KR100216336B1 - 바이러스 벡터를 이용한 경구용 b형 간염백신의 제조방법 - Google Patents

Abstract

B형 간염 백신을 경구용으로 개발하기 위하여 소장 점막을 통한 침입 경로를 가지는 소아마비 바이러스를 운반체로 사용하였다. 약독화된 소아마비 바이러스는 현재 경구용으로 사용되고 있는 매우 안전한 바이러스이다.

B형 간염 바이러스에 대한 면역성을 유발시키기 위해서는 B형 간염 바이러스 표면 항원을 암호화 하는 유전자가 소아마비 바이러스의 유전자에 삽입되어져야하나, 다량의 외래성 유전자룰 삽입할 경우 소아마비 바이러스의 증식 능력을 상실하게 되므로 소아마비 바이러스의 증식에 영향을 미치지 않는 범위내에서 B형 간염 바이러스 표면 항원을 암호화하는 유전자 일부와 치환해야 한다.

본 발명에서는 이상의 원리를 이용하여 B형 간염 바이러스의 표면 항원 중 가장 우수한 면역원성을 지니는 항원 결정부위롤 암호화하는 유전자를 합성한 후이를 소아마비 바이러스 유전자 부위중 항원 결정 부위와 치환시켜 재조합 간염-소아마비 바이러스 벡터를 만들고 이를 영장류세포에 트랜스 팻션(transfection)시켜 재조합 바이러스를 만들었으며, 증식된 재조합 바이러스를 대량 배양하여 경구용 B형 간염 백신을 제조하였다.

Description

바이러스 벡터를 이용한 경구용 B형 간염백신의 제조방법

제1도는 재조합 간염-소아마비 바이러스 벡터의 조립과정이다.

본 발명은 유전자 재조합 기술을 이용하여 소아마비 바이러스의 외피 단백질을 암호화하는 유전자 일부와 B형 간염 바이러스의 표면항원을 암호화하는 유전자를 치환하여 경구투여에 의한 B형 간염 바이러스 표면항원의 형지발현을 유도하는 경구용 B형 간염 백신의 제조에 관한 것이다.

소아마비 바이러스는 소장 점막을 통하여 감염을 일으키는 엔테로 바이러스의 일종으로, 기존의 주사제 백신은 혈관내 면역체계만 자극하는 반면에, 약독화된 소아마비 바이러스를 이용한 경우용 백신은 점막 면역체계와 혈관내 면역체계를 모두 자극시킴으로써 보다 넓은 범위의 항체생성을 유도시킬 수 있는 장점을 지니고 있다. 약독화 시킨 바이러스는 현재 대표적인 경구용 백신으로 사용되고 있다.

최근 소아마비 백신의 항원성 및 안정성을 높이거나 종특이성을 규명하기 위해서 소아마비 바이러스의 다양한 혈청형(Serotype)간에 유전자 재조합이 활발히 이루어 졌으며(K.L. Burke et al, Nature, 332, 81,1988/ T.O. Yeasts et al., EMBO, 10, 2331, 1991)외래성 바이러스 및 박테리아의 유전자 일부를 소아마비 바이러스에 도입하여 이중항원성(Dual antigenicity)을 유도해 내기도 하였다(D.J. Evaxs et al., Nature, 339, 385, 1985/ O. Jenkins et al., J. Virol., 64, 1201, 1990).

소아마비 바이러스에 외래성 유전자를 도입시켜 백신으로 제제화 하는 경우, 소아마비 바이러스의 증식능력에 손상을 일으키지 않는 범위에서 외래성 유전자와 치환하여야 한다. 약독화 소아마비 바이러스의 3차원적 구조를 살펴보면 바이러스의 외표면에서 가장 바깥쪽으로 돌출되어 있는 93에서 103번째의 아미노산 부위가 바이러스의 항원 결정기로 작용하고 있음이 밝혀 졌다. 이른바 'C3에 피토프'라 불리는 이 부위와 해당 크기의 외래성 유전자를 치환한 경우 생성된 재조합 바이러스는 증식성이 있으며, 치환된 외래성 유전자는 발현되어 항원 결정기로 작용한다(Martin, et al., EMBO J., 7, 2839, 1988).

