SK277781B6 - Peptides and polypeptides, vaccines and nucleous acid - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka peptidov, polypeptidov, vakcín a diagnostických látok pre západný podtyp vírusu TBE a nukleových kyselín a bielkovín, vhodných na použitie v týchto vakcínach a diagnostických činidlách.

Doterajší stav techniky

Západný podtyp vírusu kliešťovej encefalitídy (TBE) patrí do čeľade flaviviridae. Ide o RNA vírusy, vybavené guľovitým lipidovým obalom, ako bolo opísané vo Westaway a ďalší, Intervirology 24, 183 - 192, 1985. Prototypom tohto vírusu je vírus žltej horúčky. Všetky vírusy z tejto čeľade sú sérologicky príbuzné, ako je možné dokázať testami na inhibiciu hemaglutinácie. Pri skríženej neutralizácii je však možné túto čeľaď rozdeliť na niekoľko podskupín na základe sérologických komplexov, ako bolo popísané v DeMadrid and Portefield, J. Gen.Virol. 23, 91 - 96, 1974. Tieto skupiny obsahujú bližšie príbuzné flavivírusy na rozdiel od sérologicky menej príbuzných vírusov. Vírus TBE patrí do skupiny sérokomplexu vírusov, prenášaných kliešťami. Táto skupina zahrňuje tiež vírusy nazývané Louping ill, Langat, Omsk (hemorhagická horúčka), Kyasanur (lesná horúčka) a Negishi.

Kmene vírusu TBE ďalej možno priradiť k západnému (európskemu) typu, ktorý je prenášaný primáme kliešťom Ixodes ricinus a k ďalekovýchodnému typu, ktorého hlavným vektorom je Ixodes persulcatus (Čiarke, 1964, Bull. WHO 31,45 - 56).

Táto diferenciácia na podtypy bola potvrdená kompetitívnou RIA a mapovaním peptidov za použitia obmedzenej proteolýzy odpovedajúcich štruktúrnych glykoproteínov, ako bolo popísané v Heinz a Kunz, 1981, J. Gen. Virol. 57, 263 - 274 a tiež analýzou antigénov pri použití monoklonálnych protilátok (Heinz a ďalší, Virology 126,525-537, 1983).

Zrelé častice vírusu obsahujú iba 3 štruktúrne bielkoviny nazývané E, C a M s približnou relatívnou molekulovou hmotnosťou 50 až 60 000, 15 000 a 7 000.

Genóm flavivirusov je tvorený RNA s jednoduchým reťazcom s približne 11 000 bázami s polaritou mRNA s relatívnou molekulovou hmotnosťou 4 x 10^. Spolu s bielkovinou C tvorí táto RNA sférický nukleokapsid, ktorý je obalený lipidovým obalom, spojeným s bielkovinou E i M. Pokusy s čistenými prípravkami bielkoviny E, získanými po solubilizácii vírusu pomocou zmáčadiel dokázali, že bielkovina E predstavuje vírusový liemaglutinin, to znamená, že spôsobuje heinaglutináciu určitých erytrocytov za príslušných podmienok, čo po imunizácii vyvolá inhibiciu hemaglutinácie, neutralizácie a vznik ochranných protilátok, a tým aj imunitu proti nákaze živým virulentným vírusom, ako bolo popísané v Heinz a ďalši, Infect. Immun. 33,250 - 257, 1981.

Okrem týchto štruktúrnych bielkovín bolo možné preukázať v bunkách, infikovaných flavivírusmi určité neštruktúme bielkoviny, špecifické pre vírus.

Organizácia genómu flavivirusov bola v poslednej dobe stanovená cDNA - klonovanim a analýzou reťazca vírusov žltej horúčky, West Níle a Murray Valley encefalitídy (Rice a ďalších, Science 229, 726 - 733, 1985, Dalgamo a ďalši, J. Mol. Biol. 187, 309 - 323, 1986, Castle a ďalší, Virology 147, 227 - 236, 1985, Castle a ďalší, Virology 149, 10 - 26, 1986, Wengler a ďalší, Virology 147, 264 - 274, 1985). Podľa týchto analýz ob sahuje RNA genómu flavivirusov jednoduchý dlhý otvorený reťazec, obsahujúci približne 11 000 nukleotidov, ktorý je kódom pre všetky štruktúrne a neštruktúme bielkoviny. Poradie génov, stanovené pre vírus YF a potvrdené pre niekoľko ďaľších flavivirusov je 5; C-prM(M)-E-NS 1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4BNS5 3.C. E a prM(M) označujú štruktúrne bielkoviny, ktoré možno nájsť v nezrelých (C, prM, E) a v zrelých (C, M a E) časticiach vírusu, avšak zvyšok genómu je kódom pre neštruktúme bielkoviny. Štruktúrne a neštruktúme bielkoviny boli stanovené v korelácii s odpovedajúcimi segmentaini genómov na základe aminoterminálnej analýzy reťazca.

Je možné predpokladať, že translácia vírusových bielkovín začína na prvom kodóne AUG na 5- zakončení RNA a pokračuje až do stôp kodónu na 3 zakončení RNA. Tvorba jednotlivých bielkovín je teda sprevádzaná radom špecifických štiepnych pochodov, ktorých sa zúčastňujú ako bunečné proteázy, tak proteázy, špecifické pre vírus.

Až doposiaľ bolo zistených približne 60 rôznych flavivirusov a približne 2/3 z nich sa prenášajú uštipnutím infekčnými artropódmi, takže sú nazývané tiež vírusy ARBO (artropod - bome). Niekoľko z nich je patogénnych pre človeka vrátane vírusu žltej horúčky, vírusu dengue, vírusu japonskej encefalitídy alebo vírusmi iných eneefalitid (Shope v The Togaviruses, str. 47 - 82, Academic Press, New York, 1980).

Vírus TBE je endemický v mnohých európskych štátoch, Rusku a Číne. Ochorenie je dobre zdokumentované v niektorých štátoch strednej Európy, ako sú Rakúsko, Česko, Slovensko, Maďarsko a každoročne je hospitalizovaných niekoľko stoviek chorých, čo pred-stavuje vážny zdravotný problém.

Ochoreniu je možné účinne zabrániť vakcináciou pomocou vakcíny, ktorou je vysoko čistený, formaldehydom inaktivovaný vírus (Kunz a ďalší, J. Med. Virol. 6, 103-109, 1980), ktorý vyvoláva imunologickú odpoveď proti štruktúrnym bielkovinám vírusu. Zásadnou nevýhodou tejto vakcíny je skutočnosť, že je nutné zaobchádzať s veľkými objemami potenciálne nebezpečnej suspenzie vírusu v priebehu ich výroby. Je preto nutné zachovávať rozsiahle a nákladné bezpečnostné opatrenia.

Boli preto vyvíjané snahy nájsť spôsob výroby vakcíny bez vyššie uvedených nevýhod. V EP 284 791 sa tento problém rieši získaním molekuly DNA s obsahom DNA vírusu západného podtypu TBE, ktorá je kódom pre aspoň časť aspoň jedného typu štruktúrnej bielkoviny, napríklad zo skupiny bielkovín C, prM, M alebo E alebo západného podtypu vírusu TBE.

Táto molekula DNA zodpovedá RNA s jednoduchým reťazcom západného podtypu TBE a bolo dokázané, že je vhodná na získanie genetickej informácie pri expresii polypeptidu, a to úplnej bielkoviny C, prM, M alebo E západného podtypu vírusu TBE alebo časti niektorej vyššie uvedených bielkovín. Taký polypeptid je možné použiť na diagnostické alebo liečebné účely napríklad pri výrobe vakcíny.

Analýza reťazca takisto potvrdila, že existuje diferenciácia oproti ďalekovýchodnému podtypu. Aminokyseliny jednotlivých reťazcov sa od seba líšia až v 14% (v závislosti od bielkoviny), ako bolo popísané v publikácii Jamščikov a Pletnov, Necleic Acid Res. 16, 7750(1988).

Hoci vakcína na báze jednej alebo väčšieho počtu rekombinantných štruktúrnych bielkovín, tak ako bola opísaná v EP 284 791 môže znamenať zlepšenie v porovnaní s inaktivovaným neporušeným vírusom ako vakcínou z hľadiska výroby, má inak s uvedenou vakcínou rovnaké nevýhody, že totiž neobsahuje neštruktúme bielkoviny, ktoré môžu prispievať k ochrannej imunologickej odpovedi.

Neštruktúme bielkoviny majú dôležité funkcie pre životný cyklus flavivírusov, a to pre dozrievanie, proteolytické pochody a pre replikáciu RNA. Hoci bolo dokázané, že jedna z neštruktúmych bielkovín (NS 1) je u vírusov, odlišných od vírusov TBE, schopná vyvolať ochrannú imunologickú odpoveď (Schlessinger a ďalší, J. Virol. 62, 3027-3031 (1988) ) u pokusných zvierat, neboli k dispozícii žiadne dôkazy tohto typu pre neštruktúme bielkoviny TBE.

