出され、そしてエタノールで沈澱される。このＲＮＡを
テンプレートとして用いて、次に、該ウィルス性ＲＮＡ
に対し相補性を白°するＤＮＡが、例えばガブリエルと
ホフマンの方法［Ｇｕｂｌｃｒ ａｎｄ ｌ１ｏｆ’ｍ
ａｎｎ］ ＜Ｇａｎａ ２５．２６３−２６９．１９８
３）によって、例えばトリ骨髄芽球ウィルスからの逆転
写酵素によって試験官内において合成される。子ウシ胸
腺ＤＮＡから寿られたヘキサヌクレオチドブライマーな
どのようなブライマーを用いて、ウィルス性ＲＮＡは、
例えば英国アメルシャン社［Ａｍｃｒｓｈａｍ、 ＩＥ
ｎｇｌａｎｄ］から出版された’ ｃ Ｄ Ｎ Ａ
５ｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ”にお（１て述べら
れるような適当な条件下において、基質としてのデオキ
シアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ） 、デオキシチミジ
ン三リン酸（ｄＴＴＰ） 、デオキシグアノシン三リン
酸（ｄＧＴＰ）およびデオキンサイチジン三リン酸（ｄ
ＣＴＰ）と共に逆転写酵素とインキュベ−１・される。
このようにして得られたｃＤＮＡ−ＲＮＡ雑抽細胞は、
雑種細胞分子のＲＮＡ中にニックを生じる限定条件下に
おいてリボヌクレアーゼ Ｈで処理される。エシェリキ
ア・コリＤＮＡポリメラーゼＩが、次にニック化ＲＮＡ
をブライマーとして用いてＲＮＡ鎖を１・分に複製する
ために用いられることができる。このようにして得られ
た二重鎖ＲＮＡは、フェノール−クロロフォルム抽出に
よって除タンパクされ、エタノールを用いて沈澱され、
そして残留するＲＮＡフラグメントはりボヌクレアーゼ
での処理（例えばＴＥバッファ中で、３７℃、３０分）
によって除去される。
雑種細胞分子のＲＮＡ中にニックを生じる限定条件下に
おいてリボヌクレアーゼ Ｈで処理される。エシェリキ
ア・コリＤＮＡポリメラーゼＩが、次にニック化ＲＮＡ
をブライマーとして用いてＲＮＡ鎖を１・分に複製する
ために用いられることができる。このようにして得られ
た二重鎖ＲＮＡは、フェノール−クロロフォルム抽出に
よって除タンパクされ、エタノールを用いて沈澱され、
そして残留するＲＮＡフラグメントはりボヌクレアーゼ
での処理（例えばＴＥバッファ中で、３７℃、３０分）
によって除去される。
ｄｓＤＮＡのクローニングは、例えば合成リンカ−を用
いることによって、行なわれる。この目的のため、ｄｓ
ＤＮＡは、適当な条件（Ｍａｎｉａｔｉｓａｔ ａｌ、
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ｃ３ｌＩ
１９ｇ２）下においてエシェリキア・コリＤＮＡポリメ
ラーゼＩのフレノウフラグメントで処理されて、クロー
ン化可能なプラントエンド［ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ］の最
大量を確められ、次いで除タンパクのためにフェノール
抽出される。ｄｓＤＮＡは、適当な条件下においてＤＮ
Ａリガーゼの存在下にＢａｍＨＩとインキュベートされ
る。反応混合物は１％アガロースゲル」ユに負荷、泳動
され、そしてｃＤＮＡの種々のサイズのクラスがゲルか
ら切出され、そして例えば電気溶出によって精製される
。一方、ベクターＤＮＡとして用いられるプラスミドＤ
ＮＡ、例えばエシェリキア・コリプラスミドＢＬＵＩ：
ＳＣ１？１Ｉ）１’ ＳＫ−は、制限エンドヌクレアー
ゼＢａｍＨＩで切断され、そして細菌性アルカリフォス
ファターゼの使用によって脱リン酸化される。ＢａｍＨ
ＩでのｃＤＮＡの消化の後に、それはＢａｍＨＩ切断ベ
クターＤＮＡと混合され、そして双方のＤＮＡ分子の末
端で突出する相補的配列の雑種形成をもたらすために適
当な条件にてインキュベートされ、さらにＴ４−ＤＮＡ
リガーゼの使用によって連結される。
いることによって、行なわれる。この目的のため、ｄｓ
ＤＮＡは、適当な条件（Ｍａｎｉａｔｉｓａｔ ａｌ、
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ｃ３ｌＩ
１９ｇ２）下においてエシェリキア・コリＤＮＡポリメ
ラーゼＩのフレノウフラグメントで処理されて、クロー
ン化可能なプラントエンド［ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ］の最
大量を確められ、次いで除タンパクのためにフェノール
抽出される。ｄｓＤＮＡは、適当な条件下においてＤＮ
Ａリガーゼの存在下にＢａｍＨＩとインキュベートされ
る。反応混合物は１％アガロースゲル」ユに負荷、泳動
され、そしてｃＤＮＡの種々のサイズのクラスがゲルか
ら切出され、そして例えば電気溶出によって精製される
。一方、ベクターＤＮＡとして用いられるプラスミドＤ
ＮＡ、例えばエシェリキア・コリプラスミドＢＬＵＩ：
ＳＣ１？１Ｉ）１’ ＳＫ−は、制限エンドヌクレアー
ゼＢａｍＨＩで切断され、そして細菌性アルカリフォス
ファターゼの使用によって脱リン酸化される。ＢａｍＨ
ＩでのｃＤＮＡの消化の後に、それはＢａｍＨＩ切断ベ
クターＤＮＡと混合され、そして双方のＤＮＡ分子の末
端で突出する相補的配列の雑種形成をもたらすために適
当な条件にてインキュベートされ、さらにＴ４−ＤＮＡ
リガーゼの使用によって連結される。
組換ＤＮＡ分子は、コンピテント（受容［ｅｏｍｐｃｔ
ｃｎｔ］）エシェリキア・コリ株（例えばエシェリキア
・コリＸ Ｌ １− ｂｌｕｅ）を形質転換するために
用いられる。ウィルス特異性挿入物を含有する組換体は
、色選別によって同定される。プラスミドはミニ−プラ
スミド調製法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ Ｄｏｌｙ、
Ｎｕｅｌｃｉｃ Ａｃ１ｄｓ ｌシｃｓｃａｒｃｈ
７．１１９５−１２０４．１９７９）によって単離され
、そして挿入物の大きさはＢ ａ ｍ ＨＩを用いた制
限酵素分析によって分析され、またフラグメントの分離
は１％アガロースゲル上において得られる。
ｃｎｔ］）エシェリキア・コリ株（例えばエシェリキア
・コリＸ Ｌ １− ｂｌｕｅ）を形質転換するために
用いられる。ウィルス特異性挿入物を含有する組換体は
、色選別によって同定される。プラスミドはミニ−プラ
スミド調製法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ Ｄｏｌｙ、
Ｎｕｅｌｃｉｃ Ａｃ１ｄｓ ｌシｃｓｃａｒｃｈ
７．１１９５−１２０４．１９７９）によって単離され
、そして挿入物の大きさはＢ ａ ｍ ＨＩを用いた制
限酵素分析によって分析され、またフラグメントの分離
は１％アガロースゲル上において得られる。
これらの挿入物の塩基配列は、サンガーら［Ｓａｎｇｅ
ｒ ａｔ ａｌ］によるダイデオキシチエインターミネ
ータ−法（１）ＮＡＳ ＵＳＡ、 ７４．５４６３−５
４６７、１９７）によって決定される。得られた配列は
、ゲノムＲＮＡの全配列における研究の下に配列の位置
を決定するために、コンピュータープログラムの助けを
かりて、他のワラビウィルスの既知の配列（Ｉ？ｉｅｃ
ｃｔ ａｌ、 ５ｃｉｅｎｃｅ ２２９．７２６−７
３３．１９８５； Ｄａｌｇａｒｎｏ ｃｔ ａｌ、
Ｊ、 Ｍｏ１．旧ｏ１．１８７．３０９−３２３．１９
８６； Ｃａ５ｔｌｃ ａｔ ａｌ、 Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ １４７２２７−２３（ｉ、 １９８５； Ｃａ５ｔ
ｌｅａｔ ａｌ、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １４９．１０−
２６．１９８０； Ｗｃｎｇｌｃｒ ｃｔ ａｌ、 Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ １４７．２６４−２７４．１９８５；
ＹａＩＩｌｓｈｃｈｉｋｏｖ ａｎｄ Ｐｌｃｔｎｅ
ｖ、 Ｎｕｃｌｃｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｃｓ、 １６７７
５０．１９８８）との相同性を分υｉされる。第２図は
、完全ヌクレオチド配列をまた第３図はウェスタンサブ
タイプＴＢＥウィルスゲノムのＮＳＩ領域の相当するア
ミノ酸配列を示すものである。
ｒ ａｔ ａｌ］によるダイデオキシチエインターミネ
ータ−法（１）ＮＡＳ ＵＳＡ、 ７４．５４６３−５
４６７、１９７）によって決定される。得られた配列は
、ゲノムＲＮＡの全配列における研究の下に配列の位置
を決定するために、コンピュータープログラムの助けを
かりて、他のワラビウィルスの既知の配列（Ｉ？ｉｅｃ
ｃｔ ａｌ、 ５ｃｉｅｎｃｅ ２２９．７２６−７
３３．１９８５； Ｄａｌｇａｒｎｏ ｃｔ ａｌ、
Ｊ、 Ｍｏ１．旧ｏ１．１８７．３０９−３２３．１９
８６； Ｃａ５ｔｌｃ ａｔ ａｌ、 Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ １４７２２７−２３（ｉ、 １９８５； Ｃａ５ｔ
ｌｅａｔ ａｌ、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １４９．１０−
２６．１９８０； Ｗｃｎｇｌｃｒ ｃｔ ａｌ、 Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ １４７．２６４−２７４．１９８５；
ＹａＩＩｌｓｈｃｈｉｋｏｖ ａｎｄ Ｐｌｃｔｎｅ
ｖ、 Ｎｕｃｌｃｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｃｓ、 １６７７
５０．１９８８）との相同性を分υｉされる。第２図は
、完全ヌクレオチド配列をまた第３図はウェスタンサブ
タイプＴＢＥウィルスゲノムのＮＳＩ領域の相当するア
ミノ酸配列を示すものである。
これゆえ、本発明は最初にウェスタンサブタイプＴＢＥ
ウィルスのＮＳＩタンパク質に関しＰ ｌ；化する遺伝
子のヌクレオチド配列を提供し、そして結果的に、この
タンパク質のアミノ酸配列をも提供する。
ウィルスのＮＳＩタンパク質に関しＰ ｌ；化する遺伝
