PT90436B - Metodo para a producao de uma estirpe de levedura e metodo para a priducao de uma proteina heterologa para levedura - Google Patents

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo presente invento diz respeito a um novo método para a produção de proteínas heterologas, incluindo a utilização de certas estirpes de leveduras trans formadas deficientes em protases. 0 invento também diz respeito ao método para a produção das referidas estirpes de levedura transformadas.

CIBA-GEIGY AG e UCP GEN-PHARMA AG.

MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA ESTIRPE DE LEVEDURA E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA HETERÓLOGA PARA LEVEDURA

método para a produção das referidas proteínas heterólogas consiste em se cultivar uma estirpe de levedura sem actividade de carboxipeptídase, ysc-χ e que foi transformada com um vector híbrido compreendendo um promotor de levedura operacionalmente ligado a uma sequência de DNA codificadora da referida proteína heteróloga, e se isolar a referida proteína heteróloga.

Melhoramento na produção de polipeptídeos

O invento insere-se no campo da tecnologia de DNA recombinante e diz respeito a um método melhorado para a preparação de polipeptídeos com o auxílio de células de levedura submetidas a engenharia genética, às referidas células de levedura sujeitas a engenharia genética e a métodos para a preparação das referidas células de levedura .

Recentemente um grande número de proteínas heterólogas têm sido expressas em levedura após transformação de células de levedura com vectores de expressão adequados compreendendo sequências de DNA codificadoras das referidas proteínas , como seja e.g. -interferão /IFN^/ , Hitzeman et al (1981) Nature 294, 717-7227, lisozima / Oberto et al . , (1985 ) Gene 40 , 57-657, X -amilase / Sato e t al. , (1986) Gene 50, 247-2577, activador do plasminogénio tipo tecido / t-PA, Pedido de Patente Europeia, N° 143.0817 ou dessulfato-hirudina / Pedido de Patente Europeia NQ 225.6337. Em muitos casos no entanto, as proteínas heterólogas não são sintetizadas na forma pura, mas como uma mistura contendo proteínas parcialmente degradadas com por exemplo encurtadas no extremo C. Por exemplo, a expressão do peptideo natriurético atrial humano (hANP) em levedura resultou na secreção de duas formas de hANP maduro diferindo no seu extremoC /“Vlasuk et al . , (1986 ) J. Biol. Chem 261, 4798-47967- A forma principal tinha os dois últimos aminoácidos da proteína (Argl50 e Tirl51) enquanto a forma menor constituiu o material de tamanho completo. Resultados semelhantes foram obtidos após a expressão do factor de crescimento epidérmico (EGF) em levedura / George-Nascimento et al (1988) Biochemistry 2 7, 797-8027 onde os produtos de expressão secretados eram heterogéneos no sentido de o último (Arg53) ou os dois últimos aminoácidos (Leu52 e Arg53) faltarem e não se produzir EGF de tamanho completo.

Um polipeptideo que muito recentemente ganhou considerável atenção por parte dos biólogos moleculares é a hirudina, um agente anticoagulante que ocorre naturalmente nas sanguessugas (Hirudo medicinalis). A hirudina não é uma espécie polipeptídica única mas antes uma classe de polipeptídeos com actuação semelhante consistindo em pelo menos quatro representantes designados variante de hirudina 1 (HV1), variante de hirudina2 (HV2) /cf. Pedido de Patente Europeia NS 158.5647 variante de hirudina PA /_ cf. Pedido PCT NS 86/034937 θ des-(Vai)2~hirudina / cf. Pedido de Patente Europeia NS 158.9867 As variantes diferem na estrutura umas das outras por uma série de aminoácidos (especiaimente a sequência amino-terminal do HV1 é Val-Val-Tir, a do HV2 e do PA é Ile-Tre-Tir e asda des-(Vai)2~hirudina é Tre-Tir) mas possuem em comum uma acumulação de aminoácidos hidrofóbicos no extremo N e de aminoácidos pola6 3 res no extremo C, um resíduo tirosina (Tir ) presente como monoéster de sulfato, três pontes dissulfureto e a actividade anticoagulante.

Recentemente cDNAs e genes sintéticos codificadores de variantes de hirudina foram clorados e expressos em hospedeiros microbianos. No entanto os produtos de expressão não possuem o grupo monoéster de sulfato na ΤΪΓθ^- _e foram portanto designados dessulfato-hirudinas eles apresentam aproximadamente a mesma actividade biológica das hirudinas sulfatadas normais. A variante de dessulfato-hirudina HV1 foi expressa em Escherichia coli /Pedidos de Patente Europeia NS 158.564 e 168.3427 θ eni Succharomyces ce revisiae / Pedido de Patente Europeia NS 168.342, 200.655, 225.633 e 252.8547. De um modo semelhante a dessulfato-hiru dina HV2 foi expressa em Escherichia coli / Pedido de Patent Europeia NQ 158.5647 e em Saccharomyces cerevisiae / Pedido de Patente Europeia NQ 200.655, Pedido PCT NS 86/012247 θ des-(Vai)2~dessulfato-hirudina foi expressa em EL coli / Pedido de Patente Europeia NS 158.4867.

Geralmente, a eficácia de expressão e rendimento dos compostos de hirudina são superiores quando se escolhe S. cerevisiae como microorganismo hospedeiro. No entanto, independentemente da estirpe hospedeira específica de levedura usada no precedente de expressão é uma mistura heterogénea de espécies de dessulfato-hirudina diferindo uma das outras na sequência C-terminal. Por exemplo encontrou-se que os caldos de cultura obtidos a partir de estirpes de levedura em cultura compreendendo o gene da variante de hirudina HV1 contém dessulfato-hirudina HVl consideravelmente # 65 contaminado com análogos sem o aminoácido C-terminal Gin ou

- . , . . 64 „.65 os ammoacidos C-terminais Leu e Glu

A separação de misturas contendo proteína de tamanho completo como seja dessulfato-hirudina, ' hANP ou EGF assim como seus derivados encurtados no extremo C, nos componentes individuais até à homogeneidade e trabalhoso e demorado. Considerando os custos verifica-se a necessidade de métodos melhorados que tornem possível a produção económica de proteínas homogéneas tais como a dessulfato-hirudina em levedura. Constitui um objectivo do presente invento proporcionar métodos para a produção de proteína heteróloga homogéneas em levedura.

