JPH012586A - Ｆｓｍｅ−ウイルスの西部亜型のｄｎａおよびｒｎａ分子、この分子によつてコードされるポリペプチド、ならびにその使用 - Google Patents
Ｆｓｍｅ−ウイルスの西部亜型のｄｎａおよびｒｎａ分子、この分子によつてコードされるポリペプチド、ならびにその使用Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はＦ’８Ｍｇ−ウィルスの西部亜型のＤＮＡおよ
びＲＮＡ分子、その分子をコードするポリペプチド、な
らびにその使用に関する。
びＲＮＡ分子、その分子をコードするポリペプチド、な
らびにその使用に関する。
初ｇＬ脳炎（ＦＡＭＩｉ８＞ウィルスの西部亜型は、球
状のリピド被覆ＲＮＡウィルスであるフラビウィルス科
の仲間である（ Ｗｅｓｔａｗａｙほか： Ｉｎｔｅｒ
ｖｉｒｏｌｏｇｙ。
状のリピド被覆ＲＮＡウィルスであるフラビウィルス科
の仲間である（ Ｗｅｓｔａｗａｙほか： Ｉｎｔｅｒ
ｖｉｒｏｌｏｇｙ。
２４ ： １８３〜１９２．１９８５）。このウィルス
のゾロトタイゾは黄熱病ウィルスである。定義のように
、すべてのフラビウィルスは同族で、それは血球凝集阻
止試験によっても明らかである。
のゾロトタイゾは黄熱病ウィルスである。定義のように
、すべてのフラビウィルスは同族で、それは血球凝集阻
止試験によっても明らかである。
しかしながら、この科のウィルスは交差中和により多く
の血清複合型（Ｄｅ Ｍａｄｒｉｄ ＆ Ｐｏｒｔｅｒ
ｆｉｅｌｄ：Ｊ、 Ｇｅｎ、 Ｖｉｒ（１０）−ｅ ２
３ ” ９１〜９６．１９７４）に細分され、各分類内
のウィルスは他の血清複合型に属するウィルスや分類さ
れないウィルスより互いに類似している。Ｆ８ＭＩｌｎ
−ウィルスは” ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ ＠血清複合型
に属し、この科に属するウィルスにはほかに跳躍病（ｌ
ｏｕｐｉｎｇ−１１１） 、 Ｌａｎｇａｒｔ。
の血清複合型（Ｄｅ Ｍａｄｒｉｄ ＆ Ｐｏｒｔｅｒ
ｆｉｅｌｄ：Ｊ、 Ｇｅｎ、 Ｖｉｒ（１０）−ｅ ２
３ ” ９１〜９６．１９７４）に細分され、各分類内
のウィルスは他の血清複合型に属するウィルスや分類さ
れないウィルスより互いに類似している。Ｆ８ＭＩｌｎ
−ウィルスは” ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ ＠血清複合型
に属し、この科に属するウィルスにはほかに跳躍病（ｌ
ｏｕｐｉｎｇ−１１１） 、 Ｌａｎｇａｒｔ。
０ｍ５ｋｅｒ出血性熱病、Ｋｙａｓａｎｕｒ Ｆｏｒｅ
ｓｔ−Ｄｉｓｅａｓｅおよびネイシウイルスがある。
ｓｔ−Ｄｉｓｅａｓｅおよびネイシウイルスがある。
ｇ８Ｍｇ−ウィルス株はさらに西部（ヨーロッパ）亜型
に分類される。これはＩｘｏｄｅｓ ｒｉｃｉｎｕｓに
主として感染することによるもので、主たる媒体がＩｘ
ｏｄｅｓ ｐｅｒｓｕｌｃａｔｕｓである極東亜型もあ
る（ Ｃ１ａｒｋｅ ： Ｂｕｌｌ、 ＷＨｏ 、 ３
１ ： Ａ ５〜５６ 。
に分類される。これはＩｘｏｄｅｓ ｒｉｃｉｎｕｓに
主として感染することによるもので、主たる媒体がＩｘ
ｏｄｅｓ ｐｅｒｓｕｌｃａｔｕｓである極東亜型もあ
る（ Ｃ１ａｒｋｅ ： Ｂｕｌｌ、 ＷＨｏ 、 ３
１ ： Ａ ５〜５６ 。
１９６４）。
これらの岨型分類は、相当する構造壁タンパク質の競合
的放射免疫定量法および制限タ／バク分解酵素使用下の
ベプチドマツビ／グ（Ｈｅ１ｎｚ ＆Ｋｕｎｚ ： Ｊ
、 Ｇｅｎ、 Ｖｉｒｏｌ、ｅ ５７ ： ２６３〜２
７４ ＊１９８））ならびにモノクローナル抗体使用下
の抗原解析によって゛確認された（ Ｈｅ１ｎｚ ）ほ
か：ＶｉｒｏｌＯｇ’／ 、 １２６ ： ５２５〜５
３７ 、１９８３）。
的放射免疫定量法および制限タ／バク分解酵素使用下の
ベプチドマツビ／グ（Ｈｅ１ｎｚ ＆Ｋｕｎｚ ： Ｊ
、 Ｇｅｎ、 Ｖｉｒｏｌ、ｅ ５７ ： ２６３〜２
７４ ＊１９８））ならびにモノクローナル抗体使用下
の抗原解析によって゛確認された（ Ｈｅ１ｎｚ ）ほ
か：ＶｉｒｏｌＯｇ’／ 、 １２６ ： ５２５〜５
３７ 、１９８３）。
成熟し之ウィルス粒子は、ｇ、ｃｂよびＭと命名されｔ
３撞の構造タンパク質のみを有し、その分子量はそれぞ
れ、はぼ５０，０００〜６０，０００゜ｉ ｓ、ｏ ｏ
ｏおよび７，０００である。
３撞の構造タンパク質のみを有し、その分子量はそれぞ
れ、はぼ５０，０００〜６０，０００゜ｉ ｓ、ｏ ｏ
ｏおよび７，０００である。
フラビウイルスのｒツムは、ｍＲＮＡ極性をもつ約１１
，０００塩基の一本鎖ＲＮＡから構成され、分子量は４
Ｘ１０’／ルト／である。このＲＮＡはＣタンパク質と
ともに球状のヌクレオカシシトを形成し、ゾロティ／Ｅ
およびＭと会合したリピド膜によって包まれている。ウ
ィルスを界面活性剤で可溶化して得られるＥプロティン
の精製プレバレージョンを用いた実験でＥはウィルス性
血球凝集を示すことが明らかにされ（すなわち、適当な
条件下で特定の赤血球を凝集させる）、免疫処置後には
、血球凝集阻害、中和および放棄作用のある抗体、なら
びに生存有毒ウィルスの感染に対する免疫が誘導された
（ Ｈｅ１ｎｚほか： Ｉ ｎ ｆｅ Ｃｔ、 ｌ１ｆ
ｆｌｌｌｎ−＃３３：２５０〜２５７．１９８））。
，０００塩基の一本鎖ＲＮＡから構成され、分子量は４
Ｘ１０’／ルト／である。このＲＮＡはＣタンパク質と
ともに球状のヌクレオカシシトを形成し、ゾロティ／Ｅ
およびＭと会合したリピド膜によって包まれている。ウ
ィルスを界面活性剤で可溶化して得られるＥプロティン
の精製プレバレージョンを用いた実験でＥはウィルス性
血球凝集を示すことが明らかにされ（すなわち、適当な
条件下で特定の赤血球を凝集させる）、免疫処置後には
、血球凝集阻害、中和および放棄作用のある抗体、なら
びに生存有毒ウィルスの感染に対する免疫が誘導された
（ Ｈｅ１ｎｚほか： Ｉ ｎ ｆｅ Ｃｔ、 ｌ１ｆ
ｆｌｌｌｎ−＃３３：２５０〜２５７．１９８））。
この構造タンバク質に加えて、フラビウイルスに感染し
た細胞には、多数のウィルス特異性、非構造タンパク質
が見出される。
た細胞には、多数のウィルス特異性、非構造タンパク質
が見出される。
フラビウイルスのデノムの構成は最近、黄熱病ウィルス
、Ｗｅｓｔ ＮｉｌウィルスおよびＭｕｒｒａｙ Ｖａ
ｌｌｅｙ脳炎ウィルスについて決定された（ Ｒｉｃｅ
ほか：８Ｃ１ｅｎＣｅ＃２２９ニア２６〜７３３，１９
８５；Ｄａｌｇａｒｎｏほか： Ｊ、 Ｍｏ１．阻（３
１）−．１８７ ： ３０９〜３２３ ｅ １９８６
； Ｃａ５ｔｌｅほか： ｖｉｒｏｉｏｇｙ ｔ１４７
：２２７〜２３６ ｅ １９８５ ： Ｃａ５ｔｌｅほ
か： ＶｉｒｏｌＯｇＹ ａ １４９ ” １０〜２６
ｓ １９８６ ：ｗｅｎｇｚｅｒほか： Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ 、 １４７ ： ２６４〜２７４．１９８５）
。この解析によれば、フラビウイルスのｒツムは約１１
．０００ヌクレオチＶの単一の長い読み取り枠を含有し
、これがすべての構造および非構造タンパク質をコード
している。
、Ｗｅｓｔ ＮｉｌウィルスおよびＭｕｒｒａｙ Ｖａ
ｌｌｅｙ脳炎ウィルスについて決定された（ Ｒｉｃｅ
ほか：８Ｃ１ｅｎＣｅ＃２２９ニア２６〜７３３，１９
８５；Ｄａｌｇａｒｎｏほか： Ｊ、 Ｍｏ１．阻（３
１）−．１８７ ： ３０９〜３２３ ｅ １９８６
； Ｃａ５ｔｌｅほか： ｖｉｒｏｉｏｇｙ ｔ１４７
：２２７〜２３６ ｅ １９８５ ： Ｃａ５ｔｌｅほ
か： ＶｉｒｏｌＯｇＹ ａ １４９ ” １０〜２６
ｓ １９８６ ：ｗｅｎｇｚｅｒほか： Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ 、 １４７ ： ２６４〜２７４．１９８５）
。この解析によれば、フラビウイルスのｒツムは約１１
．０００ヌクレオチＶの単一の長い読み取り枠を含有し
、これがすべての構造および非構造タンパク質をコード
している。
構造タンパク質の遺伝子はＲＮＡの５′部分に存在し、
Ｃ−ｐｒＭ（Ｍ）−Ｅの順にｒツムの約４分の１を占め
ている。ｐｒＭはＭの前駆タンパク質であって、フラビ
ウィルスの非成熟型に存在する（ ５ｈａｐｉｒ。
Ｃ−ｐｒＭ（Ｍ）−Ｅの順にｒツムの約４分の１を占め
ている。ｐｒＭはＭの前駆タンパク質であって、フラビ
ウィルスの非成熟型に存在する（ ５ｈａｐｉｒ。
ほか： Ｖｉｔ”（３１）０ｇＹ 、 ５６ ： ８８
〜９４，１９７！１）。
〜９４，１９７！１）。
それが多分細胞内、小胞体内に存在するプロテアーゼに
よって行われるタンパク分解的切断を経てＭが形成され
る。これはウィルス成熟過橿の末期に明らかに認められ
ている。
よって行われるタンパク分解的切断を経てＭが形成され
る。これはウィルス成熟過橿の末期に明らかに認められ
ている。
ウィルスタンパク質の翻訳はＲＮＡの５′末端にある最
初のまたは多分第二のＡＵＧによって開始され、ＲＮＡ
の３′末端にある停止コド／まで行われるものと考えら
れている。連続した単一のタンバク質の形成についで、
特異的なタンパク分解を生じ、この場合も細胞内のウィ
ルス特異的プロテアーゼが関与しているものと思われる
。
初のまたは多分第二のＡＵＧによって開始され、ＲＮＡ
の３′末端にある停止コド／まで行われるものと考えら
れている。連続した単一のタンバク質の形成についで、
特異的なタンパク分解を生じ、この場合も細胞内のウィ
ルス特異的プロテアーゼが関与しているものと思われる
。
Ｐｌｅｔｎｅｖら（ｐｇｓｓ ３６６０ ｖ ２００
： ＊ ２ 。
： ＊ ２ 。
３１７〜３２１．１９８６ ）はＦ’８Ｍ１ｌｉ：ウィ
ルスの極東亜型の一定のフラグメントをクロー二／グし
、ＦＡＭＥ−ウィルスのこの組型のｒツム構成は、上に
言及したウィルスの場合と同じであることを示Ｌｌが、
ＦＳＭｇ−ウィルスのこの亜型の構造遺伝子の全配列の
クローニングおよび配列快定はできなかった。しかも、
公表されたプロティンＥの配列は、読み取り枠のずれに
よりカルだΦシ末端の範囲で誤った配列が導かれていて
正しくない。
ルスの極東亜型の一定のフラグメントをクロー二／グし
、ＦＡＭＥ−ウィルスのこの組型のｒツム構成は、上に
言及したウィルスの場合と同じであることを示Ｌｌが、
ＦＳＭｇ−ウィルスのこの亜型の構造遺伝子の全配列の
クローニングおよび配列快定はできなかった。しかも、
公表されたプロティンＥの配列は、読み取り枠のずれに
よりカルだΦシ末端の範囲で誤った配列が導かれていて
正しくない。
現在までに６０種を越えるフラビウイルスが知られてい
て、その約３分の２が感染した節足動物に咬まれて伝達
され、節足動物媒介性（ＡＲＢＯ）ウィルスである。ヒ
トの病原となるフラビウィルスも多数知られていて、黄
熱病ウィルス、Ｄｅｎ−ｇｕｅｖｉｒｕｓ ｒ日本脳炎
ウイＡ／ ｘ 、ＦＳＭＥ−ウィルスがある（ ５ｈｏ
ｐｅ ： ｉｎ ’ Ｔｈｅ Ｔｏｇａｖｉｒｕｓｅｓ
＠４７〜８２頁、 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ）。
て、その約３分の２が感染した節足動物に咬まれて伝達
され、節足動物媒介性（ＡＲＢＯ）ウィルスである。ヒ
トの病原となるフラビウィルスも多数知られていて、黄
熱病ウィルス、Ｄｅｎ−ｇｕｅｖｉｒｕｓ ｒ日本脳炎
ウイＡ／ ｘ 、ＦＳＭＥ−ウィルスがある（ ５ｈｏ
ｐｅ ： ｉｎ ’ Ｔｈｅ Ｔｏｇａｖｉｒｕｓｅｓ
＠４７〜８２頁、 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ）。
ＦＳＭＥ−ウィルスは、多くのヨーロッパの国々、ロシ
ャ、中国の風土病である。いくつかの中央ヨ−ロツパの
国、たとえばオーストリア、チェコスロパキャ ／％ン
がリーでは、患者がよく調査されている。毎年数百の痛
例が病院に収容されることが記録されていて、公衆衛生
上重要な問題となっている。
ャ、中国の風土病である。いくつかの中央ヨ−ロツパの
国、たとえばオーストリア、チェコスロパキャ ／％ン
がリーでは、患者がよく調査されている。毎年数百の痛
例が病院に収容されることが記録されていて、公衆衛生
上重要な問題となっている。
高度に精製され、ホルマリンで不活化された全ウィルス
ワクチン（Ｋｕｎｚほか： Ｊ、 Ｍｅｄ、 Ｖｉｒｏ
ｌ、。
ワクチン（Ｋｕｎｚほか： Ｊ、 Ｍｅｄ、 Ｖｉｒｏ
ｌ、。
６：１０３〜１０９．１９８０）の接種により、ウィル
スの構造タンパク質に対する免疫応答が誘導され、発病
は効果的に阻止される。しかし、このワクチンの主な欠
点は、伝染性の危険なウィルスｌ！！＆濁液を製造過穐
で大量に取り扱かわなければならないことである。した
がって、広範囲にわ九って高価な危険防止策が必委とな
ってくる。
スの構造タンパク質に対する免疫応答が誘導され、発病
は効果的に阻止される。しかし、このワクチンの主な欠
点は、伝染性の危険なウィルスｌ！！＆濁液を製造過穐
で大量に取り扱かわなければならないことである。した
がって、広範囲にわ九って高価な危険防止策が必委とな
ってくる。
本発明の目的は、したがって、上述の欠点を克服したワ
クチ／の製造方法を提供することにある。
クチ／の製造方法を提供することにある。
本発明はこの課題を、ＦＳＭＥ−ウィルスの西部亜型に
由来し、ＦＳＭＥ−ウィルス西部亜をのプロティンＣ、
ｐｒＭ 、 ＭまたはＥからなる群より選ヲｆれる少な
くとも１檀のタンパク質の少なくとも一部をコードする
ＤにＡを含有するＤＮＡ分子を使用することによって解
決する。
由来し、ＦＳＭＥ−ウィルス西部亜をのプロティンＣ、
ｐｒＭ 、 ＭまたはＥからなる群より選ヲｆれる少な
くとも１檀のタンパク質の少なくとも一部をコードする
ＤにＡを含有するＤＮＡ分子を使用することによって解
決する。
このＤＮＡ分子はｙｓＭｗ−ウィルスの西部亜型の一本
鎖ＲＮＡであり、ＦＳＭＥ−ウィルスの西部亜型のプロ
ティンＣ、ｐｒＭ 、 ＭまたはＥの単独ｔｉｔは上述
のような組合せ、あるいはその選ばれたタンパク質１檀
ま九は２種以上の部分等、診断、治療または予防の領域
で重要な？リペプチド（はの発現の之めの遺伝子情報の
供給に適している。
鎖ＲＮＡであり、ＦＳＭＥ−ウィルスの西部亜型のプロ
ティンＣ、ｐｒＭ 、 ＭまたはＥの単独ｔｉｔは上述
のような組合せ、あるいはその選ばれたタンパク質１檀
ま九は２種以上の部分等、診断、治療または予防の領域
で重要な？リペプチド（はの発現の之めの遺伝子情報の
供給に適している。
本発明のＤＮＡ分子自体またはその部分は以下に述べる
ような種々の目的に使用される。
ような種々の目的に使用される。
本発明のＤＮＡ分子は、ＦＡＭｇ−ウィルスの西部亜型
の構造タンパク質をコードする配列、好ましくは第１図
に示した全体の分子として使用することができる。第１
図に明示し几ＤＮＡ配列はＦＳＭＥ−ウイルスの西部亜
型のクローニングしたｒツムを示し、天然に生じるＦＳ
ＭＥ−ウィルスの西部亜型が包含するＲＮＡ分子に相当
する。＠１図に示しｔＤＮＡ配列は、構造タンパク質の
領域と５′非翻訳領域を含んでいる。検討されたＤＮＡ
配列はただ１個の読み取り枠を有し、プロティンＣ、ｐ
ｒＭ 、 ＭおよびＥのアミノ木端開始点ならびにクロ
ーンＡ５およびＰｌ−１の境界は矢印で示した。
の構造タンパク質をコードする配列、好ましくは第１図
に示した全体の分子として使用することができる。第１
図に明示し几ＤＮＡ配列はＦＳＭＥ−ウイルスの西部亜
型のクローニングしたｒツムを示し、天然に生じるＦＳ
ＭＥ−ウィルスの西部亜型が包含するＲＮＡ分子に相当
する。＠１図に示しｔＤＮＡ配列は、構造タンパク質の
領域と５′非翻訳領域を含んでいる。検討されたＤＮＡ
配列はただ１個の読み取り枠を有し、プロティンＣ、ｐ
ｒＭ 、 ＭおよびＥのアミノ木端開始点ならびにクロ
ーンＡ５およびＰｌ−１の境界は矢印で示した。
本発明の好ましい実施態様としては、ＦＳＭＥ −ウィ
ルスの西部亜型の構造タンパク質の１種すなわちＣ、ｐ
ｒＭ 、 Ｍま友はＥタンパク質全体をコードするＤＮ
Ａ分子の供給がある。望ましい選ばれ九構造タンパク質
ｔ−ｍ造するためには、ＤＮＡ分子の心髄なそれぞれの
部分を直接、適当な発現系に使用することができる。
ルスの西部亜型の構造タンパク質の１種すなわちＣ、ｐ
ｒＭ 、 Ｍま友はＥタンパク質全体をコードするＤＮ
Ａ分子の供給がある。望ましい選ばれ九構造タンパク質
ｔ−ｍ造するためには、ＤＮＡ分子の心髄なそれぞれの
部分を直接、適当な発現系に使用することができる。
本発明の好ましい態様は、Ｆ８ＭｆＣ−ウィルスの西部
亜型の構造タンパク質の少なくとも１個の抗原決定基の
領域をコードするＤＮＡ分子の部分を、診断、治４また
は予防に有効な薬剤の製造のために提供することにある
。抗体応答の誘導にはタンパク質の抗原決定基をもつ領
域があればよいことはよく知られた事実である。すなわ
ち、抗原性をもつことが知られているタンパク質のすべ
てを必ずしも使用する必要はなく、そのタンパク質の抗
原決定基の領域のみを使用すればよい。わずかなアミノ
酸のみの配列でも抗原として作用し、抗体応答を生じる
場合がある。し友がって、ワクチ／物質の製造には、抗
原決定基の機能を提示するアミノ酸のみをコードするＤ
ＮＡ配列を供給するだけで十分である。ＦＢＭＰ−ウィ
ルス西部亜型の構造タンパク質Ｅの抗原決定基の領域を
コードするＤＮＡ配列がとくに好ましい。
亜型の構造タンパク質の少なくとも１個の抗原決定基の
領域をコードするＤＮＡ分子の部分を、診断、治４また
は予防に有効な薬剤の製造のために提供することにある
。抗体応答の誘導にはタンパク質の抗原決定基をもつ領
域があればよいことはよく知られた事実である。すなわ
ち、抗原性をもつことが知られているタンパク質のすべ
てを必ずしも使用する必要はなく、そのタンパク質の抗
原決定基の領域のみを使用すればよい。わずかなアミノ
酸のみの配列でも抗原として作用し、抗体応答を生じる
場合がある。し友がって、ワクチ／物質の製造には、抗
原決定基の機能を提示するアミノ酸のみをコードするＤ
ＮＡ配列を供給するだけで十分である。ＦＢＭＰ−ウィ
ルス西部亜型の構造タンパク質Ｅの抗原決定基の領域を
コードするＤＮＡ配列がとくに好ましい。
本発明のＤＮＡ分子の製造には２つの方法がある。
一つの可能性は、まずＦＳＭＥ−ウィルス西部亜型から
ウィルスＲＮＡを抽出し、このＲＮＡ分子を端層し、つ
いでこの逆転写酵素を用いてこのＲＮＡ鋳型をＤＮＡ分
子に転写することによって製造する。さらに別の方法は
、ＤＮＡ配列が明らかな場合で、本発明のＤＮＡ分子を
化学的に合成する。
ウィルスＲＮＡを抽出し、このＲＮＡ分子を端層し、つ
いでこの逆転写酵素を用いてこのＲＮＡ鋳型をＤＮＡ分
子に転写することによって製造する。さらに別の方法は
、ＤＮＡ配列が明らかな場合で、本発明のＤＮＡ分子を
化学的に合成する。
本発明は好ましい実権態様として、主クレームに相当す
るＤＮＡ分子を緊縮条件下に）１イデＩＪ ｆイゼーシ
ョンしたＤＮＡ分子を包含する。この好ましい方法で得
られたＤＮＡ分子は、抗体反応の誘導により適し九ペプ
チドをコードすることができ、し友がって、このＤＮＡ
分子は［）ＮＡ−戸／デとして適している。
るＤＮＡ分子を緊縮条件下に）１イデＩＪ ｆイゼーシ
ョンしたＤＮＡ分子を包含する。この好ましい方法で得
られたＤＮＡ分子は、抗体反応の誘導により適し九ペプ
チドをコードすることができ、し友がって、このＤＮＡ
分子は［）ＮＡ−戸／デとして適している。
本発明はまた、遺伝子コードの退行および／ま友は突然
麦類および／″！たは転位によって主りレイムに相当す
るＤＮＡ分子とは異なるが、なおＦＳＭＫ−ウィルス西
部亜型のプロテインＣ、ｐｒＭ、ＭまたはＥからなる群
より選ばれるタンパク質の少なくとも１櫨の抗原性をも
つタンパク質をコーＰするすべてのＤＮＡ配列を包含す
る。選ばれた根拠から明らかなように、ＤＮＡ配列は第
１図に示したＤＮＡ 、 ＦＡＭＢ−ウィルス西部亜型
のＲＮＡ鋳型から逆転写酵素によってｃＤＮＡとして創
造され、単離され、精製されたＤＮＡ分子とは高度に異
なっている。しかしながら、このＤＮＡ分子によってコ
ードされるタンパク質には類似点が多い。
麦類および／″！たは転位によって主りレイムに相当す
るＤＮＡ分子とは異なるが、なおＦＳＭＫ−ウィルス西
部亜型のプロテインＣ、ｐｒＭ、ＭまたはＥからなる群
より選ばれるタンパク質の少なくとも１櫨の抗原性をも
つタンパク質をコーＰするすべてのＤＮＡ配列を包含す
る。選ばれた根拠から明らかなように、ＤＮＡ配列は第
１図に示したＤＮＡ 、 ＦＡＭＢ−ウィルス西部亜型
のＲＮＡ鋳型から逆転写酵素によってｃＤＮＡとして創
造され、単離され、精製されたＤＮＡ分子とは高度に異
なっている。しかしながら、このＤＮＡ分子によってコ