子のヌクレオチド配列を提供し、そして結果的に、この
タンパク質のアミノ酸配列をも提供する。
第２図に示す塩基配列は、ウェスタンサブタイプＴＢＥ
ウィルスＮＳＩタンパク質の特性を白°するポリペプチ
ドに関し暗号化するＤＮＡとしての好ましい例の１つで
ある。遺伝暗号の退化に起因して、同様のアミノ酸配列
もまた、この図に示したちの以外の３塩基連鎖によって
暗号化され得る。
ウィルスＮＳＩタンパク質の特性を白°するポリペプチ
ドに関し暗号化するＤＮＡとしての好ましい例の１つで
ある。遺伝暗号の退化に起因して、同様のアミノ酸配列
もまた、この図に示したちの以外の３塩基連鎖によって
暗号化され得る。
本発明の保護の範囲内において、突然変異、転位および
退化によって修飾された配列、アミノ酸配列に関する暗
号のみならずＮＳＩタンパク質の本質的抗原性特性を有
する配列もまた存在する。
退化によって修飾された配列、アミノ酸配列に関する暗
号のみならずＮＳＩタンパク質の本質的抗原性特性を有
する配列もまた存在する。
さらに、本発明は、天然のウェスタンザブタイプＴＢＥ
ウィルス単離体のＮＳＩ配列の単に−例を表わすもので
ある第３図に示される配列と正！ｉｆに同じアミノ酸配
列のみに関係するものではない。
ウィルス単離体のＮＳＩ配列の単に−例を表わすもので
ある第３図に示される配列と正！ｉｆに同じアミノ酸配
列のみに関係するものではない。
ＲＮＡウィルスのゲノムは、ＲＮＡポリメラーゼの高い
失敗率およびブルーフリーディング機構の欠如に起因し
て、ＤＮＡウィルスあるいは細胞性遺伝ｒに見られるも
のよりもより高い変異度をり。
失敗率およびブルーフリーディング機構の欠如に起因し
て、ＤＮＡウィルスあるいは細胞性遺伝ｒに見られるも
のよりもより高い変異度をり。
しやすいことはよく知られている事実である（ｌｌ。
１１ａｎｄ ａｔ ａｌ、 ５ｅｉｃｎｅｃ ２１５．
１５７？−１５８５，１９８２； Ｒｅａｎｎｃｙ 、
Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、 Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ、 ３６．４
７−７３．１９８２）。
１５７？−１５８５，１９８２； Ｒｅａｎｎｃｙ 、
Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、 Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ、 ３６．４
７−７３．１９８２）。
ウィルスの特徴に依存して、これらの突然変異は、イン
フルエンザウィルスの場合におけるように、抗原通続変
異による新しいウィルスタイプの迅速な発達をもたらす
であろう（Ｂｏｔｈ ａｔ ａｌ １ｎ：”ｌ’ｈｃＯ
ｒｉｇｉｎ ｏｆ Ｐａｎｄｃａ＋ｉｅ Ｉｎｆｌｕｅ
ｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ 、 １． Ｇ、 Ｌａｙｅｒ
（ｃ’ｄ、）、 Ｅｌｓｃｖｌｃｒ、 １９８３）。
フルエンザウィルスの場合におけるように、抗原通続変
異による新しいウィルスタイプの迅速な発達をもたらす
であろう（Ｂｏｔｈ ａｔ ａｌ １ｎ：”ｌ’ｈｃＯ
ｒｉｇｉｎ ｏｆ Ｐａｎｄｃａ＋ｉｅ Ｉｎｆｌｕｅ
ｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ 、 １． Ｇ、 Ｌａｙｅｒ
（ｃ’ｄ、）、 Ｅｌｓｃｖｌｃｒ、 １９８３）。
一方、ＲＮＡウィルスは自然において抗原的により安定
であり害る。これはおそらく、抗原的に活性なタンパク
質における広範な構造変化を許さない機能的束縛による
ものであろう。しかしながら、変化の幾らかの度合は勘
定に入れる必要があり、また種々の天然単離体の配列比
較によって例示されることができる。
であり害る。これはおそらく、抗原的に活性なタンパク
質における広範な構造変化を許さない機能的束縛による
ものであろう。しかしながら、変化の幾らかの度合は勘
定に入れる必要があり、また種々の天然単離体の配列比
較によって例示されることができる。
これは、例えば、第２図に示されるプロトタイプ単離体
の配列に従い調製された合成オリゴヌクレオチドをブラ
イマーとして用いるチェーンターミネート法によって、
種々の単離体のＲＮＡを配列決定することによって行な
われ得る。
の配列に従い調製された合成オリゴヌクレオチドをブラ
イマーとして用いるチェーンターミネート法によって、
種々の単離体のＲＮＡを配列決定することによって行な
われ得る。
プロトタイプ配列と比較して、ウェスタンサブタイプＴ
ＢＥウィルスの他の天然単離体において見られるように
わずかな変容を示す全ての配列はいずれも本発明に３ま
れるものである。このような変容は、核酸の試験管内に
おける修飾によっても得られうるちのである。これゆえ
、本発明は、厳重な条件下（例えば、述べられた配列あ
るいは配列の一部と少なくとも９０％のヌクレオチド配
列の同一性で選択する）において雑種形成される、およ
び好ましくは、ウェスタンサブタイプＴＢＥウィルス構
成タンパク賀の本質的な抗原決定特性をＵするタンパク
質ないしはペプチドに関し暗号化するすべての配列を包
含するものである。
ＢＥウィルスの他の天然単離体において見られるように
わずかな変容を示す全ての配列はいずれも本発明に３ま
れるものである。このような変容は、核酸の試験管内に
おける修飾によっても得られうるちのである。これゆえ
、本発明は、厳重な条件下（例えば、述べられた配列あ
るいは配列の一部と少なくとも９０％のヌクレオチド配
列の同一性で選択する）において雑種形成される、およ
び好ましくは、ウェスタンサブタイプＴＢＥウィルス構
成タンパク賀の本質的な抗原決定特性をＵするタンパク
質ないしはペプチドに関し暗号化するすべての配列を包
含するものである。
ＮＳ−１のようなタンパク質に関し暗号化するヌクレオ
チド配列の適当なベクターへの、および高レベルでの発
現のための宿主細胞への挿入は、タンパク質の構造およ
び生物学的機能の研究に関する強力な技術である。用い
られる発現系は常に、例えば興味対照のタンパク質分子
の翻訳後修飾などのようなある分子特性に依存している
。
チド配列の適当なベクターへの、および高レベルでの発
現のための宿主細胞への挿入は、タンパク質の構造およ
び生物学的機能の研究に関する強力な技術である。用い
られる発現系は常に、例えば興味対照のタンパク質分子
の翻訳後修飾などのようなある分子特性に依存している
。
発現は、原核ないしは真核細胞系において行なわれるこ
とができる。ＮＳ−１のような糖タンパク質に関しては
、発現は固有のグリコジル化が可能な真核宿主細胞にお
いて行なわれることが好ましい。
とができる。ＮＳ−１のような糖タンパク質に関しては
、発現は固有のグリコジル化が可能な真核宿主細胞にお
いて行なわれることが好ましい。
１つの好ましい発現系は、ワクシニアウィルスおよび培
地において連続的に培養される霊長類細胞からなるもの
である。これは、正しい翻訳後修飾および高レベルな合
成が達成され得ることを確かなものとするないしは確か
なものとすることを助成するものである。
地において連続的に培養される霊長類細胞からなるもの
である。これは、正しい翻訳後修飾および高レベルな合
成が達成され得ることを確かなものとするないしは確か
なものとすることを助成するものである。
さらにまた、ワクシニアウィルスの遺伝ｒ規制配列は、
“後明相［１ａｔａ ｐｈａｓｅ］″プロモータを使用
するあるいはウィルス複製のｊｉｊ明および後明相の開
店性である“構成的［ｅｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖａ］”プ
ロモーターを使用するほとんどの異質タンパク質の合成
を指示することができるというｌ・分な＝１１：拠があ
る （Ｍｏｓｓ ａｎｄ Ｆｌｃｘｎｃｒ、Ａｎｎ
、Ｒｅｖ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、４ ３０５−３２４．
（１９８７） ）。しかしながら、ワクシニアウィルス
感染細胞中に発現した異種タンパク質の安定性は、興味
対象の遺伝子の発現を規制したプロモーターによって強
く影響されることが報告されている（Ｃｏｕｐａｒ ｅ
ｔ ａｌ、 ｆｕｒ、 Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 １６
１４７９（１９８Ｂ）： ｌ’ｏｖｎｓｃｎｄ ａｔ
ａｌ、 Ｊ、 ＩＥｘｐ−Ｍａｄ、 １６８１２１１−
１２２４ （１９８８） ）。
“後明相［１ａｔａ ｐｈａｓｅ］″プロモータを使用
するあるいはウィルス複製のｊｉｊ明および後明相の開
店性である“構成的［ｅｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖａ］”プ
ロモーターを使用するほとんどの異質タンパク質の合成
を指示することができるというｌ・分な＝１１：拠があ
る （Ｍｏｓｓ ａｎｄ Ｆｌｃｘｎｃｒ、Ａｎｎ
、Ｒｅｖ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、４ ３０５−３２４．
（１９８７） ）。しかしながら、ワクシニアウィルス
感染細胞中に発現した異種タンパク質の安定性は、興味
対象の遺伝子の発現を規制したプロモーターによって強
く影響されることが報告されている（Ｃｏｕｐａｒ ｅ
ｔ ａｌ、 ｆｕｒ、 Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 １６
１４７９（１９８Ｂ）： ｌ’ｏｖｎｓｃｎｄ ａｔ
ａｌ、 Ｊ、 ＩＥｘｐ−Ｍａｄ、 １６８１２１１−
１２２４ （１９８８） ）。
ＮＳ−１特異性挿入物を含１゛する適当な発現プラスミ
ドの構築は、広範なＤＮＡ操作を必要とする。ＮＳ−１
は、細胞性およびウィルス性プロテアーゼによって個々
のタンパク質中へ翻訳後的にプロセッシングされたポリ
プロティンの一部であると考慮されるべきである（Ｍａ
ｎｄｌ ｃｔ ａｔ、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７３２９