한편, 치환하고자 하는 목적의 외래성 유전자는 C3 에피토프를 중심으로 70베이스페어를 넘지 않아야 하는 크기의 제약을 받으므로 가장 이뮤노도미넌트(immunodorminant)한 부위여야 한다. 본 발명에서 치환하고자 하는 외래성 유전자는 B형 간염바이러스 표면 항원으로서 가장 이뮤노도미넌트 한 우위로 알려진 S 영역 94번째에서 116번째의 아미노산 부위의 염기를 합성, 치환하였다. 치환할 시 제거되는 C3 에피토프 부위의 염기와 정확한 크기의 B형 간염 바이러스 표면 항원 부위의 염기를 삽입시켜 후레임 쉬프트가 일어나지 않게 하였다.

본 발명에 의해 만들어진 재조합 소아마비 바이러스는 병원성 소아마비 바이러스로의 유전자 복귀(Reversin)가 블가능하고 자체 중식력이 있는 안전한 바이러스이다. 본 발명은 B형 간염 바이러스 표면항원 부위의 유전자를 소아마비 바이러스에 도입시킴으로써 소아마비 바이러스와 B형 간염 바이러스 모두에 대한 항체를 생산시킴으로써 2가(Divalent) 면역 능력을 가지고 있다.

기존의 B형 간염 백신은 B형 간염 바이러스 보균자의 혈액으로부터 제조하거나, 형질 전환시킨 포유동물 세포에서 분비되는 항원으로 부터 제조하였다. 혈장 유래형 백신의 제조는 원료의 수급적 측면과 혈액 취급시의 위생관리적 측면, 그리고 제조 공정면에서 매우 번거롭다. 형질전환시킨 포유동물 세포에서 분비되는 항원을 정제하는 경우에는 배양 및 정제시 비용이 많이 들며, 정제 수율이 낮은 문제점을 가지고 있다.

그러나 본 발명은 경구 투약이 가능하다는 편리성 이외에도, 혈관내 면역 체계와 점막 면역체계를 모두 활성화 시키는 광범위한 항체 생성능과 소아마비 바이러스와 B형 간염 바이러스 모두에 대한 항체 생성능력을 가지는 2가 면역성, 그리고 제조 공정시 바이러스 입자의 분리 자체로 정제 공정이 완결되어 지므로 매우 간편하고 경제적인 상업성까지를 겸비하고 있는 차세대 B형 간염 백신의 제조방법이다.

[A. 재조합 소아마비 바이러스 벡터의 구성 및 확인]

B형 간염 바이러스의 표면 항원 일부를 암호화 하는 유전자를 소아마비 바이러스 C3 에피토프의 유전자와 치환시키기 위하여 다음과 같이 서브 클로닝을 실시하였다.

약독화된 소아마비 바이러스의 사빈 타입 1의 RNA로 부터 만들어진 cDNA를 상용으로 쓰는 벡터 pBR322에 연결한 플리즈미드를 pSI(T7)0라 일컫는데 여기에는 약 7500bp의 Sabin 타이프 1의 cDNA, SV40에서 유래한 T 항원, 암피실린 내성 유전자, T7 RNA 중합효소 프로모터로 이루어져 있다. pSI(T7)0 내에서 C3 에티토프를 나타내는 유전자 부위를 중심으로 본 발명에서는 뉴클레오티드 2733(Sph I 제한효소위치)와 2809(Sau3A I 제한효소 위치) 사이를 B형 간염 바이러스 표면항원과 치환하였다.

pSI(T7)0 를 Spe I 으로 자른 후 1340bp의 절편을 분리한 후 다시 Sph I으로 자른 후 190bp의 절편을 pUC 18의 Sph I 제한 효소 위치에 삽입시킨 pSA-191을 조립한다. pSA-191을 Hind Ⅲ와 Pst I으로 자른 후 200bp 절편을 분리한 것을 pBlusescript KS Ⅱ⁺를 pST I과 Hind Ⅲ로 자른 후 14bp를 제거한 벡터에 삽입시켜 pBPS-206조립한다. pBPS-206을 pST I과 PvuⅡ로 자른후 460bp의 절편을 분리한 후 다시 Sau3A I과 Kpn I으로 자른 뒤 170bp의 절편을 분리한 것과 pBPS-206를 Sph I과 Kpn I으로 자른 뒤 246bp를 제거한 vector와 미리 뉴클레오티드를 합성후 아닐링(Annealing)시킨 69bp의 B형 간염 바이러스 표면항원의 일부를 연결하여 pSBP-234를 조립하였다. 치환코자 하는 B형 간염 바이러스 표면항원(HBsAg)의 일부는 면역원성이 매우 우수해야 한다. HBsAg를 이루는 여러 부위의 면역원성을 조사한 결과 95-109 사이의 아미노산 부위가 가장 우수한 면역원성이 있음이 확인되었다(참조: Lerner, et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 78, 3403, 1981).