Je známe, že subncutralizačné koncentrácie neutralizačných protilátok alebo iných protilátok proti epitopom flavivírusovej bielkoviny E môžu sprostredkovať na protilátke závislé zlepšenie infektivity u buniek, nesúcich Fc - receptory (Portefield, Cardosa: Concepts in viral Pathogenesis I, kapitola 17, str. 117), tento poznatok pomáha objasniť patogenetiku hemorrhagickej horúčky dengue a syndróm šoku, vyskytujúci sa pri tejto chorobe (Halstead, Science 239, 476-481, 1988). V niektorých prípadoch preto môže byť výhodné sa vyvarovať použitia bielkoviny E flavivírusov vo vakcínach, alebo dokonca možno použiť NS 1 ako jedinú zložku vakcíny a vôbec do vakcíny nevčleňovať štruktúrne bielkoviny.

Jedna z bielkovín NS-1 západného podtypu vírusu TBE bola v poslednej dobe identifikovaná svojím reťazcom. Táto bielkovina je vhodnou zložkou vakcíny a možno ju ľahko získať použitím rekombinantnej DNA.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je teda peptid alebo polypeptid, ktorý obsahuje aspoň časť aminokyselinového reťazca bielkoviny NS-1 západného podtypu vírusu TBE.

V prípade, že peptid alebo polypeptid obsahuje len časť aminokyselinového reťazca bielkoviny je výhodné, aby išlo o imunogénnu časť. Avšak s výhodou má tento peptid alebo polypeptid reťazec aminokyselín, znázornený na obr. 4.

Podstatu vynálezu tiež tvoria rozličné reťazce aminokyselín, ktoré sa líšia od reťazca aminokyselín prírodného NS-1 mutácií alebo transpozícií, čo spadá do bežných prirodzených variácií západného podtypu vírusu TBE. Tieto reťazce si však stále uchovávajú podstatné vlastnosti (zvlášť antigénne) neštruktúmej bielkoviny NS-1 západného podtypu vírusu TBE.

Napriek tomu, že je výhodné získavať peptidy alebo polypeptidy podľa vynálezu expresiou príslušných nukleotidových reťazcov, je tiež možné ich izolovať alebo s výhodou syntetizovať chemickým spôsobom. Peptidy alebo polypeptidy je tak možné získať v podstate v čistej forme, bez iných látok, s ktorými sú za prírodných podmienok obvykle zmiešané.

Peptidy alebo polypeptidy podľa vynálezu je možné použiť samotné alebo spolu s jednou alebo väčším počtom pomocných látok ako diagnostické činidlá a ako zložky vakcín. S výhodou sa tieto látky spracovávajú na prostriedky pre použitie v lekárstve.

Vynález sa tiež týka vakcíny, ktorá obsahuje peptid alebo polypeptid podľa vynálezu a jednu alebo väčší počet pomocných zložiek, prijateľných z ťarmaceutického hľadiska. Z týchto zložiek môže isť o nosič alebo po mocnú látku pre peptid alebo polypeptid. Ďalšou vhodnou zložkou je napríklad pufor.

Nosičom pre vakcínu môže byť hociktorý vhodný nosič a môže v prípade potreby obsahovať jednu alebo väčší počet pomocných látok. Podľa bežnej praxe je možné všetky vakcíny podľa vynálezu sterilizovať.

Výhodným použitím vakcín s obsahom antigénnych peptidov alebo polypeptidov je príprava špecifických imunoglobulínov, napríklad monoklonálnych alebo polyklonálnych protilátok, tieto látky je možné získavať známym spôsobom. Tieto protilátky proti peptidom a polypeptidom tiež tvoria súčasť podstaty vynálezu.

Ako tiež bolo uvedené vyššie, je možné použiť prostriedok s obsahom jedného alebo väčšieho počtu peptidov alebo polypeptidov podľa vynálezu ako diagnostické činidlo.

Vynález sa rovnako týka nukleových kyselín, ktoré sú kódom pre peptidy alebo polypeptidy podľa vynálezu.

Podstatou vynálezu sú teda rovnako nukleové kyseliny, ktoré sú kódom pre aspoň časť bielkoviny NS-1 západného podtypu vírusu TBE. Tieto nukleové kyseliny, často rekombinantné, obzvlášť rekombinantná DNA môžu byť kódom pre celú alebo v podstate celú bielkovinu NS-1 alebo pre jej príslušnú časť.

Tieto molekuly DNA a RNA sú použiteľné pre získanie peptidov a polypeptidov podľa vynálezu a tiež pre výrobu živých vakcín. Tieto reťazce DNA sa s výhodou spájajú s DNA vírusu Vaccinia, ktorý sa často užíva ako živá vakcína.

Okrem svojho použitia ako živej vakcíny majú reťazce DNAa RNA svoje použitie tiež ako sondy.

V súčasnej dobe nie sú k dispozícii žiadne špecifické látky pre liečbu chorých s nákazou vírusom TBE. Existuje však niekoľko potenciálnych možnosti špecifickej interferencie so životným cyklom vírusov vrátane postupov, ktoré zahrňujú použitie neštruktúmych bielkovín, ako je replikácia RNA, posttranslačné proteolytické pochody a zostavovanie úplného vírusu. Nukleové kyseliny, ktoré sú kódom pre bielkovinu NS-1 alebo ich časť, by mohli byť na tento účel rovnako použiteľné. Okrem interferencie s funkčnými činnosťami vírusových bielkovín je tiež možné blokovať replikačné pochody vírusu pri použití protizmyselnej RNA.

Existuje rad ciest pre prípravu molekuly DNA podľa vynálezu. Jednou z možností získania molekuly DNA je postup, pri ktorom sa najprv extrahuje RNA vírusu západného podtypu TBE a molekula RNA sa čistí, načo sa vykoná transkripcia tohoto templátu RNA na molekulu DNA pri použití reverznej transkriptázy. Ďalšou možnosťou je chemicky syntetizovať molekulu DNA, akonáhle bol zistený jej reťazec.

Vo výhodnom vyhotovení zahrňuje vynález DNA, ktorá hybridizuje s molekulami DNA podľa prvého vyhotovenia a obzvlášť s reťazcami DNA z obr. 3 a/alebo molekulou DNA, ktorá je kódom pre bielkovinu z obr. 4 za vymedzených podmienok, napr. pri selekcii na aspoň 90% homológiu reťazca nukleotidov. Molekuly DNA tohto výhodného typu môžu stále ešte byť kódom pre peptidy.vyvolávajúce ako odpoveď tvorbu protilátok, okrem toho sú tieto molekuly DNA vhodné ako sondy.

V jednom z vyhotovení vynálezu ide o nukleovú kyselinu, obsahujúcu úplný reťazec genómu divokého západného podtypu vírusu TBE, ktorý je kódom pre neštruktúmu bielkovinu NS-1 a o molekuly DNA, od vodené od RNA genómu, ktoré sú kódom pre aspoň časť uvedenej bielkoviny. Molekuly DNA podľa vynálezu môžu zodpovedať alebo môžu byť komplementárne k RNA s jednoduchým reťazcom západného podtypu vírusu TBE a sú vhodné na získavanie genetickej informácie, týkajúcej sa expresie úplnej bielkoviny NS-1 alebo jej časti alebo väčšieho počtu jej častí a ich použitia ako zložky vakcíny na liečebné a diagnostické účely.

Vynález sa výslovne týka všetkých reťazcov DNA, ktoré sa líšia od molekúl DNA, ktoré zodpovedajú alebo sú komplementárne k prírodnému reťazcu RNA pre NS-1, nech už k zmene došlo degeneráciou genetického kódu a /alebo mutáciou a/alebo transpozíciou v rámci bežných prirodzených variácií západného podtypu vírusu TBE. Tieto reťazce sú teda stále ešte kódom pre bielkoviny, ktoré majú základné vlastnosti (obzvlášť základné antigénne vlastnosti) neštruktúmej bielkoviny NS-1 západného podtypu vírusu TBE.

Vo výhodnom vyhotovení vynálezu je možné tieto reťazce DNA spojovať s ďalšími reťazcami DNA.

Tieto ďalšie reťazce môžu umožňovať replikáciu a expresiu molekuly DNA v bunečnej štruktúre. Najdôležitejšie reťazce DNA na tento účel sú reťazce, ktoré majú funkciu promótora alebo môžu byť pomocnými reťazcami, polyadenylačnými signálmi, a signálmi pre štepenie. Tieto ďalšie reťazce je možné spájať s molekulami RNA podľa vynálezu štandartnými postupmi.

Výhody, ktoré sú spojené s vyššie uvedenými molekulami DNA, platia takisto rovnakým spôsobom i pre molekuly RNA. Molekuly RNA podľa vynálezu je možné získať izoláciou a čistením RNA západného podtypu vírusu TBE alebo rekombinantným postupom pri použití RNA/DNA. Podstatu vynálezu tvoria nielen molekuly RNA, ktoré boli získané čistením RNA západného podtypu vírusu TBE, ale tiež molekuly RNA, ktoré boly získané transkripciou izolovanej a čistenej RNA vírusu na DNA pôsobením reverznej transkriptázy s následnou transkripciou takto získanej DNA späť do RNA alebo transkripciou RNA, závislou na RNA.