１−３０１（１９８９） ）。天然ウィルス感染の経路
において、ＮＳ−１の合成はＮＨ２末端での内部債ｔシ
ー配列を包含するものである。この信ｔ」・は、小胞体
の内腔中・＼新生短鎖ポリペプチドを導（。
ドの構築は、広範なＤＮＡ操作を必要とする。ＮＳ−１
は、細胞性およびウィルス性プロテアーゼによって個々
のタンパク質中へ翻訳後的にプロセッシングされたポリ
プロティンの一部であると考慮されるべきである（Ｍａ
ｎｄｌ ｃｔ ａｔ、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７３２９
１−３０１（１９８９） ）。天然ウィルス感染の経路
において、ＮＳ−１の合成はＮＨ２末端での内部債ｔシ
ー配列を包含するものである。この信ｔ」・は、小胞体
の内腔中・＼新生短鎖ポリペプチドを導（。
このことはグリコジル化のような固ｈ°の翻訳後修飾の
ために必要とされるものである。正値にプロセッシング
された発現産物を得るために、この配列あるいは非対応
信じ配列が組換体分子中に含まれるべきである。
ために必要とされるものである。正値にプロセッシング
された発現産物を得るために、この配列あるいは非対応
信じ配列が組換体分子中に含まれるべきである。
さらにまた、ＮＳ−１はポリプロティンの一部であるの
で、これは翻訳のための開始および停止コドンを含んで
いない。これらは特異的組換ＤＮＡ操作によって提供さ
れるべきである。
で、これは翻訳のための開始および停止コドンを含んで
いない。これらは特異的組換ＤＮＡ操作によって提供さ
れるべきである。
疎水性（５′）信す−および（３′）アンカー配列は、
クローン１７−６の配列（第３図）中に３まれでいる。
クローン１７−６の配列（第３図）中に３まれでいる。
適当なエンドヌクレアーゼ制限サイトの欠如は、ＮＳ−
１のその“天然“（３号配列を用いての挿入ベクター中
への重置なりローニングをもたらすことはない。これゆ
え、ＮＳ−１信号配列および成熟ＮＳ−１の配列からな
る１２００ｂｐの区間が、例えばポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）において合成される。この技術はまた、拡大
されたＤＮＡの両端１−の任意の制限サイト、ならびに
開始および信号配列の導入をもたらすものである。
１のその“天然“（３号配列を用いての挿入ベクター中
への重置なりローニングをもたらすことはない。これゆ
え、ＮＳ−１信号配列および成熟ＮＳ−１の配列からな
る１２００ｂｐの区間が、例えばポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）において合成される。この技術はまた、拡大
されたＤＮＡの両端１−の任意の制限サイト、ならびに
開始および信号配列の導入をもたらすものである。
増幅のために特別に設計されたブライマ一対は、制限エ
ンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩに対する識別サイトによっ
て側面を固められたＮＳ−１配列産物をもたらす。この
方法論を用いて、自然発生ずる任意の信５；・配列によ
っであるいはブイ、 ヘインジエ［ｖ、 １ｌａｉｎｊ
ｃｌ （ＮＡＲ１４４６８３−４８９０（１９８Ｅｉ
） ）による提唱に従う合成コンセンサス信ｔｊ配列に
よって、真正ＮＳ−１信号配列を交換することが可能で
ある。
ンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩに対する識別サイトによっ
て側面を固められたＮＳ−１配列産物をもたらす。この
方法論を用いて、自然発生ずる任意の信５；・配列によ
っであるいはブイ、 ヘインジエ［ｖ、 １ｌａｉｎｊ
ｃｌ （ＮＡＲ１４４６８３−４８９０（１９８Ｅｉ
） ）による提唱に従う合成コンセンサス信ｔｊ配列に
よって、真正ＮＳ−１信号配列を交換することが可能で
ある。
ＮＳ−１分子・の発現のために特別に発達されたすべて
のプラスミドは、例えば霊長類ＣＶ−１細胞のような許
容宿主細１泡における相同の組換によって、親ワクシニ
アウィルス（株ＷＲまたはこれの転写減衰化誘導体［ａ
ｔｔｃｎｕａｔｃｄ ｄｃｒｉｖａｔａ］ ）中へ転位
されることができる。組換ワクシニアウィルスを発生さ
せるための実験的手順は、周知のものであり、また当業
者にとって熟知されているものであるので、記述する必
要はないと思われる（Ｍａｅｋａｔｔ ａｔ ａｌ、
ＪＲＬ Ｐｒｅｓｓ； ”ＤＮＡ ｅｌｏｎｉｎｇ Ｉ
ｔ°゛Ｅｄ、 ＤＭ Ｇｌｏｖｅｒ １９１−２１１．
１９８５）。
のプラスミドは、例えば霊長類ＣＶ−１細胞のような許
容宿主細１泡における相同の組換によって、親ワクシニ
アウィルス（株ＷＲまたはこれの転写減衰化誘導体［ａ
ｔｔｃｎｕａｔｃｄ ｄｃｒｉｖａｔａ］ ）中へ転位
されることができる。組換ワクシニアウィルスを発生さ
せるための実験的手順は、周知のものであり、また当業
者にとって熟知されているものであるので、記述する必
要はないと思われる（Ｍａｅｋａｔｔ ａｔ ａｌ、
ＪＲＬ Ｐｒｅｓｓ； ”ＤＮＡ ｅｌｏｎｉｎｇ Ｉ
ｔ°゛Ｅｄ、 ＤＭ Ｇｌｏｖｅｒ １９１−２１１．
１９８５）。
本発明はまた、細菌性宿主におけるＭＳ−１分子の合成
に関するものである。細菌細胞において発現される糖タ
ンパク質は、真核細胞におけるものと同様の様式におい
ては、通常グリコジル化されない。しかしながら、ＮＳ
−１の合成は、非グリコジル化形態においても、異なる
目的のためにａ用である。−例として、細―細胞におい
て発現されるＨＩＶ−１のエンベロープ糖タンパク質（
ｇｐ）１６０の誘導体は、ＨＩＶ診断および実験用ワク
チン処理を顕著に形成してきている。
に関するものである。細菌細胞において発現される糖タ
ンパク質は、真核細胞におけるものと同様の様式におい
ては、通常グリコジル化されない。しかしながら、ＮＳ
−１の合成は、非グリコジル化形態においても、異なる
目的のためにａ用である。−例として、細―細胞におい
て発現されるＨＩＶ−１のエンベロープ糖タンパク質（
ｇｐ）１６０の誘導体は、ＨＩＶ診断および実験用ワク
チン処理を顕著に形成してきている。
ワクシニアウィルスを用いての組換に関する挿入プラス
ミドの構築に類似して、真正信号配列を念ｈ°するＮＳ
−１配列がＰＣＲを用いて合成され、そして例えばｐＵ
Ｃ−１９中へクローニングされる。細菌細胞からのＭＳ
−１分丁のし分な分泌を得るために、ＴＢＥ信弓°配列
のカ１（核信５；・配列による置換が実行される。後者
は、ＮＳ−１の凝集を１（ｆｌ止し、そして洗浄剤ない
しはその他の可溶化剤を用いて溶解しなければならない
封入体の形成を阻止するものである。
ミドの構築に類似して、真正信号配列を念ｈ°するＮＳ
−１配列がＰＣＲを用いて合成され、そして例えばｐＵ
Ｃ−１９中へクローニングされる。細菌細胞からのＭＳ
−１分丁のし分な分泌を得るために、ＴＢＥ信弓°配列
のカ１（核信５；・配列による置換が実行される。後者
は、ＮＳ−１の凝集を１（ｆｌ止し、そして洗浄剤ない
しはその他の可溶化剤を用いて溶解しなければならない
封入体の形成を阻止するものである。
完全でかつ成熟したＮＳ−１の合成の他にも、この実験
的プロトコルはまた、ＮＳ−１分子の不完全な形態に対
しても適用できるものである。不完全な分子は、タンパ
ク質の特異的サイトを指向する免疫応答を誘発するため
に用いられることができる。このような形態はまた、“
部位指向化１（１清学［５ｌｔｃ ｄｉｒｃｃＬｃｄ
ｓｅｒｏｌｏｇｙｌ”を実行するための価値ある道具と
なることができる。ＮＳ−１中の免疫学的関連エピト−
プは、アジュバントとしての担体分子（例えば、ＨＢ−
核粒−Ｊ′″−）中へ、あるいは免疫刺激性複合体（ｉ
ｍｍｕｎｓｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｃ。
的プロトコルはまた、ＮＳ−１分子の不完全な形態に対
しても適用できるものである。不完全な分子は、タンパ
ク質の特異的サイトを指向する免疫応答を誘発するため
に用いられることができる。このような形態はまた、“
部位指向化１（１清学［５ｌｔｃ ｄｉｒｃｃＬｃｄ
ｓｅｒｏｌｏｇｙｌ”を実行するための価値ある道具と
なることができる。ＮＳ−１中の免疫学的関連エピト−
プは、アジュバントとしての担体分子（例えば、ＨＢ−
核粒−Ｊ′″−）中へ、あるいは免疫刺激性複合体（ｉ
ｍｍｕｎｓｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｃ。
ｍｐｌｃｘ： ＩＳＣＯＭ） （Ｍｏｒｃｉｎ ａｔ
ａｌ、 Ｉｎｍｕｎｏｌｏｇｙ ｌ”ｏｄａｙ ８（
１１） ３３３−３３８ （１９８７） ）中へ取込ま
れるようになる。
ａｌ、 Ｉｎｍｕｎｏｌｏｇｙ ｌ”ｏｄａｙ ８（
１１） ３３３−３３８ （１９８７） ）中へ取込ま
れるようになる。
本明細書において述べられた原核および真核ｆ曳糸にお
いて合成された任：？：：５．のＮＳ−１分子は、単独
で、あるいはおそらくこれとＴＢＥ−ウィルス（臼）−
Ａ−０２８４７９１）組換糖タンパク質−Ｅとのまたは
不活性化ＴＢＥ−ウィルスからなる既存のワクチンとの
組合せのいずれにおいても、ＮＳ−１ワクチン蚊補とし
て適した分子を表わす。
いて合成された任：？：：５．のＮＳ−１分子は、単独
で、あるいはおそらくこれとＴＢＥ−ウィルス（臼）−
Ａ−０２８４７９１）組換糖タンパク質−Ｅとのまたは
不活性化ＴＢＥ−ウィルスからなる既存のワクチンとの
組合せのいずれにおいても、ＮＳ−１ワクチン蚊補とし
て適した分子を表わす。
さらにこの非構造的タンパク質またはその一部分に対す
る免疫応答の分析は、ＴＢＥウィルスおよびワラビウィ
ルス属の他のメンバーの病因性を理解するのに臨界的で
ある。
る免疫応答の分析は、ＴＢＥウィルスおよびワラビウィ
ルス属の他のメンバーの病因性を理解するのに臨界的で
ある。
異種ＤＮＡないしＲＮＡ配列もまた、生きたウィルスの
ゲノｔ、中に遺伝子工学されることができ、これにより
、生ワクチンとして用いることのできる組換ウィルスが
発生される（Ｍａｅｌｃｔｔ ａｎｔｉ ＳｇＪｉｔｈ
、 Ｊ、 ＧＯＩｌ、 Ｖｉｒｏｌ、 ６７、２０６７