ードされるタンパク質には類似点が多い。
本発明の好ましい実施態様においては、特許請求の範囲
に請求されたＤＮＡ分子が、補足的なＤＮＡ配列と組合
されていてもよい。
に請求されたＤＮＡ分子が、補足的なＤＮＡ配列と組合
されていてもよい。
この補足的な配列は、ＤＮＡ分子の細胞内での複製およ
び発現を可能にするものである。この目的で重要なＤＮ
Ａ配列は工ンパンサー、プロモーター、ポリアデニル化
シグナルおよびスプライスシグナルのＤＮＡ配列である
。この補足的ＤＮＡ配列は、本発明のＤＮＡ分子と、専
門家には熟知の標準方法によって組合せることができる
。
び発現を可能にするものである。この目的で重要なＤＮ
Ａ配列は工ンパンサー、プロモーター、ポリアデニル化
シグナルおよびスプライスシグナルのＤＮＡ配列である
。この補足的ＤＮＡ配列は、本発明のＤＮＡ分子と、専
門家には熟知の標準方法によって組合せることができる
。
以上本発明のＤＮＡ分子について述べた利点はそのまま
ＲＮＡ分子にもあてはまる。本発明のＲＮＡ分子はＦＳ
Ｍｇ−ウィルスの西部亜型のＲＮＡの単離、精製、また
はｌｆＪ換えＲＮＡ ／ ＤＮＡ技術によって得ること
ができる。さらにＲＮＡ分子は本発明において得られる
ＦＳＭＥ−ウィルスの西部亜型の精製によって得られる
のみでなく、転写によって単離精製したウィルスＲＮＡ
を逆転写酵素によってＤＮＡとし、ついで得られたＤＮ
Ａを再びＲＮＡへ転写することによって得られる。
ＲＮＡ分子にもあてはまる。本発明のＲＮＡ分子はＦＳ
Ｍｇ−ウィルスの西部亜型のＲＮＡの単離、精製、また
はｌｆＪ換えＲＮＡ ／ ＤＮＡ技術によって得ること
ができる。さらにＲＮＡ分子は本発明において得られる
ＦＳＭＥ−ウィルスの西部亜型の精製によって得られる
のみでなく、転写によって単離精製したウィルスＲＮＡ
を逆転写酵素によってＤＮＡとし、ついで得られたＤＮ
Ａを再びＲＮＡへ転写することによって得られる。
本発明においては、以上述べたようなＤＮＡおよびＲＮ
Ａ分子を供給するのみでなく、上述のｆ）ＮＡまたはＲ
ＮＡ分子を挿入体として含有するベクターも提供する。
Ａ分子を供給するのみでなく、上述のｆ）ＮＡまたはＲ
ＮＡ分子を挿入体として含有するベクターも提供する。
この場合、ベクターとは、シラスミＰ１ウィルスおよび
コスミＦからなる群より選ばれる。
コスミＦからなる群より選ばれる。
このようなベクターに、プロモーター、工／ハ／サー等
、挿入されたＲＮＡま念はＤＮＡ配列の複拶および発現
を支持するＤＮＡ配列を包含できることは、熱練者には
よく知られたとおりである。
、挿入されたＲＮＡま念はＤＮＡ配列の複拶および発現
を支持するＤＮＡ配列を包含できることは、熱練者には
よく知られたとおりである。
上述のＤＮＡ配列のクローニングに適当な、文献に詳細
に報告されているプラスミドは、ｐＢｕ３２２である。
に報告されているプラスミドは、ｐＢｕ３２２である。
−
好ましい、上述の方法で製造されるプラスξＦは、第５
因に示したようなプラスミドＡ５である。
因に示したようなプラスミドＡ５である。
デラスミｒＡ５はプラスミドｐＢＲ３２２から誘導され
、プロティンＥをコードするＤＮＡ配列を包含する。さ
らに別の好ましいプラスミドにはプラスミドＰ１−１が
ある。以上の好ましいプラスミドは、デダペスト条約に
従ってドイツ微生物寄託機関に寄託され、以下の寄託番
号が付されている。
、プロティンＥをコードするＤＮＡ配列を包含する。さ
らに別の好ましいプラスミドにはプラスミドＰ１−１が
ある。以上の好ましいプラスミドは、デダペスト条約に
従ってドイツ微生物寄託機関に寄託され、以下の寄託番
号が付されている。
ａ）プラスミドＡ ５ （Ｅ、 ｃｏｌｉ ＨＢ １（
３１）中）＝ＤＳＭ ４３８２ ｂ） ７°ラスミ）Ｐｉ−１（Ｅ、ｃｏｌｉＨＢＩＱ
１中）＝ＤＳＭ ４３８３ 上述のプラスミドＡ５に出発し、本発明の好ましい態様
によれば、プラスミドＡ５中にクローニングされたＦＳ
Ｍｇ−ウィルスのｆ）ＮＡ配列の部分を含有する挿入プ
ラスミドが製造される。この場合、この嘩入シラスミｒ
は、相同性組換えによってワクシニアウィルスのＨｌｎ
ｄ ［Ｉ Ｊ−７ラグメントに組換え可能になるような
方法で異種遺伝情報を包含する。プラスミドＡ５のサブ
フラグメントを様様な制限エンドヌクレアーゼで消化す
る。たとえばプロティンＥを形成させ、疎水性アミノ酸
配列すなわちシグナルおよび膜依存性配列を含有するか
どうかを調べる。挿入プロティン１ｆｆｉ −ＤＮＡを
含有する組換えウィルスをプラークから単離する。
３１）中）＝ＤＳＭ ４３８２ ｂ） ７°ラスミ）Ｐｉ−１（Ｅ、ｃｏｌｉＨＢＩＱ
１中）＝ＤＳＭ ４３８３ 上述のプラスミドＡ５に出発し、本発明の好ましい態様
によれば、プラスミドＡ５中にクローニングされたＦＳ
Ｍｇ−ウィルスのｆ）ＮＡ配列の部分を含有する挿入プ
ラスミドが製造される。この場合、この嘩入シラスミｒ
は、相同性組換えによってワクシニアウィルスのＨｌｎ
ｄ ［Ｉ Ｊ−７ラグメントに組換え可能になるような
方法で異種遺伝情報を包含する。プラスミドＡ５のサブ
フラグメントを様様な制限エンドヌクレアーゼで消化す
る。たとえばプロティンＥを形成させ、疎水性アミノ酸
配列すなわちシグナルおよび膜依存性配列を含有するか
どうかを調べる。挿入プロティン１ｆｆｉ −ＤＮＡを
含有する組換えウィルスをプラークから単離する。
Ｆ’８■−ＤＮＡ配列の挿入体がプロティンＥの所望の
部分をコードすることは、適当な制限エンドヌクレアー
ゼで消化し、３２ｐ標＠ ＦＳＭＥ −ＣＤＮＡとハイ
ブリダイゼーシヨンして証明し、特徴的なワクシニアＨ
１ｎｄ ［Ｉ Ｊ−フラクションを確認できるかどうか
調べる。
部分をコードすることは、適当な制限エンドヌクレアー
ゼで消化し、３２ｐ標＠ ＦＳＭＥ −ＣＤＮＡとハイ
ブリダイゼーシヨンして証明し、特徴的なワクシニアＨ
１ｎｄ ［Ｉ Ｊ−フラクションを確認できるかどうか
調べる。
ワクシニアウィルスへの組換えの実行に適し之プラスミ
ドとしては６つの例を挙げることができる。クロー／化
Ｆ８匹−ＤＮＡのＨａｓ １１フラグメントを含有する
プラスミドｐＳＣ １１− Ｈ１、クローン化ＦＳＭＥ
−ＤＮＡのＦｎｕ Ｄ ＩＩフラグメントを含有するプ
ラスミドｐ８ｃ １１− Ｆ ４１ 、ならびにクロー
／化ＦＳＭＥ −ＤＮＡのＰｖｕ １１フラグメ／トを
含有するｐＳＣｌｌ−Ｐ６である。以上のプラスミドは
第７図に示す。原料のプラスミドｐＳＣ １１はＥ。
ドとしては６つの例を挙げることができる。クロー／化
Ｆ８匹−ＤＮＡのＨａｓ １１フラグメントを含有する
プラスミドｐＳＣ １１− Ｈ１、クローン化ＦＳＭＥ
−ＤＮＡのＦｎｕ Ｄ ＩＩフラグメントを含有するプ
ラスミドｐ８ｃ １１− Ｆ ４１ 、ならびにクロー
／化ＦＳＭＥ −ＤＮＡのＰｖｕ １１フラグメ／トを
含有するｐＳＣｌｌ−Ｐ６である。以上のプラスミドは
第７図に示す。原料のプラスミドｐＳＣ １１はＥ。
ｃｏｌｉ中に形質転換し、ブダペスト条約に従ってドイ
ツ微生物寄託機１月に寄託番号ＤＳＭ ４３８）号で寄
託されている。
ツ微生物寄託機１月に寄託番号ＤＳＭ ４３８）号で寄
託されている。
上述の挿入プラスミドはワクシニア発現ベクター中に所
望の配列を挿入するに際して使用するのに好ましい。
望の配列を挿入するに際して使用するのに好ましい。
この配列のビークルとしては細菌も同様に使用される。
好ましい細菌はネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏ−ｎｅｌｌ
ａ ｔｙｐｈｉ ）である。
ａ ｔｙｐｈｉ ）である。
請求されているベクターあるいにビークルを、本発明の
ＲＮＡまｔはＤＮＡ配列をコードするポリペプチドの発
現が可能な限り自然の条件下に行われる培養細胞中、好
ましくは哺乳類動物細胞中に含有させる。哺乳類動物の
使用により、ワクチンとして使用可能なポリペプチドの
発現に殻も好ましい条件が与えられる。
ＲＮＡまｔはＤＮＡ配列をコードするポリペプチドの発
現が可能な限り自然の条件下に行われる培養細胞中、好
ましくは哺乳類動物細胞中に含有させる。哺乳類動物の
使用により、ワクチンとして使用可能なポリペプチドの
発現に殻も好ましい条件が与えられる。
所望のペプチドまたはポリペプチドの発現にとくに適当
な培霧細胞はぺａ細胞またはトリ胚繊維芽細胞である。
な培霧細胞はぺａ細胞またはトリ胚繊維芽細胞である。
これは、上述したようなワクシニア発現ベクターを包含
し、ワクシニア発現ベクター中に含有されたＤＮＡ配列
に相当する各タンバク質が発現される。組換えウィルス
は、挿入ＦＳＭＥ−ＤＮＡの存在をサヂンデロットハイ
プリダイゼーショ／法で解析できる。
し、ワクシニア発現ベクター中に含有されたＤＮＡ配列
に相当する各タンバク質が発現される。組換えウィルス
は、挿入ＦＳＭＥ−ＤＮＡの存在をサヂンデロットハイ
プリダイゼーショ／法で解析できる。
本発明は、上述のヌクレオチド配列のいずれかによって
コードされるアミノ酸配列を包含するペプチドまたはポ
リペプチドを提供する。これらのペプチドまたはポリペ
ゾチｒの供給の利点は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子につい
て上述した利点と完全に一致する。
コードされるアミノ酸配列を包含するペプチドまたはポ
リペプチドを提供する。これらのペプチドまたはポリペ
ゾチｒの供給の利点は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子につい
て上述した利点と完全に一致する。
本発明のペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列は
、上述したＤＮＡおよびＲＮＡ配列に相当し、第３図に
示したアミノ酸配列が好ましい。
、上述したＤＮＡおよびＲＮＡ配列に相当し、第３図に
示したアミノ酸配列が好ましい。
上述のプラスミドｐＳＣ １１− Ｈ１、ｐｓＣ１１−
Ｆ、ｌおよびｐＳＣ １１− Ｐ ６を用い、それによ
って特定され友プロティンの、好ましくは相当するワク
シニア−発現−ベクター中への組換えにより発現が行わ
れる。
Ｆ、ｌおよびｐＳＣ １１− Ｐ ６を用い、それによ
って特定され友プロティンの、好ましくは相当するワク
シニア−発現−ベクター中への組換えにより発現が行わ
れる。
本発明の４プチドまたはポリペプチドは本発明のヌクレ
オチド配列の発現によって製造するのが好ましいが、本
発明のベゾチｒまたはボリベデチｒは化学的に合成する
ことも可能である。
オチド配列の発現によって製造するのが好ましいが、本
発明のベゾチｒまたはボリベデチｒは化学的に合成する
ことも可能である。
本発明のペプチドまたはポリペプチドは、医学領域で使
用される組成物中に含有させることが好ましい。
用される組成物中に含有させることが好ましい。
本発明のＤＮＡおよびＭＡ配列は生ワクチン物質の構造
に使用することもできる。とくにこのＤＮＡ配クリは生
ワクチンとして確立されているワクシニアウィルスのＤ
ＮＡと組合わせることが好ましい。
に使用することもできる。とくにこのＤＮＡ配クリは生
ワクチンとして確立されているワクシニアウィルスのＤ
ＮＡと組合わせることが好ましい。
一方、本発明のＲＮＡまたはＤＮＡによってコードされ
る１櫨ま之は２種以上のベデチＶまたはポリペプチドを
含有する組成物を含むワクチンを製造することもできる
。
る１櫨ま之は２種以上のベデチＶまたはポリペプチドを
含有する組成物を含むワクチンを製造することもできる
。
抗原性ペプチドまたはポリペプチドを含有するワクチン
の好ましい使用については、特異的免疫グロブリンの製
造の場合と同じで、熟練者にはよく知られているとおり
である。
の好ましい使用については、特異的免疫グロブリンの製
造の場合と同じで、熟練者にはよく知られているとおり
である。
１種または２種以上の本発明のペプチドまたはポリペプ
チドを包含する組成物はまた、診断用剤として使用する
こともできる。
チドを包含する組成物はまた、診断用剤として使用する
こともできる。
本発明のＤＮＡまたはＲＮＡ配列はまた、同定の目的で
の・戸／デとしても適している。
の・戸／デとしても適している。
本発明を次に以下の詳細な説明によってさらに明確にす
る。
る。
本発明の好ましい実施態様は図面に示しであるが、以下
に各図面について説明する。
に各図面について説明する。
第１図は、 ＦＳＭＥｉニーウィルス百部亜型のクロー
ン化ｒツムのＤＮＡ配列を示し、構造領域および５′非
翻訳領域が包含されている。プロティンＣ１ｐｒＭ （
Ｍ）およびＥのアミノ末端開始点、ならびにクロー７に
５およびＰｌ−１の境界は矢印で示しである。
ン化ｒツムのＤＮＡ配列を示し、構造領域および５′非
翻訳領域が包含されている。プロティンＣ１ｐｒＭ （
Ｍ）およびＥのアミノ末端開始点、ならびにクロー７に
５およびＰｌ−１の境界は矢印で示しである。
第２因は、ＦＳＭｇ−ウィルスの西部亜型のデノムの、
構造タンパク質をコードするＲＮＡ配列を示す。デミテ
ィンＣ、ｐｒＭ （Ｍ）およびＥの７εノ末端開始点は
矢印で示しである。
構造タンパク質をコードするＲＮＡ配列を示す。デミテ
ィンＣ、ｐｒＭ （Ｍ）およびＥの７εノ末端開始点は
矢印で示しである。
第６図は、第１図に示したＤＮＡ配列に由来するＦＳＭ
Ｅ−ウィルスの西部亜型の構造タンパク質のアミノ酸配
列を示す。各タフバク質のＮＨ２末端は矢印で示しであ
る。
Ｅ−ウィルスの西部亜型の構造タンパク質のアミノ酸配
列を示す。各タフバク質のＮＨ２末端は矢印で示しであ
る。
第４図は、Ｆ８ＭＥ−ウィルスの西部亜型に特異的な挿
入体を含有するプラスミドを制限酵素Ｓｍａ夏で分裂後
、アがロースゲル電気泳動に付した場合の写真である（
レーン２〜６）。上方のべ／げがプラスミドＤＮＡ （
４５６３ｂｐ ）を示し、下方ノ／ｆ ｙ ｌ’ カ！
’Ａ 的’ｒｆｌｌ 人ＤＮＡ （２＃ ０００〜３
−５００ｂｐの範囲）を示している。レーン１および７
のＤＮＡマーカーは、上方から下方に、２３，１３０
。
入体を含有するプラスミドを制限酵素Ｓｍａ夏で分裂後
、アがロースゲル電気泳動に付した場合の写真である（
レーン２〜６）。上方のべ／げがプラスミドＤＮＡ （
４５６３ｂｐ ）を示し、下方ノ／ｆ ｙ ｌ’ カ！
’Ａ 的’ｒｆｌｌ 人ＤＮＡ （２＃ ０００〜３
−５００ｂｐの範囲）を示している。レーン１および７
のＤＮＡマーカーは、上方から下方に、２３，１３０
。
９．４１６．６，５５７，４，３６１．２，３２２゜２
．２０７，５６４および１２５塩基対に相当する。
．２０７，５６４および１２５塩基対に相当する。
第５図は、プラスミドｐＢＲ３２２から誘導され友プラ
スミドＡ５を示す。選択されたサデフラグメ／トをその
制限エンげヌクレアーゼ切断部分に明示し、相当するＦ
ＡＭＥ−ゾロティ／Ｅコード領域に印を付した。また矢
印はｒツムＲＮＡの転写方向を示している。
スミドＡ５を示す。選択されたサデフラグメ／トをその
制限エンげヌクレアーゼ切断部分に明示し、相当するＦ
ＡＭＥ−ゾロティ／Ｅコード領域に印を付した。また矢
印はｒツムＲＮＡの転写方向を示している。
第６図は、単独のＳｍａ ｒ挿入位置に、ワクシニアプ
ロモーター、原核動物１ａｃ Ｚ遺伝子およびワクシニ
アＴＫ組み換え配列を含有する挿入プラスミドｐｓ（３
１）１ Ｋ−示す。
ロモーター、原核動物１ａｃ Ｚ遺伝子およびワクシニ
アＴＫ組み換え配列を含有する挿入プラスミドｐｓ（３
１）１ Ｋ−示す。
第７図は、ワクシニア発現ベクター中への１ｎｖｉｖｏ
組換えのための、具体的実例として、３個のＦＳＭＥ−
挿入プラスミドを示す。各プラスミド中ヌクレオチド６
．５００付近の唯一のＳｍａ ｉ部位が示されている。
組換えのための、具体的実例として、３個のＦＳＭＥ−
挿入プラスミドを示す。各プラスミド中ヌクレオチド６
．５００付近の唯一のＳｍａ ｉ部位が示されている。
ＦＳＭＨに特異的な配列の最初の塩基は、それぞれの適
当なプラスミド中ヌクレオチド６５０３である。
当なプラスミド中ヌクレオチド６５０３である。
第８図はサブクローン化されたＦＳＭＥ−ウィルス特異
的配列の特性を示す。翻訳開始コド／ならびに水親和性
プロットに由来する親水性および疎水性を表示する。こ
れらの領域はＩＢＩ −Ｐｕ５ｔｅｌｌコンピユータプ
ログラムによって同定し九〇疎水性配列はロ、親水性配
列は−で示す。
的配列の特性を示す。翻訳開始コド／ならびに水親和性
プロットに由来する親水性および疎水性を表示する。こ
れらの領域はＩＢＩ −Ｐｕ５ｔｅｌｌコンピユータプ
ログラムによって同定し九〇疎水性配列はロ、親水性配
列は−で示す。
第９図は、Ｆ８ＭＩＢ−挿入プラスミドの物理的地図な
らびにＦＡＭＥ ％異的配列が含有するプラスミドＤＮ
Ａフラグメントの検出を示す。Ａ）はエチジウムデｃ１
ξド染色アがロースゲルでＤＮＡフラゲメ／トをみるこ
とができる。Ｂ）は″Ｆ８Ｍｇ−リポデａ−デ１−・戸
ンデとのサヂンデロットハイデリダイゼーションの結果
を示ず。
らびにＦＡＭＥ ％異的配列が含有するプラスミドＤＮ
Ａフラグメントの検出を示す。Ａ）はエチジウムデｃ１
ξド染色アがロースゲルでＤＮＡフラゲメ／トをみるこ
とができる。Ｂ）は″Ｆ８Ｍｇ−リポデａ−デ１−・戸
ンデとのサヂンデロットハイデリダイゼーションの結果
を示ず。
各レーンには以下のＤＮＡを負荷し九。
入）レーン１Ｈ１ｎｄｌｌｌで切断したラム１ＤＮＡ
（サイズ標準として） ｖ−ｙ２ Ｐｖｕｌ切断ｐ８ｃ ｌ １ＤＮＡレーン３
Ｐｖｕ■切断ｐＳＣ １１− Ｐ ６ ＤＮＡレーア
４ Ｂａｎ Ｈｌ切断ｐＳＣ １１− Ｐ ６ Ｄ
ＮＡレーア ５ Ｂａｍ Ｈ１切断ｐ８Ｃ１１ＤＮＡ
レーア ６ ８ａｎ Ｈ［切断ｐ８ｃ １１− Ｆ ４
１ ＤＮＡレーン７ ＥｃｏＲ１切断ｐＳＣ １１−
Ｆ’ ４１ ＤＮＡｖ−ｙ８Ｆ２ｃｏＲＩ切断ｐＳＣ
１１ ＤＮＡＢ）ハイブリダイゼーション後、ＦＳＭ
Ｅ配列含有フラグメ／トは、 レー／３の２．８５８ ｋｂ レーン４の０−９１９ ｋｂ レー／６の１．（３１）９ｋｂ レーン７（３１）．８７９ｋｂ に確認される。これらのフラグメントはクローニングか
ら期待されたものである（第７図参照）。
（サイズ標準として） ｖ−ｙ２ Ｐｖｕｌ切断ｐ８ｃ ｌ １ＤＮＡレーン３
Ｐｖｕ■切断ｐＳＣ １１− Ｐ ６ ＤＮＡレーア
４ Ｂａｎ Ｈｌ切断ｐＳＣ １１− Ｐ ６ Ｄ
ＮＡレーア ５ Ｂａｍ Ｈ１切断ｐ８Ｃ１１ＤＮＡ
レーア ６ ８ａｎ Ｈ［切断ｐ８ｃ １１− Ｆ ４
１ ＤＮＡレーン７ ＥｃｏＲ１切断ｐＳＣ １１−
Ｆ’ ４１ ＤＮＡｖ−ｙ８Ｆ２ｃｏＲＩ切断ｐＳＣ
１１ ＤＮＡＢ）ハイブリダイゼーション後、ＦＳＭ
Ｅ配列含有フラグメ／トは、 レー／３の２．８５８ ｋｂ レーン４の０−９１９ ｋｂ レー／６の１．（３１）９ｋｂ レーン７（３１）．８７９ｋｂ に確認される。これらのフラグメントはクローニングか
ら期待されたものである（第７図参照）。
レーン１，２．５および８のＤＮＡはラムダＤＮＡか純
粋なｐＳＣ １１プラスεｐ ＤＮＡ １７） Ａであ
るのでハイブリダイゼーションは起こらない。
粋なｐＳＣ １１プラスεｐ ＤＮＡ １７） Ａであ
るのでハイブリダイゼーションは起こらない。
第１０図は、ＰＳＭＰ−ワクシニアウィルス組換えの確
認のためのスロットデロットハイデリダイゼーションを
示す。感染していない細胞、ウィルス組換え体ｖｓｃ
８で感染させた細胞（Ｍｏ５ｓ博士）ま咲は４檀の別個
に単離されたウィルス組換え体Ｐ６で感染させた細胞を
ニトロセルロース濾紙上に移し、Ａ中３２ｐ標識ｐＳＣ
１１ ＤＮＡ （ニック修ｆりとまたはＢ中Ｆ８ＭＰ
特異的“リボゾローデ０とハイブリダイゼーションさせ
る。感染していない細胞ではシグナルは全く認められな
い。組換え体ウィルスｖｓｃ ８はＴＫ配列のためにｐ
ＳＣ １ ｉとハイブリダイゼーションする。ＦＳＭＫ
特異的０リボプロープ１はｖＳ０８ｔ−もっているが予
想通り、陽性シグナルは示さない。個々に単離されたウ
ィルス組換え体Ｐ６で感染させた細胞（１〜４）は１リ
ボゾローデ１とばかりでなく （ＦＳＭｇ配列のため）
またはｐＳＣ １１ ＤＮＡとも（ＴＫ配列のため）ハ
イブリダイゼーションを示す。
認のためのスロットデロットハイデリダイゼーションを
示す。感染していない細胞、ウィルス組換え体ｖｓｃ
８で感染させた細胞（Ｍｏ５ｓ博士）ま咲は４檀の別個
に単離されたウィルス組換え体Ｐ６で感染させた細胞を
ニトロセルロース濾紙上に移し、Ａ中３２ｐ標識ｐＳＣ
１１ ＤＮＡ （ニック修ｆりとまたはＢ中Ｆ８ＭＰ
特異的“リボゾローデ０とハイブリダイゼーションさせ
る。感染していない細胞ではシグナルは全く認められな
い。組換え体ウィルスｖｓｃ ８はＴＫ配列のためにｐ
ＳＣ １ ｉとハイブリダイゼーションする。ＦＳＭＫ
特異的０リボプロープ１はｖＳ０８ｔ−もっているが予