Se bem que seja coidente que o isolamento de derivados de proteínas heterologas encurtadas no extremo C a partir dos caldos de cultura de estirpes de levedura transformadas contendo a correspondente sequencia de DNA codificadora das referidas proteínas seja devido à acção pós-tradução de proteases endógenas de levedura sobre o produto primário da expressão, e.g. dessulfato-hirudina interna, aís) protease(s) especifica(s) que é(são) responsável(eis) pela degradação C-terminal não foi(foram) até agora identificada(s). As proteases de levedura mais importantes envolvidas na degradação de proteínas em geral são endopeptídases yscA e yscB e exopeptídases yscY e yscS . A utilização de estirpes de levedura que são defectivas em actividade de pro-6-

tease A, Β, Υ se ao acaso de fato-hirudina. apreciáveis de tremo C.

e/ou S podem reduzir parcialmente a proteóliprodutos de genes estranhos tais como dessulNo entanto, ainda se observou quantidades proteínas sem um ou dois aminoácidos no exSurpreendentemente, encontrou-se que estirpes mutantes de levedura sem actividade de carboxipeptidase ysc/\ são incapazes de remover aminoácidos do extremo C de proteínas heterologas e portanto dão origem a proteínas integrais (autênticas). A carboxipeptidase ysc&< é uma exopeptidase associada a membrana e desempenha, como é bem conhecido, um papel importante na maturação do factor assassino e do factor de conjugação /^_cf. J.C. Wagner e D.H. Wolf (1987) FEBS Letters 221, 4237. Ele é o produto de expressão do gene KEXl. De acordo com os dados publicados / cf. Rendueles e D.H. Wolf (1988) FEMS Microbiol. Rev. 54, 17_7, a acção de ysc-xÇ está fortemente confinada aos resíduos de aminoácidos básicos C-terminais (Arg, Lis). Face a estes resultados e ao facto de os aminoácidos C-terminais da dessulfato-hirudina não serem b$icos (por exemplo, Glu e Leu na variante de dessulfato-hirudina HV1), é altamente surpreendentemente e um resultado inesperado que a utilização de estirpes mutantes de levedura sem actividade carboxipeptidicas ysc X torne possível a produção de dessulfato-hirudina homogénea sem ser necessário qualquer-separação tédia de análogos da dessulfato-hirudina encurtados na terminação C.

O mesmo parece ser verdadeiro para outras proteínas heterologas como por exemplo hANP, EGF ou o peptídeo activador de tecido conjuntivo-III /^-CTAP-III, Mullembach et al. (1980) J. Biol. Chem. 261, 719-7227 que podem ser produzidos na sua forma completa quando uma estirpe mutante de levedura sem actividade carboxipeptidase ysc é usada na transformação com um vector adequado.

Assim, o invento está relacionado com um método melhorado para a produção de uma proteína heteróloga para levedura numa forma homogénea compreendendo cultura de uma estirpe de levedura que não possui actividade de carboxipeptídase yscc/ e que foi transformada com um vector híbrido compreendendo um promotor de levedura operacionalmente ligado a uma sequência de DNA codificadora da referida proteína heteróloga e isolamento da referida proteína heteróloga.

Em particular, o invento relaciona-se com um método melhorado para a produção de uma proteína heteróloga para levedura numa forma homogénea compreendendo cultura da referida estirpe de levedura que foi transformada com um vector híbrido compreendendo um promotor de levedura operacionalmente ligado a uma primeira sequência de DNA codificadora de um peptideo sinal ligado na grelha de leitura correta a uma segunda sequência de DNA codificadora da referida proteína heteróloga e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição de levedura e isolamento da referida proteína heteróloga .

As proteínas heterólogas que podem ser produzidas pelo método melhorado de acordo com o invento são proteínas que são susceptíveis de degradação C-terminal pós-tradução por carboxipeptídase ysc «X após expressão em levedura. Tais proteínas heterólogas são caracterizadas por dois aminoácidos C-terminais seleccionados do grupo constituído por Lis, Arg, Tir, Ala, Leu, Gin, Asp, Asn e Ser As proteínas heterólogas preferidas são as mencionadas atrás especialmente a dessulfato-hirudina.

No seu aspecto mais preferido o invento relaciona-se com um método melhorado para a produção de dessulfato-hirudina compreendendo a cultura de uma estirpe de levedura sem actividade carboxipeptídase ysc χ e que

-β-

ίοι transformada com um vector híbrido compreendendo uma cassete de expressão da dessulfato-hirudina num promotor de levedura operacionalmente ligado a uma primeira sequência de DNA codificadora de um peptideo sinal ligado na grelha de leitura correcta a uma segunda sequência de DNA codificadora da dessulfato-hirudina e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição de levedura e isolamento da dessulfato-hirudina.

termo dessulfato-hirudina pretende englobar os compostos de dessulfato-hirudina descritos na literatura ou obtidos a partir de uma estirpe de microorganismo transformado contendo DNA que codifica uma dessulf ato-hirudina . Tais dessulfato-hirudina são, por exemplo, a variante da dessulfato-hirudina HV1, HV1 (modificada a, b),HV2, HV2 -(modificada a, b, c), PA, variantes de PA e des(Va^)-dessulfato-hirudina.

São preferidas as dessulfato-hirudina que possuem a fórmula

Xi

Tyr

Thr

Asp

Cys

Thr

Glu

Ser

Gly

Gin

Asn

Leu

Cys

Leu

Cys

Glu

Gly

Ser

Asn

Vai

cys

Gly

Gin

Gly

Asn

Xz

Cys

Ile

Leu

Gly

Ser

Asp

Gly

Glu

X3

Asn

Gin

Cys

Vai

Thr

Gly

Glu

Gly

Thr

Pro

Xu

Pro

Gin

Ser

Xs

Asn

Asp

Gly

Asp

Phe

Glu

Glu

Ile

Pro

Glu

Xe

(I) onde

a) X-^ representa o resíduo dipeptídico Val-Val e X^, e

X4 são Lis, Xç. é His e Χθ é o resíduo peptidico Glu-Tir-Leu-Gln (HV1), ou

b) %2 θ He ^ou Glu e X^ e X^-Xg são como definidos em a) (HV1 modificada a) ou

c) X^ é Ile ou Glu e X^, X^ ^e X^-Xg são ⁰³⁰¹⁰ definidos em a) (HV1 modificada a) ou

d) X^ é Ile ou Glu e X-^-Xg e Xg e Xg são como definidos em

a) (HV1 modificado a) ou

e) Xç- é Leu ou Asp e X^-X^ θ Xg são como definidos em a) (HV1 modificada a) ou

f) Xg é seleccionada do grupo constituído por Glu-Tir,

Glu-Tir-Leu, Glu-Asp-Leu-Gln, Glu-Glu-Leu-Gln, Glu-Tir-Lis-Arg Glu-Asp-Lis-Arg, Glu-Lis-Leu-Gln, Ser-Fen-Arg-Tir, Trp-Glu-Leu-Arg, Glu-Tir-Leu-Gln-Pro e Glu-Tir-Leu-Gln-Arg e X^ e

Xç. são como definidos em a) (HV1 modificada b) ou

g) em gue X^ içresenta Tre e ^2^-^6 ^S^° ^como definidos em a) (des(Va^)-dessulfato-hirudina ) , ou tendo a fórmula