−２０８２．１９８（ｉを参照のこと。）。
ゲノｔ、中に遺伝子工学されることができ、これにより
、生ワクチンとして用いることのできる組換ウィルスが
発生される（Ｍａｅｌｃｔｔ ａｎｔｉ ＳｇＪｉｔｈ
、 Ｊ、 ＧＯＩｌ、 Ｖｉｒｏｌ、 ６７、２０６７
−２０８２．１９８（ｉを参照のこと。）。
さらに、異なる遺伝子の組合せ、例えば異なるウィルス
から誘導された遺伝ｒの組合せは、Ｘ■換ＤＮＡ技術に
よって同時に発現されることができ、そして予防接種に
用いられることができる（ＰａｒｋＬＩＳ ａｔ ａｌ
、 ５ｅｉｃｎｃｃ、 ２２９．９８１−９８４．１９
８５ ） Ｏそれゆえ、本発明は、開示した配列と、そ
の他の配列、例えば、他のタンパク質に関し暗ぢ・化す
る遺伝子、またはプロモーター、エンハンサ−、ポリア
デニル化もしくはスプライシング信弓゛のようなタンパ
ク質の発現を構築する配列との任意の組合せを含むもの
である。
から誘導された遺伝ｒの組合せは、Ｘ■換ＤＮＡ技術に
よって同時に発現されることができ、そして予防接種に
用いられることができる（ＰａｒｋＬＩＳ ａｔ ａｌ
、 ５ｅｉｃｎｃｃ、 ２２９．９８１−９８４．１９
８５ ） Ｏそれゆえ、本発明は、開示した配列と、そ
の他の配列、例えば、他のタンパク質に関し暗ぢ・化す
る遺伝子、またはプロモーター、エンハンサ−、ポリア
デニル化もしくはスプライシング信弓゛のようなタンパ
ク質の発現を構築する配列との任意の組合せを含むもの
である。
完全な自然発生タンパク質が免疫あるいは診断的目的の
ために用いられるべき必要性のないことは、当業者によ
く知られていることである（Ｌｃｒｎａｒ、 Ｎａｔｕ
ｒｅ ２９９．５９２−５９６．１９８２： Ａｒｎｏ
ｎ、 １’１１３Ｓ １１、５２１−５２４．１９８６
＞。
ために用いられるべき必要性のないことは、当業者によ
く知られていることである（Ｌｃｒｎａｒ、 Ｎａｔｕ
ｒｅ ２９９．５９２−５９６．１９８２： Ａｒｎｏ
ｎ、 １’１１３Ｓ １１、５２１−５２４．１９８６
＞。
ワクチンあるいは診断試薬として用いられるタンパク質
あるいはタンパク質の一部分は、１−記したような組換
ＤＮＡ技術によってのみ調製され得るものではない。本
発明において開示された遺伝子情報はまたオリゴペプチ
ドの化学合成にも用いることができるものである。この
課題に関して多くの文献が入手可能である。多くの異な
るタンパク質に関し暗弓化するＤＮＡ配列に従い合成さ
れたペプチドが調製され、そして分子生物学的および免
疫学的研究（Ｌｃｒｎｃｒ ａｔ ａｔ、 Ｃｅ１ｌ、
２３．３０９−３１０、 １９８１； Ｌｃｒｎｃ
ｒ、 Ｎａｔｕｒｅ、 ２９９． ５９２−５９６
． １９８２）あるいはｒ防接種（Ｓｈｉｎｎｉｃｋ
ａｔ ａｌ、 Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ
、３７．４２５−４４６．１９８３； ＤｉＭａｒｅ
ｈｉ ｃｔ ａｔ、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 ２３２．６
３９−６４１，１９８（Ｓ）のような種々の［１的のた
めに用いられてきている。これゆえ、本発明において開
示される配列に相当するペプチドあるいはペプチドの組
合せの調製および使用は、当技術分野の状態を表すもの
である。
あるいはタンパク質の一部分は、１−記したような組換
ＤＮＡ技術によってのみ調製され得るものではない。本
発明において開示された遺伝子情報はまたオリゴペプチ
ドの化学合成にも用いることができるものである。この
課題に関して多くの文献が入手可能である。多くの異な
るタンパク質に関し暗弓化するＤＮＡ配列に従い合成さ
れたペプチドが調製され、そして分子生物学的および免
疫学的研究（Ｌｃｒｎｃｒ ａｔ ａｔ、 Ｃｅ１ｌ、
２３．３０９−３１０、 １９８１； Ｌｃｒｎｃ
ｒ、 Ｎａｔｕｒｅ、 ２９９． ５９２−５９６
． １９８２）あるいはｒ防接種（Ｓｈｉｎｎｉｃｋ
ａｔ ａｌ、 Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ
、３７．４２５−４４６．１９８３； ＤｉＭａｒｅ
ｈｉ ｃｔ ａｔ、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 ２３２．６
３９−６４１，１９８（Ｓ）のような種々の［１的のた
めに用いられてきている。これゆえ、本発明において開
示される配列に相当するペプチドあるいはペプチドの組
合せの調製および使用は、当技術分野の状態を表すもの
である。
例えばダニあるいは体液中のウィルスＲＮＡを測定する
ための、雑種形成プローブを調製するために、本発明に
よって提供された核酸および配列を使用することは、当
業者において公知のことである（Ｍｃｊｎｋｏｔｈ ａ
ｎｄ Ｗａｈｌ、 Ａｎａｌ、 １３ｉｏｅｈｃｍ、
１３８゜２６７−２８４．１９８４； Ｋｕｌｓｋｉ
ａｎｄ Ｎｏｒｖａｌ、 Ａｒｃｈ、 Ｖｉｒｏｌ、
８３．３−１５．１９８５） 、これらは、組換ＤＮＡ
技術によって、あるいは開示された配列によるオリゴヌ
クレオチドの化学合成にによって調製されることができ
る。
ための、雑種形成プローブを調製するために、本発明に
よって提供された核酸および配列を使用することは、当
業者において公知のことである（Ｍｃｊｎｋｏｔｈ ａ
ｎｄ Ｗａｈｌ、 Ａｎａｌ、 １３ｉｏｅｈｃｍ、
１３８゜２６７−２８４．１９８４； Ｋｕｌｓｋｉ
ａｎｄ Ｎｏｒｖａｌ、 Ａｒｃｈ、 Ｖｉｒｏｌ、
８３．３−１５．１９８５） 、これらは、組換ＤＮＡ
技術によって、あるいは開示された配列によるオリゴヌ
クレオチドの化学合成にによって調製されることができ
る。
本発明は以下の実施例に、よりさらに具体的に述べられ
る。用いられた手法は、何ら限定的なものではないが、
当分野において定型的に用いられるものに従うものであ
る。このような手法は、ザンブルック、フリッチおよび
マニアチ°ス［Ｓａｍｂｒｏｏｋ。
る。用いられた手法は、何ら限定的なものではないが、
当分野において定型的に用いられるものに従うものであ
る。このような手法は、ザンブルック、フリッチおよび
マニアチ°ス［Ｓａｍｂｒｏｏｋ。
Ｆｒ１ｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓｌの”Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ″ （第２版） 、Ｃｏｔｓ Ｓ
ｐｒｉｎｇ ｌ１ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ、 １９８９を含むいくつかの基本書におい
て見られるものである。
１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ″ （第２版） 、Ｃｏｔｓ Ｓ
ｐｒｉｎｇ ｌ１ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ、 １９８９を含むいくつかの基本書におい
て見られるものである。
実施例
実施例Ｉ ＴＢＥウィルスの増殖および純化ＴＢＥウ
ィルス感染乳児マウス脳の１０％懸濁液が、１５ｍＭ
ＨＥＰＥＳおよび１５ｍ！ＶＩＥＰＰＳＳｐＨ７，６
で緩衝された最少必須培地中に維持された一次ヒヨコ胎
芽細胞層の感染に用いられた。３７℃で４０時間のイン
キュベーションの後、−１−澄液は４℃において１１０
０００Ｘて３０分間かけて清澄化され、そしてウィルス
は４℃において５００００ｘｇで３時間の超遠心分離に
よってペレット化された。ウィルスは次に、適当な容量
のＴＡＮバッファ（０，０５Ｍ ｌ−リエタノールア
ミン、０．１Ｍ ＮａＣＮ、ｐＨ８，０）中に再懸濁
され、そして５〜２０％（Ｗ／Ｖ）ショ糖密度勾配中で
、４℃において１７００００Ｘｇで１１０分間の速度−
ゾーン遠心分離にかけられた。
ィルス感染乳児マウス脳の１０％懸濁液が、１５ｍＭ
ＨＥＰＥＳおよび１５ｍ！ＶＩＥＰＰＳＳｐＨ７，６
で緩衝された最少必須培地中に維持された一次ヒヨコ胎
芽細胞層の感染に用いられた。３７℃で４０時間のイン
キュベーションの後、−１−澄液は４℃において１１０
０００Ｘて３０分間かけて清澄化され、そしてウィルス
は４℃において５００００ｘｇで３時間の超遠心分離に
よってペレット化された。ウィルスは次に、適当な容量
のＴＡＮバッファ（０，０５Ｍ ｌ−リエタノールア
ミン、０．１Ｍ ＮａＣＮ、ｐＨ８，０）中に再懸濁
され、そして５〜２０％（Ｗ／Ｖ）ショ糖密度勾配中で
、４℃において１７００００Ｘｇで１１０分間の速度−
ゾーン遠心分離にかけられた。
ウィルスのピークは、２５４Ｈｍで勾配を走査すること
で局在化され、そして、２０〜５０％（Ｗ／Ｗ）ショ糖
密度勾配中で４℃において１５００００Ｘｇで１８時間
の平衡密度勾配遠心分離にかけられた。
で局在化され、そして、２０〜５０％（Ｗ／Ｗ）ショ糖
密度勾配中で４℃において１５００００Ｘｇで１８時間
の平衡密度勾配遠心分離にかけられた。
実施例２ ウィルス性ＲＮＡの調製
純化ウィルス１００μｇが、ブロテイナーゼに反応バッ
フｙ （１０ｍＭ Ｔｒ ｉｓ ｐＨ７，８，５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、０．５％（ｗ／ｖ） Ｓ Ｄ Ｓ）
４００ ｌｔΩ中に希釈された。ブロテイナーゼＫが最
終濃度２００ ｔｔ ｇ ／ ｍ １となるまで添加さ
れ、そしてこの混合物は３７℃で１時間インキュベート
された。続いて、該溶液は、これを等量（４００１ｔρ
）のフェノールで２回およびクロロフすルｔ１−イソア
ミルアルコール混液（２４： １）で１回抽出すること
により、除タンパク化された。次に、３Ｍ 酢酸すトリ
ウム溶液２６μｇが添加され、ＲＮＡが２．５容量のエ
タノールで沈澱された。
フｙ （１０ｍＭ Ｔｒ ｉｓ ｐＨ７，８，５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、０．５％（ｗ／ｖ） Ｓ Ｄ Ｓ）
４００ ｌｔΩ中に希釈された。ブロテイナーゼＫが最
終濃度２００ ｔｔ ｇ ／ ｍ １となるまで添加さ
れ、そしてこの混合物は３７℃で１時間インキュベート