想通り、陽性シグナルは示さない。個々に単離されたウ
ィルス組換え体Ｐ６で感染させた細胞（１〜４）は１リ
ボゾローデ１とばかりでなく （ＦＳＭｇ配列のため）
またはｐＳＣ １１ ＤＮＡとも（ＴＫ配列のため）ハ
イブリダイゼーションを示す。
第１１図は、野生型ウィルスまたはワクシニアウィルス
ＦＡＭＥ ＩＩ換え体からのライリス粒子ＤＮＡの阻ｎ
ｄ ｆｌによる切断後に含まれるフラグメントモデルで
ある。組換えの経過によってウィルス組換え体のＤＮＡ
の切断モデル中にＨｌｎｄ ｌ Ｊフラグメントが消失
することが明らかである。約５ ＫｂのサイＸＩ ｅも
つ本来のＨｌｎｄ ｒｌｉ Ｊフラグメントはアがロー
スデルのレーン乙にのみ認められる。他のＤＮＡ ７’
レパレーシヨ／はすべてＨｌｎｄ ＩＩＩ Ｊフラグメ
ントを含んでいない。
ＦＡＭＥ ＩＩ換え体からのライリス粒子ＤＮＡの阻ｎ
ｄ ｆｌによる切断後に含まれるフラグメントモデルで
ある。組換えの経過によってウィルス組換え体のＤＮＡ
の切断モデル中にＨｌｎｄ ｌ Ｊフラグメントが消失
することが明らかである。約５ ＫｂのサイＸＩ ｅも
つ本来のＨｌｎｄ ｒｌｉ Ｊフラグメントはアがロー
スデルのレーン乙にのみ認められる。他のＤＮＡ ７’
レパレーシヨ／はすべてＨｌｎｄ ＩＩＩ Ｊフラグメ
ントを含んでいない。
レーンＩ ＢｓｔＥｌｌで切断されたラムダＤＮＡ（
長さの標準として） レーン２ ＦＳＭＥ組換え体Ｆ’４１のＤＮＡ （挿
入プラスミドｐ８ｃ １１− Ｆ ４１ ）レーン３
ＦＳＭＩＩＣ組換え体Ｐ６のＤＮＡ （挿入プラスミ
ドｐＳＣ’ １１− Ｐ ６ ）レーン４ ウィルス組
換え体Ｐ１のＤＮＡ （挿入プラスミドｐＳＣ １１
） レーン５ ウィルス組換え体ｖ８ｃ ８のＤＮＡレー／
６ 野生型株ＷＲのウィルス粒子からのＮＡ 第１２図は、３２ｐ標識ＦＳＭｇ“りぜゾローデ０との
ハイブリダイゼーションによるウィルス組換え体のＨｌ
ｎｄ ＩＩ ＤＮＡフラグメント中におるＦＳＭＥ特異
的配列の検出を示す（Ａ）。対照には同一のフィルター
を２回３２ｐ −にツク修復）標識ｐＳＣ １１プラス
ミドＤＮＡとハイブリダイゼーションさせた（Ｂ）。
長さの標準として） レーン２ ＦＳＭＥ組換え体Ｆ’４１のＤＮＡ （挿
入プラスミドｐ８ｃ １１− Ｆ ４１ ）レーン３
ＦＳＭＩＩＣ組換え体Ｐ６のＤＮＡ （挿入プラスミ
ドｐＳＣ’ １１− Ｐ ６ ）レーン４ ウィルス組
換え体Ｐ１のＤＮＡ （挿入プラスミドｐＳＣ １１
） レーン５ ウィルス組換え体ｖ８ｃ ８のＤＮＡレー／
６ 野生型株ＷＲのウィルス粒子からのＮＡ 第１２図は、３２ｐ標識ＦＳＭｇ“りぜゾローデ０との
ハイブリダイゼーションによるウィルス組換え体のＨｌ
ｎｄ ＩＩ ＤＮＡフラグメント中におるＦＳＭＥ特異
的配列の検出を示す（Ａ）。対照には同一のフィルター
を２回３２ｐ −にツク修復）標識ｐＳＣ １１プラス
ミドＤＮＡとハイブリダイゼーションさせた（Ｂ）。
Ａ） Ｆ８Ｍｇ特異的１リボデローデ１はレーン１゜
２および３ではもっばらウィルス組換え体Ｆ４１からの
ＤＮＡとレーン７では組換え体Ｐ６からのＤＮＡとハイ
ブリダイゼーションさせ九。レーン４゜５および６の組
換え体Ｐ１．またレーン８０組換え体ｖ８Ｃ８からのＤ
ＮＡ 、レー／９の非感染細胞からのＤＮＡともハイブ
リダイゼーションしないことが確認された。
２および３ではもっばらウィルス組換え体Ｆ４１からの
ＤＮＡとレーン７では組換え体Ｐ６からのＤＮＡとハイ
ブリダイゼーションさせ九。レーン４゜５および６の組
換え体Ｐ１．またレーン８０組換え体ｖ８Ｃ８からのＤ
ＮＡ 、レー／９の非感染細胞からのＤＮＡともハイブ
リダイゼーションしないことが確認された。
Ｂ）放射性標識ｐＳＣ １１ＯＮＡはＦ’８ＭＥ特異的
１りがゾローデ１で検出されるすべてのＤＮＡプレパレ
ーショ／とハイブリダイゼーションする。ｐ８Ｃ１１Ｄ
ＮＡが組換えに必須のワクシニアウィルスをもっている
ことは明白である。しかしながら、このｐＳＣ １１プ
ラスミドＤＮＡはレーン４，５および６の組換え体Ｐ１
のＤＮＡともレーン８０組換え体ｖｓＣ８のＤＮＡとも
ハイブリダイゼーションする。
１りがゾローデ１で検出されるすべてのＤＮＡプレパレ
ーショ／とハイブリダイゼーションする。ｐ８Ｃ１１Ｄ
ＮＡが組換えに必須のワクシニアウィルスをもっている
ことは明白である。しかしながら、このｐＳＣ １１プ
ラスミドＤＮＡはレーン４，５および６の組換え体Ｐ１
のＤＮＡともレーン８０組換え体ｖｓＣ８のＤＮＡとも
ハイブリダイゼーションする。
非感染細胞からのＤＮＡはハイプリダーゼ−ジョンしな
い（レー／９）。
い（レー／９）。
第１６図は、ウィルス組換え体Ｐ６で感染させたぺａ細
胞からの抽出液中におけるＦＳ■特異的ノａティンのウ
ェスターンプロット解析を示している。プロティ／？１
５ｅｓポリアクリルアミドデル中で分離し、標準方法に
従ってウェスターンプロットに付す。対照としては、こ
の感染細胞からのプロティンをヒト血清陰性培地でイノ
キュペーションする（レーア１および３）。ＦＢ■ウィ
ルスに対して生じた抗体を有する陽性ヒト血清では、期
待されるＦＡＭＫ特異的抗体、サイズ約３８，０００Ｄ
がレーン２および４に検出できる。陰性血清で得られる
レーン１および３のシグナルは非特異的なものと思われ
る。
胞からの抽出液中におけるＦＳ■特異的ノａティンのウ
ェスターンプロット解析を示している。プロティ／？１
５ｅｓポリアクリルアミドデル中で分離し、標準方法に
従ってウェスターンプロットに付す。対照としては、こ
の感染細胞からのプロティンをヒト血清陰性培地でイノ
キュペーションする（レーア１および３）。ＦＢ■ウィ
ルスに対して生じた抗体を有する陽性ヒト血清では、期
待されるＦＡＭＫ特異的抗体、サイズ約３８，０００Ｄ
がレーン２および４に検出できる。陰性血清で得られる
レーン１および３のシグナルは非特異的なものと思われ
る。
以下の一般的方法によって、本発明のＤＮＡは製造され
、その配列は決定される。
、その配列は決定される。
まず、Ｆ８Ｍｇ−ウィルスの西部亜型から、またはＦ８
■−ウィルス西部亜型で感染され念細胞から、ウィルス
ＭＡを抽出する。このＲＮＡ ｔ−鋳型として使用し、
九とえは逆転写酵素を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成する
。組換えＤＮＡ技術を用いて、これらのｃＤＮＡをベク
ターＤＮＡたとえば大腸菌プラスミドＤＮＡに挿入し、
組換え体プラスミドを得る。
■−ウィルス西部亜型で感染され念細胞から、ウィルス
ＭＡを抽出する。このＲＮＡ ｔ−鋳型として使用し、
九とえは逆転写酵素を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成する
。組換えＤＮＡ技術を用いて、これらのｃＤＮＡをベク
ターＤＮＡたとえば大腸菌プラスミドＤＮＡに挿入し、
組換え体プラスミドを得る。
組換え体プラスミドを用いて適当な宿主細胞たとえば大
腸菌ＨＢ１（３１）株を形質転換し、プラスミドの増幅
または相当するタフバク質の発現を行う。
腸菌ＨＢ１（３１）株を形質転換し、プラスミドの増幅
または相当するタフバク質の発現を行う。
挿入体含有プラスミドをもつ各コロニーをＢｉｒｎ−ｂ
（１０）ｍ ＆ Ｄ（１０）ｙ （ＮｕＣｌ、 Ａｃ１
ｄｓ ＲｅＢ−ｅ ７ ” １１９５〜１２０４．１９
７９）のプラスミドミニゾレパレーション法によって同
定する。組換え体ＤＮＡがもっているウィルスの西部亜
型に特異的なＤＮＡの塩基配列は、迅速ＤＮＡ配列決定
法ならびにジデソキシチェーンターミネーター法で決定
される。
（１０）ｍ ＆ Ｄ（１０）ｙ （ＮｕＣｌ、 Ａｃ１
ｄｓ ＲｅＢ−ｅ ７ ” １１９５〜１２０４．１９
７９）のプラスミドミニゾレパレーション法によって同
定する。組換え体ＤＮＡがもっているウィルスの西部亜
型に特異的なＤＮＡの塩基配列は、迅速ＤＮＡ配列決定
法ならびにジデソキシチェーンターミネーター法で決定
される。
ｃＤＮＡ ｒ組換え体プラスミド、このプラスミドで形
質転換された細胞の製造方法および核酸配夕１」の決定
に関して詳細に説明すると次のとおりである。まず、精
製したウィルスからＦＳＭＥ−ウィルス西部亜型のウィ
ルスＲＮＡ ’ｉ得る。この目的では、ＦＳｋＡＨ−ウ
ィルス西部組型を、初代トリ胚細胞で生育させ、遠超心
分離によって濃縮し、２サイクルの庶糖濃度勾配遠心分
離によってＭ製する。タンパク質ｔ？８Ｄ８によりプロ
テナーゼにとＲＮＡ ｆｉＳＱインヒビターの存在下、
たとえば３７℃で１時間イ／′＃ユベーションして可醇
化したのち、ＲＮＡをタトエばフェノール抽出し、エタ
ノールで沈殿させる。これらのＲＮＡ ｅ鋳型として使
用してウィルスＲＮＡに対して相補的なＤＮＡを、つい
でｉｎ ｖｉｔｒ。
質転換された細胞の製造方法および核酸配夕１」の決定
に関して詳細に説明すると次のとおりである。まず、精
製したウィルスからＦＳＭＥ−ウィルス西部亜型のウィ
ルスＲＮＡ ’ｉ得る。この目的では、ＦＳｋＡＨ−ウ
ィルス西部組型を、初代トリ胚細胞で生育させ、遠超心
分離によって濃縮し、２サイクルの庶糖濃度勾配遠心分
離によってＭ製する。タンパク質ｔ？８Ｄ８によりプロ
テナーゼにとＲＮＡ ｆｉＳＱインヒビターの存在下、
たとえば３７℃で１時間イ／′＃ユベーションして可醇
化したのち、ＲＮＡをタトエばフェノール抽出し、エタ
ノールで沈殿させる。これらのＲＮＡ ｅ鋳型として使
用してウィルスＲＮＡに対して相補的なＤＮＡを、つい
でｉｎ ｖｉｔｒ。
で逆転写酵素（たとえばトリ骨髄性白血病ウィルスから
）により、Ｇｕｂｌｅｒ ＆ Ｈｏｆｍａｎｎの方法（
Ｇｅｎｅ。
）により、Ｇｕｂｌｅｒ ＆ Ｈｏｆｍａｎｎの方法（
Ｇｅｎｅ。
２５：２６３〜２５９．１９８３）に従って合成される
。ウシ胸Ｉｌｌ ＤＮＡから得られるへΦサヌクレオチ
ドデライマーのようなプライマーの使用下に、ウィルス
ＲＮＡ Ｑ 、たとえはノ１ンドプツク°ｃＤＮＡＳｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ” （Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ 、英国）に記載されているような適当な条件下に、
逆転写酵素ならびに基質としてデソキシアデノシントリ
ホスフエー） （ｄＡＴＰ ） 、デソキシチミジ／ト
リホスフェート（ｄＴＴＰ ） 、デツキジグアノシン
トリホスフェート（ｄ（）ＴＰ ） ：Ｉ、−よびデソ
キシシチジントリホスフエー） （ｄＣＴＰ ）ととも
にインキエベートする。このようにして得られたＣＤＮ
Ａ −ＲＮＡノ・イデリツｖ′ｆｒ欠にＲＮＡ５ｅＨと
、ノーイデリツＰ分子中のＲＮＡがニックを生じるよう
な一定の条件下に処理する。続いてＲＮＡ Ｈを効率よ
く補充するために、ＦＬ、 ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラ
ーゼを用いる。この場合、ニックを生じたＭＡがプライ
マーとして働く。
。ウシ胸Ｉｌｌ ＤＮＡから得られるへΦサヌクレオチ
ドデライマーのようなプライマーの使用下に、ウィルス
ＲＮＡ Ｑ 、たとえはノ１ンドプツク°ｃＤＮＡＳｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ” （Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ 、英国）に記載されているような適当な条件下に、
逆転写酵素ならびに基質としてデソキシアデノシントリ
ホスフエー） （ｄＡＴＰ ） 、デソキシチミジ／ト
リホスフェート（ｄＴＴＰ ） 、デツキジグアノシン
トリホスフェート（ｄ（）ＴＰ ） ：Ｉ、−よびデソ
キシシチジントリホスフエー） （ｄＣＴＰ ）ととも
にインキエベートする。このようにして得られたＣＤＮ
Ａ −ＲＮＡノ・イデリツｖ′ｆｒ欠にＲＮＡ５ｅＨと
、ノーイデリツＰ分子中のＲＮＡがニックを生じるよう
な一定の条件下に処理する。続いてＲＮＡ Ｈを効率よ
く補充するために、ＦＬ、 ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラ
ーゼを用いる。この場合、ニックを生じたＭＡがプライ
マーとして働く。
得られた二本鎖ＤＮＡからフェノール−クロロホルム抽
出ついでエタノール沈殿によってタンパク質を除去し、
残ったＲＮＡフラグメントはＲＮＡ５ｅ処理して除去す
る（たとえば、Ｔｌ緩衝液中、３７℃において３０分間
）。
出ついでエタノール沈殿によってタンパク質を除去し、
残ったＲＮＡフラグメントはＲＮＡ５ｅ処理して除去す
る（たとえば、Ｔｌ緩衝液中、３７℃において３０分間
）。
ｄｓ ＤＮＡのりａ−ユングをたとえば合成アダプター
を使用して実行する。仁の目的では、ｄｓ ＤＮＡ１ｋ
Ｆ、、ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラ
グメントと適当な条件下（Ｍａｎｉａｔｉｓほか： Ｍ
ｏ１ｅ−ｃｕｌａｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ 、 Ｃ８Ｈ、１
ｑ ８２ ）に処理し、クローニング可能な平滑端の最
大量を確保し、ついでフェノール抽出して除タンパクす
る。平滑端をもつｄｓ ＤＮＡの５′末端を４リヌクレ
オチＰキナーゼにより標準方法で（Ｍａｎｉａｔｉｓほ
か： １６１ｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎｇ 、 １９８
２ ）リン酸化する。リン酸化されたｄｓ ＤＮＡは、
ＤＮＡ ＩＪが一ゼの存在下、適当な条件でＢａｎ Ｈ
ｌ −８ｍａ ｒ−アダプターとインキュベーションす
る。反応混合物ｔ−１％アがロースデルに負荷し、分離
し、アダプターと結合した様々のサイズ範囲のｃＤＮＡ
をゲルから切り取り、友とえば電気溶出して精製する。
を使用して実行する。仁の目的では、ｄｓ ＤＮＡ１ｋ
Ｆ、、ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラ
グメントと適当な条件下（Ｍａｎｉａｔｉｓほか： Ｍ
ｏ１ｅ−ｃｕｌａｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ 、 Ｃ８Ｈ、１
ｑ ８２ ）に処理し、クローニング可能な平滑端の最
大量を確保し、ついでフェノール抽出して除タンパクす
る。平滑端をもつｄｓ ＤＮＡの５′末端を４リヌクレ
オチＰキナーゼにより標準方法で（Ｍａｎｉａｔｉｓほ
か： １６１ｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎｇ 、 １９８
２ ）リン酸化する。リン酸化されたｄｓ ＤＮＡは、
ＤＮＡ ＩＪが一ゼの存在下、適当な条件でＢａｎ Ｈ
ｌ −８ｍａ ｒ−アダプターとインキュベーションす
る。反応混合物ｔ−１％アがロースデルに負荷し、分離
し、アダプターと結合した様々のサイズ範囲のｃＤＮＡ
をゲルから切り取り、友とえば電気溶出して精製する。
一方、ベクターＤＮＡとして使用するプラスミドＤＮＡ
たとえばＦＬ、ｃｏｌｉプラスミド１）ＢＲ３２２−Ｄ
ＮＡ ｔ”制限工／ドヌクレア一ゼＢａｎ Ｈｌで切断
し、細菌性アルカリホスファターゼを使用して脱リン酸
化する。両端にＢａｍ Ｈ７アダプターを有する合成ｄ
ｓ ＤＮＡとＢａｎ Ｈ７切断ベクターＤＮＡを適当な
条件下にインキュベーションし、２種のＤＮＡ分子の末
端の相補性の突出した配列のハイブリダイゼーションを
可能にし、Ｔ４１Ｊが一ゼを使用してリゾ−ジョンさせ
る。ついで組換えＤＮＡ分子を用い、Ｍａｎｉａｔｉｓ
ほか（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ Ｃ８Ｈ、１
９８２）によって記載されているようにして、コンピー
テントな大１１ｋ ｃ１株を形質転換する。使用したベ
クターＤＮＡは、ア／ピシリ／およびテトラサイクリ／
抵抗性を付与する２１１聞の遺伝子を包含する。使用し
たクローン化法ではテトラサイクリン抵抗性遺伝子が破
壊される。ウィルス特異的挿入体を含有する可能性があ
る組換え体の選択には、形質転換した細菌全アンピシリ
／の存在下に生育させ、ついでテトラサイクリン感受性
を解析する。テトラサイクリン感受性コロニーのプラス
ミドをプラスミｒミニプレバレーショア法（Ｂｉｒｎｂ
ｏｉｍ ＆ Ｄｏｌｙ ： Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ、’。
たとえばＦＬ、ｃｏｌｉプラスミド１）ＢＲ３２２−Ｄ
ＮＡ ｔ”制限工／ドヌクレア一ゼＢａｎ Ｈｌで切断
し、細菌性アルカリホスファターゼを使用して脱リン酸
化する。両端にＢａｍ Ｈ７アダプターを有する合成ｄ
ｓ ＤＮＡとＢａｎ Ｈ７切断ベクターＤＮＡを適当な
条件下にインキュベーションし、２種のＤＮＡ分子の末
端の相補性の突出した配列のハイブリダイゼーションを
可能にし、Ｔ４１Ｊが一ゼを使用してリゾ−ジョンさせ
る。ついで組換えＤＮＡ分子を用い、Ｍａｎｉａｔｉｓ
ほか（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ Ｃ８Ｈ、１
９８２）によって記載されているようにして、コンピー
テントな大１１ｋ ｃ１株を形質転換する。使用したベ
クターＤＮＡは、ア／ピシリ／およびテトラサイクリ／
抵抗性を付与する２１１聞の遺伝子を包含する。使用し
たクローン化法ではテトラサイクリン抵抗性遺伝子が破
壊される。ウィルス特異的挿入体を含有する可能性があ
る組換え体の選択には、形質転換した細菌全アンピシリ
／の存在下に生育させ、ついでテトラサイクリン感受性
を解析する。テトラサイクリン感受性コロニーのプラス
ミドをプラスミｒミニプレバレーショア法（Ｂｉｒｎｂ
ｏｉｍ ＆ Ｄｏｌｙ ： Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ、’。
７：１１９５〜１２０４．１９７９）によって単離し、
挿入体のサイズｆ Ｓｍａ ｌの使用下制限酵素解析と
得られ友フラグメントの１壬アがロースデル上分離によ
り解析する。
挿入体のサイズｆ Ｓｍａ ｌの使用下制限酵素解析と
得られ友フラグメントの１壬アがロースデル上分離によ
り解析する。
この挿入体の塩基配列はＳａｎｇｅｒら（Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ。
ａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ７４ ： ５４６３
〜５４６７゜ｔ９７７）によるジデソΦシチェーンター
ミネーター法で決定する。得られた配列の、すでに知ら
れている他のフラビウイルスの配列（Ｒｌｃｅ ｔ’！
か：５ｃｉｅｎｃｅ、 ２２９ ： ７２６〜７３３
、１９８５ ：ＤａｌｇａｒｎＯほか： Ｊ、 Ｍｏ１
． ＢＬ（１０）、、 １８７ ： ３０９〜３２３
ｅ １９８７ ： Ｃａ５ｔｌｅほか： ｖｉｒｏｘｏ
ｇｙ。
〜５４６７゜ｔ９７７）によるジデソΦシチェーンター
ミネーター法で決定する。得られた配列の、すでに知ら
れている他のフラビウイルスの配列（Ｒｌｃｅ ｔ’！
か：５ｃｉｅｎｃｅ、 ２２９ ： ７２６〜７３３
、１９８５ ：ＤａｌｇａｒｎＯほか： Ｊ、 Ｍｏ１
． ＢＬ（１０）、、 １８７ ： ３０９〜３２３
ｅ １９８７ ： Ｃａ５ｔｌｅほか： ｖｉｒｏｘｏ
ｇｙ。
１４７： ２２７〜２３６．１９８５：Ｃａ５ｔｌｅほ
か： Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、 １４９ ： １０〜２６．
１９Ｂ６：Ｗｅｎｇｌｅｒはカ弓ＶｉｒｏｌＯｇ７１１
４７ ： ２６４〜２７ ｄ 。
か： Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、 １４９ ： １０〜２６．
１９Ｂ６：Ｗｅｎｇｌｅｒはカ弓ＶｉｒｏｌＯｇ７１１
４７ ： ２６４〜２７ ｄ 。
１ ９ ８ ５ ： Ｐｌｅｔｎｅｖ はカ弓
ｒｇｓｓ ３６００ 、 ２００ ：／１６２，
３１７〜３２１．１９８６）との−相同性をコンピュー
タプログラムを用いて検討し、検討した配列のｒツムＭ
Ａ全配列中の位置ｔ−Ａぺる。 ＦＥＩＭＫ−ウィルス
ゲツムの西部亜型の構造領域の、第１図は全ヌクレオチ
ド配列を、第３図は相当するアミノ酸配列を示す。
ｒｇｓｓ ３６００ 、 ２００ ：／１６２，
３１７〜３２１．１９８６）との−相同性をコンピュー
タプログラムを用いて検討し、検討した配列のｒツムＭ
Ａ全配列中の位置ｔ−Ａぺる。 ＦＥＩＭＫ−ウィルス
ゲツムの西部亜型の構造領域の、第１図は全ヌクレオチ
ド配列を、第３図は相当するアミノ酸配列を示す。