Podstatu vynálezu netvoria iba molekuly DNA a RNA, tak ako boli popísané vyššie, ale tiež vektory, obsahujúce včlenenú molekulu DNA alebo RNA tohto typu. Podstatu vynálezu teda tvoria také vektory, a to vektory pre expresiu alebo pre klonovanie, ktoré obsahujú reťazec nukleovej kyseliny uvedeného typu. Vektorom môže byť napríklad plazmid, vírus (napríklad živočíšny, ako Vaccinia, alebo fág) alebo kozmid. Ako je v odbore známe, tieto vektory obvykle obsahujú reťazce, riadiace replikáciu a expresiu RNA alebo DNA. Tieto riadiace reťazce môžu obsahovať promótor a okrem iných rôzne pomocné reťazce, uľahčujúce replikáciu a/alebo expresiu.

Podstatu vynálezu rovnako tvoria hostiteľské bunky s obsahom vyššie uvedeného vektoru. Bunky môžu tvoriť kultúru.

Vektory sa s výhodou uchovávajú v bunečnej kultúre, v ktorej dochádza k expresii polypeptidov, pre ktoré sú kódom reťazce DNA a RNA podľa vynálezu, s výhodou ide o bunečnú kultúru buniek cicavcov. Pri použití bunečnej kultúry buniek cicavcov je možné dosiahnuť najvýhodnejšie podmienky pre expresiu polypeptidu, ktorý iná byť použitý ako vakcína pre ochranu cicavcov proti infekciám západným podtypom vírusu TBE.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Vynález bude teraz opísaný pre lepšie pochopenie v súvislosti s priloženými výkresmi.

Na obr. 1 je znázornená fotografia agarozového gélu, na ktorom bola vykonaná elektroforéza nerozštiepeného plazmidu BS (dráha b), ktorý obsahuje celý kódový reťazec pre bielkovinu NS-1. V dráhe c je znázornený ten tistý plazmid po rozštiepení enzýmom BamHI a obidve dráhy a obsahujú označenie o veľkosti 0,6 kb, 2kba 100 kb.

Na obr. 2. je znázornený úplný nukleotidový reťazec včlenenej časti 17-6 v plazmide BS 17.6.

Na obr. 3. je znázornený reťazec RNA a reťazec aminokyselín, pre ktoré je tento reťazec kódom (17-6). Polohy sú číslované podľa číslovania v úplnom genóme vírusu TBE.

Na obr. 4 je znázornený reťazec aminokyselín bielkoviny NS-1, odvodenej od klonu 17-6. Polohy sú číslované od prvej aminokyseliny bielkoviny NS-1.

Na obr. 5, ktorý sa týka obsahu príkladu 10, je znázornený spôsob klonovania NS-1 v prokaryotickom vektore pre expresiu pUC19S. Na obr. 6A a 6B, ktoré sa takisto týkajú obsahu príkladu 10, sú znázornené nukleotidové reťazce klonu pNS1387 na 5'- a 3'- zakončenie. Včlenená časť NS1 je zaradená v správnom slede s bakteriálnym génom lacZ. Expresia je pod riadením laciZ operátora/ promótora.

Na obr. 6A je znázornená všeobecná organizácia uvedenej konštrukcie. Na obr. 6B sú znázornené reťazce DNA a bielkoviny. V tejto konštrukcii má NS-1 40 prídavných nukleotidov, ktoré zodpovedajú 14 aminokyselinám z génu lacZ s väzbovým reťazcom pUC 19S na jeho S'-zakončení. Na 3'-zakončeni sa nachádza 27 prídavných nukleotidov, ktoré nepatria k NS-1 (zodpovedajú 9 aminokyselinám). Polohy nukleotidov vzhľadom na genóin TBE (z obr. 3) sú označené pomocou hviezdičiek.

Na obr. 7A, ktorý sa týka príkladu 11 je znázornená stratégia klonovania NS1 s autentickým 5'-signálnym reťazcom v prokaryotickom vektore pre expresiu pUC19S.

Na obr. 7B, ktorý sa takisto týka príkladu 11 sú znázornené nukleotidové reťazce klonu ptSNS1791 na 3'- a na 5'- zakončení. Včlenený raťazec NS1 je v správnom slede s bakteriálnym génom lacZ pre expresiu pod riadením jeho proinótorového systému. V časti I je znázornená všeobecná stratégia konštrukcie. V časti Π sú znázornené reťazce DNA a bielkoviny. V tejto konštrukcii má NS1 celkom 39 prídavných nukleotidov, zodpovedajúcich 13 aminokyselinám z génu lacZ a z väzbového reťazca pUC19S na 5'zakončeni. Na 3’- zakončení sa nachádza ešte 30 nukleotidov, ktorých pôvod nie je v NS1 a ktoré odpovedajú 10 aminokyselinám na 3'- zakončení. Polohy nukleotidov relatívne ku génom TBE sú znázornené hviezdičkou (TBE genóm je na obr. 3).

Na obr. 8A, ktorý sa týka príkladu 12 je znázornené klonovanie kódovej oblasti NS1 vo vektore pTKgptFlS pre rekombináciu s vírusom Vaccinia.

Na obr. SB, ktorý sa týka rovnako príkladu 12 sú znázornené nukleotidové reťazce klonu pAPNS1338 na 5 - a na 3'- zakončení. NS1 obsahuje 19 prídavných nukleotidov, zodpovedajúcich 7 aminokyselinám v očakávanom translačnom produkte z polyväzbovej oblasti na 5 - zakončení, 30 prídavných nukeotidov zodpovedajúcich 10 aminokyselinám na 3'- zakončení.

Hviezdičkou sú označené polohy nukleotidov vzhľadom na genóm vírusu TBE (obr. 3).

Na obr. 9A a 9B, ktoré sa vzťahujú k príkladu 13, sú znázornené podrobnosti klonovania NSI a jeho putatívneho signálu reakcií s polymerázou (PCR). Na obr. 8A je znázornená všeobecná stratégia PCR, na obr. 8B reťazca chemicky syntetizovaných oligonukleotidov, použitých ako primeiy pre amplifikáciu DNA. Hviezdičkou sú označené polohy nukleotidov v genóme vírusu podľa obr. 3.

Na obr. 10, ktorý sa rovnako vzťahuje k príkladu 13, je znázornený agarózový gél s fragmentom NS1, syntetizovaným pomocou PCR Agarózový gel je zafarbený etídiumbromidom. Detekcia DNA sa vykonáva v ultrafialovom svetle. Šípka ukazuje fragment s dĺžkou približne 1 130bp.

Na obr. 11, ktorý sa rovnako týka príkladu 13, je znázornené klonovanie NS1 kódovej oblasti s putatívnym signálnym reťazcom po syntéze pomocou PCR do vektora pSCII-OrtDELTAO pre rekombináciu s vírusom vaccinia.

Na obr. 12, ktorý sa rovnako týka príkladu 13, sú znázornené reťazce klonu pSCSNS1444 na 3'- a na 5 zakončení. Autentická kódová oblasť NS1 vrátane signálneho reťazca má na svojom očakávanom produkte translácie 12 prídavných nukleotidov, zodpovedajúcich 4 aminokyselinám z oblasti väzbového reťazca na 5' zakončení. Ďalších 47 nukleotidov (zodpovedajúcich 16 aminokyselinám) sa nachádza na 3'- zakončení. Hviezdičkou sú označené polohy nukleotidov v genóme vírusu TBE (obr. 3).

Na obr. 13, ktorý sa týka príkladu 13, je znázornená analýza plazmidu pSCtSŇS1444 štiepením príslušnými reštrikčnými endunokleázami. Je znázornená správna orientácia včleneného reťazca NS1 do vektora pSCllOrt, rovnako je potvrdený rozmer fragmentov, odvodený od reťazca klonu 17-6.

Na obr. 14, ktorý sa týka príkladu 14, je znázornené klonovanie NS1 VTátane putatívneho signálneho reťazca vo vektore pTKgptF3s pre prenos a rekombináciu s vírusom vaccinia.

Na obr. 15, ktorý sa rovnako týka príkladu 14, je znázornený nukleotidový reťazec plazmidu pTKtSNS1556 na 3'- a 5¹- zakončení. V tejto konštrukcii má NS1 naviac 24 nukleotidov, ktoré zodpovedajú 8 aminokyselinám v príslušnom produkte translácie z väzbového reťazca na 5'- zakončení. Ďalších 26 nukleotidov, ktoré zodpovedajú 9 aminokyselinám, sa nachá-dza na 3'- zakončení. Hviezdičkami je označená poloha nukleotidov v genóme vírusu TBE (obr. 3).