された。続いて、該溶液は、これを等量（４００１ｔρ
）のフェノールで２回およびクロロフすルｔ１−イソア
ミルアルコール混液（２４： １）で１回抽出すること
により、除タンパク化された。次に、３Ｍ 酢酸すトリ
ウム溶液２６μｇが添加され、ＲＮＡが２．５容量のエ
タノールで沈澱された。
それ以後の使用に先立ち、ＲＮＡのアリクウォット（−
足部分）を、グリオキサルで変性し、そして１％アガロ
ースゲル１−を泳動させて、調製物の収率と品質を調べ
た。
足部分）を、グリオキサルで変性し、そして１％アガロ
ースゲル１−を泳動させて、調製物の収率と品質を調べ
た。
実施例３ 二重鎖ｃＤＮＡの合成
エタノール沈降化ＲＮＡ５μｇが、ランダムオリゴヌク
レオチドブライマー５μｇを含有する第１鎖合成バッフ
ｙ ［ｆｉｒｓｔ ５ｔｒａｎｄ ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ
ｂｕｆｆｃｒ］ （英国、アメルシャム［Ａｍｃｒ
ｓｈａｍ］社製）４０Ｍｇ中に再！ヒ濁され、７０℃へ
と１分間加熱され、そして室温まで徐冷された。４つの
デオキシヌクレオチドニリン酸のすべてが、１ｍ１ＶＩ
の最終濃度まで添加された。さらに、ヒト胎盤リボヌク
レアーゼインヒビター ５単位およびｔｔ−”ＰｄＣＴ
Ｐが該混合物へと添加された。第１鎖の合成は逆転写酵
素（アメルシャム社製）１００単位の添加により開始さ
れ、そして４２℃にて２時間反応が進行された。その後
、反応混合物は水１−に載置され、そして、第２鎖合成
のための試薬が、次の順序、すなわち、第２鎖合成バッ
フγ［５ｃｅｏｎｄ ５ｔｒａｎｄ ５ｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ ｂｕｆ’ｆｃｒｌ （英国、アメルシャム社製）９
３．５μｇ１リボヌクレアーゼＨ４単位、エシェリキア
・コリＤＮＡポリメラーゼ ２３単位および２５０Ｈｇ
の最終容量までの水の順序で添加された。第２鎖合成は
、その後の１２℃および２２℃でのインキュベーション
（それぞれ２時間）によって行なわれ、そして溶液を７
０℃へと２０分間加熱することで反応は停止された。二
重鎖ｃ Ｄ Ｎ Ａは、プラントエンド［ｂｌｕｎｔ
ａｎｄｌを形成するために、Ｔ４ ＤＮＡポリメラー
ゼ １０単位を用いて、３７℃で２０分間消化された。
レオチドブライマー５μｇを含有する第１鎖合成バッフ
ｙ ［ｆｉｒｓｔ ５ｔｒａｎｄ ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ
ｂｕｆｆｃｒ］ （英国、アメルシャム［Ａｍｃｒ
ｓｈａｍ］社製）４０Ｍｇ中に再！ヒ濁され、７０℃へ
と１分間加熱され、そして室温まで徐冷された。４つの
デオキシヌクレオチドニリン酸のすべてが、１ｍ１ＶＩ
の最終濃度まで添加された。さらに、ヒト胎盤リボヌク
レアーゼインヒビター ５単位およびｔｔ−”ＰｄＣＴ
Ｐが該混合物へと添加された。第１鎖の合成は逆転写酵
素（アメルシャム社製）１００単位の添加により開始さ
れ、そして４２℃にて２時間反応が進行された。その後
、反応混合物は水１−に載置され、そして、第２鎖合成
のための試薬が、次の順序、すなわち、第２鎖合成バッ
フγ［５ｃｅｏｎｄ ５ｔｒａｎｄ ５ｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ ｂｕｆ’ｆｃｒｌ （英国、アメルシャム社製）９
３．５μｇ１リボヌクレアーゼＨ４単位、エシェリキア
・コリＤＮＡポリメラーゼ ２３単位および２５０Ｈｇ
の最終容量までの水の順序で添加された。第２鎖合成は
、その後の１２℃および２２℃でのインキュベーション
（それぞれ２時間）によって行なわれ、そして溶液を７
０℃へと２０分間加熱することで反応は停止された。二
重鎖ｃ Ｄ Ｎ Ａは、プラントエンド［ｂｌｕｎｔ
ａｎｄｌを形成するために、Ｔ４ ＤＮＡポリメラー
ゼ １０単位を用いて、３７℃で２０分間消化された。
実施例４ リンカ一連結
合成５′−リン酸化ＢａｒｎＨＩリンカ−（二二−イン
グランドバイオラボス［Ｎｃｖ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏｌａｂｓ］社製）が、１２℃での一夜の反応において
ＣＤＮＡ ｌ−に添加された。反応混合物は、２０Ｍｇ
の最終容量の連結バッフγ（５０ｍＭ Ｔｒ ｉ ５
ｐＨ７，５，５ｍＭ ＭｇＣｊ７２．５ｍＭ ＤＴ
Ｔ 、 １ ｍ Ｍ Ａ Ｔ Ｐ ）中に、約ｌμ
ｇのｃＤＮＡ、１７１Ｈのリンカ−ＤＮＡおよび１ ｌ
ｔΩのＴ４ＤＮＡリガーゼにューイングランドバイオラ
ブス社製）を含んでいた。
グランドバイオラボス［Ｎｃｖ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏｌａｂｓ］社製）が、１２℃での一夜の反応において
ＣＤＮＡ ｌ−に添加された。反応混合物は、２０Ｍｇ
の最終容量の連結バッフγ（５０ｍＭ Ｔｒ ｉ ５
ｐＨ７，５，５ｍＭ ＭｇＣｊ７２．５ｍＭ ＤＴ
Ｔ 、 １ ｍ Ｍ Ａ Ｔ Ｐ ）中に、約ｌμ
ｇのｃＤＮＡ、１７１Ｈのリンカ−ＤＮＡおよび１ ｌ
ｔΩのＴ４ＤＮＡリガーゼにューイングランドバイオラ
ブス社製）を含んでいた。
実施例５ ｃＤＮＡのサイズ分画
ｃＤＮＡは１％アガロースゲル」−にて分画された。異
なる大きさの分画が、ゲルから切り出され、そしてＤＮ
Ａは、分析的電気溶出器［ａｎａｌｙｔｉｅａｌｃｌａ
ｅｔｒｏｃｌｕｔｅｒ］ （アイビーアイ［１１３１１
？土製）１こおいてこの業者の指導書に従い、アガロー
スから抽出された。取扱うＤＮＡの量が臭化エチジウム
染色によってはほとんど検知できないような少量である
にもかかわらず、抽出操作は、ＣＤＮＡ中に取込まれた
放射標識によって容易にモニターできるものである。こ
のサイズ分画段階は、ｃ ＤＮＡの大きなフラグメント
の手段を選択的にクローニングする手段を提供し、さら
にまたｃＤＮＡを非連結リンカ−分子から完全に分離す
ることを与えるものである。
なる大きさの分画が、ゲルから切り出され、そしてＤＮ
Ａは、分析的電気溶出器［ａｎａｌｙｔｉｅａｌｃｌａ
ｅｔｒｏｃｌｕｔｅｒ］ （アイビーアイ［１１３１１
？土製）１こおいてこの業者の指導書に従い、アガロー
スから抽出された。取扱うＤＮＡの量が臭化エチジウム
染色によってはほとんど検知できないような少量である
にもかかわらず、抽出操作は、ＣＤＮＡ中に取込まれた
放射標識によって容易にモニターできるものである。こ
のサイズ分画段階は、ｃ ＤＮＡの大きなフラグメント
の手段を選択的にクローニングする手段を提供し、さら
にまたｃＤＮＡを非連結リンカ−分子から完全に分離す
ることを与えるものである。
実施例６ 細菌性ファージミド中への
クローニング
ｃＤＮＡは、Ｂａｎ）ＩＩ制限エンドヌクレアーゼ Ｉ
ＯＵを用いて、３７℃で１時間消化された。
ＯＵを用いて、３７℃で１時間消化された。
フェノールおよびクロロフォルム抽出の後に、ＤＮＡは
２容量のエタノールで沈澱さ第１、そして少量の水に再
懸濁された。ｃＤＮＡ２０〜３０ｎｇは、ＢａｍＨＩ消
化によって線状化されたファージミドＢＬＵＩ：ＳＣ旧
ｐｒ ＳＫ−（スタータジーン［ｓｔａｒｔａｇｃｎｃ
］社製）５０ｒｚｚと混合された。 １３ＬＵピＳＣＲ
ｌ １）１’なる用語は商標名である。これらの２つの
成分は、１６℃での一夜の反応において、連結バッフγ
（」二足参照のこと。）１０μｇ中のＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼによって連結された。次の朝、連結混合物は６５
°Ｃ・＼と５分間加熱され、水で１００倍に希釈され、
そしてエシェリキア・コリＸＬＩＢＩｕｅ細胞を形質転
換するために用いられた。要望にかなう細菌は、スター
タジーン社から購入され、そして提供業者からＩｊえた
れたプロトコルに正確に従って、希釈された連結混合物
３ ｔｔρを用いて形質転換された。細菌は、アンピリ
ジン、テトラサイクリン、Ｉ ＰＴＧおよびＸ−Ｇａ１
を含ＧするＬＢ寒天プレート１−へと載せられた。
２容量のエタノールで沈澱さ第１、そして少量の水に再
懸濁された。ｃＤＮＡ２０〜３０ｎｇは、ＢａｍＨＩ消
化によって線状化されたファージミドＢＬＵＩ：ＳＣ旧
ｐｒ ＳＫ−（スタータジーン［ｓｔａｒｔａｇｃｎｃ
］社製）５０ｒｚｚと混合された。 １３ＬＵピＳＣＲ
ｌ １）１’なる用語は商標名である。これらの２つの
成分は、１６℃での一夜の反応において、連結バッフγ
（」二足参照のこと。）１０μｇ中のＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼによって連結された。次の朝、連結混合物は６５
°Ｃ・＼と５分間加熱され、水で１００倍に希釈され、
そしてエシェリキア・コリＸＬＩＢＩｕｅ細胞を形質転
換するために用いられた。要望にかなう細菌は、スター
タジーン社から購入され、そして提供業者からＩｊえた
れたプロトコルに正確に従って、希釈された連結混合物
３ ｔｔρを用いて形質転換された。細菌は、アンピリ
ジン、テトラサイクリン、Ｉ ＰＴＧおよびＸ−Ｇａ１
を含ＧするＬＢ寒天プレート１−へと載せられた。
実施例７１ＩＴ１人物Ｓ有フγ−ジミドの同定ＢＬ［Ｓ
Ｃｌシ１１）１’ベクター系において、種人物含ｆｒプ
ラスミドは白色の細菌コロニーを生じ、−ｈ、自己連結
ファージミドは青色の反応を誘発する。これゆえ、白色
のコロニーを採集し、そしてアンピリジンを含ｈ゛する
ＬＢ培地２ｍｌに播種し、２２０回転／分の振盪機中に
おいて３７℃で一夜培養した。次の日、標準沸騰法（Ｂ
ｌｒｎｂｏｊｍａｎｄ Ｄｏｌｙ。
Ｃｌシ１１）１’ベクター系において、種人物含ｆｒプ
ラスミドは白色の細菌コロニーを生じ、−ｈ、自己連結
ファージミドは青色の反応を誘発する。これゆえ、白色
のコロニーを採集し、そしてアンピリジンを含ｈ゛する
ＬＢ培地２ｍｌに播種し、２２０回転／分の振盪機中に
おいて３７℃で一夜培養した。次の日、標準沸騰法（Ｂ
ｌｒｎｂｏｊｍａｎｄ Ｄｏｌｙ。
Ｎｕｅｌｃｌｅ Ａｅｉｄｓ ｌシｃｓｃａｒｅｈ
７． １１９５−１２０４． １９７９）によって
急速なプラスミド調製が行なわれた。プラスミドは制限
酵素ＢａｍＨＩで消化され、そして１％アガロースゲル