ＥおよびＭの正確なアミン末端は、たとえばＣｈａｎｇ
ほか（Ｆ’１ｌｎＢＳ Ｌｅｔｔ、、 ９５ ： ２０
５〜２１４゜１９７Ｂ）によって報告された技法を用い
たＮ末端アミノ酸配列解析によって決定される。この目
的ではＥタンパク質をたとえばプレパラサイズＳＤ８−
ＰＡＧＥにより単離し、ケ゛ルから電気溶出し、Ｎ末
端配列解析に付す。得られた配列は３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｃ
ｙｓで、それ故Ｅのアミノ末端は他の７ラグイウイルス
の場合と同じ位置に正確に置かれる。とくに２個のアミ
ノ酸と保持性の高いシスティ／残基である（第６図）。
ほか（Ｆ’１ｌｎＢＳ Ｌｅｔｔ、、 ９５ ： ２０
５〜２１４゜１９７Ｂ）によって報告された技法を用い
たＮ末端アミノ酸配列解析によって決定される。この目
的ではＥタンパク質をたとえばプレパラサイズＳＤ８−
ＰＡＧＥにより単離し、ケ゛ルから電気溶出し、Ｎ末
端配列解析に付す。得られた配列は３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｃ
ｙｓで、それ故Ｅのアミノ末端は他の７ラグイウイルス
の場合と同じ位置に正確に置かれる。とくに２個のアミ
ノ酸と保持性の高いシスティ／残基である（第６図）。
Ｍタンパク質のアミン末端の決定には、以下の方法を取
ることもできる。精製したウィルスを非イオン界面活性
剤（７′？、とえばトリトンＸ１００）に可溶化し、界
面活性剤を含まないサッカロース勾配中密度勾配遠心分
離法によってＥとＭｔ？含有するタンパク複合体を得る
（ Ｈｅ１ｎｚ ＆ Ｋｕｒｚ ： Ｊ。
ることもできる。精製したウィルスを非イオン界面活性
剤（７′？、とえばトリトンＸ１００）に可溶化し、界
面活性剤を含まないサッカロース勾配中密度勾配遠心分
離法によってＥとＭｔ？含有するタンパク複合体を得る
（ Ｈｅ１ｎｚ ＆ Ｋｕｒｚ ： Ｊ。
Ｇｅｎ、 Ｖｉｒｏｌ、、 ４９ ： １２５〜１３２
、１９８０）。
、１９８０）。
このタンパク複合体の配列解析により以下の２種の配列
ｓｅｒ−Ａｒｇ−ｃｙｓ−
３ｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−
が導かれる。この８ｅｒ−Ａｒｇ−ＣｙｓはＥの配列に
相当し、５ｅｒ−Ｖａｌ−ＬｅｕがＭり７ ノｆり質の
アミノ末端を示している。これらの末端は第１図および
第３図に示した配列中に印を付しである。
相当し、５ｅｒ−Ｖａｌ−ＬｅｕがＭり７ ノｆり質の
アミノ末端を示している。これらの末端は第１図および
第３図に示した配列中に印を付しである。
本発明はしたがって、ＦＳＭＥ−ウィルスの西部亜型の
ｒツムの５′領域のヌクレオチド配列を構造タンパク質
をコーＰする配列も含めてはじめて提供するものであり
、またその結果としてさらにこれらの構造タンパク質の
アミノ酸配列を提供する。
ｒツムの５′領域のヌクレオチド配列を構造タンパク質
をコーＰする配列も含めてはじめて提供するものであり
、またその結果としてさらにこれらの構造タンパク質の
アミノ酸配列を提供する。
第１図からの塩基配列は、ＦＳＭｇ−ウィルスの西部組
型の構造タンパク質の特性を有するポリペプチドをコー
ドするＤＮ入の好ましい例である。遺伝子コードの退行
の結果、図に示した塩基トリジレット以外の塩基となっ
ても同じアミノ酸配列がコードされる場合があり得る。
型の構造タンパク質の特性を有するポリペプチドをコー
ドするＤＮ入の好ましい例である。遺伝子コードの退行
の結果、図に示した塩基トリジレット以外の塩基となっ
ても同じアミノ酸配列がコードされる場合があり得る。
本発明の範囲には、突然変異、転位および退行によって
変化していても、それにもかかわらず構造タンパク質の
実質的な抗原性をまだ保持しているアミノ酸配列をコー
レする配列も包含される。
変化していても、それにもかかわらず構造タンパク質の
実質的な抗原性をまだ保持しているアミノ酸配列をコー
レする配列も包含される。
さらに、本発明は第３図に示した、ＦＳＭＥ−ウィルス
の西部亜型の天然単離体であるにすぎないアミノ酸配列
と正確に同一のアミノ酸配列のみに関するものではない
。ＭＡポリメラーゼの高いミス対合率および校正機能の
ミスにより、ＲＮＡウィルスのｒツムは高頻度の突然変
異を受け、それがＲＮＡウィルス自体、ＤＮＡウィルス
または細胞遺伝子に認められることはよく知られている
（ Ｈｏ１ｌａｎｄほか： ５ｃｉｅｎｃｅ、 ２１５
： １５７７〜１５８５゜１９ ８２ ； Ｒｅａ
ｎｎｅｙ 二 Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、 Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ、。
の西部亜型の天然単離体であるにすぎないアミノ酸配列
と正確に同一のアミノ酸配列のみに関するものではない
。ＭＡポリメラーゼの高いミス対合率および校正機能の
ミスにより、ＲＮＡウィルスのｒツムは高頻度の突然変
異を受け、それがＲＮＡウィルス自体、ＤＮＡウィルス
または細胞遺伝子に認められることはよく知られている
（ Ｈｏ１ｌａｎｄほか： ５ｃｉｅｎｃｅ、 ２１５
： １５７７〜１５８５゜１９ ８２ ； Ｒｅａ
ｎｎｅｙ 二 Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、 Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ、。
３６：４７〜７３．１９８２）。ウィルスの特性の依存
性により、これらの突然変賢は、インフルエンずウィル
スの場合にみられるように（Ｂｏｔｈほか ： ｉｎ
＠ Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ Ｐａｎｄ
ｅｍｉｃ ＩｎｆｌｕｅｎｚａＶｉｒｕｓｅｓ ＠Ｗ
、Ｇ、 Ｌａｖｅｒ ４１． ｇｌｓｅｖｉｅｒ、 １
９８３）、抗原漂流から新しいウィルス型の急速な発生
を招く。一方、抗原構造に関係するＲＮＡウィルスは天
然の生態条件下では安定で、おそらくは抗原性タンパク
質の広範囲な構造上の変化を許さない機能上の抑制の結
果と考えられる。それにもかかわらず、ある程度の変動
は常に考慮する必要があり、それは異なる天然単離体の
配列比較によって明らかにすることができる。
性により、これらの突然変賢は、インフルエンずウィル
スの場合にみられるように（Ｂｏｔｈほか ： ｉｎ
＠ Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ Ｐａｎｄ
ｅｍｉｃ ＩｎｆｌｕｅｎｚａＶｉｒｕｓｅｓ ＠Ｗ
、Ｇ、 Ｌａｖｅｒ ４１． ｇｌｓｅｖｉｅｒ、 １
９８３）、抗原漂流から新しいウィルス型の急速な発生
を招く。一方、抗原構造に関係するＲＮＡウィルスは天
然の生態条件下では安定で、おそらくは抗原性タンパク
質の広範囲な構造上の変化を許さない機能上の抑制の結
果と考えられる。それにもかかわらず、ある程度の変動
は常に考慮する必要があり、それは異なる天然単離体の
配列比較によって明らかにすることができる。
たとえば異なる単離体のＲＮＡをジデソキシチェーンタ
ーミネーター法により、第１図に示したゾロト型単雌体
の配列に従って合成した合成オリイヌクレオチドをゾラ
イマーとして配列決定できる。
ーミネーター法により、第１図に示したゾロト型単雌体
の配列に従って合成した合成オリイヌクレオチドをゾラ
イマーとして配列決定できる。
Ｅり／バク質に相当するヌクレオチド配列をこのような
異なる単離体について解析すると異なるヌクレオチドを
示した。以下のヌクレオチド交換が天然の単離体（ＺＺ
−９）のＲＮＡに認められた。
異なる単離体について解析すると異なるヌクレオチドを
示した。以下のヌクレオチド交換が天然の単離体（ＺＺ
−９）のＲＮＡに認められた。
２３７５ Ａ Ｕ Ｔ
ｈｒ−−ｓｅｒ２３４７ Ｕ
Ｃ−−２３２３Ａ Ｇ −−
２３１７Ａ Ｇ −−２２８Ｉ
ＣＵ −−２２６６ｔｙ
ｃ −−２２６３Ａ
Ｇ −−２０２１Ｃ［７−− １８７６ＣＵ ＋＋ １８６８ Ａ Ｇ Ｍｅｔ
−−Ｖ４１１７７３ ＣＵ Ａｌａ
−−Ｖ４１１６６Ｂ Ａ Ｇ
Ｇｌｕ−−（）ｌｙ１６６５ Ｃ
Ｕ −一１６６１ Ａ
Ｇ Ａｓｎ−−Ａｓｐ１６６０
ＣＵ −−１４７２ｔｙ
ｃ −−１４５１Ａ
ａ ｌ１ｅ−−Ｖ４１１３４８
ＣＵ −−１１１４Ｕ ｃ
−−１１１１０ｃ ＋＋ １０９０ ＣＵ −−１０
４８Ｕ Ｃ−− ９９４Ｕ Ｃ−− 認められた交換はＦＳＭＥ−ウィルスの新しい血清型を
生じない程度の天然変異の表出である。同じ血清複合体
に属さないフラヴイウイルスのＥタンパク質の間に認め
られる配列の相同性は４０〜５０チの範囲で、たとえば
ＹＦとＭｖＥウィルスの間の相同性は４４．４％である
。同じフラヴイウイルス血清複合体の構成メンバーの間
での相同性は７０〜８０％の範囲で、たとえばＷＮとＭ
ＶＥウィルスの間の相同性は７７．１ ％である。
ｈｒ−−ｓｅｒ２３４７ Ｕ
Ｃ−−２３２３Ａ Ｇ −−
２３１７Ａ Ｇ −−２２８Ｉ
ＣＵ −−２２６６ｔｙ
ｃ −−２２６３Ａ
Ｇ −−２０２１Ｃ［７−− １８７６ＣＵ ＋＋ １８６８ Ａ Ｇ Ｍｅｔ
−−Ｖ４１１７７３ ＣＵ Ａｌａ
−−Ｖ４１１６６Ｂ Ａ Ｇ
Ｇｌｕ−−（）ｌｙ１６６５ Ｃ
Ｕ −一１６６１ Ａ
Ｇ Ａｓｎ−−Ａｓｐ１６６０
ＣＵ −−１４７２ｔｙ
ｃ −−１４５１Ａ
ａ ｌ１ｅ−−Ｖ４１１３４８
ＣＵ −−１１１４Ｕ ｃ
−−１１１１０ｃ ＋＋ １０９０ ＣＵ −−１０
４８Ｕ Ｃ−− ９９４Ｕ Ｃ−− 認められた交換はＦＳＭＥ−ウィルスの新しい血清型を
生じない程度の天然変異の表出である。同じ血清複合体
に属さないフラヴイウイルスのＥタンパク質の間に認め
られる配列の相同性は４０〜５０チの範囲で、たとえば
ＹＦとＭｖＥウィルスの間の相同性は４４．４％である
。同じフラヴイウイルス血清複合体の構成メンバーの間
での相同性は７０〜８０％の範囲で、たとえばＷＮとＭ
ＶＥウィルスの間の相同性は７７．１ ％である。
極東亜型の公表されたヌクレオチド配列（ｐｌｅｔ−ｎ
ｅｖほか： ＦＥＢ３３６００．２００ ：４２．３１
７〜３２１．１９８６）と西部亜型の比較では約８５チ
の相同性を示す。
ｅｖほか： ＦＥＢ３３６００．２００ ：４２．３１
７〜３２１．１９８６）と西部亜型の比較では約８５チ
の相同性を示す。
ゾロト型配列の比較で軽度の変異を示すすべての配列は
、ＦＡＭＥ−ウィルスの西部亜型の他の天然の単離体に
現れる変異と同様、本発明に包含される。しかもこのよ
うな変異は核酸のｉｎ ｖｉｔｒ。
、ＦＡＭＥ−ウィルスの西部亜型の他の天然の単離体に
現れる変異と同様、本発明に包含される。しかもこのよ
うな変異は核酸のｉｎ ｖｉｔｒ。
修飾によっても得ることができる。し念がって、本発明
は、緊縮条件下で、友とえば少なくとも９０チのヌクレ
オチド配列相同性をもって、明らかくされ九配列または
配列部分、好ましくはＦＳＭＥ−ウィルス西部亜型の構
造タンパク質の抗原決定基の特性をもつタンパク質ま九
はペプチドをコードする配列とハイブリダイゼーション
したすべての配列を包含する。
は、緊縮条件下で、友とえば少なくとも９０チのヌクレ
オチド配列相同性をもって、明らかくされ九配列または
配列部分、好ましくはＦＳＭＥ−ウィルス西部亜型の構
造タンパク質の抗原決定基の特性をもつタンパク質ま九
はペプチドをコードする配列とハイブリダイゼーション
したすべての配列を包含する。
明らかにされたＤＮＡまたはその部分が適当なベクター
中に挿入できること、ｉＩｌ換えベクターＴｈｅ当な細
胞の形質転換に使用できること、またはＤＮＡの増幅も
しくは相当するタンパク質の発現を達成できることは、
本技術分野の専門家にはよく知られているとおりである
。これらの操作に適当な宿主、ベクターおよび条件は本
発明の技術分野における専門家にはよく知られていると
おりである。組換えＤＮＡ技術による異種タンパク質の
合成を述べｔ出版物は多数ある（概要はたとえば、Ｒｅ
ｚｎｉｋｏｆｆ ＆ （）ｏｌｄ編： Ｍａｘｉｍｉｚ
ｉｎｑ Ｇｅｎｅ Ｅｘｎｒｅｓｓｉｏｎ。
中に挿入できること、ｉＩｌ換えベクターＴｈｅ当な細
胞の形質転換に使用できること、またはＤＮＡの増幅も
しくは相当するタンパク質の発現を達成できることは、
本技術分野の専門家にはよく知られているとおりである
。これらの操作に適当な宿主、ベクターおよび条件は本
発明の技術分野における専門家にはよく知られていると
おりである。組換えＤＮＡ技術による異種タンパク質の
合成を述べｔ出版物は多数ある（概要はたとえば、Ｒｅ
ｚｎｉｋｏｆｆ ＆ （）ｏｌｄ編： Ｍａｘｉｍｉｚ
ｉｎｑ Ｇｅｎｅ Ｅｘｎｒｅｓｓｉｏｎ。
Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓｅ １９ ８ ６ ：
Ｈａｒｒｉｓ ： Ｇｅｎ、 Ｅｎｇ、。
Ｈａｒｒｉｓ ： Ｇｅｎ、 Ｅｎｇ、。
４ ： １２７〜１８３ ＊ ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅ
ｓｓ、 １９８３；Ｗｅｔｚｅｌ ＆＋ Ｇｏａｄｄｅ
ｌ ： Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、 ５ ： １〜６
４゜１９８３）。これらの方法によりタンパク質をコ−
ドするクローン化ＤＮＡを、細閑、酵母または補乳類細
胞中で発現させる。このようにして発現され几タンパク
質を免疫付与のためのワクチンとして（Ｖａｌｅｎｚｕ
ｅｌａほか： Ｎａｔｕｒｅ、 ２９ Ｂ ： ３４７
〜３５０ 、１９８２ ：ＭｃＡｌｅｅｒほか： Ｎａ
ｔｕｒｅ 。
ｓｓ、 １９８３；Ｗｅｔｚｅｌ ＆＋ Ｇｏａｄｄｅ
ｌ ： Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、 ５ ： １〜６
４゜１９８３）。これらの方法によりタンパク質をコ−
ドするクローン化ＤＮＡを、細閑、酵母または補乳類細
胞中で発現させる。このようにして発現され几タンパク
質を免疫付与のためのワクチンとして（Ｖａｌｅｎｚｕ
ｅｌａほか： Ｎａｔｕｒｅ、 ２９ Ｂ ： ３４７
〜３５０ 、１９８２ ：ＭｃＡｌｅｅｒほか： Ｎａ
ｔｕｒｅ 。
３０７：１７８〜１８０．１９８４）または診断甲抗原
として使用することは本発明の一態様である。
として使用することは本発明の一態様である。
霞橿ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を生存しているウィルスの
ｒツム中に導入することもできる。これによ＃）組換え
ウィルスが生じ、生ワクチンとして使用することができ
る（４説としてＭａｃｋｅｔｔ ｌｌｏ ５ｍ１ｔｈ：
Ｊ、 Ｇｅｎ、 Ｖｉｒｏｌ、、 ６７ ： ２０６７
〜２０８２ 。
ｒツム中に導入することもできる。これによ＃）組換え
ウィルスが生じ、生ワクチンとして使用することができ
る（４説としてＭａｃｋｅｔｔ ｌｌｏ ５ｍ１ｔｈ：
Ｊ、 Ｇｅｎ、 Ｖｉｒｏｌ、、 ６７ ： ２０６７
〜２０８２ 。
１９８６参照）。
同様に、たとえば各櫨ウィルスに由来する様々な遺伝子
のｄ合せを、同時に組換えＤＮＡ技術で発現させ、ワク
チンとして使用することも可能である（ Ｐｅｒｋｕｓ
ほか： ５ｃｉｅｎｃｅ、 ２２９ ： ９８）〜９８
４．１９８５）。本発明はしたがって、明らかにされｔ
配列と他の配列九とえは他のタンパク質の発現に寄与す
る九とえばプロモーター、エンハンサ−、ポリアデニル
化シグナルもしくはスプライスシグナルのような配列の
すべての組合せを包含する。
のｄ合せを、同時に組換えＤＮＡ技術で発現させ、ワク
チンとして使用することも可能である（ Ｐｅｒｋｕｓ
ほか： ５ｃｉｅｎｃｅ、 ２２９ ： ９８）〜９８
４．１９８５）。本発明はしたがって、明らかにされｔ
配列と他の配列九とえは他のタンパク質の発現に寄与す
る九とえばプロモーター、エンハンサ−、ポリアデニル
化シグナルもしくはスプライスシグナルのような配列の
すべての組合せを包含する。
免疫処置または診断の目的には、天然に現われるタンパ
ク質の全体を必ずしも使う必髪のないことは本技術分骨
の専門家にはよく知られている（Ｌｅｒｎｅｒ ：Ｎａ
ｔｕｒｅ、 ２９９ ： ５９２〜５９６ ｅｉ ９
Ｂ ２ ： Ａｒｎｏｎ ： ＴｌＢ５
、 １ １ ： ５ ２ １ 〜５２４゜１９
Ｂ６）。ＦＳＭｇ−ウィルス西部亜型Ｅタンパク質の場
合、９．０００ダルトンのタンパク分解フラグメントに
よる免疫処置による血球＃８集阻止および中和抗体の誘
導は、天然タンパク質全体による免疫処置で得られた（
Ｈｅ１ｎｚほか： Ｊ、 Ｇｅｎ。
ク質の全体を必ずしも使う必髪のないことは本技術分骨
の専門家にはよく知られている（Ｌｅｒｎｅｒ ：Ｎａ
ｔｕｒｅ、 ２９９ ： ５９２〜５９６ ｅｉ ９
Ｂ ２ ： Ａｒｎｏｎ ： ＴｌＢ５
、 １ １ ： ５ ２ １ 〜５２４゜１９
Ｂ６）。ＦＳＭｇ−ウィルス西部亜型Ｅタンパク質の場
合、９．０００ダルトンのタンパク分解フラグメントに
よる免疫処置による血球＃８集阻止および中和抗体の誘
導は、天然タンパク質全体による免疫処置で得られた（
Ｈｅ１ｎｚほか： Ｊ、 Ｇｅｎ。
Ｖｉｒｏｌ、、 ６５ ： １９２１〜１９２９．１９
８４）ポリクローナル免疫血清との反応と同穆度である
。
８４）ポリクローナル免疫血清との反応と同穆度である
。
他のタンパク分野フラグメントも免疫処置または診断の
目的に同様に適している。
目的に同様に適している。
ワクチンまたは診断薬として使用されるタンパク質また
はタンパク質部分は、上に述べたような組換えＤＮＡ技
術によって製造できるのみでなく、本発明によって明ら
かにされた配列情報に基づきオＩＪ 、Ｆペプチドの化
学合成によっても、得ることができる。この領域には厖
大な文献がある。様々なタンパク質をコードするＤＮＡ
配列に相当する合成ペプチドがたとえば分子生物学的研
究や免疫学的 。
はタンパク質部分は、上に述べたような組換えＤＮＡ技
術によって製造できるのみでなく、本発明によって明ら
かにされた配列情報に基づきオＩＪ 、Ｆペプチドの化
学合成によっても、得ることができる。この領域には厖
大な文献がある。様々なタンパク質をコードするＤＮＡ
配列に相当する合成ペプチドがたとえば分子生物学的研
究や免疫学的 。
研究の目的で（’Ｌｅｒｎｅｒほか： Ｃｅ１ｌ、 ２
３ ： ３０９〜３１０ 、１９８） ： Ｌｑｒｎｅ
ｒ ： Ｎａｔｕｒｅ、 ２９９：５９２〜５９６．１
９８２）またはワクチンに使用する目的で（５ｃｈｉｎ
ｎｉｃｋほか： Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、 Ｍｉｃｒｏ−ｂ
ｉｏｌ、、 ３７ ： ４２５〜４４６ 、１９８３；
ＤｉＭａｒｃｈｉ−―赫ほか： ５ｃｉｅＯｃｅ、 ２
３２ ： ６３９〜６４１−１９８６）製造されている
。本発明で明らかにされた配列に相当するペプチドまた
はそのペプチドの組合せの製造および使用は本発明の一
態様である。
３ ： ３０９〜３１０ 、１９８） ： Ｌｑｒｎｅ
ｒ ： Ｎａｔｕｒｅ、 ２９９：５９２〜５９６．１
９８２）またはワクチンに使用する目的で（５ｃｈｉｎ
ｎｉｃｋほか： Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、 Ｍｉｃｒｏ−ｂ
ｉｏｌ、、 ３７ ： ４２５〜４４６ 、１９８３；
ＤｉＭａｒｃｈｉ−―赫ほか： ５ｃｉｅＯｃｅ、 ２
３２ ： ６３９〜６４１−１９８６）製造されている
。本発明で明らかにされた配列に相当するペプチドまた
はそのペプチドの組合せの製造および使用は本発明の一
態様である。
本発明によって提供される核酸と配列が、たとえばダニ
もしくは体液中のウィルスＲＮＡの決定のためのハイデ
リデーショ／・ｌンデに使用されることは、本技術分野
の専門家にはよく仰られているとおりである（ Ｍｅｉ
ｎｋｏｔｈ ＆ Ｗａｈｌ ： Ａｎａｌ、 Ｂｉｏ−
ｃｈｅｍ−，１３８：２６７〜２８４．１９８４：Ｋｕ
ｌｓｋｉ ＆ Ｎｏｒｖａｌ ： Ａｒｃｈ、Ｖ
ｉｒｏｌ、、Ｆ３３ ： ３−１５．１９８５）。
もしくは体液中のウィルスＲＮＡの決定のためのハイデ
リデーショ／・ｌンデに使用されることは、本技術分野
の専門家にはよく仰られているとおりである（ Ｍｅｉ
ｎｋｏｔｈ ＆ Ｗａｈｌ ： Ａｎａｌ、 Ｂｉｏ−
ｃｈｅｍ−，１３８：２６７〜２８４．１９８４：Ｋｕ
ｌｓｋｉ ＆ Ｎｏｒｖａｌ ： Ａｒｃｈ、Ｖ
ｉｒｏｌ、、Ｆ３３ ： ３−１５．１９８５）。
これらは、明らかくされた配列に相当するオリがヌクレ
オチドの組換えＤＮＡ技術または化学合成のいずれかに
よる製造で得られる。