이 부위를 중심으로 뉴클레오티드를 합성하였는 바 G부터 G로 끝나는 77mers와 C에서 T로 끝나는 69mers를 합성후 아닐링시켜 양끝이 각각 Sph I과 Sau3A I의 제한효소 위치를 갖는 69bp의 절편을 만들었다. 합성한 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다.

한편 pSI(T7)0을 Spe I으로 자른 후 1340bp의 절편을 분리한 후 pBluescnpt KS Ⅱ⁺의 Spe I 제한 효소 위치에 삽입시켜 pBSKS-1341을 조립하였다. pBSKS-1341을 Sph I으로 처리한 후 190bp의 절편을 제외한 벡터에 pSBP-234를 Sph I으로 자른 후 분리한 190bp의 절편을 삽입시켜 pSBS-198를 조립하였다. pSI(T7)0는 Spe I으로 자른 후 1340bp의 절편을 제거한 벡터에 pSBS-198를 Spe I으로 자른후 분리한 1340bp의 절편을 삽입시켜 pSBS-69를 조립하였다. pSBS-69는 궁극적으로 pSI(T7)0의 뉴클레오티드 2733-2809가 HBsAg의 유전자 일부로 치환된 재조립 소아마비 바이러스의 cDNA를 함유한 플라즈미드이다. 본 명세서에서 기술되는 모든 프랄즈미드는 에스케리치아 콜라이에서 증식되며 재조립된 플라즈미드는 제한 효소 위치에 의해 확인하였다.

[B. 영장류 동물세포의 배양]

ATCC(American Tissne Culture Collection)로 부터 입수한 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포인 Vero와 HelaS3 세포를 우태아 혈청 10%가 포함된 DMEM 배지(Dulbecco's Modification of Eagle's 배지) 37℃, 5% CO₂가 유지되는 CO₂배양기 속에서 배양하였다.

현탁 배양을 위해 HeLaS3 세포를 스피너 플라스크를 이용하여 우태아 혈청 10%가 포함된 MEMS(Minimum Essential Medium Eagle)배지에서 37℃, 5% CO₂가 유지되는 CO₂배양기 속에서 배양하였다.

[C. Vero 세포내로의 트랜스팻션(transfection) 및 재조합 바이러스의 계대배양]

소아마비 바이러스 사빈 타입 1의 cDNA를 함유한 플라즈미드와 재조합 간염-소아마비 바이러스의 플라즈미드를 디에틸아세틸아민에틸(DEAE)-덱스트란 방법에 의해 트랜스 팻션 시켰다(P.N.A.S. USA, 83, 2330, 1986). 트랜스 팻션 후 세포의 변성이 나타나면 바이러스의 증식이 일어나는 것으로서 이 시점에서 세포 및 세포 배양액을 수거한 후 -20℃에서 얼리고 실론에서 방치하는 과정을 3회 반복하였다. 최종 녹인 세포 배양약을 900g에서 15분간 원심분리한 후 일부는 분주하여 바이러스 균주로 보관하여 사용하였다. HeLaS3 세포내에서의 바이러스 배영은 앞서 계대 배양한 바이러스 부유액을 1/10로 희석한 후 미리 배양한 세포에 접종 세포 변성이 일어날때 까지 37℃, 5% CO₂로 유지되는 배양기에서 배양하였다.

[D. 감염력 측정 (J. Virol., 1302, 1989)]

각 바이러스 원액을 혈청이 첨가되지 않은 DMEM 배지로 1/10로 계란 희석한다. 90% 단일 세포층의 상태가 되도록 배양한 영장류 세포의 배양액을 제거한 뒤 생리식염수로 세척한 후 희석한 바이러스액을 접종한다. 바이러스액이 세포에 흡착되도록 실온에서 30분간 방치한 후 미리 만들어둔 2% 한천과 2 X DMEM(2% 우태아 혈청포함)을 섞어 그 혼합액을 40℃로 식히고 이를 합착된 세포위에 부은 후 실온하에서 굳혔다. 37℃, 5% CO₂로 조절된 배양기에 넣고 3-4일 후 프라그가 형성되었으면 겔화된 한천을 세포표면에서 제거한후 1% 크리스탈 바이을렛으로 염색한 뒤 생성된 프라그수를 측정하였다. 바이러스의 감염력은 다음과 같은 공식에 의해 얻었다.