Yl

Tyr

Thr

Asp

Cys

Thr

Glu

Ser

Gly

Gin

Asn

Leu

Cys

Leu

Cys

Glu

Gly

Ser

Asn

Vai

Cys

Gly

Lys

Gly

Asn

Lys

Cys

Ile

Leu

Gly

Ser

Asn

Gly

Lys

Gly

Asn

Gin

Cys

Vai

Thr

Gly

Glu

Gly

Thr

Pro

Yz

Pro

Glu

Ser

His

Asn

Asn

Gly

Asp

Phe

Glu

Glu

Ile

Pro

Glu

Glu

Ϊ3

Leu

Gin

(II) onde

a) Y-^ representa o resíduo dipeptídico N-terminal Ile-Tre, Y2 é Asn e Y3 é Tir (HV2) ou

b) Y2 é Lis, Arg ou His e Y^ e Y^ são como definidos em a) (HV2 modificado a) ou

c) Y^ é Glu ou Asp e Y-j_ e Y2 são como definidos em a) (HV2 modificado b) ou

d) em que y representa o residuo dipeptídico N-terminal Val-Val e Y ^e Y3 são como definidos em a) (HV2 modificado

c) , ou tendo a fórmula

Ile	Thr	Tyr	Thr	Asp	Cys	Thr
Leu	Cys	Glu	Gly	Ser	Asn	Vai
Ile	Leu	Gly	Ser	Gin	Gly	Lys
Glu	Gly	Thr	Pro	Lys	Pro	Gin
Glu	Pro	Ile	Pro	Glu	Asp	Ala

Glu	Ser	Gly	Gin	Asn	Leu	Cys
Cys	Gly	Lys	Gly	Asn	Lys	cys
Asp	Asn	Gin	Cys	Vai	Thr	Gly
Ser	His	Asn	Gin	Gly	Asp	Phe
Tyr	Asp	Glu

(III) (PA) e variantes do referido um encurtamento da estrutura no extremo N ou em 18 , 10, 9 extremo C.

PA que são caracterizados por primária em 1 ou 2 aminoácidos ou 4 ou 2 aminoácidos no

Os compostos de dessulfato-hirudina mais preferido é o da fórmula I em que Χ^-Χθ são como definidos em a) .

dura e os cifiçados

As constituintes dos abaixo.

estirpes hospedeiras de levevectores híbridos são os espeAs estirpes de levedura transformadas foram cultivadas usando métodos conhecidos.

Assim, as estirpes de levedura transformadas de acordo com o invento, foram cultivadas num meio líquido contendo fontes assimiláveis de carbono, azoto e sais inorgânicos.

Podem ser usadas várias fontes de carbono. São exemplos de fontes de carbono preferidas os açúcares assimiláveis, tais como glucose, maltose manitol, frutose ou lactose ou um acetato como seja acetato de sódio, que podem ser usados sozinhos ou em misturas adequadas. Fontes de azoto adequadas incluem, por exemplo, aminoácidos, tais como casaminoácidos, peptideos e proteínas e seus produtos de degradação, como seja triptona, peptona ou extractos de carne, ainda extracto de levedura, extracto de malte, melaço de milho, assim como sais de amónio, comoseja cloreto, sulfato ou nitrato de amónio que podem ser usados sozinhos ou em misturas adequadas. Os sais inorgânicos que podem ser usados, incluem, por exemplo, sulfatos, cloretos, fosfatos e carbonatos de sódio, potássio, magnésio e cálcio. Em adição, o meio nutritivo pode também conter substâncias promotoras do crescimento. Substâncias que promovem o crescimento incluem, por exemplo, micronutrientes, como seja fer ro, zinco, manganês e similares ou aminoácidos individuais.

Devido à incompatibilidade entre o DNA de dois-micron endógeno e os vectores híbridos portadores do seu replicão, as células de levedura transformadas com tais vectores híbridos tendem a perder estes últimos. Tais células de levedura têm de ser cultivadas em condições selectivas, i.e. condições que requeiram a expressão de um gene codificado pelo plasmideo para crescerem. A maior parte das marcas selectivas correctamente usadas e presentes nos vectores híbridos de acordocom o invento (infra) são genes codificadores de enzimas da biossíntese de aminoácidos ou purinas. Isto como necessário usar meios mínimos sintéticos deficientes no correspondente aminoácido ou base puina No entanto, também podem ser usados genes que conferem resistência a um biocida adequado Γe .g. um gene que confere' resistência ao aminoglicosido G4187- As células de levedura transformadas com vectores contendo genes de resistência a antibióticos foram cultivadas em meios complexos contendo o correspondente antibiótico pelo que se atingem velocidades

-13de crescimento mais rápidos e maiores densidades celulares.

Os vectores híbridos compreendendo o DNA de dois-microns completo (incluindo uma origem de replicação funcional) são estávelmente mantidos dentro de estirpes de Saccharomyces cerevisiae que não possuam os pias mídeos endógenos de dois-micron (as chamadas estirpes cir°) de modo que a cultura pode ser efectuada em condições de crescimento não selectivas, i.e. num meio complexo.

As células de levedura contendo plasmídeos híbridos com um promotor constitutivo (e.g.

ADHI, GAPDH) expressam DNA codificador de uma proteína heteróloga controlado pelo referido promotor sem indução . No entanto, se o referido DNA estiver sob o controle de um promotor regulado (e.g. PGK ou PHO5) a composição do meio de crescimento tem de ser adaptado para se obter níveis máximos de mRNA transcrito, i.e. quando se usa o promotor PHO5 o meio de crescimento deve conter uma concentração baixa de fosfato inorgânico para a descompressão deste promotor.

A cultura é efectuada empregando técnicas convencionais. As condições de cultura, tais como temperatura , pH do meio e tempo de fermentação são seleccionados de modo a que sejam produzidos níveis máximos, da proteína heteróloga. Uma estirpe de levedura escolhida é de preferência cultivada em condições aeróbicas em cultura submersa com agitação a uma temperatura de cerca de 25° a 35°C, de preferência a cerca de 28°C a um valor de pH de 4 a 7, por exemplo a aproximadamente pH 5 e durante pelo me nos 1 a 3 dias, de preferência enquanto se obtiverem produções satisfatórias de proteína.

As proteínas heterólogas expressas em leveduras podem ser acumuladas dentro das células ou

-14podem ser secretadas pra o meio de cultura. No caso do dessulf ato-hirudina independentemente da estirpe de levedura, do promotor e do peptideo sinal usado, a maior parte da proteína produzida é secretada para o meio de cultura enquanto que apenas uma pequena parte permanece associada à célula.

A proporção exacta (compostos secretados) compostos associados às células ) depende das condições de fermentação e do processo de recuperação aplicado. Em geral atinge cerca de 8:1 ou mais. Assim, a dessulfato-hirudina secreteda é sempre fortemente dominante.

A proteína heteróloga pode ser isolada a partir-do meio de cultura por meios convencionais.