オチドの組換えＤＮＡ技術または化学合成のいずれかに
よる製造で得られる。
次に以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明す
る。
る。
例 １
ＦＳＭＥ−ウィルス西部亜型で感染させたマウス乳仔脳
の１０−懸濁液を、１５ ｍＭ ＨＥＰＥ８および１５
ｍＭ ＥＰＰＢでｐＨ７，６Ｋ緩衝した最小培地（Ｍ
］ｌｎＭ）中の一次単層培養匈胚細胞の感染に使用した
。
の１０−懸濁液を、１５ ｍＭ ＨＥＰＥ８および１５
ｍＭ ＥＰＰＢでｐＨ７，６Ｋ緩衝した最小培地（Ｍ
］ｌｎＭ）中の一次単層培養匈胚細胞の感染に使用した
。
３７℃で４０時間インキュベーショ／したのち、上清液
を４℃、 １０．０００９で３０分間庶明化し、４℃、
５０，０００ ＩＩで３時間超遠心分離してウィルス
をペレット化した。ついでウィルスを適当容量のＴＡＮ
緩衝液（０，０５Ｍ トリエタノールアミン、０、Ｉ
Ｍ Ｎａｃｔ、 ｐＨ８，０）中に再懸濁し、５〜２０
ｖ。
を４℃、 １０．０００９で３０分間庶明化し、４℃、
５０，０００ ＩＩで３時間超遠心分離してウィルス
をペレット化した。ついでウィルスを適当容量のＴＡＮ
緩衝液（０，０５Ｍ トリエタノールアミン、０、Ｉ
Ｍ Ｎａｃｔ、 ｐＨ８，０）中に再懸濁し、５〜２０
ｖ。
（Ｗ／Ｗ ）庶糖密度勾配により１１０分間１７０．０
００ｇ、４℃でゾーン（レイトゾーン）超遠心に付す。
００ｇ、４℃でゾーン（レイトゾーン）超遠心に付す。
２５４ ｎｍで勾配を走査してウィルスのピークの位置
を決定し、２０〜５０％（Ｗ／Ｗ）庶糖勾配を用い、１
８時間４℃、１５０，０００．９で平衡密度勾配遠心に
付す。ウィルスのぎ−クｔ−ｐＨ８，０のＴＡＮ緩衝液
に対して透析して過剰の庶糖を除去する。
を決定し、２０〜５０％（Ｗ／Ｗ）庶糖勾配を用い、１
８時間４℃、１５０，０００．９で平衡密度勾配遠心に
付す。ウィルスのぎ−クｔ−ｐＨ８，０のＴＡＮ緩衝液
に対して透析して過剰の庶糖を除去する。
例 ２
ウィルスＭｋの調製
１００μｇの積置ウィルスをプロテナーゼに反応緩衝液
（１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７，８、５ｍＭｇｐＴＡ。
（１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７，８、５ｍＭｇｐＴＡ。
０．５チＷ／Ｖ８Ｄ８）で希釈した。プロテナーゼＫｔ
ｈ′最終濃度が２００ｇｇ／―になるように加え、この
混合物ｔ−３７℃で１時間インキュベーションした。つ
いで、この溶液を同容（４００μｔ）のフェノールで２
回、りｇｏホルム：イソアミルアルコール（２４：１）
で１回抽出して除蛋白した。
ｈ′最終濃度が２００ｇｇ／―になるように加え、この
混合物ｔ−３７℃で１時間インキュベーションした。つ
いで、この溶液を同容（４００μｔ）のフェノールで２
回、りｇｏホルム：イソアミルアルコール（２４：１）
で１回抽出して除蛋白した。
次に６Ｎ酢酸ナトリウム溶液２６μｔを加え、ＲＮＡを
２．５容のエタノールで沈殿させた。使用に先立ッテＲ
ＮＡのサンプルをグリオキゾールで変性シ、１チアがロ
ースゲル上で分離して、プレバレージョンの収率および
品質を調べた。
２．５容のエタノールで沈殿させた。使用に先立ッテＲ
ＮＡのサンプルをグリオキゾールで変性シ、１チアがロ
ースゲル上で分離して、プレバレージョンの収率および
品質を調べた。
例 ３
エタノール沈殿ＲＮＡ ５μｇｔ、”ランダム０オリが
ヌクレオチドゾライマ−５μｇを含有する第−鎖合成緩
衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ、 ＵＫ ） ４０ ｔｔｌｌ
に再懸濁し、７０℃に１分間加熱し、ついで徐々に室温
まで冷却させた。４徨のすべてのデオキシヌクレオチド
三リン酸塩を最終濃度が１ｍＭになるように加えた。さ
らに、５単位のヒト胎盤−リボヌクレアーゼインヒビタ
ーと混合物のα−３２ｐ ａｃ’ｒｐ１０ ａｃｌに添
加しｔ０逆転写酵素（Ａｍｅｒｓｈａｍ ）１００単位
を加えて第−鎖合成を開始させ、４２℃で２時間続けた
。次に反応混合物を氷上に置き、第二鎖合成のための試
薬を以下の順序で加えた。
ヌクレオチドゾライマ−５μｇを含有する第−鎖合成緩
衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ、 ＵＫ ） ４０ ｔｔｌｌ
に再懸濁し、７０℃に１分間加熱し、ついで徐々に室温
まで冷却させた。４徨のすべてのデオキシヌクレオチド
三リン酸塩を最終濃度が１ｍＭになるように加えた。さ
らに、５単位のヒト胎盤−リボヌクレアーゼインヒビタ
ーと混合物のα−３２ｐ ａｃ’ｒｐ１０ ａｃｌに添
加しｔ０逆転写酵素（Ａｍｅｒｓｈａｍ ）１００単位
を加えて第−鎖合成を開始させ、４２℃で２時間続けた
。次に反応混合物を氷上に置き、第二鎖合成のための試
薬を以下の順序で加えた。
すなわち、第二鎖合成緩衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ、 Ｕ
Ｋ ）９３．５μｔ、リボヌクレアーゼＨ４単位、Ｅ、
ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ２３単位および水を最終
容量２５０μｔになるように添加し友。第二鎖合成は１
２℃および２２℃（各２時間）での連続インキュベーシ
ョンにより行い、溶液を２０分間７０℃に加熱して停止
させた。二重鎖ｃＤＮＡはＴ ４ ＤＮＡポリメラーゼ
１０単位と３７℃で３０分間イ／キュベーションを行っ
て平滑端を生成させた。最後Ｋ ＣＤＮＡ ｅフェノー
ルおよびクロロホルム抽出によって精製し、２容のエタ
ノールで沈殿させた。
Ｋ ）９３．５μｔ、リボヌクレアーゼＨ４単位、Ｅ、
ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ２３単位および水を最終
容量２５０μｔになるように添加し友。第二鎖合成は１
２℃および２２℃（各２時間）での連続インキュベーシ
ョンにより行い、溶液を２０分間７０℃に加熱して停止
させた。二重鎖ｃＤＮＡはＴ ４ ＤＮＡポリメラーゼ
１０単位と３７℃で３０分間イ／キュベーションを行っ
て平滑端を生成させた。最後Ｋ ＣＤＮＡ ｅフェノー
ルおよびクロロホルム抽出によって精製し、２容のエタ
ノールで沈殿させた。
例 ４
ｃＤＮＡはすべて５′末端がリン酸化され、リゾ−ジョ
ンが行われることを確実にするため２ｍＭＡＴＰの存在
下にポリヌクレオチダーゼで処理した。
ンが行われることを確実にするため２ｍＭＡＴＰの存在
下にポリヌクレオチダーゼで処理した。
Ｂａｎ Ｈｌ −Ｓｍａ （アダプターはＰｈａｒｍａ
ｃｉａから入手した。このアダプターは、５′−突出、
Ｒａｍ Ｈ）適合性突出（付着）末端と平滑末端を有
し、その配列内に完全なりａｎ ｌ認識部位を含有する
。最初は、平滑末端のみが５′−リン酸基を有し、リゲ
ーションできるが、突出末端は脱リン酸化されてい友。
ｃｉａから入手した。このアダプターは、５′−突出、
Ｒａｍ Ｈ）適合性突出（付着）末端と平滑末端を有
し、その配列内に完全なりａｎ ｌ認識部位を含有する
。最初は、平滑末端のみが５′−リン酸基を有し、リゲ
ーションできるが、突出末端は脱リン酸化されてい友。
このアダプター５μｇをリゾ−ジョン緩衝液（５０ｍＭ
Ｔｒｉ８＊ ｐＨ７，５、５ｍＭＭｇｅｔ２ 、５ ｒ
１１Ｍｆ７Ｉ’Ｔ 、 ｉ ｍＭ Ａ’Ｉ’Ｐ ） ２
０ Ｂｔ中ＣＤＮＡと混合した。
Ｔｒｉ８＊ ｐＨ７，５、５ｍＭＭｇｅｔ２ 、５ ｒ
１１Ｍｆ７Ｉ’Ｔ 、 ｉ ｍＭ Ａ’Ｉ’Ｐ ） ２
０ Ｂｔ中ＣＤＮＡと混合した。
反応はＴ ４ ＤＮＡりが−ゼ（Ｎｅｖｒ Ｅｎｇｌａ
ｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を触媒として１４℃で一夜行っ
た。
ｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を触媒として１４℃で一夜行っ
た。
例 ５
ＣＤＮＡは１チ低融点アがロースデル上で分離した。様
々のサイズの群をゲルから切り取り、ＤＮＡを標準方法
によシアがロースから熱フェノールで抽出した。取扱か
ったＤＮＡは少量でエチジウムデロミげによる着色では
ｔｌとんど検出されなかったが、ｃＤＮＡに導入した放
射性標識により抽出工程は容易に追跡可能であった。サ
イズ分離工程は大ｃ ＤＮＡフラグメントの選択的クロ
ーニングを可、能にし、またｃＤＮＡをリゾ−ジョンし
なかったアダプターから完全に分離するのに有効であっ
た。
々のサイズの群をゲルから切り取り、ＤＮＡを標準方法
によシアがロースから熱フェノールで抽出した。取扱か
ったＤＮＡは少量でエチジウムデロミげによる着色では
ｔｌとんど検出されなかったが、ｃＤＮＡに導入した放
射性標識により抽出工程は容易に追跡可能であった。サ
イズ分離工程は大ｃ ＤＮＡフラグメントの選択的クロ
ーニングを可、能にし、またｃＤＮＡをリゾ−ジョンし
なかったアダプターから完全に分離するのに有効であっ
た。
例 ６
細菌性プラスミドへのクローニング
様々のサイズのｃＤＮＡのＢａｍＨ１適合性末端をボリ
ヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、フェノールおよび
クロロホルム抽出で脱蛋白を行った。ついでＤＮＡ ｅ
２容のエタノールで沈殿させ、小容量の水だ再懸濁し
た。ｃＤＮＡ ２ Ｄ〜３０ ｎ、！７ｋ、予めＢａｍ
ＨＴ切断てよって線状化し自己りｒ−ジョンを防止す
るために脱リン酸化した大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２
の１０ Ｏｎ、９と混合した。この両成分をりｒ−ジョ
ン緩衝液（前述）５μを中Ｔ４ＤＮＡ Ｕが一ゼと１６
℃で一夜反応させてりｐ−ジョンを行った。翌日、リゾ
−ジョン混合物を水で５倍に希釈し、Ｅ、 ｃｏｌｉ
ＨＢ Ｉ Ｑ １の形質転換にそのまま使用した。コン
ビ−テントを細菌はＢＲＬ（Ｍａｒｙｌａｎｄ、 ＵＳ
八）から入手し、製造業者の指示したプロトコールに従
い、希釈リゾ−ジョン混合物５μｔで形質転換した。ア
／ぎシリン含有アが一ル平板上で平板培養すると、何百
もの形質転換細胞が得られた。
ヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、フェノールおよび
クロロホルム抽出で脱蛋白を行った。ついでＤＮＡ ｅ
２容のエタノールで沈殿させ、小容量の水だ再懸濁し
た。ｃＤＮＡ ２ Ｄ〜３０ ｎ、！７ｋ、予めＢａｍ
ＨＴ切断てよって線状化し自己りｒ−ジョンを防止す
るために脱リン酸化した大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２
の１０ Ｏｎ、９と混合した。この両成分をりｒ−ジョ
ン緩衝液（前述）５μを中Ｔ４ＤＮＡ Ｕが一ゼと１６
℃で一夜反応させてりｐ−ジョンを行った。翌日、リゾ
−ジョン混合物を水で５倍に希釈し、Ｅ、 ｃｏｌｉ
ＨＢ Ｉ Ｑ １の形質転換にそのまま使用した。コン
ビ−テントを細菌はＢＲＬ（Ｍａｒｙｌａｎｄ、 ＵＳ
八）から入手し、製造業者の指示したプロトコールに従
い、希釈リゾ−ジョン混合物５μｔで形質転換した。ア
／ぎシリン含有アが一ル平板上で平板培養すると、何百
もの形質転換細胞が得られた。
例 ７
それぞれのア／ぎシリ／抵抗性コロニーをテトラサイク
リン含有アが−ル平板に接種し念。試験したコｏニーの
約５％はテトラサイクリンに感受性を示した。これらは
アンピシリン含有ＬＢ−メジウム２ＩＲ１の接種に使用
し、−夜、３７℃、２２０ｕｐｍの振盪器中でインキュ
ベーションシタ。ｆｉ日、標準方法によりプラスミド迅
速製造を行った（ Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ＆ Ｄｏｌｙ
： Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅａ、、 ７ ：１１
９５〜１２０４．１９７９）。プラスミドを制限酵素Ｓ
ｍａ Ｉで消化し、１％アがロースゲル上で解析した（
第４図）。この方法により２１個のプラスミドが同定さ
れ、サイズ範囲２，０００〜３．５００ ｂｐの挿入体
を含有した。
リン含有アが−ル平板に接種し念。試験したコｏニーの
約５％はテトラサイクリンに感受性を示した。これらは
アンピシリン含有ＬＢ−メジウム２ＩＲ１の接種に使用
し、−夜、３７℃、２２０ｕｐｍの振盪器中でインキュ
ベーションシタ。ｆｉ日、標準方法によりプラスミド迅
速製造を行った（ Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ＆ Ｄｏｌｙ
： Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅａ、、 ７ ：１１
９５〜１２０４．１９７９）。プラスミドを制限酵素Ｓ
ｍａ Ｉで消化し、１％アがロースゲル上で解析した（
第４図）。この方法により２１個のプラスミドが同定さ
れ、サイズ範囲２，０００〜３．５００ ｂｐの挿入体
を含有した。
例 ８
挿入体の暫定的特性
挿入体含有シラスミ）’ｅ、標準方法によりより大きな
規模で製造して（Ｍａｎｉａｔｉｓほか： Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、 ＣＦ３Ｈｅ １９８２ ）
、エチジウムデロミｒ密度勾配遠心法で精製し念。プラ
スミド−ＤＮＡ約５００ｎｇｅいくつかの制限酵素で切
断し、１％アがロースゲル上で解析した。各プラスミド
が特徴的バンドパターンを保持するならば、挿入体は重
複するま之は相異なる配列領域を含有できるとの仮定が
容認される。
規模で製造して（Ｍａｎｉａｔｉｓほか： Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、 ＣＦ３Ｈｅ １９８２ ）
、エチジウムデロミｒ密度勾配遠心法で精製し念。プラ
スミド−ＤＮＡ約５００ｎｇｅいくつかの制限酵素で切
断し、１％アがロースゲル上で解析した。各プラスミド
が特徴的バンドパターンを保持するならば、挿入体は重
複するま之は相異なる配列領域を含有できるとの仮定が
容認される。
例 ９
シラスミｒＡ５と呼ばれる挿入体含有プラスミドをＳｍ
ａ Ｉで切断し、０．７１アがロースゲル上で分離した
。全挿入体が表現されるバンドをゲルから切り取り、Ｄ
ＮＡ’ｉアがロースから電気専用して精製した。単離さ
れたフラグメントを、平滑末端を生じる多数の制限酵素
たとえばＲｓａ （、Ａｌｕ ｌおよびＨ（１６） ［
１１ｆｔ用いた様々の反応で消化した。バクテリオファ
ージＭ １３ｍｐ ８の二重鎖型をＳｍａｌで切断し脱
リン酸化した。ＤＮＡフラグメントの混合物を脱蛋白し
、沈殿させ、前述し友ようなＭ１３ベクターとリゾ−ジ
ョンさせた。Ｅ、 ｃｏｌｉ ＪＭ１０５細胞の形質転
換、組換えファージの色素選択法による同定および一本
鎖ＤＮＡの製造は標準方法によって実施した。各クロー
ンを選択し、Ｓａ■ｅｔ”ら（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
ＡＣａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ７４ ： ５４６
３〜５４６７．１９７７）の記載のようにしてジデソキ
シ配列決定法によって配列を決定し念。
ａ Ｉで切断し、０．７１アがロースゲル上で分離した
。全挿入体が表現されるバンドをゲルから切り取り、Ｄ
ＮＡ’ｉアがロースから電気専用して精製した。単離さ
れたフラグメントを、平滑末端を生じる多数の制限酵素
たとえばＲｓａ （、Ａｌｕ ｌおよびＨ（１６） ［
１１ｆｔ用いた様々の反応で消化した。バクテリオファ
ージＭ １３ｍｐ ８の二重鎖型をＳｍａｌで切断し脱
リン酸化した。ＤＮＡフラグメントの混合物を脱蛋白し
、沈殿させ、前述し友ようなＭ１３ベクターとリゾ−ジ
ョンさせた。Ｅ、 ｃｏｌｉ ＪＭ１０５細胞の形質転
換、組換えファージの色素選択法による同定および一本
鎖ＤＮＡの製造は標準方法によって実施した。各クロー
ンを選択し、Ｓａ■ｅｔ”ら（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
ＡＣａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ７４ ： ５４６
３〜５４６７．１９７７）の記載のようにしてジデソキ
シ配列決定法によって配列を決定し念。
プライマーとしては、一般に市販品を入手できるＭ２Ｓ
−共通プライマーを使用した。クローンＡ５の多数の異
なるフラグメントの配列を決定し、發終的にこのクロー
ンの全ＤＮＡ配列が導かれた。この配列を種々のフラビ
ウィルスの公表されているｒツム配列と比較し、Ａ５は
、罰−プロティンのアミノ末端半分を除き構造蛋白質Ｃ
１ＭおよびＥをコードするウィルスゲノムの領域を含有
することが確認された。
−共通プライマーを使用した。クローンＡ５の多数の異
なるフラグメントの配列を決定し、發終的にこのクロー
ンの全ＤＮＡ配列が導かれた。この配列を種々のフラビ
ウィルスの公表されているｒツム配列と比較し、Ａ５は
、罰−プロティンのアミノ末端半分を除き構造蛋白質Ｃ
１ＭおよびＥをコードするウィルスゲノムの領域を含有
することが確認された。
例１０
ｃＤＮＡ−りａ−７を構築する九めのＦＳＭＥ−ウィル
ス特異的プライマーには、Ｃプロティンのすべての配列
情報を含めたウィルスゲノムの全５′−領域ならびに非
翻訳５′−リーダー領域の大部分を含む領域を使用し友
。このオリ♂ヌクレオチげプライマーは、Ｅ−プロティ
ンのＣ末端アミノ酸をコ−ｒするＦＳ■−デノムの領域
に相補的な１４個のヌクレオチドから構成さ１れた。ウ
ィルスＲＮＡの製造および二重鎖ｃＤＮＡの合成は、こ
の場合ＲＮＡ１μｇと合成オリ？ヌクレオチドゾライマ
ーＰ１の０．５μｇのみを用いたほかは、本質的には上
述のようにして実施した。結局、第二鎖合成およびＴ
ｄ ＤＮＡ−ポリメラーゼ処理のｔめのインキュベーシ
ョン時間は１時間ないしは３分に低下された。
ス特異的プライマーには、Ｃプロティンのすべての配列
情報を含めたウィルスゲノムの全５′−領域ならびに非
翻訳５′−リーダー領域の大部分を含む領域を使用し友
。このオリ♂ヌクレオチげプライマーは、Ｅ−プロティ
ンのＣ末端アミノ酸をコ−ｒするＦＳ■−デノムの領域
に相補的な１４個のヌクレオチドから構成さ１れた。ウ
ィルスＲＮＡの製造および二重鎖ｃＤＮＡの合成は、こ
の場合ＲＮＡ１μｇと合成オリ？ヌクレオチドゾライマ
ーＰ１の０．５μｇのみを用いたほかは、本質的には上
述のようにして実施した。結局、第二鎖合成およびＴ
ｄ ＤＮＡ−ポリメラーゼ処理のｔめのインキュベーシ
ョン時間は１時間ないしは３分に低下された。
例１１
砒化のこの時点までに手許にある情報から、全構造領域
にＥｃｏＲＩＪ識部位は含まないことが明らかである。
にＥｃｏＲＩＪ識部位は含まないことが明らかである。
したがって、クローニング処理にはＥｃｏＲＩリンカ−
（Ｎｅｖｒ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ） １
に使用できた。約１μｇのＣＤＮＡ ｔ” １μｇのリ
ンカ−ＤＮＡとを、Ｔ ４ ＤＮＡりが一ゼと前述した
緩衝系を用いて１４℃で６時間リゾ−ジョンした。洗浄
後、混合物をフェノールおよびクロロホルム抽出および
エタノール沈殿に付し、ＤＮＡ？４０μｔ （Ｄ ｒメ
ジウム塩」制限酵素緩衝液（Ｃ３）（−／−ンｒデック
）に再懸濁し、過剰量のＥｃｏＲＴ （８０単位）ｆｅ
用い６７℃で６時間苗化した。最後に混合物を１％アが
ロースゲル上で分離し、１．５００〜２，５００ｂｐの
大領域のｃＤＮＡ ｔ−ゲルから電気溶出により回収し
た。
（Ｎｅｖｒ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ） １
に使用できた。約１μｇのＣＤＮＡ ｔ” １μｇのリ
ンカ−ＤＮＡとを、Ｔ ４ ＤＮＡりが一ゼと前述した
緩衝系を用いて１４℃で６時間リゾ−ジョンした。洗浄
後、混合物をフェノールおよびクロロホルム抽出および
エタノール沈殿に付し、ＤＮＡ？４０μｔ （Ｄ ｒメ
ジウム塩」制限酵素緩衝液（Ｃ３）（−／−ンｒデック
）に再懸濁し、過剰量のＥｃｏＲＴ （８０単位）ｆｅ
用い６７℃で６時間苗化した。最後に混合物を１％アが
ロースゲル上で分離し、１．５００〜２，５００ｂｐの
大領域のｃＤＮＡ ｔ−ゲルから電気溶出により回収し
た。
同時に、新しい多目的ベクター、ブルースクリプトに８
Ｍ １３ ＋ （８ｔｒａｔａｇｅｎｅ ）をＥＣ０
ＲＴで切断した。この線状化プラスミドを全ｃＤＮＡプ