[E. 공시 바이러스 및 재조합 간염-소아마비 바이러스의 정제]

CaCl의 농도구배를 만들고 여기에 한외 여과에 의해 농축한 바이러스액을 얹은 다음 초고속 원심 분리하여 농도구배 분획을 얻고 이를 260㎚에서 흡광도를 측정하여 바이러스가 포함되어 있는 분획을 투석하여 바이러스를 정제하였다.

[F. 재조합 간염 - 소아마비 바이러스 RNA의 확보]

6차 바이러스 계대 배양시 얻어진 감염상태의 HeLaS3 세포를 생리 식염수로 세척한 후 Nonidet P-40 존재하에서 용해시켰다. 원심분리하여 상층액을 우레아 용액과 혼합한 후 페놀-클로로포름용액으로 처리하였다. 수층의 RNA를 에탄올 침전법에 의해 수득하고 이를 다시 녹여서 올리고(dt)-셀룰로즈 컬럼에 흡착시키고 폴리(A)⁺RNA를 용출시켰다(J.Virol., 63, 5386, 1989).

[G. 재조합 바이러스 RNA의 확인]

B형 간염 바이러스의 유전자 전체가 포함된 플라즈미드 pHBV-315로 부터 HBsAg를 암호화하는 부위를 템프리트로 하여 렌덤 프라이머 라벨링 방법에 의하여³²P가 표지된 프로브를 만들었다. E에서 만들어진 검체를 위에 기술한³²P 프로브를 사용하여 하이브리다이제이션 방법에 의하여 확인하였다(J. Viro;., 63, 5354, 1989).

[H. 재조합 바이러스의 유전자 서열의 규명]

플라즈미드 pSBS-198을 Sph I으로 자른 후 분리한 190bp의 절편을 MB13 파아지 벡터를 이용하여 재조립 N13 단일 가락의 DNA를 만들어 보링거 멘하임사의 M13 시퀀스 키트로 분석하였다(참조 Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 74, 5463, 1977).

[I. 재조합 바이러스의 항체 생성능 검성]

E에서 정제한 공시 바이러스 및 재조합 바이러스액을 프로인트 어쥬반트(Freund's adjuvant)와 1:1로 유화시킨 뒤 토끼에 1cc씩 근육내 주사를 하였다. 초기 접종후 21일내에 동일한 방법으로 제조된 바이러스-어쥬반트액을 피하주사로 주사한뒤 7일째 부터 채혈을 실시 혈청을 분리하였다. 분리한 혈청에서 프로테인 A 컬럼을 이용 IgG를 분획한 후 HBSAg가 코팅퇸 ElA 플레이트에서 ELISA에 의해 HBSAg에 대한 항체(Anti-HBS)의 역가를 확인하였다.

다음의 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

[실시예 1. 재조합 간염-소아마비 바이러스 벡터의 구성(제1도 참조)]

1) pSA-191의 구성

약독화 소아마비 바이러스의 cDNA가 들어있는 플라즈미드 pSI(T7)0을 Spe I 으로 자른후 1 한천 겔 전기영동에 의해 1340bp의 절편을 분리하였다. 한천겔에서의 DNA 절편의 분리는 DEAE-셀룰로오즈 막을 이용하여 분리하였다. 분리된 1340bp의 단편은 다시 제한 효소 Sph I으로 자른후 pUC18을 Sph I으로 처리후 송아지의 알칼라인 포스파타졔로 처리한 것에 T4 DNA 리가제(Ligace)를 사용하여 위에서 얻은 190bp의 유전자 절편을 삽입시켰다. 그 결과 프라즈미드 벡터 pSA-191을 얻고 이를 HB101에 형질전환[Transformtion)시켜 목적 세균주를 선별한 다음 이를 배양하여 알칼리 용해(alkali lysis)법에 의해 다량의 pSA-191을 얻었다.