Por exemplo o primeiro passo consiste geralmente na separação das células do meio de cultura por meio de centrifugação. 0 sobrenadante resultante pode ser enriquecido em proteína heterloga por tratamento com polietileneimida de modo a remover o material não proteico e precipitação das proteínas por saturação da solução com sulfato de amónio. As proteínas do hospedeiro, se presentes, podem ser também precipitados por meio de acidificação com ácido acético (por exemplo a 0,1%, pH 4-5). Um posterior enriquecimento em proteína heteróloga pode ser conseguido por extracção do sobrenadante com ácido acético usando n-butanol . Outros passos de purificação incluem, por exemplo, remoção do sal, processos cromatográficos, como seja cromatografia de permuta iónica, cromatografia de filtração em gel, cromatografia de pertição, HPLC, HPLC de fase reversa e similares. A separação dos constituintes da mistura 'de proteínas é também efectuada por diálise, de acordo com a carga por meio de electroforese em gel õu electroforese sem veículo, de acordo com o peso molecular por meio de uma coluna de Sephadex adequada, por exemplo cromatografia de afinidade, por exemplo com anticorpos, especiaimente anticorpos monoclonais ou com trombinas acoplada a um veículo adequado para cromatografia de afinidade ou por outros processos, especiaimente os conhecidos da literatura.

Se a proteína heterologa não for secretada ou se se pretender isolar qualquer proteína heteróloga adicional que esteja associada às células i.e. que se tenha acumulado intracelularmente ou no espaço periplasmático, são necessários alguns passos de purificação suplementares. Assim, no caso da proteína heterologa se ter acumulado dentro das células o primeiro passo para a sua recuperação consiste na sua libertação do interior da célula.

Na maior parte dos processos a parede celular é primeiro removida por digestão enzimática com glucosidases (infra). Subsequentemente, os esferoplastos resultantes são tratados com detergentes, como seja triton. Como alternativa também são adequadas para rebentar células forças mecânicas, como sejam forças de cisalhamento (por exemplo prensa X, prensa Francesa) ou agitação com esferas de vidro. No caso de a proteína heterologa ser secretada pelas células hos pedeiras para o espaço periplasmático, pode-se usar um protocolo simplificado. A proteína heterologa é recuperada sem lise celular por remoção enzimática da parede celular ou por tratamento com agentes químicos, e.g. reagentes de tiol ou EDTA, os quais danificam a parede celular permitindo a libertação do produto.

No caso da dessulfato-hirudina o teste com anticorpos anti-hindina ou anti-dessulfato-hirudina (por exemplo, anticorpos monoclonais obtidos a partir de células de hibridoma), o teste da trombina / M.V. Bergmeyer (ed.), Methods in Enzymatic Analysis, VolII, p. 314-316,

Verlag Chemie, Weinheim (FRG) 1983) 7 ou o teste da coagulação do sangue / F. Markwardt et al., (1982) Thromb. Haemost.

47, 2267 pode ser usado para detectar a actividade de hirudina em fracções obtidas no decurso do processo de purificação. Ensaios análogos conhecidos da literatura podem ser usados para detectar outras proteínas heterólogas.

As células hospedeiras de levedura transformadas de acordo com o invento podem ser preparadas

por técnicas DNA recombinante compreendendo os passos cé

- preparação de um vector híbrido compreendendo um promotor de levedura operacionalmente ligado a uma sequência de DNA codificadora de uma proteína heteróloga, especialmente um vector híbrido compreendendo um promotor de levedura operacionalmente ligado a uma primeira sequência de DNA codificadora de um peptídeo sinal ligado na grelha de leitura correcta a uma segunda sequência de DNA codificadora de uma proteína heteróloga e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição de levedura,

-caso seja necessário, obtenção de uma estirpe mutante de levedura gue' não possua actividade de carboxipeptidase ysc X

- transformação da estirpe mutante de levedura obtida com o referido vector híbrido.

- e selecção de células de levedura transformadas de entre células de levedura¹ ’ não transformadas.

Vectores de expressão

Os vectores híbridos de levedura de acordo com o invento compreendem um promotor de levedura operacionalmente ligado a uma seguência de DNA codificadora de uma proteína heteróloga. Os vectores híbridos preferidos compreendem um promotor de levedura operacionalmente ligado a uma primeira sequência de DNA codificadora de um peptideo sinal ligado na grelha de leitura correcta a uma segunda sequência codificadora de uma proteína heteróloga como seja dessulfato-hirudina e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição de levedura.

O promotor de levedura é um promotor regulado como seja o promotor PHO5 , MF.>( 1 ou GALl ou um promotor constitutivo. No caso da expressão da dessulfato-hirudina é preferido um promotor constitutivo. 0 promotor constitutivo de levedura de preferência deriva de um gene de levedura altamente expresso, como seja um gene codificador de uma enzima glicolítica, como seja o promotor dos genes de enolase, gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH 3-fosfoglicerato-cinase (PGK), hexocinase, piruvato-descarboxilase, fosfofrutocinase, glucose-6-fosfato-isomerase, 3-fosfoglicerato-mutase, piruvato-cinase, triosefosfato-isomerase , fosfoglucose-isomerase e glucocinase, ainda o promotor de ADHI ou de TRPI e um promotor encurtado da fosfatase ácida PHO5 que foi desprovido dos sítios de actividade a montante. É especialmente preferido o promotor GAPDH e seus fragmentos funcionais começando no nucleotídeo entre -550 e -180, em particular no nucleotídeo-540, -263 ou -198, e terminando no nucleotídeo45 do gene GAPDH e promotores constitutivos encurtados PHO5 começando no nucleotídeo entre -200 e -150, em particular em -173 e terminando no nucleotídeo-9 do gene PHO5.

A sequência de DNA codificadora de um peptideo sinal (sequência sinal) é de preferência

derivada de um genede levedura codificador de um polipeptídeo que normalmente é secretado. A sequência sinal da hirudina obtida a partir de DNA genómico de sanguessuga ou outras sequências sinal de proteínas heterologas , que são normalmente secretadas, também podem ser escolhidas. Sequências sinal de levedura são, por exemplo, as sequências sinal e prepro de genes da invertase de levedura, factor feromona-peptidase (KEX 1), toxina assâssina e genes, reprimíveis da fosfatase ácida (PHO5) e a sequência sinal da glucoamilase de Aspargillus awamori. Como alternativa, podem ser construídas sequências sinal fundidas por ligação de parte da sequência sinal (se presente) do gene naturalmente ligado ao promotor usado (por exemplo PHO5), com parte da sequência sinal da hirudina de uma outra proteína heteróloga. São favorecidas as combinações que permitem uma clivagem precisa entre a sequência sinal e e.g. a sequência de aminoácidos da dessulfato-hirudina. Sequências adicionais tais como sequências pro- ou espeçadoras que possam ou não ser portadoras de sinais de processamento específicos podem também ser incluídas nas construções para facilitar o processamento preciso de moléculas precursoras . Como alternativa, podem ser geradas proteínas fundidas contendo sinais de processamento internos que permitem a maturação correcta in vivo ou in vitro. Por exemplo, os sinais de processamento contendo um resíduo lis-Arg, que é reconhecido por uma endopeptidase de levedura situada nas membranas do' Golgi. De acordo com o presente invento as sequências sinal preferidas são as do gene PHO5 de levedura codificando um peptideo sinal tendo a fórmula

Met Phe Lys Ser Vai Vai Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ala Asn Ala, e do gene da invertase de levedura codificando um peptideo sinal tendo a fórmula

Met Leu Leu Gin Ala Phe Leu Phe Leu Ala Lys Ile Ser Ala.