１−で分析された。このノブ法において同定された１つ
のクローンが、Ｂ５１７−６であり、これは約２００ｂ
ｐの長さのウィルス特異性挿入物を担持していた。第１
図は、超螺旋環状形態およびＢａｍＨＩ消化形態の双方
におけるＢ５１７−６の急速なプラスミド調製の１％ア
ガロースゲルを示すものである。
７． １１９５−１２０４． １９７９）によって
急速なプラスミド調製が行なわれた。プラスミドは制限
酵素ＢａｍＨＩで消化され、そして１％アガロースゲル
１−で分析された。このノブ法において同定された１つ
のクローンが、Ｂ５１７−６であり、これは約２００ｂ
ｐの長さのウィルス特異性挿入物を担持していた。第１
図は、超螺旋環状形態およびＢａｍＨＩ消化形態の双方
におけるＢ５１７−６の急速なプラスミド調製の１％ア
ガロースゲルを示すものである。
実施例８ クローンＢ５１７−６の挿入物の配列分析
クローンＢ５１７−６の一重鎖ＤＮＡは、ＶＣＳヘルバ
ファージ（スタータジーン社製）を２０＝１の感染多重
度（Ｍ、０．１）でＢ５１７−６３白゛エシエリキア・
コリＸＬＩ Ｂｌｕｅ細菌の指数的培養培地へ添加す
ることにより調製された。
ファージ（スタータジーン社製）を２０＝１の感染多重
度（Ｍ、０．１）でＢ５１７−６３白゛エシエリキア・
コリＸＬＩ Ｂｌｕｅ細菌の指数的培養培地へ添加す
ることにより調製された。
培地を３７℃で１６時時間−よく攪拌した後に、−重鎖
ＤＮＡは標準的なプロトコルに従い、１−澄液から純化
された。この−重鎖ＤＮＡは、５ＥＱＵＩＥＮＡＳＩＥ
酵素（米国バイオケミカルズ［１（ｉｏｅｈｃｍｉｅコ
ｔｌｓ１社製）およびこの酵素製造業質により供給され
た試薬を用いて、サンジャー［Ｓ ａ ＩＩｇ ｃ ｒ
］らのジデオキシ法（ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７４．５４
６３−５４６７； １９７７）に、より挿入物の全領域
において配列決定された（Ｓｔ：ＱＵＩ：ＮＡＳＥなる
用語は商標名である。）。１つのベクター特異性オリゴ
ヌクレオチドおよび１組のウィルス−配列特異性オリゴ
ヌクレオチドが、配列決定反応のためのブライマーとし
て用いられた。挿入物１７−６の完全配列は第２図に示
される。
ＤＮＡは標準的なプロトコルに従い、１−澄液から純化
された。この−重鎖ＤＮＡは、５ＥＱＵＩＥＮＡＳＩＥ
酵素（米国バイオケミカルズ［１（ｉｏｅｈｃｍｉｅコ
ｔｌｓ１社製）およびこの酵素製造業質により供給され
た試薬を用いて、サンジャー［Ｓ ａ ＩＩｇ ｃ ｒ
］らのジデオキシ法（ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７４．５４
６３−５４６７； １９７７）に、より挿入物の全領域
において配列決定された（Ｓｔ：ＱＵＩ：ＮＡＳＥなる
用語は商標名である。）。１つのベクター特異性オリゴ
ヌクレオチドおよび１組のウィルス−配列特異性オリゴ
ヌクレオチドが、配列決定反応のためのブライマーとし
て用いられた。挿入物１７−６の完全配列は第２図に示
される。
実施例９ タンパク質ＮＳＩのアミノ酸配列の誘導
全ての候補リーディングフレームにおける１７−６のヌ
クレオチド配列の形質転換は、わずか１つのロングオー
ブンリーディングフレームを表す。
クレオチド配列の形質転換は、わずか１つのロングオー
ブンリーディングフレームを表す。
このフレーム中に誘導されたアミノ酸配列は、他のワラ
ビウィルスの配列ｌ＼−列に整列された（ Ｒｉｃｃ
ａｔ ａｌ、 ５ｃｉｅｎｃｅ ２２９；７２Ｂ−７３
３（１９８５） ； Ｃｏ１ａａｔ ａｌ、 Ｊ、
Ｇａｎ、 Ｖｉｒｏｌ、 ６９．１−２１ （１’１
８）： ＣｈａｌＤｂｃｒｓ ａｔ ａｌ、 Ｖｆｒｏ
ｌｏｇｙ １６９．１００−１０９ （１９８９） ）
＝これらの分析のために、ベックマン［Ｂｃｅｋｍａ
ｎ］ ＭｌｃＲＯＧ［ＮＩｌ、’ソフトフェア（バー
ジョン４．０）が１８Ｍパーソナルコンピュータにおい
て用いられた。Ｍ ｌｃＩ？０ＧＥＮ Ｉ Ｌ：なる用
語は商標名である。分析は、クローン１７−６が、タン
パク質ＮＳＩに関する完全な暗号配列、およびフラビウ
イルスゲノム中においてＮＳＩゲノムと側面を接するタ
ンパク質ＥおよびＮＳ２Ａの暗号配列の一部を倉むもの
であることを示すものであった。
ビウィルスの配列ｌ＼−列に整列された（ Ｒｉｃｃ
ａｔ ａｌ、 ５ｃｉｅｎｃｅ ２２９；７２Ｂ−７３
３（１９８５） ； Ｃｏ１ａａｔ ａｌ、 Ｊ、
Ｇａｎ、 Ｖｉｒｏｌ、 ６９．１−２１ （１’１
８）： ＣｈａｌＤｂｃｒｓ ａｔ ａｌ、 Ｖｆｒｏ
ｌｏｇｙ １６９．１００−１０９ （１９８９） ）
＝これらの分析のために、ベックマン［Ｂｃｅｋｍａ
ｎ］ ＭｌｃＲＯＧ［ＮＩｌ、’ソフトフェア（バー
ジョン４．０）が１８Ｍパーソナルコンピュータにおい
て用いられた。Ｍ ｌｃＩ？０ＧＥＮ Ｉ Ｌ：なる用
語は商標名である。分析は、クローン１７−６が、タン
パク質ＮＳＩに関する完全な暗号配列、およびフラビウ
イルスゲノム中においてＮＳＩゲノムと側面を接するタ
ンパク質ＥおよびＮＳ２Ａの暗号配列の一部を倉むもの
であることを示すものであった。
第３図は、ＲＮＡ配列およびクローン１７−６から誘導
された暗シｌ化アミノ酸配列を描くものである。ＮＳＩ
のアミノ末端は細胞性シグナラーゼによって、またカル
ボキシ末端はシグナラーゼ様酵素によって解放されるも
のであることを示唆するものである。タンパク質ＮＳ２
Ａのアミノ末端部をまた含有するＮＳＩタンパク質のよ
り大きな形態は、マソン［Ｍａｓｏｎｌらによって観察
されている（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５ｇ、 ３６１−３
７２ （１９８７）） 、 Ｎ Ｓ １タンパク質のこ
の形態のカルボキシ末端は、ウィルス特異性プロテアー
ゼあるいは細胞性シグナラーゼによって解放されるもの
である（Ｒｉｃｅ ａｔ ａｔ。
された暗シｌ化アミノ酸配列を描くものである。ＮＳＩ
のアミノ末端は細胞性シグナラーゼによって、またカル
ボキシ末端はシグナラーゼ様酵素によって解放されるも
のであることを示唆するものである。タンパク質ＮＳ２
Ａのアミノ末端部をまた含有するＮＳＩタンパク質のよ
り大きな形態は、マソン［Ｍａｓｏｎｌらによって観察
されている（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５ｇ、 ３６１−３
７２ （１９８７）） 、 Ｎ Ｓ １タンパク質のこ
の形態のカルボキシ末端は、ウィルス特異性プロテアー
ゼあるいは細胞性シグナラーゼによって解放されるもの
である（Ｒｉｃｅ ａｔ ａｔ。
５ｃｉｃｎｅｃ ２２９．７２（ｉ−７３３（１９８５
） ）。アミノ末端および３つの候補カルボキシ末α：
１シが第３図に示される。シダナラーゼ様酵素（Ｃｈａ
＋ｎｂｃｒｓ ａｔ旧、Ｖｉｒ。
） ）。アミノ末端および３つの候補カルボキシ末α：
１シが第３図に示される。シダナラーゼ様酵素（Ｃｈａ
＋ｎｂｃｒｓ ａｔ旧、Ｖｉｒ。
＋ｏｇｙ １６９１００−１０９ （１９８８） ）に
よって解放されるカルボキシ末々；Ｌは、“Ｃ０ＯＨ末
端１“とじて描かれ、おそらくウィルス特異性プロテア
ーゼによって形成されそうなカルボキシ末端は”Ｃ０Ｏ
Ｈ末端２”として示され、そして細胞性シグナラーセに
よって解放される潜在的カルボキシ末端は’Ｃ０ＯＨ末
端３″として示される。第３図において用いられた１）
”Ｌ置番りはＴＢＥウィルスの完全な長さのゲノムに関
係するものである。
よって解放されるカルボキシ末々；Ｌは、“Ｃ０ＯＨ末
端１“とじて描かれ、おそらくウィルス特異性プロテア
ーゼによって形成されそうなカルボキシ末端は”Ｃ０Ｏ
Ｈ末端２”として示され、そして細胞性シグナラーセに
よって解放される潜在的カルボキシ末端は’Ｃ０ＯＨ末
端３″として示される。第３図において用いられた１）
”Ｌ置番りはＴＢＥウィルスの完全な長さのゲノムに関
係するものである。
第４図は、クローン１７−６の配列情報から誘導される
ようなタンパク質ＮＳＩのアミノ酸配列を示すものであ
る。候補Ｃ０ＯＨ末端が、第３図におけると同様に示さ
れる。位置番５」°は、タンパク′ｉ！１ＮＳ１の最初
のアミノ酸から数えられたものである。第４図はまた、
ＴＢＥウィルスタンパク質ＮＳＩ中に存在する３つの潜
在的Ｎ−グリコジル化サイトの位置を描くものである。
ようなタンパク質ＮＳＩのアミノ酸配列を示すものであ
る。候補Ｃ０ＯＨ末端が、第３図におけると同様に示さ
れる。位置番５」°は、タンパク′ｉ！１ＮＳ１の最初
のアミノ酸から数えられたものである。第４図はまた、
ＴＢＥウィルスタンパク質ＮＳＩ中に存在する３つの潜
在的Ｎ−グリコジル化サイトの位置を描くものである。
実施例１０ ＮＳＩ暗５」化領域のｌｊ、ｊ核発現ベ
クター中へのクローニング ＮＳＩに関し暗−シ化するヌクレオチド配列が、クロー
ン１７−６からＩ） Ｕ Ｃ１９Ｓ中へとサブクローニ
ングされた。ベクターｐＵｃ１９ｓは、ＢａｍＨＩサイ
ト中へクローニングされた３つの全てのリーディングフ
レーム中に、ＴＡＧ停止コドンを（ｉする停止リンカ−
を六むｐＵＣ１９の誘導体である。ＮＳ２ａの微小部分
を３′−末端に含むＮＳＩ配列は、制限エンドヌクレア
ーゼＣｆ。
クター中へのクローニング ＮＳＩに関し暗−シ化するヌクレオチド配列が、クロー
ン１７−６からＩ） Ｕ Ｃ１９Ｓ中へとサブクローニ
ングされた。ベクターｐＵｃ１９ｓは、ＢａｍＨＩサイ
ト中へクローニングされた３つの全てのリーディングフ
レーム中に、ＴＡＧ停止コドンを（ｉする停止リンカ−
を六むｐＵＣ１９の誘導体である。ＮＳ２ａの微小部分
を３′−末端に含むＮＳＩ配列は、制限エンドヌクレア
ーゼＣｆ。
■で切断され、そしてブラントエンドが８１−ヌクレア
ーゼを用いて形成された。クローニングベクターｐＵｃ
１９ｓは、それのポリリンカーにおいて５ａｌｌで線状
化され、そして末端はＴ４ＤＮＡ ポリメラーゼで満
たされた（第５図）。
ーゼを用いて形成された。クローニングベクターｐＵｃ
１９ｓは、それのポリリンカーにおいて５ａｌｌで線状
化され、そして末端はＴ４ＤＮＡ ポリメラーゼで満
たされた（第５図）。
ベクターと挿入物の連結は、５ａｌｌサイトを再生し、