2) pBPS-206의 구성

pSA-191을 제한 효소 Hind Ⅲ와 Pst I 으로 자른후 1.5 한천-겔 전기영동시킨후 DENE-셀룰로오즈 막을 이용 200bp의 유전자 절핀을 얻었다. pBluescript KS Ⅱ⁺를 Pst I과 Hind Ⅲ로 자른후 1% 한천겔 전기엉동에 전개한뒤 큰 단편을 BIO-101사의 진 클린키트(Gene Clean Kit)룰 사용 분리하였다. 여기에 위에서 언급한 200bp의 절편을 T4 리가제를 사용하여 삽입시킨 후 에스케리치아 HB101에 형질전환 하였다. 배양한 세균에서 플라즈미드 DNA를 분리한 뒤 제한 효소의 위치를 확인하여 목적하는 플라즈미드를 선별하였다.

3) pSBP-234의 구성

pSPS-206를 Sph I 과 Kpn I 으로 절단한 뒤 1% 한천겔 전기 영동에 의해 자른후 전개한 뒤 큰 절편을 진 클린 키트에 의해 분리하였다. 다시 pBPS-206을 Pst Ⅰ과 Pvu Ⅱ로 자른뒤 1.5% 한천-겔 전기영동에 전개한후 진 클린 키트를 이용 460bp의 유전자 절편을 분리하였다. 분리된 460bp 절편을 Sau3A Ⅰ과 Kpn Ⅰ으로 자른뒤 12% 폴리아크릴아마이드 겔에 전개시킨후 크러쉬 앤드 소크(Crush and Soak) 방법에 의해 170bp의 절편을 순수 분리하였다.

HBSAg 중 목적하는 부위의 유전자 단편은 각각의 뉴클레오티드를 69mer, 77mer되게 합성한 후 아닐링시켜 양끝이 각각 Sph Ⅰ과 Kpn Ⅰ제한효소 말란을 지니게 하였다. 이상 3개의 절편을 T4 DNA 리가제에 의해 연결하여 pSBP-234를 구성하였다.

4) pBSKS-1341의 구성

pSI(T7)0을 Spe Ⅰ으로 자른후 한천 겔 전기 영동에 전개시킨 뒤 1340bp의 절편을 진 클린 키트를 이용하여 분리하였다. pBluescript KS Ⅱ⁺를 제한효소 Spe Ⅰ으로 자른뒤 송아지의 장 알칼리성 포스파타제(Calf Intestinal Phosphatase)를 처리한 후 위에서 분리한 1340bp의 유전자 절편을 삽입하였다.

5) pSBS-198의 구성

pSBP-234를 제한 효소 Sph Ⅰ으로 자른뒤 12% 폴리아크릴아마이드 겔 전기엉동에 전개시킨 뒤 190bp의 유전자 절편을 분리하였다. pBSKS-1341을 Sph Ⅰ로 처리한 후 송아지의 장 알칼리성 포스파타제로 처리한 후 분리한 190bp의 절편을 T4 DNA 리가제를 이용하여 삽입시켰다.

6) pSBS-69 의 구성

PSI(T7)0을 제한효소 Spe Ⅰ로 자른뒤 1% 한천겔 전기영동에 전개시킨뒤 11200bp의 큰 절편을 진 클린 키트로 분리한뒤 송아지의 장 알칼리성 포스파타제로 처리하였다. pSBS-198을 Spe Ⅰ으로 자른 뒤 1% 한천겔 영동장치에 전개한후 진 클린 키트로 1340bp의 절편을 분리하였다. 분리된 1340bp의 절편을 위에서 분리한 큰 절편에 삽입하였다.

[실시예 2. DEAE-덱스트란 방법을 이용한 영장류 세포내로의 트랜스팻션]

트랜스팻션 시키기 24시간 전 6-well 세포 배양 플레이트에 웰당 1.5×10⁶의 vero 세포를 분주한후 37℃, 5% CO₂가 조절되는 배양기에 24시간 배양하였다. 각각의 플라즈미드 DNA를 증류수로 회석, 일정한 농도로 준비하였다. 혈청이 첨가되지 않은 DEME 배지에 HEPES를 넣어 최종농도가 10mM 되게 준비한후 37℃에 가온시켰다. 일정농도의 DNA에 50㎎/㎖의 DEAE-덱스트탄, 10mM HEPES-DMEM을 혼합하여 최종농도 250㎍/㎖의 DEAE-덱스트란이 되도록 1㎖의 혼합액을 만들었다.