Leu Ala Gly Phe Ala genómicas de uma artir de fontes roduzido a partir meio de processos per se .

Sequências de DNA proteína heteróloga podem ser isoladas a p naturais ou um DNA cópia (cDNA) pode ser p do correspondente mRNA complementar ou por químicos ou enzimáticos, de modo conhecido

Por exemplo, a sequência de DNA codificadora· da dessulfato-hirudina é conhecida ou pode ser isolada a partir de DNA genómico de sanguessuga ou um DNA complementar de cadeia dupla da dessulfato-hirudina (ds cDNA da dessulfato-hirudina) é produzido a partir de mRNA da dessulfato-hirudina ou um gene codificador da sequência de aminoácidos da dessulfato-hirudina é produzido por meio de processos químicos a enzimáticos.

Uma sequência de DNA contendo sinais de terminação de transcrição de levedura é de preferência a sequência delimitante 3' de um gene de levedura que contem sinais correctos para terminação e poliadenilação. Sequências delimitantes 3' adequadas são por exemplo as do gene de levedura naturalmente ligado ao promotor usado. A sequência delimitante preferida é a do gene PHO5 de levedura.

O promotor de levedura, a sequência de DNA facultativa codificadora do peptideo sinal, a sequência de DNA codificadora de uma proteína heteróloga e a sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição de levedura são operacionalmente ligados um aos outros, i.e. são justapostos de modo a que as suas funções normais sejam mantidas. 0 arranjo é tal que o promotor efectua a expressão correcta do gene heterólogo (facultativamente precedida

-20de uma sequência sinal), os sinais de terminação da transcrição efectuam a terminação correcta da transcrição e poliadenilação e a sequência sinal facultativa está ligada na grelha de leitura correcta ao gene heterólogo de modo a que o último codão da sequência fique directamente ligado ao primeiro codão do gene codificador da proteína heteróloga e ocorre a secreção da proteína. Se o promotor e a sequência sinal derivarem de genes diferentes , o promotor é de preferência ligado à sequência sinal entre o principal sítio de iniciação do mRNA e o ATG do gene naturalmente ligado ao promotor. A sequência sinal deverá ter o seu próprio ATG para iniciação da tradução. A junção destas sequências pode ser efectuada por meio de oligodesoxinucleotídeos adaptadores sintéticos portadores da sequência de reconhecimento de uma endonuclease.

Além da cassete de expressão, os vectores híbridos de acordo com o invento correspondem uma origem de replicação de levedura. Assim, os vectores híbridos compreendem um segmento de DNA originado no DNA de dois-microns contendo a origem de replicação ou, se se usarem estirpes de levedura $m o DNA de dois-micron, DNA total de dois-micron. É preferido este último tipo de vectores. Os vectores híbridos preferidos de acordo com o invento contem o DNA de dois-micron completo numa forma não interrompida, i.e. o DNA de dois-micron é clivado uma vez com uma endonuclease de restrição, o DNA linearizado é ligado aos outros componentes do vector antes da recircularização. 0 sítio de restrição é escolhido de modo a que as funções normais dos genes REPl , REP2 e FLP e dos sítios ORI, SIB, IR1 e IR2 do DNA de dois-micron sejam mantidas. Facultativamente, o sítio de restrição é escolhido de modo a que o gene D do DNA de dois-micron também seja mantido instacte. Os sítios de restrição preferidos são o sítio PstI único situado dentro do gene D e os sítios Hpal e SmaBI únicos fora de todos os genes e sítios referidos.

λ

-21De preferênica, os vectores híbridos de acordo com o invento incluem uma ou mais, especialmente uma ou duas, marcas genéticas selectivas para levedura e uma marca selectiva e uma origem de replicação para um hospedeiro bacteriano, especialmente Escherichia coli.

Como marcas genéticas para leveduras pode ser usadas qualquer marca genética que facilita⁵ a selecção de transformantes devido à expressão fenotipica do gene marcador. São marcas adequadas para leveduras , por exemplo, as que expressam a antibióticos ou, no caso de mutantes de levedura auxotróficos, genes que complementam lesões do hospedeiro. Os genes correspondentes, conferem, por exemplo resistência aos antibióticos G418 , higromicina ou bleomicina ouproporcionam prototrofia num mutante de levedura auxotrófico, por exemplo o gene VRA3 , LEU2, LIS2 ou TRP1 .

Como a amplificação dos vectores-híbridos é convenientemente feita eM E. coli, com vantagem são incluídos uma marca genética para E. coli e uma origem de replicação de E. coli . Estas podem ser obtidas a partir de plasmídeos de E.coli tais como pBR322 ou um plasmideo pUC, por exemplo pUCl8 ou p(JC19 , os quais contem a origem de replicação de E.coli e uma marca genética para E.coli conferindo resistência a antibióticos, como seja a ampicilina.

Os vectores híbridos de acordo com o invento são preparados por métodos conhecidos, por exemplo através da ligação da cassete de epressão compreendendo um promotor de levedura operacionalmente ligado a uma sequência de DNA codificadora de uma proteína heteróloga e os fragmentos de DNA contendo marcas genéticas selectivas para levedura e para um hospedeiro bacteriano e origens de replicação para levedura e para um hospedeiro bacteriano na ordem predeterminada.

-22Estirpes de levedura sem actividade de carboxipeptidase ycs

As estirpes de levedura de acordo com o invento não possuem actividade de carboxipeptidase ysc o( - De preferência, as estirpes de levedura são mutan tes duplos, triplos ou quádruplos, i.e. são defectivos noutras actividades de peptidase.

Uma larga variedade de proteinases tal como as mencionadas, foi caracterizada na levedura / ver T. Achstetter e D.H. Wolf Mutantes sem actividade da maior