Na obr. 16, ktorý sa týka príkladu 15, je znázornená analýza southem blot pre NSI- rekombinanty vírusu vaccinia, varecNS1444 a varecNS1556. Bunky CV-1 boli infikované rekombinantným vzorcom vaccinia pri 5 pfu/bunka. Dva dni po infekcii bola čistená celková bunečná DNA, materiál bol rozštiepený reštrikčnou endonukleázou HindUI a delený na 1% agarózovom géle. DNA bola prenesená na nitrocelulózový filter a bola vykonaná hybridizácia s rádioaktívne značeným plazmidom pSCtNS1444 ako sondou pre detekciu včleneného fragmentu NSI a pre susediace reťazce vírusu tk. Porovnaním rekombinantných kmeňov varecNSl 1556-112, -124, -122 a varecNS 1444-121 s divokým typom vírusu vaccinia (vzorka 4) bol preukázaný očakávaný posun fragmentu, získaného štepením HindlU smerom k vyššej relatívnej molekulovej hmotnosti. Iba v prípade varecNS 1556-222 bolo možné preukázať malý pás, zodpovedajúci w. t. fragmentu. To znamená, že izolát plaku nie je homogénny. 1556-122 atď., sú rôzne izoláty plakov z toho istého rekombinačného pokusu po trojitom čistení plakov. Ako kontroly a na označenie veľkosti fragmentov boli použité rôzne štiepne produkty plazmidu pSCtSNS1444 (vzorky 6 a 7).

Na obr. 17, ktorý sa týka príkladu 17, je znázornený autorádiograf denaturačného SDS-gélu s rekombinant-nými vírusmi varecNS1444 a varecNS 1556, pri kto-rých dochádza k expresii bielkoviny NSI. Bielkovinu s očakávanou relatívnou molekulovou hmotnosťou je možné dokázať u týchto vírusov (rel. mol. hmotnosť 48 000), avšak nie u divokého typu varecl342 (pri ktorom dochádza k expresii odlišnej bielkoviny v infikovaných bunkách). Veľmi silný pás pre bielkovinu, ktorý prechádza cez značku 97 000 je β- galaktosidáza (relatívna molekulová hmotnosť 166 000), k jej expresii dochádza pod riadením promótóra Pil v rekombinantných kmeňoch varecNS 1444 a varec 1342, odvodených od pSC 11-Ort.

Je možné pripraviť nukleovú kyselinu podľa vynálezu a stanoviť jej reťazec nasledujúcimi všeobecnými postupmi:

Predovšetkým je možné získať RNA vírusu extrakciou z buniek, infikovaných západným podtypom vírusu TBE. Pri použití RNA ako templátu je možné získať cDNA s dvojitým reťazcom, napríklad pri použití reverznej transkriptázy. Pri použití rekombinantnej techniky je možné túto cDNA uložiť do DNA vektora, napríklad do plazmidovej DNA Escherichia coli, čím sa získa rekoinbinantný plazmid. Rekombinantné plazmidy je možné použiť na transformáciu prísluš-ných hostiteľských buniek, napríklad E. coli, kmeň HB101 pre amplifikáciu plazmidov alebo pre expresiu zodpovedajúcich bielkovín. Jednotlivé kolónie s plaz-midmi, obsahujúcimi vloženú DNA je možné identifi-kovať postupom, ktorý bol uvedený v publikácii Bim-boim a Doly, Nucleic Acids Research 7, 1195-1204, 1979. Reťazec báz DNA, špecifický pre západný sub-typ vírusu, prítomný v rekombinantnom plazmide je možné preukázať postupmi pre rýchle stanovenie re-ťazca DNA, napríklad pri použití dideoxyreťazcov.

Podrobnejšie je možné opísať spôsob výroby cDNA, rekombinantných plazmidov, buniek, transformovaných týmito plazmidmi a spôsob stanovenia nukleotidového reťazca takto: Najprv sa získa z čisteného západného subtypu vírusu TBE vírusová RNA. Na tento účel sa vírus pestuje na primárnych bun-kách kuracích embryí, koncentruje sa pomocou ultraodstredivky a čistí sa v dvoch cykloch pri odstredení pomocou sacharózového gradientu. Po solubilizácii bielkovín pomocou SDS za prítomnosti proteinázy K a inliibítora RNázy, napríklad tak, že sa materiál inkubuje I hodinu pri teplote 37°C sa RNA extrahuje napríklad fenolom a zráža etanolom. Pri použití tejto RNA ako templátu sa potom získa DNA, komplementárna s vírusovou RNA in vitro pôsobením reverznej transkriptázy, napríklad z vírusu myeloblastózy vtákov, napríklad spôsobom podľa publikácie Gublera Hofmann, Gene 25, 263-269, 1983. Pri použití primérov, napríklad hexanukleotidového typu, získaných z teľacieho týmusu a jeho DNA, sa vírusová RNA inkubuje za príslušných podmienok, napríklad podľa príručky cDNA synthesis systém, Amersham, Veľká Británia, pri použití reverznej transkriptázy spolu s deoxyadenozíntrifosfátom (dATP), deoxytyinidíntrifosfátom (dTTP), deoxyguanozíntrifosfátom (dGTP) a deoxycytidíntrifosfátom (dCTP) ako substrátom. Takto získaná hybridná cDNA. RNA sa spracováva pôsobením RNázy H za presne definovaných podmienok za vzniku hybridnej molekuly RNA s vypustenými úsekmi. Potom je možné účinne použiť DNA-polymerázu I z E. coli k náhrade reťazca RNA pri použití RNA s vypustenými úsekmi ako priméru Takto získaná RNA s dvojitým reťazcom sa deproteinizuje extrakciou zmesou fenolu a chloroformu, vyzráža sa etanolom a zostávajúce fragmenty RNA sa odstránia pôsobením RNázy napríklad v pufre TE 30 minút pri teplote 37°C.

Klonovanie dsDNA sa vykonáva napríklad pri použití syntetických väzbových reťazcov. Za týmto účelom sa dsDNA spracuje pri použití Klenovovho fragmentu DNA polymerázy I z E. coli za príslušných podmienok podľa publikácie Maniatis a ďalší, Molecular Cloning, CSH 1982, aby bolo možné zaistiť čo najväčšie množstvo klonovateľných zakončení, načo sa vykonáva extrakcia fenolom a deproteinizácia. Potom sa dsDNA inkubuje za vhodných podmienok s väzbovými reťazcami BamHI za prítomnosti DNA-ligázy. Reakčná zmes sa nanesie na 1% agarózový gél a z gélu sa vyrežú cDNA s rôznou relatívnou molekulovou hmotnosťou a tie sa potom ďalej čistia napríklad elektroelúciou. Na druhej strane sa DNA plazmidu, ktorý má byť užitý ako vektor, napríklad plazmid Bluescript SK- z E. coli rozštiepi reštrikčnou endonukleázou BamHI a defosforyluje pri použití bakteriálnej alkalickej fosfatázy. Po rozštiepení cDNA enzýmom sa materiál zmieša s vektorom, rovnako rozštiepeným enzýmom BamHI a zmes sa inkubuje za príslušných podmienok pre umožnenie hybridizácie komplementárnych prečnievajúcich reťazcov na koncoch oboch molekúl DNA a vykonáva sa väzba pôsobením T4-DNA-ligázy. Rekombinantná molekula DNA sa použije na transformáciu kompetentného kmeňa E. coli, napríklad E. coli XL 1-blue. Rekombinanty, obsahujúce včlenenú časť, špecifickú pre vírus sa identifikujú na základe farebnej odlišnosti. Plazmidy sa izolujú podľa publikácie Bimboim a Doly, Nucleic Acids Research7, 1195-1204, 1979 a rozmery včlenených častí sa analyzujú pomocou reštrikčných enzýmov pri použití enzýmu BamHI s následným delením získaných fragmentov na 1 % agarózovom géle.

Reťazec báz v týchto včlenených úsekoch sa stanoví podľa publikácie Sanger a ďalší, PNAS USA 74, 54635467, 1977. Získaný reťazec sa analyzuje na homológii s už známymi reťazcami iných flavivírusov podľa publikácie Rice a ďalší, Science 229, 726-733, 1985, Dalgarno a ďalší, J. Mol. Biol. 187, 309-323, 1986, Castle a ďalší, Virology 147, 227-236, 1985, Castle a ďalší, Virology 149, 10-26, 1986, Wengler a ďalší, Virology 147,264-274, 1985, Jamščikov a Pletnev, Nucleic Acids Research 16 7750,1988 pri použití počítačových programov pre stanovenie uloženia reťazca v celkovom reťazci gcnómu RNA. Na obr. 2 je znázornený úplný nukleotidový reťazec a na obr. 3 zodpovedajúci reťazec aminokyselín oblasti NS1 západného subtypu genótnu vírusu TBE.

Vynález prvýkrát poskytuje možnosť získať nukleotidový reťazec génu, ktorý je kódom pre bielkovinu NS1 západného subtypu vírusu TBE a v dôsledku toho tiež objasňuje reťazec aminokyselín tejto bielkoviny.

Reťazec báz na obr. 2 je výhodným príkladom DNA, ktorá je kódom pre polypeptidy, charakteristické pre západný subtyp vírusu TBE, a to pre jeho bielkovinu NS1. Na základe degenerácie genetického kódu môže byť kódovým reťazcom pre ten istý reťazec aminokyselín tiež triplet báz, odlišných od báz, uvedených na obr.

2.

Do odboru vynálezu spadajú tiež reťazce, ktoré sú pozmenené mutáciou, transpozíciou alebo degradáciou, avšak aj tak sú kódom pre reťazec aminokyselín, ktorý si uchováva základné antigéiuie vlastnosti bielkoviny NS1.