レバレージョンと混合し、ＤＮＡ’ｉエタノールで共沈
穀し友。シラスξドーｃＤＮＡリゲーションは上述のよ
うにして実施した。リゾ−ジョン混合物を段階的に２倍
から１００倍までに希釈し、Ｅ、 ｃｏｌｉｘｒ、−１
デル−の形質転換に使用した。形質転換および挿入体含
有プラスミドの色素選択による同定は製造業者（８ｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ ）の指示に従って実施した。４樗のプ
ラスミドが得られ、長さ約２５００ ｂｐの挿入体を含
有し九０ 例１２ プラスミドＰ１−１と命名された挿入体含有プラスミド
を用い、−木調鋳型ＤＮＡ ’！ｉ−製造し九〇これは
、Ｍ、Ｏ，１，２０： １のプラスミドＰ１−１含有細
菌培養の指数増殖期にヘルパーファージＲ４０８を加え
て行った。２４ Ｑ ｕｐｍの振盪話中６７℃で８時間
インキュベーションしたのち、ファージ粒子含有部分を
選び、−木調Ｐ１−１−ＤＮＡを標準方法により製造し
た。旧来のＭ２Ｓ−系と踵なり、ブルースクリプト基で
は全ｃＤＮＡ配列を含有する一本鎖鋳型ＤＮＡの製造が
可能となり、サブクロー二／グ法における時間の浪費も
不必要になる。Ｐｌ−１の配列決定は、標準のジデソキ
シ法により、またプライマーとして、各種ウィルス配列
に相当する共通Ｍ１３ゾライマーおよび合成オリ♂ヌク
レオチドゾライマーを用いて行つ之。
Ｍ １３ ＋ （８ｔｒａｔａｇｅｎｅ ）をＥＣ０
ＲＴで切断した。この線状化プラスミドを全ｃＤＮＡプ
レバレージョンと混合し、ＤＮＡ’ｉエタノールで共沈
穀し友。シラスξドーｃＤＮＡリゲーションは上述のよ
うにして実施した。リゾ−ジョン混合物を段階的に２倍
から１００倍までに希釈し、Ｅ、 ｃｏｌｉｘｒ、−１
デル−の形質転換に使用した。形質転換および挿入体含
有プラスミドの色素選択による同定は製造業者（８ｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ ）の指示に従って実施した。４樗のプ
ラスミドが得られ、長さ約２５００ ｂｐの挿入体を含
有し九０ 例１２ プラスミドＰ１−１と命名された挿入体含有プラスミド
を用い、−木調鋳型ＤＮＡ ’！ｉ−製造し九〇これは
、Ｍ、Ｏ，１，２０： １のプラスミドＰ１−１含有細
菌培養の指数増殖期にヘルパーファージＲ４０８を加え
て行った。２４ Ｑ ｕｐｍの振盪話中６７℃で８時間
インキュベーションしたのち、ファージ粒子含有部分を
選び、−木調Ｐ１−１−ＤＮＡを標準方法により製造し
た。旧来のＭ２Ｓ−系と踵なり、ブルースクリプト基で
は全ｃＤＮＡ配列を含有する一本鎖鋳型ＤＮＡの製造が
可能となり、サブクロー二／グ法における時間の浪費も
不必要になる。Ｐｌ−１の配列決定は、標準のジデソキ
シ法により、またプライマーとして、各種ウィルス配列
に相当する共通Ｍ１３ゾライマーおよび合成オリ♂ヌク
レオチドゾライマーを用いて行つ之。
その結采、Ｐｌ−１は構造蛋白質コード領域ｔ？Ｉい、
Ｃ７°ｃｌテインの開始コドンを越えて１２０ｂｐに達
することが明らかにされた。Ｐｌ−１の正確な位置は第
１図にも示す。
Ｃ７°ｃｌテインの開始コドンを越えて１２０ｂｐに達
することが明らかにされた。Ｐｌ−１の正確な位置は第
１図にも示す。
例１３
ＲＮｋの直接配列決定による各種天然単離体の配列決定
ＦＥ’１ＭＢウィルス西部亜型の各種天然単離体の構造
蛋白質をコードする配列？：、Ｓａｎｇｅｔのジデソキ
シ法の改良法、Ｚｉｍｍｅｒ ＆ Ｋ（１６）ｓｂｅｒ
ｇ （Ｐｒｏｃ。
蛋白質をコードする配列？：、Ｓａｎｇｅｔのジデソキ
シ法の改良法、Ｚｉｍｍｅｒ ＆ Ｋ（１６）ｓｂｅｒ
ｇ （Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 ８ｃｉ、 ＵＳＡ 、 ７５
： ｄ ２５７〜４２６１゜１９７８）の記載にほぼ
従ってｒツムＲＮＡの直接配列決定によって調べ友。デ
ノムの様々な位置ニ相当する各種合成オリイヌクレオチ
ドをプライマーとして使用した。ｒツムＲＮＡ約１μｇ
とそれぞれのプライマー０．５μｇを容！１０μを中に
混合し、６５℃に３分間加熱し、ついで徐々に４２′Ｃ
に冷却した。配列決定反応は逆転写酵素（Ａｍｅｒ−ａ
ｈａｍ ） １１−触媒として４２℃で１５分間行った
。対照として同時に、ＦＳＭＥｅウイルスゾａト型Ｎｅ
ｕｄ６−ｒｆｌの配列決定を行い、同じポリアクリルア
ミドデル上で解析した。これにより、様々の天然＆離体
における配列変動の単純かつ間違いのない同定が可能に
なつｔｏ一般的な記述の部分に述べたような位置に配列
変異が認められた。
： ｄ ２５７〜４２６１゜１９７８）の記載にほぼ
従ってｒツムＲＮＡの直接配列決定によって調べ友。デ
ノムの様々な位置ニ相当する各種合成オリイヌクレオチ
ドをプライマーとして使用した。ｒツムＲＮＡ約１μｇ
とそれぞれのプライマー０．５μｇを容！１０μを中に
混合し、６５℃に３分間加熱し、ついで徐々に４２′Ｃ
に冷却した。配列決定反応は逆転写酵素（Ａｍｅｒ−ａ
ｈａｍ ） １１−触媒として４２℃で１５分間行った
。対照として同時に、ＦＳＭＥｅウイルスゾａト型Ｎｅ
ｕｄ６−ｒｆｌの配列決定を行い、同じポリアクリルア
ミドデル上で解析した。これにより、様々の天然＆離体
における配列変動の単純かつ間違いのない同定が可能に
なつｔｏ一般的な記述の部分に述べたような位置に配列
変異が認められた。
例１４
精製したＦ８ＭＩＩＢ−ウィルスの西部亜型１キを、Ｌ
（１６）ｍｍｌｉ ＆ Ｆａｖｒｅ （Ｊ、 Ｍｏ１．
Ｂｉｏ１１８０ ： ５７５〜５９９．１９７３）の
方法に従い、１０％アクリルアミドゲル上に負荷した。
（１６）ｍｍｌｉ ＆ Ｆａｖｒｅ （Ｊ、 Ｍｏ１．
Ｂｉｏ１１８０ ： ５７５〜５９９．１９７３）の
方法に従い、１０％アクリルアミドゲル上に負荷した。
Ｅ７°０ティ／はｒルのｄカ紙プロットをアミド黒で染
色し、その蛋白質’２ｃルから切り取り、ｌ５ＣＯＩ出
装置を使用して、５時間ないし３週間電気溶出した。Ｎ
末端配列解析はＣｈａｎｇらの記載した方法（ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔｅｒｓ。
色し、その蛋白質’２ｃルから切り取り、ｌ５ＣＯＩ出
装置を使用して、５時間ないし３週間電気溶出した。Ｎ
末端配列解析はＣｈａｎｇらの記載した方法（ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔｅｒｓ。
９３：２０５〜２１４．１９７８）に従って行った。得
られた配列はＳｅｒ−Ａｒｇ−Ｃｙｓであって、第６図
に示した配列にお′けるＥプロティンの正確な位置の確
認が可能となつ友。
られた配列はＳｅｒ−Ａｒｇ−Ｃｙｓであって、第６図
に示した配列にお′けるＥプロティンの正確な位置の確
認が可能となつ友。
別法として、ＥならびにＭｔ−含有する蛋白複合体を、
精製ＦＳＭＥウィルス西部亜型のＴｒｉｔｏ（１ｘｌｏ
ｏによる可尋化、ついでＨｅ１ｎｚ ＆ Ｋｕａｚ（Ｊ
。
精製ＦＳＭＥウィルス西部亜型のＴｒｉｔｏ（１ｘｌｏ
ｏによる可尋化、ついでＨｅ１ｎｚ ＆ Ｋｕａｚ（Ｊ
。
Ｇｅｎ、 Ｖｉｒｏｌ、ｓ ４９ ： １２５〜１３２
．１９８０）の記載のように界面活性剤を含まない密度
勾配中で密度勾配遠心分離を行い創造した。期待された
ように、アミノ末端配列解析では２種の配列。
．１９８０）の記載のように界面活性剤を含まない密度
勾配中で密度勾配遠心分離を行い創造した。期待された
ように、アミノ末端配列解析では２種の配列。
８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ、 ５ｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ
ｆ与えた。Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＣｙｓがｇｆＯティンに由
来することはすでに知られていたので、配列８ｅｒ−Ｖ
ａｌ−ＬａｕはＭのアミノ末端と同定され７？、（第３
図）。
ｆ与えた。Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＣｙｓがｇｆＯティンに由
来することはすでに知られていたので、配列８ｅｒ−Ｖ
ａｌ−ＬａｕはＭのアミノ末端と同定され７？、（第３
図）。
例１５
第５図には、本技術分野の熟練者にはよく知られた方法
で、ｐＢＲ３２２誘導体プラスミドとして知られたプラ
スミドＡ５ｔ−示す。第５図から明らかなように、プラ
スミドＡ５は、ＦＳＭｇ−ウィルスのプロティンＥｉコ
ードするＤＮＡ配列を含有する。第５図にはさらに制限
工／ドヌクレアーゼ切断部位によるサブフラグメントな
らびにＦＳＭＥ ７′″ロテイ／Ｅコード領域を示しで
ある。矢印はｒノ五ＲＮＡの転写方向を示す。
で、ｐＢＲ３２２誘導体プラスミドとして知られたプラ
スミドＡ５ｔ−示す。第５図から明らかなように、プラ
スミドＡ５は、ＦＳＭｇ−ウィルスのプロティンＥｉコ
ードするＤＮＡ配列を含有する。第５図にはさらに制限
工／ドヌクレアーゼ切断部位によるサブフラグメントな
らびにＦＳＭＥ ７′″ロテイ／Ｅコード領域を示しで
ある。矢印はｒノ五ＲＮＡの転写方向を示す。
さらに、ウィルス材料およびプラスミド材料、ならびに
ｆｏティンＥをコードする具体的なＤＮＡ部分断片を含
有するプラスミドを作成するための方法を以下に述べる
。
ｆｏティンＥをコードする具体的なＤＮＡ部分断片を含
有するプラスミドを作成するための方法を以下に述べる
。
ワクシニアウィルス舒生型株ＷＲはＡ’ｒＣ”Ｃに寄託
番号ＶＲ−ｉ１９で寄託されていて入手できる。
番号ＶＲ−ｉ１９で寄託されていて入手できる。
チミン／キナーゼを産生しないヒトＴＫ−１４３細胞は
、一般に市販品を入手できるし、またパスツール研究所
に寄託されている（寄託番号ｌ−７６２）。ワクシニア
ウィルスはベロ細胞から４７〜５５継代増殖する。細胞
を５％ＦＣＢ （胎仔ウシ血清）、抗生物質およびグル
タミン含有ＭＩｌｉ１Ｍ（＊小必須培地）中で培養する
。組換えに使用したウィルス株は、ＴＫ＋野生型ウィル
スを選択するため、５％ＦＣ８含有ＨＡＴ （ヒボキサ
ンチン、アミノブチリ／、チミン／）培地で１回継代培
讐する。
、一般に市販品を入手できるし、またパスツール研究所
に寄託されている（寄託番号ｌ−７６２）。ワクシニア
ウィルスはベロ細胞から４７〜５５継代増殖する。細胞
を５％ＦＣＢ （胎仔ウシ血清）、抗生物質およびグル
タミン含有ＭＩｌｉ１Ｍ（＊小必須培地）中で培養する
。組換えに使用したウィルス株は、ＴＫ＋野生型ウィル
スを選択するため、５％ＦＣ８含有ＨＡＴ （ヒボキサ
ンチン、アミノブチリ／、チミン／）培地で１回継代培
讐する。
組換えＴＫ−ウィルスは５ ％ ＦＣＢ含有ＭｌｌｅＭ
中に２５ＩＩＩ／ｍｌのＢＵｄＲｔ−加えて生育させた
ヒトＴＫ−１４！１細胞に感染させる。組換えは、５％
ＦＣ８，２５μｇ／ ＠ｌ ＢＵｄＲならびに２５０
ｍｇ ／ ＲＩ Ｘ−ｇａｌ ｆ含有する低融点アがロ
ースに細胞単層を形成することにより確認できる。細胞
の培’Ｉ框３７℃において４２〜７２時間、イノキュベ
ーター中で継続した。
中に２５ＩＩＩ／ｍｌのＢＵｄＲｔ−加えて生育させた
ヒトＴＫ−１４！１細胞に感染させる。組換えは、５％
ＦＣ８，２５μｇ／ ＠ｌ ＢＵｄＲならびに２５０
ｍｇ ／ ＲＩ Ｘ−ｇａｌ ｆ含有する低融点アがロ
ースに細胞単層を形成することにより確認できる。細胞
の培’Ｉ框３７℃において４２〜７２時間、イノキュベ
ーター中で継続した。
自発性のＴＫ″″ウィルスの突然変異の程度は′１′に
一細胞単層の２５μｇ／―のＢＵｄＲの存在または非存
在下における感染によって決定される。通常は１０４以
下の突然変異ウィルスが認められる（ Ｍａｃｋｅｔｔ
ほか： ｉｎ ” ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ｖｏｌ
、 ｌ 、 Ａ ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ
＠、 ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、 Ｄ、Ｍ、 Ｇｌｏｖｅ
ｒ編、１９８５）。
一細胞単層の２５μｇ／―のＢＵｄＲの存在または非存
在下における感染によって決定される。通常は１０４以
下の突然変異ウィルスが認められる（ Ｍａｃｋｅｔｔ
ほか： ｉｎ ” ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ｖｏｌ
、 ｌ 、 Ａ ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ
＠、 ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、 Ｄ、Ｍ、 Ｇｌｏｖｅ
ｒ編、１９８５）。
１５．２ プラスｉ Ｆとクローニング方法第５図に
示すように、プラスミドＡ５はｐＢＲ３２２に由来する
プラスミドで、制限酵素地図も図に示すとおりである。
示すように、プラスミドＡ５はｐＢＲ３２２に由来する
プラスミドで、制限酵素地図も図に示すとおりである。
第６図にはプラスミドｐＳＣ’ １１ ｔ−示す。これ
は１青色１判定の友めのＬ ｃｏｌｉ ｌａｃ Ｚ遺伝
子、ＴＫ−周辺配列およびワクシニア−プロモーターを
含有する。プラスミドｐ８ｃ １１は公知で、一般に入
手できるが、とくにＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎ５ｔｉｔｕ
ｔｅ ｏｆＨｅａｌｔｈから取り寄せることができる。
は１青色１判定の友めのＬ ｃｏｌｉ ｌａｃ Ｚ遺伝
子、ＴＫ−周辺配列およびワクシニア−プロモーターを
含有する。プラスミドｐ８ｃ １１は公知で、一般に入
手できるが、とくにＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎ５ｔｉｔｕ
ｔｅ ｏｆＨｅａｌｔｈから取り寄せることができる。
ＤＮＡの修飾に使用されるすべての制限エンドヌフレア
ーゼは製造者の使用指導に従って応用される。サヂノプ
ロット解析とプラスミドＤＮＡの単離は標準方法に従っ
て行われる（ Ｍａｎｌａｔｌｓほか：Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 ｃｓＴ（１９８２）
。
ーゼは製造者の使用指導に従って応用される。サヂノプ
ロット解析とプラスミドＤＮＡの単離は標準方法に従っ
て行われる（ Ｍａｎｌａｔｌｓほか：Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 ｃｓＴ（１９８２）
。
放射性標識プローブは、ニック修復法またはｐｓｐ ６
− ” ＩＪ ＆ゾローデ°法で得られる（ Ｇｒｅｅ
ｎほか： Ｃｅ１１．３２ ： ６８）〜６９４．１９
８３）。
− ” ＩＪ ＆ゾローデ°法で得られる（ Ｇｒｅｅ
ｎほか： Ｃｅ１１．３２ ： ６８）〜６９４．１９
８３）。
本発明に使用される°りざゾローデプンデは、ＦＳＭｇ
−ヌクレオチド内部配列的１．０ｋｂｔ−プラスミドｐ
ｓｐ ６４中にリゲーションして製造される。
−ヌクレオチド内部配列的１．０ｋｂｔ−プラスミドｐ
ｓｐ ６４中にリゲーションして製造される。
ＦＩＮＡ合成開始前にプラスミドをＥｃｏＲｊで線状に
する。代表的なメジウムは以下のとおりである。
する。代表的なメジウムは以下のとおりである。
Ｔｒｉｓ ＨＣ４ｐＨ７，５４０ｍＭ
Ｍｇｃｔ２６ ｍＭ
スペルミジン ２ｍＭＮａＣＡ
２０ ｍＭＤＴＴ
ＩＱ ｍＭＡＴＰ、 ＣＴＰ、 ＣＴＰ
各 ［１，５ｍＭヒト胎盤ＲＮＡ５ ｅイン
ヒビター ２００ｐ８Ｐ ６４−ｐ５ｘｍｃｏＲ１
２ｘＦｌα”Ｐ ＵＴＰ （４００ＣＬ／ｍｍｏＡ
１００ μｃｉＳＰ ６ＲＮＡポリメラーゼ
４Ｕ全容 ２０μｔ イ／キュページ゛ヨ／：４０℃で１時間組込まれないヌ
クレオチドはカラムクロマトグラフィーにより放射標識
ｃ ＲＮ Ａと分離した。
２０ ｍＭＤＴＴ
ＩＱ ｍＭＡＴＰ、 ＣＴＰ、 ＣＴＰ
各 ［１，５ｍＭヒト胎盤ＲＮＡ５ ｅイン
ヒビター ２００ｐ８Ｐ ６４−ｐ５ｘｍｃｏＲ１
２ｘＦｌα”Ｐ ＵＴＰ （４００ＣＬ／ｍｍｏＡ
１００ μｃｉＳＰ ６ＲＮＡポリメラーゼ
４Ｕ全容 ２０μｔ イ／キュページ゛ヨ／：４０℃で１時間組込まれないヌ
クレオチドはカラムクロマトグラフィーにより放射標識
ｃ ＲＮ Ａと分離した。
インフエクションおよびトランスフェクション：組換え
はＭａｃｋｅｔｔら（８，１５，１）に記載された方法
にほぼ従って行つ之。ヒトＴＫ−細胞の場合には、宿主
細胞としてベロ細胞もトリ胚繊維芽細胞も使用できる。
はＭａｃｋｅｔｔら（８，１５，１）に記載された方法
にほぼ従って行つ之。ヒトＴＫ−細胞の場合には、宿主
細胞としてベロ細胞もトリ胚繊維芽細胞も使用できる。
トランスフェクション＠１〜３時間に、細胞ヲ腎生型Ｗ
Ｒ−株０．（３１）〜０．０５ ｐｆｕ／細胞で多重感
染法（ｍ、ａ、ｉ、 ）で感染させる。
Ｒ−株０．（３１）〜０．０５ ｐｆｕ／細胞で多重感
染法（ｍ、ａ、ｉ、 ）で感染させる。
法人のトランスフェクション用の１ＰＥ３緩衝食塩溶液
は、８．１８％Ｎａｃｚ（ｗ／ｖ）、５．９ 、！ｌ
％ｍｐｇｓ （Ｗ／ Ｖ ）ならびに０．２ ％ Ｎａ
２ＨＰＯ４（Ｗ／ Ｖ）を含有する１ＱＸＨＢ８′ｔ−
使用前に２ Ｘ ＨＢＳで希釈して製造した。−値は１
Ｎ Ｎａ０Ｔ（で正確に７．０５に調整した。緩衝液は
１Ｘ ）（ＢＳで希釈し、濾過して滅菌した。このＩ
Ｘ ＨＢＳ １ ｍｌに１〜５μＩのプラスミドＤＮＡ
と１０〜２０μｓのキャリアーｆ）ＮＡ（’１７ｔｄワ
クシニアウィルスの舒生型もしくはＬａｃｈｓｓｐｅｒ
ｍｉｅｎ ＤＮＡ ）を加えた。とくにキャリヤー［）
ＮＡの添加が好ましいように思われた。上述の混合物を
、ポルテックス振盪機を用いて１分間完全に混合した。
は、８．１８％Ｎａｃｚ（ｗ／ｖ）、５．９ 、！ｌ
％ｍｐｇｓ （Ｗ／ Ｖ ）ならびに０．２ ％ Ｎａ
２ＨＰＯ４（Ｗ／ Ｖ）を含有する１ＱＸＨＢ８′ｔ−
使用前に２ Ｘ ＨＢＳで希釈して製造した。−値は１
Ｎ Ｎａ０Ｔ（で正確に７．０５に調整した。緩衝液は
１Ｘ ）（ＢＳで希釈し、濾過して滅菌した。このＩ
Ｘ ＨＢＳ １ ｍｌに１〜５μＩのプラスミドＤＮＡ
と１０〜２０μｓのキャリアーｆ）ＮＡ（’１７ｔｄワ
クシニアウィルスの舒生型もしくはＬａｃｈｓｓｐｅｒ
ｍｉｅｎ ＤＮＡ ）を加えた。とくにキャリヤー［）
ＮＡの添加が好ましいように思われた。上述の混合物を
、ポルテックス振盪機を用いて１分間完全に混合した。
ついで２Ｍ ＣａＣｔ２溶液ｆ！：最終濃度が０．１２
５Ｍになるまで徐々に加えた。ＤＮＡの沈殿は２５℃で
２０〜３０分後に見えるようになった。感染細胞からメ
ジウムを除去し、単層ｔ−１＠細胞培養メジウムで洗浄
し、残った溶液を完全に除去したのち、ＤＮＡの沈殿を
徐々に加えた。３０分後に、２５℃の新たなメジウムを
加え、細胞を３７℃でインキュベーションした。３〜４
時間後、メジウムを再び除去し、−所しい細胞培養メジ
ウム交換する。細胞を常法により２４〜４８時間後にか
き集めて収穫し、低速度で沈降させ、細胞ペレットを全
容５００μｔのメジウムに集めた。
５Ｍになるまで徐々に加えた。ＤＮＡの沈殿は２５℃で
２０〜３０分後に見えるようになった。感染細胞からメ
ジウムを除去し、単層ｔ−１＠細胞培養メジウムで洗浄
し、残った溶液を完全に除去したのち、ＤＮＡの沈殿を
徐々に加えた。３０分後に、２５℃の新たなメジウムを
加え、細胞を３７℃でインキュベーションした。３〜４
時間後、メジウムを再び除去し、−所しい細胞培養メジ
ウム交換する。細胞を常法により２４〜４８時間後にか
き集めて収穫し、低速度で沈降させ、細胞ペレットを全
容５００μｔのメジウムに集めた。
プラークアッセイおよび組換えウィルスの精製：ウィル
ス懸濁液の凍結、解凍を３回反復し、懸濁液６０μｔを
１．２５ｒｓトリプシ／ し′５ 容とともに３７℃で
３０分間インキュベーションした。
ス懸濁液の凍結、解凍を３回反復し、懸濁液６０μｔを
１．２５ｒｓトリプシ／ し′５ 容とともに３７℃で
３０分間インキュベーションした。
１０ｃＴｒＬ２の平板に生育させたＴＫ−１４３細胞の
融合性単層に一連の３段階の希釈度（１：１０）を加え
た。３０〜６０分、３７℃でインキュベージヨシしたの
ち、メジウムを除去し、２５μｇ／αのプロモデソキシ
ウリジンを含むメジウム５ ｍｌを加えた。６７℃に２
４〜４８時間置いた装ちメジウムを再び除去し、２５μ
ｇ／ｒＩｔｌプロモデソキシｆｙ Ｑ シｙ ｂ ヨび
１２５ ａ９ ／ｒｆＬｌｘ −ｇａｌ ｋ含むアがロ
ース層に移した。さらに２４〜４８時間インキュベーシ