Saccharomyces cerevisiae (1985) Yeast 1, 139-1577. parte destas proteases foram isolados e estudados bioquimicamente. As consequências da ausência de certas proteases foram elucidadas e algumas propriedades mostraram-se úteis para o isolamento de novo dos mutantes deficientes em proteases. Uma vez que as frequências de mutação espontânea são baixas, as leveduras são geralmente tratadas com mutagé nios tais como raios X ou radiação U.V. ou mutagénios quími cos que são bastante eficientes e podem induzir mutações a -4 -3 uma velocidade de 1,15 alO por gene sem uma grande mortalidade. As proteases que faltam nas estirpes de levedura de acordo com o invento não efectuam funções indispensáveis no metabolismo celular; portanto, as mutações que destroem completamente a actividade destas proteínas não são letais. Cada tipo de mutante das proteases referidas (ysc ,YscB, yscA, yscY e YscS) podem ser isolados separadamente após mutagénese. 0 isolamento e selecção baseiam-se de despiste de colónias que são bem conhecidos. Um segundo método mais eficaz para introduzir as deficiências em proteases simples ou múltiplas pretendidas no genoma da levedura é por mutagé nese dirigida especifica de sítio ou desmantelamento de genes ou substituição de genes / cf. H. Rudolph et al Gene, 36 ( 1985) 87-95/. Quando a sequência genética é conhecida, como é por exemplo, o caso da protease yscB, carboxipeptida

se yscY e carboxipeptídase ysc χ , o gene genómico da protease pode ser tornado defectivo por inserção, substituição ou delecção fazendo uso do processo de mutagénese dirigida bem conhecido / ver, por exemplo, m.J. Zoller e M. Smith (1983) Methods Enzymol. 100, 4687 que envolve a proporção de um oligodesoxirribonucleotídeo adaptador mutagénico adeqúadamente projectado. Como alternativa, o gene genómico da proteína pode ser substituído por DNA estranho ou o referido DNA estranho pode ser inserido num sítio de restrição adequado do gene da proteína. Por exemplo, para preparar um mutante de levedura sem actividade de peptidase ysc (mutante Kex ) o DNA estranho é inserido num sítio de restrição adequado que ocorre no gene genómico KEX1. No caso da estirpe de levedura usada ter um defeito num gene cromossómico codificador de uma enzima da biossíntese de aminoácidos ou purinas um gene correspondente intacto pode ser inserido no gene cromossómico KEX1 proporcionando assim prototrofia na estirpe de levedura auxotrófica e mudando o genótipo ao mesmo tempo de KEX1 para Kexl. Os processos de substituição de genes ou de mutagénese dirigida são normalmente aplicados neste campo e sao absolutamente reprodutíveis.

O método corrente para compor estirpes defectivas em múltiplas proteases, como sejam as estirpes sem as actividades ysc \ e yscB, consiste no cruzamento meiótico e subsequente análise de tétradas. As tétradas que derivam de células dipóides, são dissociadas de acordo com técnicas genéticas convencionais. Combinações ao acaso entre os quatro esporos de uma tétrada permite a construção de mutantes duplos e múltiplos em cruzamentos subsequentes. A análise de esporos ao acaso também pode ser usada como sistema alternativo.

Uma vez que os mutantes sem proteínas individuais e mesmo mutantes duplos estão disponíveis nos centros de stocks genéticos de leveduras, mutantes triplos e quádruplos podem ser reprodutivelmente combi-

-24nadas por técnicas de cruzamento nucióticos sucessivos .

Estirpes de partida adequadas de Saccharomyces cerevisiae incluem, por exemplo, a estirpe Kex 96 obtida do Yeast Genetic Stock Center , Berkeley, estirpes de leveduras negativas para peptidases A (yscA)

AB103 (ATCC 20673) e ABHO(ATCC 20796) ,estirpes de levedura negativas para peptidases B(yscB) HT246, H426 e H449 (esta última é também cir°) depositados no Deutsche Sammlung von Mikroorgassismen, Braunschuweig, FRG, com os números de acesso 4084, 4231 e 4413, respectivamente, estirpe de levedura negativa para peptidases Β, Y e S (yscB, yscY e yscS) BY5232-31-42 e estirpe de levedura negativa para peptidases A, Β, Y e S (yscA, yscB, YscY e YscS) ABYS .

re et al., (1981) Mol

Conforme referido atrás, as estirpes de levedura preferidas de acordo com o invento não possuem DNA endógeno de dois micron. O plasmideo dois-micron é um elemento de DNA extracromossómico de auto-replicação e elevado número de cópias, contendo na maior parte das estirpes de Saccharomyces cerevisiae. As características estruturais mais importantes do plasmideo dois-micron são duas repetições invertidas (IRl e IR2) de 659 pb cada dividindo o plasmideo em duas regiões de DNA de tamanho diferente. A recombinação homóloga entre estas duas sequências IR idênticas resulta na formação de dois isómeros moleculares (forma A e forma Β). A estabilidade do plasmideo dois-micron é dada por três funções codificadas pelo plasmideo. os produtos do gene REP1 e REP2 são proteínas que actuam em trans necessárias à divisão estável do plasmideo de dois micron. Destes dois REP1 é possivelmente o mais importante, pelo facto de a deficiência do repartimento estar dependente da dosagem genética do produto do gene REP1, /^_A . CashmoGenet. 203

1547. Estas duas proum elemento importante teínas actuam no sítio STB (REP3) do plasmideo que actua em cis /^_M . Jayaram et al., (1985)

Mol. Cell. Biol. 5, 2466-2475; B. Viet et al (1985) Mol.

-25Cell. Biol. 5, 2190-21967.

Tais estirpes cir° de Saccharotnyces cerevisiae são conhecidos ou podem ser preparadas por métodos conhecidos / ver, por exemplo, C.P. Hollenberg (1982) Curr. Top. Microbiol. Immun. 96, 1197- O processo alternativo que se segue para a preparação de estirpes cir° baseia-se no pressuposto que a substituição do plasmideo dois-micron por um segundo plasmideo envolve aumento de dosagem do sítio STB para reduzir as proteínas REP1 e REP2 . Esta redução relativa das proteínas REPl e REP2 conduziria a uma instabilidade do plasmideo endógeno de dois micron.

De preferência, o segundo plasmídeo usado tem um defeito ou não possui o gene REPl. Um exemplo de tal plasmideo é pDP38 que além de não possuir REPl também não tem uma repetição invertida (IR2). Isto torna a sua expressão de um elevado número de cópias dependente da complementação da proteína REPl pelo plasmideo endógeno dois micron. Ele possui duas marcas selectivas para levedura: URA3 , usada em situações de elevado e baixo número de cópias e dLEU2, aplicável apenas em situações de elevado número de cópias / E. Erhart et al (1988) J. Bacteriol. 6257.

Uma estirpe de levedura que é Ura e Leu foi transformada com o plasmideo pDp38 e seleccionadas as colónias Ura⁺. A selecção em plasma sem uracilo (selecção Ura) dá uma frequência de transformação muito melhor do que a selecção em placas sem leucina (selecção Leu), uma vez que o gene URAJ é muito melhor expresso do que o gene defectivo dLEU2. Seleccionou-se uma única colónia e semeou-se uma placa de selecção Leu que dá colónias de vários tamanhos e forma . Algumas das colónias mais pequenas foram semeadas novamente em placas de selecção. Ura é transferidas para placas de selecção Leu. Seleccionaram-se as colónias que podem crescer sob selecção Ura mas apenas muito

-26lentamente sob selecção Leu. 0 crescimento em placas de selecção Ura mostra que o plasmideo pDP38 ainda está presente e que o níero crescimento lento sob selecção Leu não é devido à perda deste plasmideo e o não crescimento sob selecção Leu implica que pDP38 não é capaz de complementar esta marca. Este último facto pode ser explicado de duas maneiras:

A: 0 gene EEU2 em pDP38 está mutageneizado ou B: 0 plasmídeo não pode complementar leu2 devido a não poder aumentar o seu número de cópias, implicando que o plasmideo dois-micron não está disponível (i.e. perdido) para complementar o produto do gene REP1.