Okrem toho sa vynález netýka iba presného reťazca aminokyselín z obr. 3, ktorý je iba príkladom možného reťazca bielkoviny NS1 prírodného západného podtypu vírusu TBE. Je známou skutočnosťou, že genómy vírusov RNA sú podrobené častejším mutáciám ako genómy DNA vírusov alebo bunečných génov, a to vzhľadom na väčší výskyt chýb v činnosti RNA polymeráz a nedostatok kontrolných a riadiacich mechanizmov, ako bolo uvedené v publikáciách Holland a ďalší, Science 215, 1577-1585, 1982, Reanney, Ann. Rev. Microbiol. 36, 47-73, 1982. V závislosti na vlastnostiach vírusu môžu tieto mutácie dať vznik novým typom vírusov vzhľadom na posun antigénnych vlastností, tak ako to bolo v prípade chrípkového vírusu podľa publikácie Botli a ďalší, Origin of Pandemic Influenza Viruses, W.G.Laver (ed.), Elsevier, 1983. Na druhej strane môžu byť RNA vírusy antigénne stálejšie za prírodných ekologických podmienok, pravdepodobne v dôsledku prírodných funkčných obmedzení, ktoré nedovoľujú rozsiahlejšie štruktúrne zmeny v antigénne aktívnych bielkovinách. Je však potrebné napriek tomu brať do úvahy určitú mieru variácie, ako je možné dokázať porovnaním reťazcov rôznych prírodných izolátov.

To je možné dosiahnuť napríklad tak, že sa analyzuje reťazec RNA z rôznych izolátov pri použití dideoxyreťazcov na zakončeniach a pri použití syntetických oligonukleotidov ako primérov. Tieto reťazce sa pripravia podľa prototypového reťazca izolátu z obr. 2.

Všetky reťazce, ktoré majú v porovnaní s reťazcom prototypu drobné variácie, napríklad také, ktoré boli nájdené v ďalších prírodných izolátoch západného subtypu vírusu TBE, sú do vynálezu zahrnuté. Tieto variácie je možné získať tiež modifikáciou nukleovej kyseliny in vitro. Vynález preto zahrňuje všetky reťazce, ktoré hybridizujú za obmedzených podmienok, napríklad pri selekcii na aspoň 90% homológii reťazca s reťazcom podľa vynálezu alebo jeho častí a ktoré sú s výhodou kódom pre bielkoviny alebo peptidy s podstatnými antigénnymi determinujúcimi vlastnosťami západného subtypu vírusu TBE, t.j. jeho štruktúrnych bielkovín.

Uloženie nukleotidového reťazca, ktorý je kódom pre bielkovinu, napríklad pre NS1 do príslušného vektora alebo vektorov a do hostiteľskej bunky k expresii tejto bielkoviny vo veľkom množstve je účinnou technológiou pre štúdium štruktúry a biologických funkcií bielkovín. Systém, použitý na expresiu vždy závisí na určitých vlastnostiach molekuly, napr. na posttranslačnej modifikácii skúmanej molekuly bielkoviny.

Expresiu je možné uskutočniť v prokaryotickom alebo eukaryotickom bunečnom systéme. V prípade glykoproteínov, ako sú bielkoviny typu NS1 je na expresiu vhodnejšia eukaryotická hostiteľská bunka, pre tože táto bunka je lepšie schopná uskutočniť glykozyláciu.

Výhodným systémom pre expresiu je vírus vaccinia a bunky primátov, ktoré rastú v kontinuálnej kultúre. Týmto spôsobom je možné zaistiť alebo pomôcť zaisteniu správnej posttranslačnej modifikácie a vysokej úrovne syntézy.

Okrem toho je zrejme možné preukázať, že riadiace reťazce vírusu vaccinia sú schopné riadiť syntézu takmer ktorejkoľvek cudzorodej bielkoviny buď pri použití promótora pre neskoršiu fázu alebo pri použití promótora konštitutívneho promótora, ktorý je činný v priebehu včasnej i neskorej fázy replikácie vírusu, ako bolo opísané v Moss a Flexner, Aiui. Rev. Immunol. 4, 305-324, 1987. Boli však podávané i správy o tom, že stálosť cudzorodých bielkovín, ku ktorých expresii došlo v bunkách, infikovaných vírusom vaccinia je silne ovplyvnená promótorom, ktorý riadi expresiu príslušného génu, ako bolo popísané v Coupar a ďalší, Eur. J. Immunol. 16, 1479, 1986 a Townsend a ďalší, J. Exp. Med. 168, 1211-1224, 1988.

Konštrukcia príslušného plazmidu pre expresiu s obsahom reťazca, špecifického pre NS1 vyžaduje extenzívnu manipuláciu s DNA. Je nutné brať do úvahy, že NS1 je časťou polyproteínu, ktorý je posttranslačne spracovávaný na jednotlivé bielkoviny proteázami vírusu a bunky, ako bolo opísané v Mandl a ďalší, Virology 173, 291-301, 1989. V priebehu prírodnej vírusovej infekcie zahrňuje syntéza NS1 vnútorný signálny reťazec na aminoterminálnom zakončení. Signálny reťazec smeruje vznikajúci reťazec do endoplazmatického retikula, čo je nevyhnutné pre správnu posttranslačnú modifikáciu, napríklad pre glykozyláciu. Aby bolo možné získať správne spracovaný produkt expresie, je nutné, aby tento signálny reťazec alebo heterológny signálny reťazec bol zahrnutý v rekombinantnej molekule.

Okrem toho vzhľadom na to, že NS1 je časťou polyproteínu, neobsahuje kodóny pre počiatok ani stop kodón pre transláciu. Tieto kodóny je potrebné zaistiť špecifickou manipuláciou rekombinantnej DNA.

Hydrofóbny reťazec 5- a reťazec 3- sú zaradené v klone 17-6 (obr. 3). Vzhľadom na to, že nie sú k dispozícii miesta štiepenia reštrikčnými endonukleázami, nie je možné priamo klonovať NS1 s jej prírodným signálnym reťazcom vo vektore pre včlenenie. Z tohto dôvodu je možné syntetizovať napríklad ďalší reťazec 1200 bp, obsahujúci signálny reťazec NS1 a reťazec pre úplnú bielkovinu NS1, napríklad pri použití polymerázy (PCR). Táto technika tiež umožňuje zaradenie prípadných miest štiepení reštrikčnou endonukleázou na oboch stranách amplifikovanej DNA a reťazcov pre počiatok a ukončenie.

Špecificky konštruovaný pár primér pre amplifikáciu dáva vznik reťazcu NS1, ktorý iná na každej strane miesto pôsobenia reštrikčnej endonukleázy EcoRI. Pri použití tohto postupu je možné zameniť autentický signálny reťazec akýmkoľvek signálnym reťazcom, prírodné sa vyskytujúcim alebo syntetickým signálnym reťazcom, ako bolo opísané v Heinje, NAR 14, 46834690,1986.

Všetky plazmidy, špecificky vyvinuté pre expresiu molekuly je možné transportovať do vírusu vaccinia (kmeň WR alebo oslabený derivát tohto kmeňa) homológnou rekombináciou v hostiteľskej bunke, napríklad v bunkách primátov CV-1. Experimentálny postup na získavanie rekombinantného vímsu vaccinia je známy, a nie je preto nutného bližšie opisovať (Mackett a ďalší,

JRL Presá: DNA cloning Ľ, Ed. DM Glover, 191-211, 1985.

Vynález sa rovnako týka syntézy molekúl NS-1 v bakteriálnom hostiteľovi. Glykoproteiny, ku ktorých expresii došlo v bakteriálnej bunke, obvykle nie sú glykozylované rovnakým spôsobom ako produkty, získané v eukaryotických bunkách. Pretože môže byť syntéza NS-1 aj v neglykozylovanej forme užitočná na rôzne účely. Ako príklad je možné uviesť, že deriváty obalového glykoproteínu (gp) 160 HTV-1, ku ktorých expresii došlo v bakteriálnej bunke, podstatne prispeli k diagnostike HIV a experimentálnej vakcinácii.

Analogicky ako skonštruovaný plazmid pre rekombináciu s vírusom vaccinia bol syntetizovaný tiež reťazec pre NS-1 vrátane autentického signálneho reťazca pomocou PCR a bol klonovaný napríklad v plazmide pUC-19. Je možné nahradiť TBE signálny reťazec prokaryotickým signálnym reťazcom za účelom dosiahnutia účinnej sekrécie molekúl NS-1 z bakteriálnej bunky. Bakteriálny signálny reťazec totiž môže zabrániť agregácii NS-1 a tvorbe inkluzívnych teliesok, ktoré je potom nutné rozpustiť pomocou zmáčadiel alebo inými solubilizačnými prostriedkami.