ョンして青色のプラークが確認できた。
融合性単層に一連の３段階の希釈度（１：１０）を加え
た。３０〜６０分、３７℃でインキュベージヨシしたの
ち、メジウムを除去し、２５μｇ／αのプロモデソキシ
ウリジンを含むメジウム５ ｍｌを加えた。６７℃に２
４〜４８時間置いた装ちメジウムを再び除去し、２５μ
ｇ／ｒＩｔｌプロモデソキシｆｙ Ｑ シｙ ｂ ヨび
１２５ ａ９ ／ｒｆＬｌｘ −ｇａｌ ｋ含むアがロ
ース層に移した。さらに２４〜４８時間インキュベーシ
ョンして青色のプラークが確認できた。
このプラークを個々に採取し、５００μｔのメジウムに
懸濁した。このウィルス含有懸濁液を上に述べたように
、トリデシ／で処理した。プラークの精製は少なくとも
２回実施した。
懸濁した。このウィルス含有懸濁液を上に述べたように
、トリデシ／で処理した。プラークの精製は少なくとも
２回実施した。
１７５ｃｒｎ２のフラスコから感染細胞をかき取り、ｐ
Ｈ７，６のＰＢＢ −Ｃａ”／ Ｍｇ２＋で２回洗浄し
九〇遠心分離後、細胞を２５０μｔのＰＢＳに再懸濁し
ｔ０細胞を、短時間内に３回凍結、解凍を反復させた。
Ｈ７，６のＰＢＢ −Ｃａ”／ Ｍｇ２＋で２回洗浄し
九〇遠心分離後、細胞を２５０μｔのＰＢＳに再懸濁し
ｔ０細胞を、短時間内に３回凍結、解凍を反復させた。
２ｘ細胞尋解緩衝液（１％ｌＪ）、／Ｘ１００；７ Ｑ
ｍＭβ−メルカプトエタノール： Ａ Ｑ ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ）２５０μを容量を加え、細胞は５分間氷上で溶
解した。核を１分間、１６，０００×ｇで細胞質から分
離した。集ままたウィルス粒子を含む上層を新たな小管
に移し、３０分間１６．０００９で遠心分離して、ウィ
ルスをペレット化した。ついで、ウィルス−溶解−緩衝
液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｔｐＨ８。
ｍＭβ−メルカプトエタノール： Ａ Ｑ ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ）２５０μを容量を加え、細胞は５分間氷上で溶
解した。核を１分間、１６，０００×ｇで細胞質から分
離した。集ままたウィルス粒子を含む上層を新たな小管
に移し、３０分間１６．０００９で遠心分離して、ウィ
ルスをペレット化した。ついで、ウィルス−溶解−緩衝
液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｔｐＨ８。
ｌ ｍＭ ＥＤＴＡ 、 ５ ｍＭβ−メルカプトエタ
ノーにし、２００ ｍＶ ＭａＣｌ 、 １％Ｓ［ｌＳ
、 ｌ ５Ｑｔｔ９ ／１ｔｔｌゾａテナーゼＫ）１０
０μを量會ベレットに加え、５６℃で３０分間インキュ
ベーションし友。次に、核酸ｆ Ｔｒｉｓ−ＨＣｔｆａ
和フェノールで３回抽出し、りｏ Ｃ１＊ ルム：イソ
アミルアルコール（２４：１）で再抽出した。この場合
ＤＮＡは剪断力にＩＩＩ＆されていないことに留意すべ
きである。核酸は０．１ＭＮａＣｔおよび２．５倍容の
エタノールによｏ−２０℃で一夜沈殿させた。約１０〜
２０μｇのＤＮＡ カ１０’個の細胞から単離される。
ノーにし、２００ ｍＶ ＭａＣｌ 、 １％Ｓ［ｌＳ
、 ｌ ５Ｑｔｔ９ ／１ｔｔｌゾａテナーゼＫ）１０
０μを量會ベレットに加え、５６℃で３０分間インキュ
ベーションし友。次に、核酸ｆ Ｔｒｉｓ−ＨＣｔｆａ
和フェノールで３回抽出し、りｏ Ｃ１＊ ルム：イソ
アミルアルコール（２４：１）で再抽出した。この場合
ＤＮＡは剪断力にＩＩＩ＆されていないことに留意すべ
きである。核酸は０．１ＭＮａＣｔおよび２．５倍容の
エタノールによｏ−２０℃で一夜沈殿させた。約１０〜
２０μｇのＤＮＡ カ１０’個の細胞から単離される。
遠心分離後（６０分。
１７．０ＯＯＸ＆）、ＤＮＡは少量の２０〜４０μｔの
水に溶解し友。このＤＮＡ ’ｉ制限工／ドヌクレアー
ゼＨｉαｄ［ｉで切断し、０．６％アがロースデル上Ｔ
Ａ緩衝液でフラグメントを分離した（ ＲＩＣθほか：
Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、 ５６ ： ２２７〜２３９ 、
１９８５）。
水に溶解し友。このＤＮＡ ’ｉ制限工／ドヌクレアー
ゼＨｉαｄ［ｉで切断し、０．６％アがロースデル上Ｔ
Ａ緩衝液でフラグメントを分離した（ ＲＩＣθほか：
Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、 ５６ ： ２２７〜２３９ 、
１９８５）。
出
すｆ／プロット
１’ルＣ３０’、 ０−５ＮＮａＯＨｋよび２Ｘ１０’
、１０ｘ ＳＳＣ／ ［１，５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｔｐ
Ｈ７，５）からＤＮＡ ’ｋ ＝トロセルロースフィル
ター上に移動後、これを８０℃で４時間乾燥した。フィ
ルターを５×ヂンハルト溶［（ＩＸ−Ｆ”ンハルト−０
，０２％フィコーにし、０．０２％ポリビニルぎロリド
ン、０．０２％ＢＳＡ）中６５℃で６時間、前Ｉ・イデ
リダイゼーションした。湿つ友フィルターをプラスチッ
クポケット内に封入し、ハイブリダイゼーション溶液お
よび放射性ゾンデと４３℃で１８時間インキュベーショ
ンした。フィルターを６５℃で６回、各回３０分、２
Ｘ Ｓｅｃ 、 １Ｘ ８ＳＣおよび０．１×ＳＳＣ中
、０．１％ＳＯ８および２０ ｍＭ ＮａＰＯ，で洗浄
し念。虱乾後、フィルターをコダックＸ −Ｄｆｎａｔ
ＡＲＸ線フィルムに露出した。
、１０ｘ ＳＳＣ／ ［１，５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｔｐ
Ｈ７，５）からＤＮＡ ’ｋ ＝トロセルロースフィル
ター上に移動後、これを８０℃で４時間乾燥した。フィ
ルターを５×ヂンハルト溶［（ＩＸ−Ｆ”ンハルト−０
，０２％フィコーにし、０．０２％ポリビニルぎロリド
ン、０．０２％ＢＳＡ）中６５℃で６時間、前Ｉ・イデ
リダイゼーションした。湿つ友フィルターをプラスチッ
クポケット内に封入し、ハイブリダイゼーション溶液お
よび放射性ゾンデと４３℃で１８時間インキュベーショ
ンした。フィルターを６５℃で６回、各回３０分、２
Ｘ Ｓｅｃ 、 １Ｘ ８ＳＣおよび０．１×ＳＳＣ中
、０．１％ＳＯ８および２０ ｍＭ ＮａＰＯ，で洗浄
し念。虱乾後、フィルターをコダックＸ −Ｄｆｎａｔ
ＡＲＸ線フィルムに露出した。
第５図に示したプラスミドＡ５からのＦＳ匹−フラグメ
ントに含まれる”リボゾロ−デーベクター（ｐ８Ｐ ６
） ｔ−１Ｆ ＳＭｇ−ウィルス特異的１リボプロー
デ１の製造に使用した。放射性で標識されたｃ ＲＮＡ
をハイブリダイゼーション溶液（５０幅ホルムアミド、
Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＠製、５ＸＳＳＣ，１ｘデンハル
ト溶液、０．１％ＳＯ３、１００μｇ／１１１１ニシン
精子ＤＮＡ ）と混合した。至適ノ１イブリダイゼーシ
ョン条件に套装な１００μｔ／ｃｒＩＬ２フイルターか
ら、ハイブリダイゼーション溶液の全容ｔｔ−５０４ｔ
と決定した。放射性ｃＲＮＡの量は約１０〒〜１０６ｃ
ｐｍ ／ａｎ２フィルターとした。溶液は６５℃に５分
間加熱した。
ントに含まれる”リボゾロ−デーベクター（ｐ８Ｐ ６
） ｔ−１Ｆ ＳＭｇ−ウィルス特異的１リボプロー
デ１の製造に使用した。放射性で標識されたｃ ＲＮＡ
をハイブリダイゼーション溶液（５０幅ホルムアミド、
Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＠製、５ＸＳＳＣ，１ｘデンハル
ト溶液、０．１％ＳＯ３、１００μｇ／１１１１ニシン
精子ＤＮＡ ）と混合した。至適ノ１イブリダイゼーシ
ョン条件に套装な１００μｔ／ｃｒＩＬ２フイルターか
ら、ハイブリダイゼーション溶液の全容ｔｔ−５０４ｔ
と決定した。放射性ｃＲＮＡの量は約１０〒〜１０６ｃ
ｐｍ ／ａｎ２フィルターとした。溶液は６５℃に５分
間加熱した。
スポットプロット
この実験はＭａｃｋｅｔｔら（ｓ、 １５−１ ）に従
い、わずかに改変して実権しｔ０単離されたプラークの
１／４ の材料に３５ｍペトリ皿の感染に使用した。
い、わずかに改変して実権しｔ０単離されたプラークの
１／４ の材料に３５ｍペトリ皿の感染に使用した。
４８時間感染させたのち細胞を収穫し、５０ｍＭＴｒｉ
ａ ＨＣｔｒＨ７−５および１００ ｍＭ ＮａＣＡ
ｋ含む緩衝液で洗浄し友、最後に細胞をこの緩衝液に再
懸濁した。そのサンプル１００μｔｅ取り、真空中でニ
トロセルロース上に吸収させる。乾燥後フィルターをク
ロマト用濾紙に重ねて０．５ Ｍ ＮａＯＨ中に５分間
浸漬した。ついで濾紙上のフィルターを２ Ｘ ８８０
／ ｌ Ｍ ＴｒｉＳ ＨＣｔｐＨ７−５に各６分間
浸して中和した。ついでフィルターを少なくとも２時間
加熱乾燥し、さらにサヂ／デロットハイデリダイゼーシ
ョ／について上述したと同様に処理した。
ａ ＨＣｔｒＨ７−５および１００ ｍＭ ＮａＣＡ
ｋ含む緩衝液で洗浄し友、最後に細胞をこの緩衝液に再
懸濁した。そのサンプル１００μｔｅ取り、真空中でニ
トロセルロース上に吸収させる。乾燥後フィルターをク
ロマト用濾紙に重ねて０．５ Ｍ ＮａＯＨ中に５分間
浸漬した。ついで濾紙上のフィルターを２ Ｘ ８８０
／ ｌ Ｍ ＴｒｉＳ ＨＣｔｐＨ７−５に各６分間
浸して中和した。ついでフィルターを少なくとも２時間
加熱乾燥し、さらにサヂ／デロットハイデリダイゼーシ
ョ／について上述したと同様に処理した。
ベロ細胞またはＴＫ−１４３細胞は、総容量的１〜２
ｍｌ／ ２５ ｃｍ２容器、ｍ、ｏ、ｉ、 １ ｐｆｕ
／細胞で感染させた。いくつかの実験では細胞を、１
００μＣｉ ”Ｓ−メチオニン／ばて標識した。ＣＰＥ
が強い場合は、°細胞を収慣し、２回ＰＢＳで洗浄し、
最後に１００μｔのＲＩ ＰＡ緩衝液（１５０ｍＭＮａ
Ｃｚ。
ｍｌ／ ２５ ｃｍ２容器、ｍ、ｏ、ｉ、 １ ｐｆｕ
／細胞で感染させた。いくつかの実験では細胞を、１
００μＣｉ ”Ｓ−メチオニン／ばて標識した。ＣＰＥ
が強い場合は、°細胞を収慣し、２回ＰＢＳで洗浄し、
最後に１００μｔのＲＩ ＰＡ緩衝液（１５０ｍＭＮａ
Ｃｚ。
ｌ Ｑ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｔｐＨ７−２、１％ナト
リウムヂソキシ コ − し − ト 、 １
％ ト リ ト ／Ｘ−１００，０，１１８
Ｄ８ 、１００ ＃、？ ／ｍｊＰＭｓＦ ’）に再懸
濁した（５〜１５０μ／、１５Ｘ１０５〜１．５ Ｘ
１０’細胞）。氷上に１０分間装いたのち、プローブを
６０秒間超音波処理した。このタンバク質混合物８μｔ
に１２μｔの２×加熱緩衝液（０，２ＭＤＴＴ 、 ４
％８ＤＳ 、 ０．１６ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ−Ｈ６
，８、２０％グリセリン、ｌ／１ｏｏ容量のエタノール
中５−ＢＰＢ ）を添加し、タンパク質を１０分間１０
０℃で変性させ、１５ （４５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ドデル上電気泳動に付した（ Ｂｏｄｅｍｅｒほか：
ＶｉｒｏｌｏｇＹ、１０３二６４０〜３４９．１９８０
）。タンパク質はゲルから、０．１９２ Ｍグリシン、
０．０２５ Ｍ Ｔｒｌｓ ｐ）１８．３および２０俤
メタノールを含む緩衝液中、ニトロセルロースフィルタ
ーに、！気１．５ Ａ ２．５時間処理して移した。ニ
トロセルロースフィルターはついで、遮断引［” ＮＥ
Ｔ ＠（０−１５ＭＮａＣ４５ｍＭ ＥＤＴＡ 、
５ ０ ｍＭＴｒｉｓｐＨ７−４−０−０５％
ト リ トンＸ １００ ｈ ２ ！ｆｉＢｓＡ ）中
テ（ン＄ユヘｙヨンし友。ヒト血清および酵素標識した
第２の抗ヒト免疫グロデリ／抗体をＮ１１ｉ、Ｔ中にｉ
：ｓｏｏの希釈度で加え、２時間インキエペーションし
た。フィルターをＮＥＴで３×１０分間洗浄し、ついで
’ｒＢｓ（２０ｍＭ Ｔｒｌｓ ｐＨ７，５＋ ０．９
９６ ＮａＣｔｊ２ｅ４ ＢＳＡ）に３×１０分間浸漬
した。バンドは５ Ｑ ｒｒｔ／： ＴＢＳと発色基質
中でＤＡＢとＨ２Ｏ。を生成した。
リウムヂソキシ コ − し − ト 、 １
％ ト リ ト ／Ｘ−１００，０，１１８
Ｄ８ 、１００ ＃、？ ／ｍｊＰＭｓＦ ’）に再懸
濁した（５〜１５０μ／、１５Ｘ１０５〜１．５ Ｘ
１０’細胞）。氷上に１０分間装いたのち、プローブを
６０秒間超音波処理した。このタンバク質混合物８μｔ
に１２μｔの２×加熱緩衝液（０，２ＭＤＴＴ 、 ４
％８ＤＳ 、 ０．１６ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ−Ｈ６
，８、２０％グリセリン、ｌ／１ｏｏ容量のエタノール
中５−ＢＰＢ ）を添加し、タンパク質を１０分間１０
０℃で変性させ、１５ （４５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ドデル上電気泳動に付した（ Ｂｏｄｅｍｅｒほか：
ＶｉｒｏｌｏｇＹ、１０３二６４０〜３４９．１９８０
）。タンパク質はゲルから、０．１９２ Ｍグリシン、
０．０２５ Ｍ Ｔｒｌｓ ｐ）１８．３および２０俤
メタノールを含む緩衝液中、ニトロセルロースフィルタ
ーに、！気１．５ Ａ ２．５時間処理して移した。ニ
トロセルロースフィルターはついで、遮断引［” ＮＥ
Ｔ ＠（０−１５ＭＮａＣ４５ｍＭ ＥＤＴＡ 、
５ ０ ｍＭＴｒｉｓｐＨ７−４−０−０５％
ト リ トンＸ １００ ｈ ２ ！ｆｉＢｓＡ ）中
テ（ン＄ユヘｙヨンし友。ヒト血清および酵素標識した
第２の抗ヒト免疫グロデリ／抗体をＮ１１ｉ、Ｔ中にｉ
：ｓｏｏの希釈度で加え、２時間インキエペーションし
た。フィルターをＮＥＴで３×１０分間洗浄し、ついで
’ｒＢｓ（２０ｍＭ Ｔｒｌｓ ｐＨ７，５＋ ０．９
９６ ＮａＣｔｊ２ｅ４ ＢＳＡ）に３×１０分間浸漬
した。バンドは５ Ｑ ｒｒｔ／： ＴＢＳと発色基質
中でＤＡＢとＨ２Ｏ。を生成した。
上述した材料と方法により、タンパク質ＥのＤＮＡ配列
を含有するプラスミドを製造し比ゆまず、プラスミドＡ
５（第５図）を制限エンドヌクレアーゼＰｖｕ ｉｌ
、 ＦｎｕＤ ｌｌおよびＨ（１６） ｆｌで消化した
。このフラグメントをプラスミドｐＳＣ １１ （第６
図）の唯一のＳｍａ １部位に挿入し友。３檀のＦ８Ｍ
Ｉｌ！： −７ラグメントがアがロースゲルから電気溶
出によって単離され、プラスミドｐＳＣ１１とりｒ−ジ
ョンさせた。この場合も同様に唯一のＳｍａ １部位が
直線化された。これらのプラスミドの物理的地図は第７
図に示す。３種の７ラグメントのサイズは、１０２２
ｂｐ （Ｐｖｕ ＩＩ ） −１４８５ｂｐ（Ｆｎｕ
Ｄｌｌ）および１５５３ ｂｐ （Ｈ（１６） ｎ ）
である。上述の６種の制限エンドヌクレアーゼは、タン
パク質Ｅの内部部分をコードするヌクレオチド配列１１
ｄ ＩＢＩＰｕｓｔｅｌｌコンぎニータデミグラムによ
って行つｔ親水性ゾロットにより疎水性シグナルおよび
膜依存性配列をもたない仁とが明らかにされていたので
使用した（第８図）。挿入タンパク質配列の方向は、す
０″ノブロツト解析によるｐ７．５Ｆｔ／ｌワクシニア
−プロモーターとの１；ｌ係で決定された。
を含有するプラスミドを製造し比ゆまず、プラスミドＡ
５（第５図）を制限エンドヌクレアーゼＰｖｕ ｉｌ
、 ＦｎｕＤ ｌｌおよびＨ（１６） ｆｌで消化した
。このフラグメントをプラスミドｐＳＣ １１ （第６
図）の唯一のＳｍａ １部位に挿入し友。３檀のＦ８Ｍ
Ｉｌ！： −７ラグメントがアがロースゲルから電気溶
出によって単離され、プラスミドｐＳＣ１１とりｒ−ジ
ョンさせた。この場合も同様に唯一のＳｍａ １部位が
直線化された。これらのプラスミドの物理的地図は第７
図に示す。３種の７ラグメントのサイズは、１０２２
ｂｐ （Ｐｖｕ ＩＩ ） −１４８５ｂｐ（Ｆｎｕ
Ｄｌｌ）および１５５３ ｂｐ （Ｈ（１６） ｎ ）
である。上述の６種の制限エンドヌクレアーゼは、タン
パク質Ｅの内部部分をコードするヌクレオチド配列１１
ｄ ＩＢＩＰｕｓｔｅｌｌコンぎニータデミグラムによ
って行つｔ親水性ゾロットにより疎水性シグナルおよび
膜依存性配列をもたない仁とが明らかにされていたので
使用した（第８図）。挿入タンパク質配列の方向は、す
０″ノブロツト解析によるｐ７．５Ｆｔ／ｌワクシニア
−プロモーターとの１；ｌ係で決定された。
ｐＳＣ １１− Ｐ ６ゾラスミドをＰｖｕ ｌまたは
ＢａｍＨｊで切断すると明瞭な２．５８５ ｋｂまたは
０．９１９ｋｂフラグメントが得られた（第９Ａ図レー
ン３および４）。いずれも３５１ｐ標識“リポプローブ
１−・戸ンデとハイブリダイゼーションした（第９Ｂ図
、レー／３および４）。プラスミドｐＳＣ １１−Ｆ４
１はＢａｍ Ｉ（ＩまたはＥｃｏＲｌ でフラグメント
に切断される。サイズ１．（３１）９ ｋｂまたは１，
８７９ｋｂのフラグメントでもっばら１リボゾロニデ１
−・戸ンデとハイブリダイゼーションする（第９Ｂ図、
レーン６および７）。
ＢａｍＨｊで切断すると明瞭な２．５８５ ｋｂまたは
０．９１９ｋｂフラグメントが得られた（第９Ａ図レー
ン３および４）。いずれも３５１ｐ標識“リポプローブ
１−・戸ンデとハイブリダイゼーションした（第９Ｂ図
、レー／３および４）。プラスミドｐＳＣ １１−Ｆ４
１はＢａｍ Ｉ（ＩまたはＥｃｏＲｌ でフラグメント
に切断される。サイズ１．（３１）９ ｋｂまたは１，
８７９ｋｂのフラグメントでもっばら１リボゾロニデ１
−・戸ンデとハイブリダイゼーションする（第９Ｂ図、
レーン６および７）。
ワクシニア株ＷＲで感染し定皐層ベロ細胞をプラスξ）
’ ＤＮＡでトランスフェクションし念。４８〜７２時
間後に強い細胞変性効果が明らかとなり、細胞を収穫し
た。ウィルスは細胞から、上述したような凍結−解凍の
反復ならびにトリゾシン処理により駆送された。次に、
ＴＫ−細胞単層をこのウィルス懸濁液で感染させた。細
胞をＢＵｄＲの存在下に生育させた。発生するプラーク
を発色基質Ｘ−ｇａｌを含むアがロース層で可視化した
。ウィルスの希釈は３５ｗｍの盤上に１０〜３０のプラ
ークを与えるように行った。青色プラークをそれぞれに
採取し、感染選択によりプラークをさらに精製する目的
でＴＫ−細胞の感染に、まｔウィルス巨大分子の解析の
究めにベロ細胞の感染に使用しｔ０ロット解析 ３５ｍｍの盤上ま友は２５ｍ２培麿フラスコからの感染
細胞単層の少量（約１００μｔ）のプｏ −デを分割し
、ニック修復標識ｐ８Ｃ１１プラスミド（ＦＡＭｍ配列
を含んでいない）またはＦＳＭＥ −” ＩＪざプロー
ブ（第１０図）と・・イデリタ゛−ゼーションし九〇感
染していない細胞は両デ／デともシグナルを全く示さな
かった。ｌａｃ Ｚ遺伝子とＴＫ□ −ワクシニア配列
を含むがＦＳＭＥ配列は全く含まないウィルスｖｓｃ
Ｆ３は、Ｆ’８ＭＥ −’リポプローブと１性の結果全
示した。しかしながら、期待されたように、多くの各プ
ラークから単離されたウィルスをもつ細胞はすべで、Ｆ
ＳＭＥ−およびｐＳＣ’１１−＝／’ンデに陽性を示し
た。
’ ＤＮＡでトランスフェクションし念。４８〜７２時
間後に強い細胞変性効果が明らかとなり、細胞を収穫し
た。ウィルスは細胞から、上述したような凍結−解凍の
反復ならびにトリゾシン処理により駆送された。次に、
ＴＫ−細胞単層をこのウィルス懸濁液で感染させた。細
胞をＢＵｄＲの存在下に生育させた。発生するプラーク
を発色基質Ｘ−ｇａｌを含むアがロース層で可視化した
。ウィルスの希釈は３５ｗｍの盤上に１０〜３０のプラ
ークを与えるように行った。青色プラークをそれぞれに
採取し、感染選択によりプラークをさらに精製する目的
でＴＫ−細胞の感染に、まｔウィルス巨大分子の解析の
究めにベロ細胞の感染に使用しｔ０ロット解析 ３５ｍｍの盤上ま友は２５ｍ２培麿フラスコからの感染
細胞単層の少量（約１００μｔ）のプｏ −デを分割し
、ニック修復標識ｐ８Ｃ１１プラスミド（ＦＡＭｍ配列
を含んでいない）またはＦＳＭＥ −” ＩＪざプロー
ブ（第１０図）と・・イデリタ゛−ゼーションし九〇感
染していない細胞は両デ／デともシグナルを全く示さな
かった。ｌａｃ Ｚ遺伝子とＴＫ□ −ワクシニア配列
を含むがＦＳＭＥ配列は全く含まないウィルスｖｓｃ
Ｆ３は、Ｆ’８ＭＥ −’リポプローブと１性の結果全
示した。しかしながら、期待されたように、多くの各プ
ラークから単離されたウィルスをもつ細胞はすべで、Ｆ
ＳＭＥ−およびｐＳＣ’１１−＝／’ンデに陽性を示し
た。
ベロ細胞単層？１〜１０ｐｆｕ／細胞のｍ、ｏ、ｉ。
で、多数のプラーク精製ワクシニア組換え体により感染
させた。ウィルスＤＮＡは感染細胞から取り出したウィ