Estas duas possibilidades podem ser fácilmente distinguidas. Em primeiro lugar, o crescimento mínimo observado com as referidas colónias (como contra o crescimento zero absoluto de células sem pDP38) mostra que está presente alguma expressão LEU2. 0 segundo ponto pode ser directamente testado, como na ausência do plasmideo dois micron pDP38 actuará apenas como um plasmídeo tipo ARS, i.e. será muito instável de modo gue a maior parte das colónias perdi-lo-à após algumas gerações. Assim, quando uma única colónia é semeada numa placa YPD e colónias isoladas repicadas para placas sem uracilo, então apenas algumas crescerão sob selecção Ura. As colónias que não cresceram foram testadas pro hibridação relativamente a sequências pUC e dois-micron. As colónias que não apresentam sinais de hibridação não possuem o plasmideo pDP38 e os plasmideos endógenos dois-micron (estirpes cir°). As estirpes cir° obtidas podem ser tratadas como descrito atrás para dar estirpes mutantes de leveduras sem peptídase, especiaimente actividade Ysc e em adição não possuem DNA dois-micron.

Além da ausência deactividade ysc as estirpes de levedura preferidas de acordo com o invento também não possuem outras peptidases seleccionadas do grupo constituído por YscA, YscB, YscY e YscS e não possuem DNA dois-micron. As estirpes de levedura mais preferidas não possuem actividade Ysc pq e YscY e facultativamente podem não possuir actividade yscB e yscS ou yscA e yscB enão tem o DNA dois-micron.

As estirpes de levedura de acordo com este invento podem vantajosamente ser usadas na produção de proteínas heterólogas. Surpreendetemente encontrou-se que as estirpes Kexl de acordo com o Jn/ento portadoras de um vector híbrido contendo um gene codificador de uma proteína heteróloga para levedura produzem a referida proteína numa forma homogénea, i.e. quaisquer bioprodutos encurtados no extremo C.

Estirpes de leveduras transformadas invento diz ainda respeito a uma estirpe de levedura que não possui actividade carboxipeptidase ysc^ e que foi transformada com um vector híbrido compreendendo um promotor de levedura operacionalmente ligado a uma sequência de DNA codificadora de uma proteína heteróloga e a um método para a sua produção.

Estirpes hospedeiras de levedura adequadas incluem estirpe de Saccharomyces cerevisiae sem actividade carboxipeptidase ysc e facultativamente outras actividades peptidases e que, facultativamente, foram desprovidas dos plasmídeos endógenos dois micron (ver atrás método para a produção da referida estirpe de levedura transformada compreende transformação de uma estirpe de levedura que não possui actividade carboxipeptidase ysc com o referido vector.

-28A transformação de levedura com os vectores híbridos de acordo com o invento pode ser conseguida de acordo com o método descrito por Hinnem et al / Proc. Natl. Acad.' Sei. USA 75 , 1929 (197827 Este método pode ser dividido em três passos:

(1) Remoção de toda ou parte da parede celular da levedura usando várias preparações de glucosidases, como sejam de © (r) sucos intestinais de cobra (e.g., Glusulase ou Helicase ) ou mistura de enzimas obtida a partir de microorganismos (R) (e.g. Zymolyase^) em soluções osmóticamente estabelizadas (e.g. IM sorbitol).

(2) Tratamento das células nuas de levedura (esferoplastos) com o DNA vector na presença de PEG (polietilenoglicol) ~ 2 + e iões Ca (3) Regeneração da parede celular e selecção das células transformadas numa camada sólida de agar. Esta regenerção é convenientemente feita por embebição dos esferoplastos em agar. Por exemplo, mistura-se agar fundido (cerca de 50°C) com os esferoplastos. Quando do arrefecimento da solução para temperaturas de crescimento (cerca de 30°C) obtem-se uma camada sólida. Esta camada de agar é para evitar difusão rápida e perda de macromoléculas essenciais a partir do esferoplasto e facilita assim a regeneração da parede celular. No entanto, a regeneração da parede celular pode também ser conseguida (se bem que com uma eficácia menor) semeando os esferoplastos na superfície de camadas de agar pré-formuladas .

De preferência o agar de regeneração é preparado de modo a permitir a regeneração e selecção de células transformadas ao mesmo tempo. Uma vez que os genes de levedura codificadora da enzima das vias de biossíntese de aminoácidos e nucleotideos são geralmente usadas como marcas selectivas (supra), a regeneração é de preferên-29-

cia efectuada em agar de meio mínimo para leveduras. Se forem necessárias eficiências de regeneração muito altas é vantajoso o processo de dois passos que se segue:

(1) regeneração da parede celular num meio complexo rico e (2) selecção das células transformadas por transferência da camada celular para placas de agar selectivo.

Uma outra execução do invento é uma dessulfato-hirudina da fórmula

Xi

Tyr

Thr

Asp

Cys

Thr

Glu

Ser

Gly

Gin

Asn

Leu

Cys

Leu

Cys

Glu

Gly

Ser

Asn

Vai

Cys

Gly

Gin

Gly

Asn

Xi

Cys

Ile

Leu

Gly

Ser

Asp

Gly

Glu

Χ3

Asn

Gin

Cys

Vai

Thr

Gly

Glu

Gly

Thr

Pro

X.,

Pro

Gin

Ser

Xs

Asn

Asp

Gly

Asp

Phe

Glu

Glu

Ile

Pro

Glu

x6

(IV), onde X₁ representa o resíduo dipeptídico Val-Val, >

e X^ são Lis , Xj. é His e Χθ é seleccionado do grupo constituído por Glu-Tir-Lis-Arg , Ser-Fen-Arg-tir e Trp-Glu-Leu-Arg

As proteínas heterólogas conhecidas obtidas pelo processo de acordo com o invento podem ser usadas de modo conhecido per se, e.g. na terapia e profilaxia de doenças humanas e de animais. Por exenpio, ANP humano tem actividades natriuréticas , diuréticas e vascorelaxa-

-30mento e pode ser usado na regulação da homeostasia cardiovascular .

Os compostos de dessulfato-hirudina podem ser usados, de modo análogo à hirudina natural , na terapia e profiláxia de trombose, na terapia de choque agudo, na terapia de coagulopatias de consemption e similares como descrito no Pedido de Patente Europeia NP 168.342.

O invento diz respeito especialmente a estirpes de leveduras transformadas, a métodos para a sua produção e ao método para a produção de proteínas heterólogas, como descrito nos Exemplos.

Breve descrição dos desenhos

Na parte experimental que se segue estão descritas várias realizações do presente invento com referência aos desenhos juntos em que:

Fig. 1 descreve os cromatogramas de dessulfato-hirudina colhidas a partir das estirpes trans formadas de S_. cerevisiae KEX1 e Kexl.

fig. 2 é um diagrama esquemático que msotra a síntese in vitro do gene da hirudina HVl incluindo a sequência sinal de PHO5 com os codões preferidos das leveduras. Os 21 oligodesoxinucleotídeos usados estão indicados pelas linhas numeradas e linhas a tracejado, respectivamente .