단층 배양된 세포의 배지를 제거한 뒤 37℃로 가온된 10mM HEPES-DMEM 배지로 2회 세척하였다. 상기의 DNA 혼합액을 웰당 250㎕씩 첨가한뒤 10분마다 가볍게 플레이트를 흔들어 주면서 45분간 37℃, 5%, CO₂가 조절되는 배양기에 방치하였다. DNA 혼합액을 제거한 뒤 가온한 HEPES-DMEM 배지로 2회 세척후 우태아 혈청 1%가 포함된 DMEM 배지로 1회 세척한다. 2 X DMEM 배지(2% 우태아 혈청포함)와 융해한 2% 한천을 1 : 1로 섞은 배지나, 1% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지를 웰당 3㎖씩 첨가한 후 37℃, 5%, CO₂가 유지되는 배양기에 배양시켰다.

[실시예 3. 생성된 재조합 바이러스의 계대 배양]

트랜스팻션후 액체 배양 배지하에서 세포 변성이 일어나거나 한천을 깔아 놓은 세포 배양에서 프라그가 형성되면 전자의 경우 세포와 배양액을 수거하고 얼림과 녹임을 3회 반복하여 세포막을 파괴한 후 900g에서 15분간 원심분리, 상층액을 채취한다. 채취한 상층액을 1/10로 희석하여 접종재료로 준비하며 프라그가 형성된 배양세포에서는 프라그를 순수 분리하여 접종재료로 사용한다. 우태아 혈청 10%가 포함된 DMEM 배지하에 배양한 Vero 세포경우 배지를 제거한뒤 생리 식염수로 단층으로 형성된 세포를 1회 세척한다. 바이러스 접종재료 0.1㎖을 접종한 후 세포에 흡착되도록 실온에서 30-1시간 방치한다. 1% 우태아 혈청이 첨가된 DMEM 배지를 첨가한 후 세포변성이 일어날때 까지 37℃, 5%, CO₂가 유지되는 배양기에 배양한다.

HeLa S3의 경우 바이러스 접종 재료를 직접 배양된 세포에 접종한다. 이상과 같은 과정을 반복하여 바이러스를 3-5회 계대 배양하면 바이러스의 역가는 1㎖당 1-10×10⁷PFU를 나타냈다.

[실시예 4. 공시 바이러스 및 재조합 바이러스의 정제]

바이러스를 세포 변성이 일어날때 까지 대량 배양한 후 세포 및 배양액을 수거하여 얼림과 녹임을 3회 반북한다. 900g에서 15분간 원심분리하여 수거한 상층액을 아미콘 YM 300,000막으로 한외 여과하여 농축시킨다. 40%(W/W) CsCl, 0.0M 트리스-Hcl이 포함된 pH 7.4의 용액 5㎖과 5%(W/W)CsCl, 0.0M 트리스-Hcl이 포함된 pH7.4의 용액 5㎖을 초고속 원심 분리용 튜브에 농도구배가 이루어지도록 채우고 그위에 1% NP-40 이 포함된 바이러스 농축액을 1㎖ 얹었다. 액체 파라핀을 가장 위에 얹고 4℃ 에서 120,000g로 4시간 동안 초고속 원심분리 했다. 얻어진 농도 구배 분획을 260㎚에서 흡광도룰 측정하고 바이러스가 포함되어 있는 분획을 생리 식염수로 투석하여 CsCl을 제거한 후 정제된 바이러스를 얻었다.

[실시예 5. 재조합 바이러스 RNA의 확인을 위한 프로브의 제조]

pHBV 315로 부터 분리한 HBsAg를 이루는 DNA의 절편을 0.05㎍/㎕로 조정하여 템프리트로 사용했다. 템프리트 2㎕, 0.5mmol/1 dATP 1㎕, 0.5mmol/1 dGTP 1㎕,0.5mmol/l dTTP 1㎕, 반응완충액(Random Primed DNA Ldbeling Kit, Boehringer Mannheim 제품) 2㎕, 3000Ci/mmol [α³²p dCTP 5㎕(NEN 제품), 증류수 7㎕, 2U/㎕ 크레노우 단편 1㎕을 함께 혼합하고 37℃ 에서 30분간 반응시켜 프로브를 제조해다.