そしてフレーｌ、中においてＮＳ１を１ａｃＺ逍云」−
ヘト融合した（第６ａ及び６ｂ図）。ＮＳ１ヌクレオヂ
ド配列は、３−末端で、ベクター中に含まれていた原核
転写および翻訳停止り信すによって側面を固められるも
のである。このプラスミドはｐＮ８１３８７と呼称され
る。
そしてフレーｌ、中においてＮＳ１を１ａｃＺ逍云」−
ヘト融合した（第６ａ及び６ｂ図）。ＮＳ１ヌクレオヂ
ド配列は、３−末端で、ベクター中に含まれていた原核
転写および翻訳停止り信すによって側面を固められるも
のである。このプラスミドはｐＮ８１３８７と呼称され
る。
実施例１１ ポリメラーゼ連鎖反応を用いての５′近１
１゛Ｌ疎水性信５じ一配列を含むＮＳＩ暗’−： 化領
域のクローニング 真正信号配列を包ＡするＮＳＩ暗−じ化領域をＡ白゛す
る誘発可能性原核発現プラスミドを構築するために、ｐ
ｓｃｔｓｎｓ１４４４ｃ実施ρ１１１３）からの５ａｌ
ｌフラグメントがｐＵＣ１９Ｓへと移される。ＮＳＩ逍
伝ｒ−を１ａｃＺと同じリーディングフレーム中へ配置
するために、クローンＩ） ｔ ＳＮ Ｓ １（ｉ８２
はＨｉ ｎ ｄ ＩＩＩで消化され、ブラントエンドが
８１ヌクレアーゼを用いて形成されそして再連結され、
このようにして４ヌクレオチドの欠失をｆｉするクロー
ンｐｔｓＮｓ１７９１が形成される。
１゛Ｌ疎水性信５じ一配列を含むＮＳＩ暗’−： 化領
域のクローニング 真正信号配列を包ＡするＮＳＩ暗−じ化領域をＡ白゛す
る誘発可能性原核発現プラスミドを構築するために、ｐ
ｓｃｔｓｎｓ１４４４ｃ実施ρ１１１３）からの５ａｌ
ｌフラグメントがｐＵＣ１９Ｓへと移される。ＮＳＩ逍
伝ｒ−を１ａｃＺと同じリーディングフレーム中へ配置
するために、クローンＩ） ｔ ＳＮ Ｓ １（ｉ８２
はＨｉ ｎ ｄ ＩＩＩで消化され、ブラントエンドが
８１ヌクレアーゼを用いて形成されそして再連結され、
このようにして４ヌクレオチドの欠失をｆｉするクロー
ンｐｔｓＮｓ１７９１が形成される。
’Ａ施例１２ ワクシニアウィルス中への組換えのため
のプラスミドの構築： ＶＶ− ｐＨ（Ｌ）プロモータのホ制御下の ＮＳ−１タンパク質 ＮＳ−１暗号化領域（例えば実施例１０中）が、プラス
ミドｐＴＫｇｐｔＦｌｓの５ａｌＩサイト中・＼サブク
ローニングされる（Ｐａｌｋｎｃｒ、 Ｇ、 Ｉ’、
ａｎｄ １３． Ｍｏ５ｓ、 Ｊ、 Ｖｉｒｏ
ｌ ６２． １８４９−１８５４（１９８８））
。
のプラスミドの構築： ＶＶ− ｐＨ（Ｌ）プロモータのホ制御下の ＮＳ−１タンパク質 ＮＳ−１暗号化領域（例えば実施例１０中）が、プラス
ミドｐＴＫｇｐｔＦｌｓの５ａｌＩサイト中・＼サブク
ローニングされる（Ｐａｌｋｎｃｒ、 Ｇ、 Ｉ’、
ａｎｄ １３． Ｍｏ５ｓ、 Ｊ、 Ｖｉｒｏ
ｌ ６２． １８４９−１８５４（１９８８））
。
ＮＳＩ配列は、ベクターのＡＴＧ翻訳開始コドンと共に
フレーム内に位置される。翻訳停止信５；はまた、ベク
ターによって１是供される。ベクターのポリリンカー領
域は、５′末端で付加的な７コのアミノ酸を、また３′
末端で（＝１加的な１０コのアミノ酸を加える。このク
ローニング術およびタンパク質の側面配列は、第８ａお
、よび８ｂ図に示される。このプラスミドはｐ Ａ Ｐ
Ｎ Ｓ １３３８とＩＩ’ｓ” ！；Ｉ、される。
フレーム内に位置される。翻訳停止信５；はまた、ベク
ターによって１是供される。ベクターのポリリンカー領
域は、５′末端で付加的な７コのアミノ酸を、また３′
末端で（＝１加的な１０コのアミノ酸を加える。このク
ローニング術およびタンパク質の側面配列は、第８ａお
、よび８ｂ図に示される。このプラスミドはｐ Ａ Ｐ
Ｎ Ｓ １３３８とＩＩ’ｓ” ！；Ｉ、される。
実施例１３ ワクシニアウィルス中への組換えのための
プラスミドの構築二ＶＶ− ｐ７． ５ （ＩＥ／Ｌ）プロモータの制御下における
真正信号配列をｈｏするＭＳ−１タンパク質 ＮＳＩ暗号化領域およびその信号配列からなるヌクレオ
チド配列が、クローン１７−６をテンプレートとして用
いてポリメラーゼ連鎖反応によって合成される。制限エ
ンドヌクレアーゼ切断サイ）ＥｃｏＲＩおよび５ａｉｌ
を５′末端に、また５ａｔ）およびＨｐａｌを３′末端
に白゛する２つのオリゴヌクレオチドが化学合成され、
そしてＰＣＲにおいてブライマーとして使用される（第
９ａおよび９ｂ図）。増幅されたＮＳＩフラグメントが
アガロースゲルから純化され（第１０図）、５ａｉｌで
分割され、そして最小限の修飾の後にベクターｐｓｃ１
１−Ｏｒｔｈの５ａｉｌサイト中にクローニングされた
。プラスミドｐｓｃ１１−Ｏｒｔｈは１９９０年１月１
５０に、西ドイツ、ブラウンシュヴフイクのザ デイ−
ニスエム［１’Ｉｔ ａＤ、Ｓ、Ｍ、、 Ｂｒａｕｎｓ
ｃｈｗｃｉｇ、 Ｗｅｓｔ ＧｅｒＩＩｌａｎｙ］にＤ
ＳＭ５７３４として供託された。クローニング術および
この新しい構造物の５′および３′末端の配列はＴＳｌ
ｌおよび１２図に示される。種人物の正しい定位を６ｆ
ｆｉ認するための該クローンの制限消化のアガロースゲ
ルがｋｊＳ１３図に示される。このプラスミドはｐｓｃ
ｔｓＮｓ１４４４と呼称される。
プラスミドの構築二ＶＶ− ｐ７． ５ （ＩＥ／Ｌ）プロモータの制御下における
真正信号配列をｈｏするＭＳ−１タンパク質 ＮＳＩ暗号化領域およびその信号配列からなるヌクレオ
チド配列が、クローン１７−６をテンプレートとして用
いてポリメラーゼ連鎖反応によって合成される。制限エ
ンドヌクレアーゼ切断サイ）ＥｃｏＲＩおよび５ａｉｌ
を５′末端に、また５ａｔ）およびＨｐａｌを３′末端
に白゛する２つのオリゴヌクレオチドが化学合成され、
そしてＰＣＲにおいてブライマーとして使用される（第
９ａおよび９ｂ図）。増幅されたＮＳＩフラグメントが
アガロースゲルから純化され（第１０図）、５ａｉｌで
分割され、そして最小限の修飾の後にベクターｐｓｃ１
１−Ｏｒｔｈの５ａｉｌサイト中にクローニングされた
。プラスミドｐｓｃ１１−Ｏｒｔｈは１９９０年１月１
５０に、西ドイツ、ブラウンシュヴフイクのザ デイ−
ニスエム［１’Ｉｔ ａＤ、Ｓ、Ｍ、、 Ｂｒａｕｎｓ
ｃｈｗｃｉｇ、 Ｗｅｓｔ ＧｅｒＩＩｌａｎｙ］にＤ
ＳＭ５７３４として供託された。クローニング術および
この新しい構造物の５′および３′末端の配列はＴＳｌ
ｌおよび１２図に示される。種人物の正しい定位を６ｆ
ｆｉ認するための該クローンの制限消化のアガロースゲ
ルがｋｊＳ１３図に示される。このプラスミドはｐｓｃ
ｔｓＮｓ１４４４と呼称される。
実施例１４ ワクシニアウィルス中への組換えのための
プラスミドの構築： ＶＶ− ｐＨ（Ｌ）プロモータの制御下にお ける真正信号配列をＵするＮＳ−１ タンパク質 プラスミドｐＴＫｔＳＮＳ１５５６は、クローンｐＳＣ
ｔＳＮＳ１４４４からのＮＳＩをベクターｐＴＫｇ ｐ
ｔ Ｆ ３ ｓ （Ｐａｌｋｎｅｒ ａｎｄ Ｍｏ５
ｓ、 Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ Ｂ２゜１８４９−１８５４
（１９８８））中へサブクローニングすることから得ら
れる。ＮＳＩ配列は５ａｉｌで切断され、そしてｐＴＫ
ｇｐｔＦ３ｓの５ａｌｌサイト中へ挿入された。クロー
ニング術および１）Ｔ Ｋ ｔＳＮＳ １５５６のヌク
レオチド配列は第１４および１５図に示される。
プラスミドの構築： ＶＶ− ｐＨ（Ｌ）プロモータの制御下にお ける真正信号配列をＵするＮＳ−１ タンパク質 プラスミドｐＴＫｔＳＮＳ１５５６は、クローンｐＳＣ
ｔＳＮＳ１４４４からのＮＳＩをベクターｐＴＫｇ ｐ
ｔ Ｆ ３ ｓ （Ｐａｌｋｎｅｒ ａｎｄ Ｍｏ５
ｓ、 Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ Ｂ２゜１８４９−１８５４
（１９８８））中へサブクローニングすることから得ら
れる。ＮＳＩ配列は５ａｉｌで切断され、そしてｐＴＫ
ｇｐｔＦ３ｓの５ａｌｌサイト中へ挿入された。クロー
ニング術および１）Ｔ Ｋ ｔＳＮＳ １５５６のヌク
レオチド配列は第１４および１５図に示される。
すべてのプラスミドは、ＤＫｌ、ＢＨＩＯＩあるいはＪ
Ｍ株（ＪＭ１０５、ＪＭ８３）のようなエンエリキア・
コリ宿主中で１００μｇ／ｍｌのアンピリジン選択条件
下において培養された。
Ｍ株（ＪＭ１０５、ＪＭ８３）のようなエンエリキア・
コリ宿主中で１００μｇ／ｍｌのアンピリジン選択条件
下において培養された。
実施例１５ ＮＳＩタンパク質の発現のためのワクシ
ニア組換体の形成 組換ウィルスは標準的手法に従い形成される（Ｍａｅｋ
ｃｔＬ、 Ｍ、、 Ｓｍ１ｔｈ、 Ｇ、 ａｎｄ Ｍｏ
５ｓ、 Ｂ、 Ｉｎ： ｌ）ＮへＣｌ０１１１ｇ二Ａ
Ｐｒ１ｌｅＬｌｅａｌ ＡｐｐｒｏｌｅＦｌｌｐｐ １
９１−１２１−Ｅ旧Ｌｃｔｌ ｂｙ Ｄ、 Ｍ、 Ｇ
ｌｏｖｅｒ； Ｏｘｌ’ｏｒ屯ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ）
。
ニア組換体の形成 組換ウィルスは標準的手法に従い形成される（Ｍａｅｋ
ｃｔＬ、 Ｍ、、 Ｓｍ１ｔｈ、 Ｇ、 ａｎｄ Ｍｏ
５ｓ、 Ｂ、 Ｉｎ： ｌ）ＮへＣｌ０１１１ｇ二Ａ
Ｐｒ１ｌｅＬｌｅａｌ ＡｐｐｒｏｌｅＦｌｌｐｐ １
９１−１２１−Ｅ旧Ｌｃｔｌ ｂｙ Ｄ、 Ｍ、 Ｇ
ｌｏｖｅｒ； Ｏｘｌ’ｏｒ屯ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ）
。
ｐｓｃｔｓＮｓ１４４４のプラスミドＤ Ｎ−Ａおよび
ｐＴＫｔＳＮＳ１５５ＧのプラスミドＤＮＡは、ワクシ
ニアウィルス野生型で感染されたＣＶ−１細胞中へ形質
転換される。ｐｓｃｌｌ−Ｏｒｔｈ誘導組換体ｖ ａｒ
ｅ ｃ Ｎ Ｓ １４４４は、１４３ ｔ ｌｃ細胞
１−のＢｕＤＲを用いて選択される。ｐＴＫｇｐｔＦｓ
誘４ Ａ’ｆｌ換体ｖ ａ ｒ ｅ ｃ ＮＳ１５５Ｇ
は、ＣＶ−１細胞ににおけるｇｐｔ選択により単離され
る。すべての組換体は、３度にわたりプラーク純化され
る。
ｐＴＫｔＳＮＳ１５５ＧのプラスミドＤＮＡは、ワクシ
ニアウィルス野生型で感染されたＣＶ−１細胞中へ形質
転換される。ｐｓｃｌｌ−Ｏｒｔｈ誘導組換体ｖ ａｒ
ｅ ｃ Ｎ Ｓ １４４４は、１４３ ｔ ｌｃ細胞
１−のＢｕＤＲを用いて選択される。ｐＴＫｇｐｔＦｓ