ルス粒子から単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化なら
びにすｆ／デａットハイプリダイゼーションによって解
析した。野性型ＤＮＡ （第１１因レー／６に示す）の
５ ｋｂ Ｈｉｎｄ ｍフラグメントは、本来の阻ｎｄ
［フラグメントとＴＫ遺伝子ＩＷにｌ（１ｖｉｖｏ組
換えで挿入された同一のＤＮＡ配列からなるＨ１ｎｄＩ
ｆｆ大フラグメントによって交換された。ｖｓｃ ８ウ
イルスは３．５ ｋｂ ｌａｃ Ｚ遺伝子を含有するの
で、ＨｉｎｄｌｌｌＪ−フラグメントは約８．５ ｋｂ
のサイズをもつことが期待される（＠１１図、レーン５
）。大フラグメントは低百分率ゲルではそのままでは分
離できず、最終的な決定はサデンデロットハイデリダイ
ゼーショ／による組換えＤＮＡによって行われた（第１
２図）。３２ｐ標識ゾンデはすべてのフラグメントラ検
出できるので、クローニング法によって、前述のサイズ
が提示される。ｐＳＣ １１− Ｐ ６の組換えにより
構築され次組換えウィルスは、１）ＳＣ１１−Ｆ４１組
換え体より小さい、わずかに（約５００ ｂｐ ）サイ
での異なるＨｌｎｄ ｍフラグメントを持っていた（第
１２Ａ図および第１２Ｂ図）。感染していない細胞から
のＤＮＡは、ｐＳＣ １１ ” ニック修復“標識・戸
ンデとも”りざプローブ１ともハイブリダイゼーション
を示さなかった（第１２Ａおよび１２Ｂ図、レーン９）
。ライＡ／ スｖｓｃ Ｆ３からのＤＮＡは、ｐＳＣ１
１１ニック修復１標識ゾンデのみと、共通のＴＫ配列お
よびｌａｃ 、Ｚ遺伝子によりハイブリダイゼーション
した（第１２Ｂ図、レー／８）。ＦＡＭＰ−“リポプロ
ーブは期待されたようにハイデリダイゼショ／を全く示
しなかった。“リポプローブ１も“ニック修飾°標職デ
／デも、しかしながら、サイズの異雀るＨｌｎｄ ｉｌ
ｌ −Ｊフラグメント１組換体＠を同定した（第１２Ａ
図および１２Ｂ図、レーン１〜３および７）。挿入プラ
スミドｐＳ（３１）１と野生型ウィルスで絹換え後に生
じｔワクシニアウィルスのＤＮＡは、第１２Ａおよび第
１２Ｂ図レーン４〜６に示す。′リポプローブ１では（
第１２Ａ図）ハイデリダイゼーショ／は認められないが
、プラスミドｐＳＣ １１ （第１２図）には認められ
た。
させた。ウィルスＤＮＡは感染細胞から取り出したウィ
ルス粒子から単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化なら
びにすｆ／デａットハイプリダイゼーションによって解
析した。野性型ＤＮＡ （第１１因レー／６に示す）の
５ ｋｂ Ｈｉｎｄ ｍフラグメントは、本来の阻ｎｄ
［フラグメントとＴＫ遺伝子ＩＷにｌ（１ｖｉｖｏ組
換えで挿入された同一のＤＮＡ配列からなるＨ１ｎｄＩ
ｆｆ大フラグメントによって交換された。ｖｓｃ ８ウ
イルスは３．５ ｋｂ ｌａｃ Ｚ遺伝子を含有するの
で、ＨｉｎｄｌｌｌＪ−フラグメントは約８．５ ｋｂ
のサイズをもつことが期待される（＠１１図、レーン５
）。大フラグメントは低百分率ゲルではそのままでは分
離できず、最終的な決定はサデンデロットハイデリダイ
ゼーショ／による組換えＤＮＡによって行われた（第１
２図）。３２ｐ標識ゾンデはすべてのフラグメントラ検
出できるので、クローニング法によって、前述のサイズ
が提示される。ｐＳＣ １１− Ｐ ６の組換えにより
構築され次組換えウィルスは、１）ＳＣ１１−Ｆ４１組
換え体より小さい、わずかに（約５００ ｂｐ ）サイ
での異なるＨｌｎｄ ｍフラグメントを持っていた（第
１２Ａ図および第１２Ｂ図）。感染していない細胞から
のＤＮＡは、ｐＳＣ １１ ” ニック修復“標識・戸
ンデとも”りざプローブ１ともハイブリダイゼーション
を示さなかった（第１２Ａおよび１２Ｂ図、レーン９）
。ライＡ／ スｖｓｃ Ｆ３からのＤＮＡは、ｐＳＣ１
１１ニック修復１標識ゾンデのみと、共通のＴＫ配列お
よびｌａｃ 、Ｚ遺伝子によりハイブリダイゼーション
した（第１２Ｂ図、レー／８）。ＦＡＭＰ−“リポプロ
ーブは期待されたようにハイデリダイゼショ／を全く示
しなかった。“リポプローブ１も“ニック修飾°標職デ
／デも、しかしながら、サイズの異雀るＨｌｎｄ ｉｌ
ｌ −Ｊフラグメント１組換体＠を同定した（第１２Ａ
図および１２Ｂ図、レーン１〜３および７）。挿入プラ
スミドｐＳ（３１）１と野生型ウィルスで絹換え後に生
じｔワクシニアウィルスのＤＮＡは、第１２Ａおよび第
１２Ｂ図レーン４〜６に示す。′リポプローブ１では（
第１２Ａ図）ハイデリダイゼーショ／は認められないが
、プラスミドｐＳＣ １１ （第１２図）には認められ
た。
野性型または組換えウィルスをもつ細胞を１〜１０ｐｆ
ｕ／細胞のｍ、ｏ、ｉ、で感染させた。細胞は感染後時
間を変えて３ＩＳＳ−メチオニンで標識し、収穫し、順
次、変性５Ｄ８−ポリアクリルアミドデル上で解析した
。タンパク質Ｅ変異体分子は、ヒト抗血清とのウェスタ
ー／プロット解決で決定した。組換え体ウィルスＰ６で
感染させた細胞中には、分子置駒３８，０００ ／ルト
ンのＦＳＭＥウィルス特異的タンパク質が確認できた。
ｕ／細胞のｍ、ｏ、ｉ、で感染させた。細胞は感染後時
間を変えて３ＩＳＳ−メチオニンで標識し、収穫し、順
次、変性５Ｄ８−ポリアクリルアミドデル上で解析した
。タンパク質Ｅ変異体分子は、ヒト抗血清とのウェスタ
ー／プロット解決で決定した。組換え体ウィルスＰ６で
感染させた細胞中には、分子置駒３８，０００ ／ルト
ンのＦＳＭＥウィルス特異的タンパク質が確認できた。
このタンパク質は一次配列に由来するサイ、、＊ ′ｆ
！：示し、Ｆ’ＳＭ］ｌｉ：タンパク質Ｅからの３３５
個のアミノ酸とワクシニアＴＫ遺伝子からの８７個のア
ミノ酸から構成されていた。Ｆ８Ｍｇ配列が内部停止コ
ド／を含まないことから、この融合が考えられる。ＦＳ
ＭＥタンパク質配列のｇｎｕＤＩ［−７ラグメントを含
む第２の組換え体ウィルスは、約４２ＫＤのタンパク質
と予測される。
！：示し、Ｆ’ＳＭ］ｌｉ：タンパク質Ｅからの３３５
個のアミノ酸とワクシニアＴＫ遺伝子からの８７個のア
ミノ酸から構成されていた。Ｆ８Ｍｇ配列が内部停止コ
ド／を含まないことから、この融合が考えられる。ＦＳ
ＭＥタンパク質配列のｇｎｕＤＩ［−７ラグメントを含
む第２の組換え体ウィルスは、約４２ＫＤのタンパク質
と予測される。
ワクシニア−ウイルス組換体で感染させた細胞内でＦ８
ＭＩＥタンパク質合成の時間経過は、感染からの時間を
変えて短時間（４時間）細胞を３５８−メチオニンで標
識することにより調べ友。Ｐ７．５プａモーターは感染
サイクルの早い時期でも違い相でも活性であり、感染か
ら早い時期でも遅い時期でも、細胞はＦ８Ｍｇタンパク
質を産生ずることができる。これに比べて遅いＰ１１プ
ロモーターは分子量１１６ｋｄのβ−ｇａｌタンパク質
の合成を調整する。このタンパク質は感染後連れて現れ
る。以上述べたプロモーターの早いまたは遅い活性化は
細胞の収穫の時点に関係する。とくに、所望のタンパク
質の精製および製造の之めに大量のウィルスを用立てる
必要がある場合には重要である。
ＭＩＥタンパク質合成の時間経過は、感染からの時間を
変えて短時間（４時間）細胞を３５８−メチオニンで標
識することにより調べ友。Ｐ７．５プａモーターは感染
サイクルの早い時期でも違い相でも活性であり、感染か
ら早い時期でも遅い時期でも、細胞はＦ８Ｍｇタンパク
質を産生ずることができる。これに比べて遅いＰ１１プ
ロモーターは分子量１１６ｋｄのβ−ｇａｌタンパク質
の合成を調整する。このタンパク質は感染後連れて現れ
る。以上述べたプロモーターの早いまたは遅い活性化は
細胞の収穫の時点に関係する。とくに、所望のタンパク
質の精製および製造の之めに大量のウィルスを用立てる
必要がある場合には重要である。
第１図は、 Ｆ８Ｍｌｌｅ−ウィルス西部亜型のクロー
ン化されたゲノムのＤＮＡ配列を示す。 第２図は、７８Ｍ］１ｉｉ−ウィルス西部亜型のゲノム
の、構造タンパク質をコードするＲＮＡ配列を示す。 第３図は、ＦＳＭＫ−ウィルス西部亜型の構造タンパク
質のアミノ酸配列を示す。 第４図は、ＦＳＭＫ−ウィルス西部亜型に特異的な挿入
体を含有するシラスミげを制限酵素で切断後、アがロー
スデル電気泳動に付した写真である。 第５図は！ラスミドｐＢＲ３２２から誘導されたプラス
ミドＡ５の制限酵素地図である。 第６図は、プラスミドｐ８Ｃ１１の制限酵素地図である
。 第７囚はｐｓＣ１１−Ｈ１、ｐ８ｃ １１− Ｆ ４１
およびｐ８Ｃ１１Ｐ ６の制限酵素地図である。 第８図は、サブクローン化されたＦＳＭＫ−ウィルス特
異的配列の特性を示す。 第９Ａ図及び第９Ｂ図はＦＳ匹挿入プラスミドの物理的
地図ならびにその検出を示す図である。 第１０図は、ＦＳＭｇ−ワクシニアウィルス組換えのス
ロットデロットハイプリダイゼーショ／による確認を示
す図である。 第１１図は、野生型ウィルスまたはワクシニアウィルス
ＦＡＭＥ組換え体からの制限酵素切断フラグメントを示
す図である。 第１２図４．３２ｐ標識ＦＳＭＥ“りがゾローデ。 とのハイデリダイゼーショ／によるＦＳＮＢＳＮ的配列
の検出を示す図である。 第１６図は、ウィルス組換え体Ｐ６で感染させたべａ細
胞からの抽出液にかけるＦＡＭＥ特異的タンパク質のウ
ェスターンプロット法による解析を示す図である。
ン化されたゲノムのＤＮＡ配列を示す。 第２図は、７８Ｍ］１ｉｉ−ウィルス西部亜型のゲノム
の、構造タンパク質をコードするＲＮＡ配列を示す。 第３図は、ＦＳＭＫ−ウィルス西部亜型の構造タンパク
質のアミノ酸配列を示す。 第４図は、ＦＳＭＫ−ウィルス西部亜型に特異的な挿入
体を含有するシラスミげを制限酵素で切断後、アがロー
スデル電気泳動に付した写真である。 第５図は！ラスミドｐＢＲ３２２から誘導されたプラス
ミドＡ５の制限酵素地図である。 第６図は、プラスミドｐ８Ｃ１１の制限酵素地図である
。 第７囚はｐｓＣ１１−Ｈ１、ｐ８ｃ １１− Ｆ ４１
およびｐ８Ｃ１１Ｐ ６の制限酵素地図である。 第８図は、サブクローン化されたＦＳＭＫ−ウィルス特
異的配列の特性を示す。 第９Ａ図及び第９Ｂ図はＦＳ匹挿入プラスミドの物理的
地図ならびにその検出を示す図である。 第１０図は、ＦＳＭｇ−ワクシニアウィルス組換えのス
ロットデロットハイプリダイゼーショ／による確認を示
す図である。 第１１図は、野生型ウィルスまたはワクシニアウィルス
ＦＡＭＥ組換え体からの制限酵素切断フラグメントを示
す図である。 第１２図４．３２ｐ標識ＦＳＭＥ“りがゾローデ。 とのハイデリダイゼーショ／によるＦＳＮＢＳＮ的配列
の検出を示す図である。 第１６図は、ウィルス組換え体Ｐ６で感染させたべａ細
胞からの抽出液にかけるＦＡＭＥ特異的タンパク質のウ
ェスターンプロット法による解析を示す図である。
Claims (42)
- （１）ＦＳＭＥ−ウィルスの西部亜型に由来し、ＦＳＭ
Ｅ−ウィルスの西部亜型のプロテインＣ、ｐｒＭ、Ｍま
たはＥからなる群より選ばれるタンパク質の少なくとも
１種の少なくとも一部をコードするＤＮＡを包含するこ
とを特徴とするＤＮＡ分子。 - （２）ＦＳＭＥ−ウィルスの構造タンパク質をコードす
る全ＤＮＡ配列、好ましくは第１図に示した配列を包含
する特許請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ分子。 - （３）ＦＳＭＥ−ウィルスの西部亜型のプロテインＣ、
ｐｒＭ、ＭまたはＥからなる群より選ばれるタンパク質
の１種をコードする特許請求の範囲第１項または第２項
のいずれかに記載のＤＮＡ分子。 - （４）ＦＳＭＥ−ウィルスの西部亜型のプロテインＣ、
ｐｒＭ、ＭまたはＥからなる群より選ばれるタンパク質
の１種、好ましくはプロテインＥの少なくとも抗原決定
基の範囲をコードする特許請求の範囲第１項から第３項
までの少なくともいずれかに記載のＤＮＡ分子。 - （５）ＦＳＭＥ−ウィルスの西部亜型の精製ＲＮＡ分子
の逆転写酵素による逆転写で得られる特許請求の範囲第
１項から第４項までの少なくともいずれかに記載のＤＮ
Ａ分子。 - （６）化学的ＤＮＡ合成によつて製造された特許請求の
範囲第１項から第４項までの少なくともいずれかに記載
のＤＮＡ分子。 - （７）特許請求の範囲第１項から第６項までのいずれか
に記載のＤＮＡ分子と緊縮条件下にハイブリダイゼーシ
ヨンを行つた特許請求の範囲第１項から第６項までの少
なくともいずれかに記載のＤＮＡ分子。 - （８）遺伝子コードの退行および／または突然変異およ
び／または転位の結果、特許請求の範囲第１項から第７
項までに記載のＤＮＡ分子とは異なつているが、なお、
ＦＳＭＥ−ウィルスのプロテインＣ、ｐｒＭ、Ｍまたは
Ｅからなる群より選ばれるタンパク質の少なくとも１種
の抗原性をもつタンパク質をコードする特許請求の範囲
第１項から第７項までの少なくともいずれかに記載のＤ
ＮＡ分子。 - （９）補足的なＤＮＡ配列と組合されている特許請求の
範囲第１項から第８項までの少なくともいずれかに記載
のＤＮＡ分子。 - （１０）補足的なＤＮＡ配列は細胞培養液中でのＤＮＡ
分子の複製および発現を可能にするものであつて、プロ
モーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルおよ
びスプライスシグナルからなる群より選ばれる特許請求
の範囲第９項に記載のＤＮＡ分子。 - （１１）ＦＳＭＥ−ウィルスの西部亜型に由来し、ＦＳ
ＭＥ−ウィルスの西部亜型のプロテインＣ、ｐｒＭ、Ｍ
またはＥからなる群より選ばれるタンパク質の少なくと
も１種の少なくとも一部をコードするＲＮＡ分子。 - （１２）その構造タンパク質をコードする全ＲＮＡ配列
、好ましくは第２図に示した配列を包含する特許請求の
範囲第１１項に記載のＲＮＡ分子。 - （１３）ＦＳＭＥ−ウィルスの西部亜型のプロテインＣ
、ｐｒＭ、ＭまたはＥからなる群より選ばれるタンパク
質の１種をコードする特許請求の範囲第１１項に記載の
ＲＮＡ分子。 - （１４）ＦＳＭＥ−ウィルスの西部亜型のプロテインＣ
、ｐｒＭ、ＭまたはＥからなる群より選ばれるタンパク
質の１種、好ましくはプロテインＥの少なくとも抗原決
定基の範囲をコードする特許請求の範囲第１１項から第
１３項までの少なくともいずれかに記載のＲＮＡ分子。 - （１５）ＦＳＭＥ−ウィルスの西部亜型のＲＮＡの単離
および精製または組換えＲＮＡ／ＤＮＡ技術によつて得
られる特許請求の範囲第１１項から第１４項までの少な
くともいずれかに記載のＲＮＡ分子。 - （１６）転写によつて単離精製したウィルスＲＮＡを逆
転写によつてＤＮＡを得、ついでこのＤＮＡを転写して
再びＲＮＡとする特許請求の範囲第１５項に記載のＲＮ
Ａ分子。 - （１７）特許請求の範囲第１１項から第１５項までに記
載のＲＮＡ分子とその相補鎖を緊縮条件下にハイブリダ
イゼーシヨンを行つた特許請求の範囲第１１項から第１
５項までの少なくともいずれかに記載のＲＮＡ分子。 - （１８）特許請求の範囲第１項から第１０項までのいず
れかに記載のＤＮＡ配列または特許請求の範囲第１１項
から第１７項までのいずれかに記載のＲＮＡ配列の挿入
体を含有し、プラスミド、ウィルスおよびコスミドから
なる群より選ばれるベクター。 - （１９）プラスミドｐＢＲ３２２であり、これにＦＳＭ
Ｅ−ウィルスの西部亜型のプロテインＣ、ｐｒＭ、Ｍも
しくはＥまたはその部分からなる群より選ばれるタンパ
ク質をコードするＤＮＡ配列を含有する特許請求の範囲
第１８項に記載のベクター。 - （２０）ＤＳＭに寄託番号ＤＳＭ４３８２号で寄託され
た、第５図に示すようなプラスミドＡ５である特許請求
の範囲第１９項に記載のベクター。 - （２１）ＤＳＭに寄託番号ＤＳＭ４３８３号で寄託され
たプラスミドＰ１−１である特許請求の範囲第１９項に
記載のベクター。 - （２２）プロテインＥの相同性組換えＤＮＡ配列または
その部分をワクシニアウイルスのＨｉｎｄIIIＪ−フラ
グメント中に有する挿入プラスミドである特許請求の範
囲第１８項または第１９項の少なくともいずれかに記載
のベクター。 - （２３）第７図に示したプラスミドｐＳＣ１１−Ｐ６で
あつて、ヌクレオチド６５０３〜７５２４にプロテイン
ＥをコードするＤＮＡ配列を含有する特許請求の範囲第
２２項に記載のベクター。 - （２４）第７図に示したプラスミドｐＳＣ１１−Ｆ４１
であつて、ヌクレオチド６５０３〜７９９８にプロテイ
ンＥをコードするＤＮＡ配列を含有する特許請求の範囲
第２２項に記載のベクター。 - （２５）第７図に示したプラスミドｐＳＣ１１−Ｐ６で
あり、ヌクレオチド６５０３〜７５２４にプロテインＥ
をコードするＤＮＡ配列を含有する特許請求の範囲第２
２項に記載のベクター。 - （２６）プロテインＥの相同性組換えＤＮＡ配列、好ま
しくは特許請求の範囲第２２項から第２５項までに記載
のプラスミドの１種から挿入されたＤＮＡ配列を含有し
、上記ＤＮＡ配列に相当するアミノ酸配列を含むプロテ
インＥまたはその部分の発現に適したワクシニア発現ベ
クター。 - （２７）特許請求の範囲第１項から第１０項までのいず
れかのＤＮＡ配列または特許請求の範囲第１１項から第
１７項までのいずれかのＲＮＡ配列の挿入体を含有する
バクテリア性好ましくはネズミチフス菌ビークル。 - （２８）特許請求の範囲第１項から第１７項までに記載
の配列のいずれかを含有する細胞培養。 - （２９）特許請求の範囲第１項から第１７項までのいず
れかに記載のＲＮＡまたはＤＮＡ配列によつてコードさ
れるポリペプチドの発現を可能にし、細胞は好ましくは
動物細胞である特許請求の範囲第２８項に記載の細胞培
養。 - （３０）特許請求の範囲第２６項に記載のワクシニア−
発現−ベクターを含有し、挿入ＤＮＡ配列に相当するプ
ロテインＥの部分を発現するベロ細胞培養または鶏胚−
線維芽細胞培養である特許請求の範囲第２８項または第
２９項のいずれかの細胞培養。 - （３１）特許請求の範囲第１項から第１７項までに記載
ヌクレオチド配列のいずれかによつてコードされるアミ
ノ酸配列を含有するペプチドまたはポリペプチド。 - （３２）特許請求の範囲第１項から第１７項までのいず
れかに記載の配列の適当な発現系における発現によつて
製造される特許請求の範囲第３１項に記載のペプチドま
たはポリペプチド。 - （３３）特許請求の範囲第３０項における細胞培養にお
いて製造される特許請求の範囲第３２項に記載のペプチ
ドまたはポリペプチド。 - （３４）化学的に合成される特許請求の範囲第３１項に
記載のペプチドまたはポリペプチド。 - （３５）特許請求の範囲第３１項から第３４項までに記
載のペプチドまたはポリペプチドの１種または２種以上
を含有する組成物。 - （３６）特許請求の範囲第１項から第１０項までのいず
れかに記載のＤＮＡ配列および／または特許請求の範囲
第１１項から第１７項までのいずれかに記載のＲＮＡ配
列を含有する生ワクチン。 - （３７）特許請求の範囲第１項から第１０項までのいず
れかに記載のＤＮＡ配列１種または２種以上をワクシニ
ア−ウイルスＤＮＡと組合せた生ワクチン。 - （３８）特許請求の範囲第２６項に記載のワクシニアベ
クターを含有する特許請求の範囲第３７項に記載の生ワ
クチン。 - （３９）特許請求の範囲第３５項に記載の組成物を含有
するワクチン。 - （４０）特許請求の範囲第３６項から第３９項までに記
載のワクチンの特異的免疫グロブリンの産生のための使
用。 - （４１）特許請求の範囲第３５項に記載の組成物を含有
する診断薬。 - （４２）特許請求の範囲第１項から第１７項までのいず
れかに記載のＤＮＡまたはＲＮＡ配列とハイブリダイゼ
ーシヨンを行つたＤＮＡまたはＲＮＡゾンデ。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP87104114 | 1987-03-20 | ||
| EP87104114.1 | 1987-03-20 | ||
| EP88103003A EP0284791B1 (de) | 1987-03-20 | 1988-02-29 | DNA- und RNA-Moleküle des westlichen Subtyps des FSME-Virus, Polypeptide, die von diesen Molekülen codiert werden, und deren Verwendung |
| EP88103003.5 | 1988-02-29 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS642586A JPS642586A (en) | 1989-01-06 |
| JPH012586A true JPH012586A (ja) | 1989-01-06 |
Family
ID=
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