[실시예 6. 재조합 바이러스 RNA를 얻기 위한 시험관내 전사]

실시예 1에서 구성되어진 최종적인 재조합 바이러스 DNA를 제한 효소 Eco RI으로 잘라 선상(linear form)으로 한 다음 1배의 페놀-클로로포름 혼합액을 첨가하여 효소 및 단백질을 제거하고 0.1배의 소디움 아세테이트(pH 5.2)용액 및 2.2배의 에탄올을 처리하여 얻어진 각 벡터를 2㎍/㎕ 로 증류수에 용해시켰다. 5배 농축 전사용 완충액(Transcription buffer) 20㎕, 1M 디티오트레이톨 1㎕, 50U/㎕ 리브뉴클레이즈 억제제 2㎕, 각기 2.5mM의 ATP, CTP, GTP, UTP의 혼합액 20㎕, 2㎍/㎕ 재조합 바이러스 벡터, 20U/㎕ T7 RNA 중합효소 2㎕, 디에칠피로카보네이트(DEPC)로 처리된 증류수 49㎕을 마이크로 원심분리기튜브에 넣어 혼합하고 39℃에서 10분간 반응시킨 후 페놀-클로로포름 혼합액으로 효소 및 단백질을 제거하였다. 0.1배의 3M 소디옴 아세테이트(pH 5.2)용액 및 2.5배의 에탄올을 첨가하여 RNA 트랜스크립트를 수득하였다.

[실시예 7. 재조합 바이러스 RNA 확인을 위한 도트 블롯 하이브리다이제이션 재조합 바이러스 RNA 트랜스크립트 및 콘트롤 벡터(pSI(T7)0)의 RNA 트랜스크립트를 각각 0.5㎍/㎖로 증류수에 녹인후 RNA 혼합용액 10㎕에 100% 포름아미드 20㎕, 37% 포름 알데하이드 7㎕, 20X SSC 2㎕을 혼합하고 68℃ 수욕조에서 15분간 변성(denaturation)시킨뒤 얼음에 두었다가 20 X SSC 80㎕을 혼합시켜 검체를 준비하였다. 나일론 막(Hybond-N Hybridization transfer membranes, Amersham 제품)을 물에 적시고 20X 소디움 클로라이드-소디움 시트레이트(SSC)용액에 다가 실온에서 1시간 적셔 두었다. 메니폴드(manifold)하단부 위에 20X SSC로 적신 흡수성 종이를 2장 얹고 상기의 나일론 막을 얹었다. 메니폴드 상단부를 덮고 기포를 제거한 후 10X SSC를 구멍마다 가득 채운 후 진공흡입시켜 제거 시켰다. 준비한 120㎕의 검체를 메니폴드의 구멍에 넣고 진공 흡입시킨 후 10X SSC 1㎖로 2회 세척하고 5분간 진공흡입시켰다. 막을 메니폴드로 부터 분리하고 UV 240㎚에서 3분간 노출시켜 RNA가 막에 결합되도록 하였다. 막을 6X SSC 용액에 2분간 적신후, 밀폐용 비닐 봉투속에 넣고 42℃로 덮혀진 24㎖의 프리하이브리다이제이션 용액을 넣었다. 공기를 제거하고 비닐 봉투를 밀폐한 후 42℃ 수욕조에서 2시간 동안 뜨지 않게 담가두었다.

비닐봉투에서 프리하이브리다이제이션 용액을 제거하고 100℃에서 5분간 변성시킨 후 즉시 0℃에서 급냉시킨 프로브 50㎕을 첨가하고 하이브리다이제이션 용액 24㎖을 혼합시켰다. 이때 혼합액속의 프로브의 최종농도는 2ng/㎖이 되도록 조절하였다. 기포를 제거하고 비닐봉투를 밀봉한 후 42℃에서 18시간 동안 뜨지 않게 담가두었다. 나일론 막을 꺼내어 실온에서 0.5% SDS가 포함된 2X SSC 500㎖로 5분간 세척한 다음 0.1% SDS가 포함된 2 X SSC 50㎖로 15분간 세척하였다. 37℃에서 0.5% SDS가 포함된 0.1X SSC 500㎖로 45분간 세척하고 68℃에서 0.5% SDS가 포함된 0.1 X SSC 200㎖로 1분간 세척한 후 나일론 막을 종이타올 위에 놓아 흡습시킨 후, 나일론 막을 시란랩위에 얹고³²P가 들어 있는 잉크로 표시한후 랩으로 쌌다.