Okrem syntézy úplnej bielkoviny NS-1 je možné tento experimentálny postup aplikovať tiež na skrátené formy molekuly NS-1. Tieto skrátené molekuly je možné použiť na vyvolanie imunologickej odpovede, namierenej proti špecifickým miestam bielkoviny. Tieto fonny sú rovnako cenným nástrojom pre takzvanú sérológiu, namierenú proti špecifickým miestam. Imunologický relevantné epitopy v bielkovine NS-1 je možné včleniť do nosných molekúl ako pomocné úseky (napríklad častice HB jadra) alebo do imunostimulačnélio komplexu (ISCOM) podľa publikácie Morein a ďalší, Iminunology today 8(11), 333-338, 1987.

Akákoľvek z molekúl NS-1, syntetizovaných v prokaryotických a eurokaryotických systémoch pre expresiu, opísaných v tomto opise, predstavuje molekulu, vhodnú ako zložka NS-1 vakcíny, molekulu je možné použiť samotnú alebo viazanú na rekombinant-ný glykoproteín E vírusu TBE (EP 284791), alebo je možné tieto molekuly pridávať do existujúcej vakcíny s obsahom inaktivovaného vírusu TBE.

Okrem toho môže byť analýza imunologickej odpovede proti týmto neštruktúmyin bielkovinám alebo ich častiam kritická pre porozumenie patogenicity vímsu TBE a ďalších členov skupiny flavivírusov.

Do genómu živých vírusov je rovnako možné zaradiť cudzorodé reťazce DNA alebo RNA, čím vzniknú rekombinantné vírusy, ktoré je možné použiť ako živú vakcínu. Zhrnutie tejto možnosti bolo opísané v publikácii Mackett a Smistli, J. Gen. Virol. 67, 20672082, 1986.

Taktiež kombinácie rôznych génov, napríklad odvodených od rôznych vírusov, je možné spracovať gene-tickou technológiou tak, že je možné dosiahnuť ich expresie a použiť pre vakcináciu (Perkus a ďalší, Science, 229, 981-984, 1985). Vynález preto zahrňuje akékoľvek kombinácie reťazcov, uvedených v tomto opise s ďalšími reťazcami, ako sú gény, ktoré sú kódom pre odlišné bielkoviny alebo reťazce, ktoré prispievajú k expresii bielkovín ako sú promótory, podporné reťazce, polyadenylačné alebo štiepne signály·

Je známe, že na imunizačné alebo diagnostické účely nie je bezpodmienečne nutné použiť úplnú prírodné sa vyskytujúcu bielkovinu (Lemer, Náture 229,

592-596, 1982, Anión, TIBS 11, 521-524, 1986).

Bielkoviny alebo časti bielkovín, ktoré je možné použiť ako vakcíny alebo diagnostické činidlá, je možné získať rekombinantnou vyššie opísanú technológiou s použitím DNA, reťazec podľa vynálezu je však rovnako možné použiť na získanie informácii, ktoré možno využiť pri syntéze oligopeptidov. O tomto je k dispozícii rozsiahla literatúra. Peptidy, syntetizované pomocou reťazcov DNA boli pripravené a použité na rad účelov, napríklad pre biologické a imunologické štúdie, ako bolo opísané v Lemer a ďalší, Celí, 23, 309 až 310, 1981, Lemer, Neture 299, 592-596, 1982. Použitie pre vakcináciu bolo opísané v Shinnick a ďalší, Ann. Rev. Microbiol. 37, 425-446, 1983, DiMarchi a ďalší, Science 232, 639-641, 1986. Všeobecná príprava peptidov alebo kombinácia peptidov je teda známa.

Ďalej je známe použitie nukleových kyselín a reťazcov, získaných pomocou týchto kyselín, na prípravu hybridizačných sond, napríklad na použitie pri zisťovaní vírusovej RNA u kliešťov alebo v krvnom sére (Meinkoth a Wahl, Anal.Biochem 138, 267-284, 1984, Kulski a Norval, Árch. Virol. 83, 3-15, 1985). Tieto sondy je možné pripraviť buď tecluiológiou pri použití rekombinantnej DNA alebo chemickou syntézou oligonukleotidov na základe požadovaného reťazca.

Vynález bude objasnený nasledujúcimi príkladmi. Ak nie je výslovne uvedené inak, vykonávajú sa jednotlivé postupy spôsobom, ktorý je sám osebe známy. Tieto postupy je možné nájsť v rade štandartných publikácií, vrátane publikácie Sambrook, Fritsch a Maniatis Mole-cular Cloning: A Labolatory Manuaľ' (2. vydanie), Cold Spring Harbor Labolatory Press, 1989.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Propagácia a čistenie vírusu TBE.

10% suspenzie vírusu TBE vo forme infikovaných mozgov infantilných myši bolo použití na infekciu primárnych buniek kuracích embryí v jednej vrstve, udržovaných na minimálnom základnom prostredí aMEM s prísadou pufra 15 inM Hepes a 15mM EPPS s pH 7,6. Po 40 hodinách inkubácie pri teplote 37®C bol supematant vyčerený odstredením pri 10 000 g počas 30 minút pri teplote 4°C a vírus bol usadený ultraodstredením pri 50 000 g počas 3 hodín pri teplote 4®C. Potom bol vírus znovu uvedený do suspenzie v príslušnom objeme pufra TNA (0,05 M trietanolamínu, 0,1 M chloridu sodného s pH 8,0) a potom bol materiál podrobený zonálnemu odstredeniu v sacharózovom gradiente 5 až 20 % hmotnostných pri 17 777 g celkom 110 minút pri teplote 4°C. Najväčšia koncentrácia vírusu bola potom stanovená sledovaním garientu pri 254 nm, načo bol materiál znovu odstredený v 20 až 50% sacharózovom gradiente na dosiahnutie rovnovážneho stavu 18 hodín pri teplote 4’C a pri 15 000 g. Potom bol vírus dialyzovaný proti pufra TAN pri pH 8,0 na odstránenie prebytku sacharózy.

Príklad 2 Príprava RNA vírusu.

100 pg čisteného vírusu sa zriedi na 400 ul pridaním pufra pre reakciu s proteinázou K ( 10 mM tris s pH 7,8m 5 mM EDTA, Ô, 5 % SDS). Proteináza K sa pridá do konečnej koncentrácie 200 pg/ml a zmes sa hodinu inkubuje pri teplote 37°C. Potom sa roztok de proteinizuje tak, že sa dvakrát extrahuje rovnakým objemom (400 ul) fenolu a potom ešte raz chloroformom a izoamylalkoholom v pomere 24 : I, potom sa pridá 26 ul 2M roztoku octanu sodného a RNA sa vyzráža pridaním 2,5 objemu etanolu. Pred ďalším použitím sa podiel RNA denaturuje glyoxalom a potom sa podrobí elektroforéze na agarózovom géle na kontrolu výťažku a kvality získaného materiálu. Príklad 3

Syntéza cDNA s dvojitým reťazcom.

pg RNA, vyzrážanej etanolom sa znovu uvedie do suspenzie v 40 ul pufra pre syntézu prvého reťazca (Amersham, UK) s obsahom 5 pg náhodne volených oligonukleotidových primárov, zmes sa zahreje na 70°C na 1 minútu a potom sa nechá pomaly schladiť na teplotu miestnosti. Potom sa pridajú všetky štyri deoxynukleotidtrífosfáty do konečnej koncentrácie 1 mM. Okrem toho sa ku zmesi pridá 5 jednotiek inhibítora ribonukleázy z ľudskej placenty a 10 uCi -a dCTP. Syntéza prvého reťazca sa začne pridaním 100 jednotiek reverznej transkriptázy (Amersam) a reakcia sa nechá prebiehať 2 hodiny pri teplote 42°C. Potom sa reakčná zmes uloží do ľadu a reakčné zložky pre tvorbu drahého reťazca sa pridajú v tomto poradí: 93,5 ul pufra pre syntézu druhého reťazca (Amersam, UK), 4 jednotky ribonukleázy H, 23 jednotiek DNA - polymerázy z E. coli a voda do konečného objemu 250 ul. Syntéza druhého reťazca sa vykonáva následnou inkubáciou pri 12°C (každé dve hodiny) a potom sa zastaví zaliriatim roztoku na 20 minút na teplotu 70°C. Potom sa cDNA s dvojitým reťazcom rozštiepi pôsobením 10 jednotiek T4 DNA - polyinerázy 30 minút pri teplote 37°C pre vznik vhodných zakončení. Potom sa cDNA čistí extrakciou fenolom a chloroformom a vyzráža dvoma objemami etanolu. Príklad 4

Väzba pomocou väzbových reťazcov

Syntetické 5'-fosforylované väzbové reťazce BamHl (New England Biolabs) sa pridávajú k cDNA a reakcia sa nechá prebiehať cez noc pri teplote 12°C. Reakčná zmes obsahovala v konečnom objeme 200 ul pufra pre uskutočnenie väzby (50 mM tris o pH 7,5, 5 mM MgCb, 5 mM DTT, 1 mM ATP) približne 1 pg cDNA, 1 pg väzbovej DNA a 1 ul T4 DNA-ligázy (New England Biolabs).