誘４ Ａ’ｆｌ換体ｖ ａ ｒ ｅ ｃ ＮＳ１５５Ｇ
は、ＣＶ−１細胞ににおけるｇｐｔ選択により単離され
る。すべての組換体は、３度にわたりプラーク純化され
る。
組換体の正確な組織は、サウザンブロツト分Ｊｌｉ［５
ｏｕｔｈｃｒｎ １３１ｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓｌによ
って分ＩＪｒされる（第１６図）。
ｏｕｔｈｃｒｎ １３１ｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓｌによ
って分ＩＪｒされる（第１６図）。
実施例１６ ワクシニアウィルス組換体で感染されたＣ
Ｖ−１細胞におけるＮＳＩの 発現 ＣＶ−１細胞が、ワクシニアウィルス組換体Ｖａ ｒ
ｅ ｃＮｓ１４４４およびｖａｒｅｃＮｓ１５５（ｉで
感染される。感染の二ロ後、細胞は３５−Ｓメヂオニン
を用いて４時間かけて標識される。タンパク質は１２％
ＳＤＳ変性ポリアクリルアミドゲル−１゜で分離され、
そしてオートラジオグラフィーによって識別された。約
４８ｋＤの朋侍される分Ｊ’量に相当するタンパク質バ
ンドが検知されることができる。これは、野生型ウィル
ス、またはｖａｒｅ ｃ １３４２のような非ＮＳ−１
組換体で感染された細胞中には見られないものである。
Ｖ−１細胞におけるＮＳＩの 発現 ＣＶ−１細胞が、ワクシニアウィルス組換体Ｖａ ｒ
ｅ ｃＮｓ１４４４およびｖａｒｅｃＮｓ１５５（ｉで
感染される。感染の二ロ後、細胞は３５−Ｓメヂオニン
を用いて４時間かけて標識される。タンパク質は１２％
ＳＤＳ変性ポリアクリルアミドゲル−１゜で分離され、
そしてオートラジオグラフィーによって識別された。約
４８ｋＤの朋侍される分Ｊ’量に相当するタンパク質バ
ンドが検知されることができる。これは、野生型ウィル
ス、またはｖａｒｅ ｃ １３４２のような非ＮＳ−１
組換体で感染された細胞中には見られないものである。
第１図は、アガロースゲル電気泳動写真を示す。
第２図は、ヌクレオチド配列を示す図面である。
第３図は、挿入物１７−６のＲＮＡ配列およびエンコー
ド化アミノ酸配夕１１を示す図面である。 第４図は、タンパク質ＮＳＩのアミノ酸配列を示す図面
である。 第５図は、ＮＳＩを原核生物発現ベクターｐＵＣ１９Ｓ
にクローニングする方策を示す図面である。 第６Ａ図と第６Ｂ図は、５′および３′末端におけるク
ローンｐＮ８１３８７ヌクレオチド配列を示す図面であ
る。 第７Ａ図は、羅かな５′信５シ配列を有するＮＳ１を原
核生物発現ベクターｐＵｃ１９ｓにクローニングする方
策を示す図面である。 第７Ｂ図は、５′および３′末端のクローンｐｔｓＮｓ
１７９１のヌクレオチド配列を示す図面である。 第８Ａ図は、ワクシニアウィルスで組み換えるためにＮ
ＳＩコード域をトランスファーベクターｐＴＫｇｐ ｔ
Ｅ １ ｓクローニングすることを示す図面である。 第８Ｂ図は、５′および３′末端のクローンｐＡＰＮＳ
１３３８のヌクレオチド配列を示す図面である。 第９Ａおよび第９Ｂ図は、ＮＳＩとその想像１−の借倒
配列とのポリメラーゼ鎖反応によるクローニングを示す
図面である。 第１０図は、ＰＣＲ法で合成したＮＳＩフラグメントを
示すアガロースゲルを示す図面である。 第１１図は、ＰＣＲ法で合成後想像−にの信″−ｊ″配
列をａするＮＳＩコード域の、ワクシニアウィルスを用
いる組換えのため、トランスファーベクターｐｓｃ１１
−オルソΔ０へのクローニングを示す図面である。 第１２図は、３′および５′末端のクローンｐＳＣｔ
ｓＮＳ １４４４の配列を示す図面である。 第１３図は、適切な制限エンドヌクレアーゼ消化による
プラスミドｐｓｃｔＮｓ１４４４の分）１ｉ結果を示す
図面である。 第１４図は、想（￥ＡＩ；０’）信５」配列’；−’ｆ
ｊ ｔ ’、１ Ｎ Ｓ １を、ワクシニアウィルスを
用いて組換えるために、トランスファーベクターｐＴＫ
ｇｐｔＦ３ｓへクローニングすることを示す図面である
。 第１５図は、５′および３′末ζ：１シのプラスミドｐ
ＴＫｔｓＮｓ１５５６のヌクレオチド配列を示す図面で
ある。 第１６図は、ＮＳＩワクシニア組換えｖａ ｒｅｃＮｓ
１４４４とｖａｒｅｃＮｓ１５５６ザザンブロツト分析
結果を示す図面である。 第１７図は、組換えウィルスｖａｒｅｃＮｓ１４４４と
ｖａｒｅｃＮｓ１５５６の発現ＮＳＩタンパク質を示す
変成ＳＤＳゲルオートラジオグラフを示す図面である。
ド化アミノ酸配夕１１を示す図面である。 第４図は、タンパク質ＮＳＩのアミノ酸配列を示す図面
である。 第５図は、ＮＳＩを原核生物発現ベクターｐＵＣ１９Ｓ
にクローニングする方策を示す図面である。 第６Ａ図と第６Ｂ図は、５′および３′末端におけるク
ローンｐＮ８１３８７ヌクレオチド配列を示す図面であ
る。 第７Ａ図は、羅かな５′信５シ配列を有するＮＳ１を原
核生物発現ベクターｐＵｃ１９ｓにクローニングする方
策を示す図面である。 第７Ｂ図は、５′および３′末端のクローンｐｔｓＮｓ
１７９１のヌクレオチド配列を示す図面である。 第８Ａ図は、ワクシニアウィルスで組み換えるためにＮ
ＳＩコード域をトランスファーベクターｐＴＫｇｐ ｔ
Ｅ １ ｓクローニングすることを示す図面である。 第８Ｂ図は、５′および３′末端のクローンｐＡＰＮＳ
１３３８のヌクレオチド配列を示す図面である。 第９Ａおよび第９Ｂ図は、ＮＳＩとその想像１−の借倒
配列とのポリメラーゼ鎖反応によるクローニングを示す
図面である。 第１０図は、ＰＣＲ法で合成したＮＳＩフラグメントを
示すアガロースゲルを示す図面である。 第１１図は、ＰＣＲ法で合成後想像−にの信″−ｊ″配
列をａするＮＳＩコード域の、ワクシニアウィルスを用
いる組換えのため、トランスファーベクターｐｓｃ１１
−オルソΔ０へのクローニングを示す図面である。 第１２図は、３′および５′末端のクローンｐＳＣｔ
ｓＮＳ １４４４の配列を示す図面である。 第１３図は、適切な制限エンドヌクレアーゼ消化による
プラスミドｐｓｃｔＮｓ１４４４の分）１ｉ結果を示す
図面である。 第１４図は、想（￥ＡＩ；０’）信５」配列’；−’ｆ
ｊ ｔ ’、１ Ｎ Ｓ １を、ワクシニアウィルスを
用いて組換えるために、トランスファーベクターｐＴＫ
ｇｐｔＦ３ｓへクローニングすることを示す図面である
。 第１５図は、５′および３′末ζ：１シのプラスミドｐ
ＴＫｔｓＮｓ１５５６のヌクレオチド配列を示す図面で
ある。 第１６図は、ＮＳＩワクシニア組換えｖａ ｒｅｃＮｓ
１４４４とｖａｒｅｃＮｓ１５５６ザザンブロツト分析
結果を示す図面である。 第１７図は、組換えウィルスｖａｒｅｃＮｓ１４４４と
ｖａｒｅｃＮｓ１５５６の発現ＮＳＩタンパク質を示す
変成ＳＤＳゲルオートラジオグラフを示す図面である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ウェスタンサブタイプＴＢＥウィルス のＮＳ−１タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも１部
を含むペプチドまたはポリペプチド。 ２、第４図に示されるアミノ酸配列を有する特許請求の
範囲第１項に記載のペプチドまたはポリペプチド。 ３、ウェスタンサブタイプＴＢＥウィルス のＮＳ−１タンパク質。 ４、突然変異および／またはウェスタンサブタイプＴＢ
Ｅウィルスの正常範囲の天然変異である転置であろうと
なかろうと、天然ＮＳ−１配列のアミノ酸配列と異なる
アミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチド。 ５、薬剤用の特許請求の範囲第１〜４項のいずれか１項
に記載のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質。 ６、特許請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の
ペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質および１若
しくはそれ以上の追加の薬理学上許容される成分を含む
ワクチン組成物。 ７、特許請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む診断試
薬。 ８、特許請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする
核酸。 ９、特許請求の範囲第８項に記載の核酸を含む生ワクチ
ン。 １０、特許請求の範囲第８項に記載の核酸を含むプロー
ブ。 １１、特許請求の範囲第８項に記載の核酸にハイブリダ
イズする核酸。 １２、第３図に示されるＤＮＡ配列にハイブリダイズす
る特許請求の範囲第１１項に記載の核酸。 １３、遺伝子コードの変性および／または突然変異およ
び／または転置であってウェスタンサブタイプＴＢＥウ
ィルスの正常範囲であろうとなかろうと、天然ＮＳ−Ｉ
ＲＮＡ配列に対応または相補的なＤＮＡ分子と異なる配
列を有する核酸。 １４、追加核酸配列と結合した特許請求の範囲第８〜１
３項のいずれか１項に記載の核酸。 １５、核酸がＤＮＡであり、追加配列が細胞培養中でＤ
ＮＡ分子の複製および発現を許容し、プロモーター、促
進剤、ポリアデニル化シグナルおよび／またはスプライ
スシグナルとして機能する配列を含むことが好ましい特
許請求の範囲第１４項に記載の核酸。 １６、特許請求の範囲第８〜１５項のいずれか１項に記
載の核酸を含むプラスミド、ウィルスまたはファージの
如きベクター。 １７、ワクシニアウイルスから誘導される特許請求の範
囲第１６項に記載のベクター。 １８、細菌プラスミドから誘導される特許請求の範囲第
１６項に記載のベクター。 １９、特許請求の範囲第１６、１７または１８項に記載
のベクターを含む宿主細胞。 ２０、特許請求の範囲第１９項に記載の宿主細胞の培養
。 ２１、哺乳類細胞培養である特許請求の範囲第２０項に
記載の培養。
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Family Applications (1)
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