엑스레이 필름 홀더속에 랩으로 싼 나일론 막을 넣고 암소에서 엑스레이 필름을 덮었다. 인텐시 파잉 스크린이 그 다음 오도록 하고 홀더를 잠가 차광한뒤 -70℃ 에서 48시간 두었다가 암실에서 필름을 꺼내어 엑스레이 현상액에서 5분, 3% 아세트산에서 5분, 속성픽서에서 5분, 흐르는 물에서 15분간 담가 필름을 현상하고 해당 검체위치에서 삽입된 유전자의 존재를 확인하였다.

[실시예 8. 재조합 바이러스의 항체 생성능 검정]

실시예 4에서 정제된 각각의 바이러스를 총단백 농도가 100㎍/㎖ 되게 조정한 후 바이러스 농축액 1㎖과 프로인트 어쥬반트 1㎖을 혼합, 유화시킨다.

2개월된 토끼에 마리당 100㎍씩 피하 주사한 후 3주 뒤에 부스팅을 위해 100㎍씩 근육내 주사를 하였다. 2차 접종후 7일재 부터 적당한 시간 간격으로 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액을 원심분리하여 혈청을 얻고 동량의 생리 식염수룰 섞은 후 0.22㎛ 막 필터로 여과하였다. 여액을 프로테인 A 친화 컬럼(Protein A offinity Column)을 통과시켜 순수한 면역글로부린 G(IgG)만을 분리, 농축한후 총 단백량을 측정하였다. 효소 면역학적 분석(ELISA)를 수행하기 위하여 96웰 EIA 플레이트에 B형 간염 바이러스 표면항원 0.5㎍ 또는 소아마비 바이러스 10PFU가 포함된 0.05M 카보네이트 완충액을 100㎕을 넣었다. 37℃ 에서 2시간 반응시켜 비특이적인 반응을 미리 방지하였다. 증류수로 10회 세척한 후 계단 희석된 순수 분리한 IgG와 3% 우혈청 알부민이 포함된 PBS 100㎕을 넣었다. 37℃에서 2시간 항원-항체 반응을 유도시키고 증류수로 10회 세척한 후 3% 우혈청 알부민이 포함된 PBS에 1㎍/㎖의 안티레빗 IgG 페록시데이즈 콘쥬게이트(Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate)가 포함된 용액 100㎕을 넣고 37℃에서 2시간 반응시켰다. 증류수로 10회 세척후 1㎎/㎖ OPD 용액을 넣고 37℃ 에서 30분간 효소 발색반응을 유도시켰다. 2N H₂SO₄50㎖을 넣어 효소반응을 정지시킨 후 490㎚에서 흡광도를 측정함으로써 B형 간염 바이러스 및 소아마비 바이러스에 대한 항체 생성능을 확인하였다.

Claims (7)

1. 소아마비 바이러스의 외피 단백질을 암호화하는 유전자의 일부를 제거하고 여기에 B형 간염 바이러스의 표면항원을 암호화 하는 유전자를 삽입시켜 재조합 간염-소아마비 바이러스 벡터를 제조한 후, 벡터를 영장류 세포에 트랜스 팻션(Transfection)시켜 바이러스를 증식시키고 증식된 바이러스를 계대 배양한 다음 정제하여 재조합 간염-소아마비 바이러스를 분리하고, 이를 장용성 복용형으로 제형함을 특징으로 경구용 B형 간염백신을 제조하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 유전자를 치환시키는데 있어서 약독화된 소아마비 바이러스의 cDNA가 포함된 플라즈미드를 이용함을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기한 재조합 바이러스 서브클로닝 벡터는 pSA-191, pBPS-206, pSBP-234, pBSKS-1341, pSBS-198, pSBS-69임을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 영장류 세포로서 Vero와 HeLa S3 세포를 이용하여 재조합 소아마비-간염 바이러스를 제조함을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기한 트랜스 팻션은 디에틸아세틸 아미노에칠-텍스트란을 이용함을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기한 정제는 한외 여과 및 CsCl 농도 구배가 있는 초고속 원심분리를 이용함을 특징으로 하는 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기한 재조합 바이러스는 소아마비 바이러스와 B형 간염바이러스에 대한 항체를 유발시키는 2가(divalent) 면역능력을 가지는 바이러스임을 특징으로 하는 방법.