Príklad 5 Frakcionácia cDNA podľa veľkosti.

cDNA bola frakcionovaná na 1% agarozovom géle. Frakcie s rôznou veľkosťou boli z gélu vykrojené a DNA bola extrahovaná z agarózy elektroelúciou v analytickom zariadení na tento účel (Π3Ι) podľa pokynov výrobcu. Napriek tomu, že množstvo DNA bolo veľmi malé, takže ho bolo iba s ťažkosťami možné preukázať farebným etídiumbromídom, bolo možné extrakciu ľahko sledovať vzhľadom na rádioaktívne označenie DNA. Frakcionačný stupeň je teda prostriedkom na získanie veľkých frangmentov cDNA vhodných pre selektívne klonovanie a tiež umožňuje cDNA úplne oddeliť od nenaviazaných väzbových reťazcov.

Príklad 6 Klonovanie v bakteriálnom plazmide.

cDNA bola rozštiepená pôsobením 10 jednotiek reštrikčnej endonukleázy BamHl, reakcia trvala 1 hodinu pri teplote 37°C. Po extrakcii fenolom a chloroformom bola DNA vyzrážaná 2 objemami etanolu

SK 277781 Β6 a znovu uvedená do suspenzie v malom objeme vody. Potom bolo 20 až 30 ng cDNA zmiešané s 50 mg fagemidu Bluescript SK- (Stratagene), ktorý bol linearizovaný rozštiepeným enzýmom BamHI (výraz Bluescript je obchodná značka). Tieto dve zložky boli na seba naviazané pôsobením T4 DNA-ligázy v 10 ul vyššie uvedeného pufra pre väzbu cez noc pri 16°C. Nasledujúce ráno bola zmes zahriata na 5 minút na 65°C, a zriedená 100 x vodou a použitá na transformáciu buniek E. coli XL1 (Blue). Kompetentné baktérie boli získané od firmy Stratagene a transformované v 3 ul zriedenej zmesi pre väzbu presne podľa návodu výrobcu. Baktérie boli nanesené na LB agarovej platne s obsahom ampicilinu, tetracyklínu, IPIG a X-Gal.

Príklad 7 Identifikácia fagemidov s obsahom včleneného reťazca

V systéme Bluescript nadobúdajú fagemidy s včleneným reťazcom biele sfarbenie bakteriálnych kolónií, ale navzájom viazané fagemidy poskytujú modro sfarbené kolónie. Tieto biele kolónie boli izolované a použité na naočkovanie 2 ml prostredia LB s obsahom ampicilinu a boli pestované cez noc pri 37“C na trepačke pri 220 otáčkach za minútu. Nasledujúceho dňa bol rýchle pripravený plazmid štandartným spôsobom pri použití varu podľa publikácie Bimboim a Doly, Nucleic Acids Research 7, 1195-1204, 1979. Plazmidy boli rozštiepené reštrikčným enzýmom BamHI a analyzované na 1% agarózovotn géle. Jeden z klonov, ktorý bol týmto spôsobom identifikovaný, bol flagemid BS 17-6, ktorý nesie včlenenú časť, špecifickú pre vírus, v dĺžke približne 2 000 bp. Na obr. 1 je znázornený na 1% agarózovotn géle takto pripravený plazmid BD 17-6 ako v cirkulámej forme, tak vo forme po rozštiepení enzýmom BamHI.

Príklad 8

Analýza reťazca včlenenej časti v klone BS 17-6.

DNA s jednoduchým reťazcom klonu BS 17-6 bola pripravená pridaním pomocného fágu VCS (Stratagene) v pomere 20 : 1 k exponenciálne rastúcej kultúre Baktérií E. coli XLl(Blue) s obsahom BS 17-6. Zmes sa energicky mieša 16 hodín pri teplote 37°C a potom zo supernatantu čisti ssDNA známym spôsobom. DNA s jednoduchým reťazcom sa analyzuje z celej oblasti včlenenej časti postupom podľa publikácie Sanger a ďalší, PNAS USA 74, 5463-5467, 1977 pri použití enzýmu Sequanázy ( United States Biochemicals) a reakčných činidiel, dodaných výrobcom. (Výraz Sequenáza je obchodný názov). Oligonukleotidy, špecifické pre vírus a pre vektor, boli použité ako priméry pre analýzu reťazca. Úplný reťazec včlenenej časti 17-6 je znázornený na obr. 2. Príklad 9

Odvodenie reťazca aminokyselín bielkoviny NS1.

Translácia nukleotidového reťazca klonu BS 17-6 vo všetkých smeroch objavila iba jedinú možnosť správnej translácie dlhšieho reťazca. Reťazec aminokyselín, odvodený týmto spôsobom, bol porovnávaný s reťazcami pre ďalšie flavivirosy, ktoré boli uvedené v publikáciách Rice a ďalší, Science 229, 726-733, 1985, Coia a ďalší, J. Gen. Virol. 69, 1-21, 1988, Chatnbers a ďalší, Virology 169, 100 až 109, 1989. Pre tieto analýzy bol užitý software Beckman MICROGENIE (verzia 4,0) na IBM osobnom počítači. Výraz MICROGENIE je obchodný názov. Analýza preukázala, že kloň 17-6 obsahuje úplný kódový reťazec pre bielkovinu NS-1 a časti kódového reťazca pre bielkovinu E a NS2A, ktoré ohraničujú gén NS 1 proti genómu flavivírusu.

Na obr. 3 je znázornený reťazec RNA a reťazec ami nokyselín; pre ktoré je tento reťazec kódom, odvodený od klonu 17-6. Aminoterminálne zakončenie NS1 je zrejme uvoľnené btuiečnou signalázou, karboxytenninálne zakončenie enzýmom, podobným signaláze. Dlhšia forma bielkoviny NS1, ktorá obsahuje tiež aminotermi-nálne zakončenie bielkoviny NS2A bola pozorovanáMasonom a ďalšími ( Virology 158, 361-372, 1987). Karboxyterminálnu formu tejto bielkoviny NS1 je možné uvoľniť pre vírus špecifickou proteázou alebo bunečnou signalázou podľa publikácie Rice a ďalší, Science 229, 726-733, 1985. Aminoterminálne zakončenie a tri možné karboxytenninálne zakončenia sú znázornené na obr. 3. Karboxytenninálne zakončenie, uvoľnené enzýmom, podobným signaláze ( Chambers a ďalší, Virology 169, 100-109, 1988) je opísané ako COOH-Terminus 1, karboxytenninálne zakončenie, ktoré je pravdepodobne tvorené pre vírus špecifickou proteázou, je označené COOH-Tenninus 2 a potenciálne karboxytenninálne zakončenie, uvoľnené bunečnou signalázou, je znázornené ako COOH-Terminus 3. Čísla polôh, uvedené na obr. 3 odpovedajú plnej dĺžke genómu vírusu TBE.

Na obr. 4 je znázornený reťazec aminokyselín bielkoviny NS1, odvodený od reťazca klonu 17-6. Možné COOH-terminálne zakončenia sú označené rovnako ako na obr. 3. Číselné označenie polohy je počítané od prvej aminokyseliny bielkoviny NSI. Na obr. 4 je rovnako znázornené umiestnenie troch potencionálnych miest pre N-glykozyláciu, ktoré sú prítomné v bielkovine NSI vírusu.

Príklad 10

Klonovanie oblastí, ktorá je kódom pre NSI v prokaryotickom vektore pre expresiu.

Nukleotidový reťazec, ktorý je kódom pre bielkovinu NSI, sa podrobí subklonovaniu z klonu 17-6 do plazmidu pUC19S. Vektor pUC19S je derivát plazmidu pUC19, ktorý obsahuje stop-väzbový reťazec s obsahom stop kodónu TAG vo všetkých troch reťazcoch, klonovaných v mieste štiepenia BamHI. Reťazec pre NSI, ktorý obsahuje malú časť reťazca pre bielkovinu NS2a na svojom 3'-tenninálnom zakončení sa vyberie pôsobením reštrikčnej endonukleázy Cfol a zakončenie sa upraví pôsobením Sl-nukleázy. Vektor pUC19S pre klonovanie sa linearizuje v polyväzbovej oblasti pôsobením Sali a zakončenie sa vyplní T4-DNA-polymerázou (obr. 5). Väzba vektora a včleneného reťazca dáva vznik miestu pôsobenia enzýmu Sali, a tým sa viaže reťazec pre bielkovinu NSI na gén lacZ v správnom poradí (Obr. 6A a 6B). Na 3'-terminálnom zakončení je reťazec pre bielkovinu NS 1 ohraničený prokaryotickými stop signálmi pre transkripciu a transláciu, ktoré sú obsiahnuté vo vektore, plazmid je označený pNS1387.

Príklad 11

Klonovanie kódovej oblasti pre NSI vrátane 5'proximálneho zakončenia hydrofóbneho signálneho reťazca pri použití PCR.

Aby bolo možné konštruovať indukovateľný prokaryotický plazmid pre expresiu s obsahom kódovej oblasti pre NSI vrátane autentického signálneho reťazca bol prenesený fragment plazmidu pSCtSNS1444 po štiepení enzýmom Sali (Príklad 13) do plazmidu pUC19S, čím bol získaný kloň ptSNS1682. Aby bolo možné uložiť gén pre NSI do správnej polohy vzhľadom na gén lacZ, bol kloň ptSNS1682 rozštiepený enzýmom HindlII, zakončenia boli upravené pomocou SI -nukleázy a znovu naviazané za vzniku klonu ptSNS1791 s vypustenými 4 nukleotidmi, ako je znázornené na obr. 7a a 7b.

Príklad 12

Konštrukcia plazmidu pre rekombináciu vo víruse vaccinia: reťazec pre bielkovinu NS1 pod riadením promótora W-pl l(L).

Kódová oblasť pre bielkovinu NS1, napríklad z príkladu 10 sa podrobí subklonovaniu v mieste štiepenia enzýmom Sali plazmidu pTKgpFls ( Falkner G.F. a Moss B., J. Virol 62, 1849-1854, 1988). Reťazec pre NS1 sa uloží v správnom zmysle vzhľadom na kodón ATG pre počiatok translácie vo vektore. Translačný stop signál je rovnako obsiahnutý vo vektore. Polyväzbová oblasť vektora je príčinou pridania 7 aminokyselín na 5-zakončení a 10 aminokyselín na 3'-zakončeni. Stratégia klonovania a hraničné oblasti bielkoviny sú znázornené na obr. 8a a 8b. Plazmid bol označený PAPNS1338.

Príklad 13

Konštrukcia plazmidu pre rekombináciu vo víruse vaccinia: reťazec pre bielkovinu NS1 s prírodným signálnym reťazcom pod riadením promótora VV-p7.5(E/L)

Reťazec nukleotidov s obsahom kódovej oblasti pre bielkovinu NS1 s jej signálnym reťazcom sa syntetizuje pomocou PCR pri použití klonu 17-6 ako templátu. Chemicky sa syntetizujú dva oligonukleotidy so štiepnymi miestami pre reštrikčné endonukleázy EcoRI a Sali na 5'-zakončení a Sali a Hpal na 3'-zakončeni, tieto oligonukleotidy sa použijú ako priméry pri PCR ( obr. 9A a 9B). Amplifikovaný fragment NS1 sa čisti na agarózovom gele ( obr. 10) po štiepení Sali a potom sa klonuje v mieste štiepenia Sali vektora pSCl 1-Orth po malých modifikáciách. Plazmid pSCl 1-Orth bol uložený vo verejnej zbierke D.S.M., Braunschweig, SRN pod číslom DSM 5734 dňa 15. januára 1990. Stratégia klonovania a reťazce na 3'- a 5'- zakončení novej konštrukcie sú uvedené na obr. 11 a 12. Analýza reštrikčných fragmentov klonu na agarózovom gele potvrdzuje správnu orientáciu včlenenej časti, ako je zrejmé z obr. 13. Plazmid bol označený pSCtSNS1444.

Príklad 14

Konštrukcia plazinidov pre rekombináciu vo víruse vaccinia: Reťazec pre bielkovinu NS1 s pôvodným signálnym reťazcom pod riadením promótora VV-pl 1 (L).

Plazmid pTKtSNS 1556 je výsledkom subklonovania reťazca pre NS1 z klonu pSCtSNS1444 vo vektore pTKgpíF3s (Falkner a Moss, J. Virol. 62, 1849-1854, 1988). Reťazec pre NS1 sa vyberie použitím enzýmu Sali a včlení sa do miesta štiepenia enzýmom Sali v plazmide pTKgptF3s. Stratégia klonovania a reťazec nukleotidov pre plazmid pTKtSNS 1556 je znázornený na obr. 14 a 15. Všetky plazmidy sa pestujú pri použití selekcie ampicilínom v množstve 100 pgánl v E. coli, kmeňoch DK1, BH101 alebo JM ako v hostiteľovi (JM105, JM83).

Príklad 15

Vytvorenie rekombinantov vírusov vaccinia pre expresiu bielkoviny NS1.

Rekombinantné vírusy sa získavajú štandardným spôsobom (Mackett M., Smith G. a Moss B.: DNA Cloning: A Practical Approach, str. 191-121 ,ed. D.M. Glover, Oxford: IRL Press). DNA plazmidu pSCtSNS1444 a plazmidu pTKtSNS 1556 sa podrobí transfekcii v bunkách CV-1, infikovaných vírusom vaccinia, divokým typom. Rekombinant varecNS1444, odvodený od plazmidu pSC 11-Orth sa podrobí selekcii na BuDR v bunkách

143tk. Rekombinant varecNS1556, odvodený od pTKgptFs sa izoluje selekciou gpt v bunkách CV-1. Všetky rekombinanty boli čistené trikrát vo forme plakov. Správna organizácia rekombinantov bola zistená analýzou Southem blot (Obr. 16).

Príklad 16

Expresia bielkoviny NS1 v bunkách CV-1, infikovaných rekombinantmi vírusu vaccinia.

Bunky CV-1 sa infikujú rekombinantami varecNS1444 a varecNS1556 vírusu vaccinia. Dva dni po infekcii sa bunky označia metionínom, označeným ~'·Έ počas 4 hodín. Bielkoviny sa oddelia na 12 % SDSpolyakrylamidovom géle s denaturačným účinkom a identifikujú autorádiograficky. Pás bielkoviny, zodpovedajúci očakávanej relatívnej molekulovej hmotnosti približne 48 888 je možné oddeliť. Tento pás nie je obsiahnutý v bunkách divokého typu vírusu alebo v rekombinantoch vírusu typu varec 1 342, ako je znázornené na obr. 17.

Claims (21)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Peptid alebo polypeptid, vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje aspoň časť reťazca aminokyselín bielkoviny NS-1 západného subtypu vírusu TBE.
2. 2. Peptid alebo polypeptid podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že obsahuje reťazec aminokyselín, znázornený na obr.4.
3. 3. Bielkovina NS-1 západného subtypu vírusu ΓΒΕ podľa nároku 1.
4. 4. Bielkovina alebo polypeptid podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že obsahuje reťazec aminokyselín, ktorý sa líši od reťazca prírodnej bielkoviny NS-1 na základe mutácie alebo transpozície v rámci bežných variácií západného subtypu vírusu TBE.
5. 5. Bielkovina, peptid alebo polypeptid podľa nároku 1 až 4 pre použitie v lekárstve.
6. 6. Vakcína, vyznačujúca sa tým, že obsahuje peptid, polypeptid alebo bielkovinu podľa nárokov 1 až 4 a jednu alebo väčší počet ďalších zložiek, prijateľných z farmaceutického hľadiska.
7. 7. Diagnostické činidlo, vyznačujúce sa t ý m , že obsahuje peptid, polypeptid alebo bielkovinu podľa nárokov 1 až 4.
8. 8. Nukleová kyselina, vyznačujúca sa tým, že je kódom pre peptid, polypeptid alebo bielkovinu podľa nárokov 1 až 4.
9. 9 Živá vakcína, vyznačujúca sa t ý m , že obsahuje nukleovú kyselinu podľa nároku

   8.
10. 10. Sonda, vyznačujúca sa tým,že obsahuje nukleovú kyselinu podľa nároku 8.
11. 11. Nukleová kyselina, vyznačujúca sa t ý m , že hybridizuje s reťazcom DNA znázorneným na obr. 3.
12. 12. Nukleová kyselina podľa nároku 8, vyznačujúca sa tým.že obsahuje reťazec z nároku 8.
13. 13. Nukleová kyselina podľa nároku 8, vyznačujúca sa tým,že jej reťazec sa líši od reťazca molekuly DNA, ktoré zodpovedajú alebo sú komplementárne s prírodným reťazcom RNA pre bielkovinu NS-1 v dôsledku degenerácie genetického kódu a/alebo mutácie a/alebo transpozície v rámci bežných variácií západného subtypu vírusu TBE.
14. 14. Nukleová kyselina podľa nároku 8 až 13, vyznačujúca sa tým,že je viazaná na ďalšie reťazce nukleových kyselín.
15. 15. Nukleová kyselina podľa nároku 14, vyz- načujúca sa t ý m , že ide o DNA, pričom 5 pridané reťazce umožňujú replikáciu a expresiu molekuly DNA v bunečnej kultúre a s výhodou obsahujú reťazce, ktoré majú funkciu promótora, podporného reťazca, polyadenylačného signálu a/alebo signálu pre štiepenie. 10
16. 16. Vektor, napríklad plazmid, vírus alebo fág, vyznačujúci sa tým,že obsahuje nukleovú kyselinu podľa nároku 8 až 15.
17. 17. Vektor podľa nároku 16, vyznačujúci sa t ý m , že je odvodený od vírusu vaccinia. ' 5
18. 18. Vektor podľa nároku 16, vyznačujúci sa t ý m , že je odvodený od bakteriálneho plazmidu.
19. 19. Hostiteľská bunka, vyznačujúca sa t ý m , že obsahuje vektor podľa nároku 16, 17 alebo

    18. ²⁰
20. 20. Kultúra buniek, vyznačujúca sa t ý m , že obsahuje hostiteľské bunky podľa nároku 19.
21. 21. Kultúra buniek podľa nároku 20, vyznačujúca sa t ý m , že ide o bunečnú kultúru buniek cicavcov.