Fig. 3 ilustra esquemáticamente a construção do plasmideo pDP33.

Fig. 4 ilustra esquemáticamente a construção dos plasmídeos pDP34 e pDP38.

Fig. 5 ilustra esquemáticamente a construção do plasmideo de expressão pDP34/GAPFL-YHIR.

Fig. 6 ilustra esquemáticamente a construção do plasmideo de expressão pDP34/PHO5(-173)-YHIR)

Fig. 7 ilustra esquemáticamente a trução do plasmideo pDP92.

Fig. 8 descreve os cromatogramas de hirudina tipo selvagem e de mutante de hirudina HV1-KR, HV1-WQLR e HV1_SFRY a partir de culturas de S. eerevisiae BYSKEX1 e Byskexl.

-32Exemplo 1: Cruzamento da estirpe 96 mutante Kexl de S. cerevisiae com a estirpe BYS de S_. cerevisiae e análise dos esporos quanto à capacidade secretora do factor 7/ e actividade carboxipeptidase ysc oÇ (gene KEX1)

A estirpe 96 mutante Kexl de S_. cerevesiae (a, KEX1 , 9 de 2, thrl), que foi obtida do Yeast Genetic Stock Center, Berkeley, USA, foi cruzada com a estirpe BYS232-31-42 de S. cerevisiae ( FX , prbl-1, prc-1, cps-3, lys 2, leu 2, his 7) / Achstetter, T. e Wolf, D.H. (1985) EMBOJ. _4, 173-177; Wolf, D.H. e Ehmann, C. (1981) J. Bacteriol. 147, 418-4267 portadora do alelo tipo selvagem KEX1. Células heterozigóticas diplóides do genótipo Kexl/ /KEX1 foram isoladas a partir deste cruzamento. As tétradas que derivam das células diplóides foram dissociadas com técnicas convencionais de genética / Hawthorne, D.C. e Mortimer , R.K. (1960) Genetics 45 , 1085-1110; Methods in Yescts Genetics 1986 (Sherman, F. et al., eds) Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. 7.

Òs quatro esporos de cada tétrada foram testadas quanto à sua capacidade para secretar o factor ‘Λ . Para distinguir entre colónias tipo selvagem KEXl e mutantes Kexl usou-se a estirpe RC629 de Í5. cerevisiae~' supersénsivel è feromona (a, sst-2 , ade2-l, ural, his6 , meti, canl , cyh2 , rme) / Chan, R.K. e Otte , C.K. (1982) Mol. Cell. Biol. 2, 11-20; Chan, R.K. e Otte, C.K. (1982) Mol. Cell.

Biol _2, 21-247. Conforme esperado a partir das características codificadas por graus nucleares simples, de todas as tétradas analisadas , dois esporos de cada tétrada secretam o factor a, enquanto que dois outros esporos secretam o factor . As colónias KEX1 tipo selvagem do tipo de conjugação inibem o crescimento da estirpe tester num grau elevado e produzem assim um grande halo à sua volta, uma vez que são capazes de processar completamente o precursor do factor e de produzir quatro moléculas de factor ac-

-33tivas a partir de uma molécula precursora. Pelo contrário, colónias mutantes Kexl inibem o crescimento da estirpe de ensaio gram menor e portanto produzem um pequeno halo à sua volta, uma vez que elas são capazes de produzir apenas uma molécula de factor OÇ madura a partir de uma molécula precursora .

Os esporos de várias tétradas completas que foram identificadas como defectivas para o gene Kexl pelo ensaio de feromona atrás descrito, foram finalmente testadas quanto à actividade específica de carboxipeptidase ysc . As células foram cultivadas, preparadas as suas membranas e testadas quanto à actividade de carboxipepti dase ysc o<Z usando como substrato Cbz-tir-Lis-Arg como descrito /‘Wagner, J.C. e Wolf, D.H. (1987) FEBS Lett. 221,2 , 423-4267. O facto de a actividade de carboxipeptidase não estar presente nas células dos mutantes Kexl, indica que KEX1 é o gene estrutural desta enzima. Isto implica que a carboxipeptidase ysc está de facto envolvida no procedimento do extremo carboxilo do factor cx^ .

Exemplo 2: Classificação dos mutantes Kexl confirmados acerca da deficiência de proteases yscB, yscY e YscS

Os mutantes Kexl de S_. cerevisiae foram classificados relativamente à deficiência noutras proteases (proteinase yscB, carboxipeptidase yscy e carboxipeptidase yscS) e outras necessidades de factores de crescimento .

O material celular dos mutantes Kexl que foram preparados a partir da fase estacionária em

-34meio YPD (Difco) foi suspenso em 200 yul de tampão 20 mM Tris-HCl , pH 7,2 em tubos Eppendorf e adicionadas esferas de vidro (0,4 mm de diâmetro) até dois terços do volume, suspensão foi agitada três vezes durante 1 min. num misturador vortex com arrefecimento intermitente em gelo.

A centrifugação durante 5 min permite recuperar os extractos brutos do sobrenadante. Estes extractos foram dializados contra -tanpão O,1M imidazole-HCl pH 5,2 com ZnC^ O,1M para activar proteases e remover aminoácidos livres dos extractos.

As actividades de yscb foram medidas de acordo com o teste Azocoll (R.E. Ulane et al.,((1976) J. Biol. Chem. 251, 3367; E. Cabib et al., (1973) Biochem. Biophys. Res. Commun. 50 , 186; T. Saheki et al (1974) ; Eur. J. Biochem. 42 , 6217. Apés medição da concentração de proteína uma pequena quantidade de cada amostra foi adicionado tampão fosfato de sódio O,1M (NaPi) pH 7,0 até 100 yal por ajustar as quantidades iguais de proteína necessárias. A solução de proteína adiciona-se uma suspensão de 500 jul de Azocoll (240 mg em 10 ml de tampão NaPi 0,lM, pH 7,0).

Estas misturas foram incubadas a 30°C durante uma hora com agitação. Após a adição de 500 ^ul de ácido tricloroacético a 10% que para a -reacção as misturas foram centrifugadas duas vezes e medidas os espectros de absorção dos sobrenadantes a 520 nm.

As actividades de carboxipeptidase yscY e yscS foram medidas usando o substrato cromogénico Clz-Gln-Leu / cf. D.H. Wolf et al (1978) FEBS Letters 91:59; D.H. Wolf et al . , (1977) Eur. J. Biochem. 73, 5537. Os extractos dialisados foram divididos em três partes e a duas delas adicionou-se fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) numa concentração final de 1 mM ou EDTA numa concentração final de 5 mM para bloquear selectivamente as duas actividades de proteases. Nomeafemente PMSF inibe a actividade de

-35carboxipeptidase yscY e EDTA inibe a ci carboxipeptidase yscS. As misturas com inibidores foram cada uma incubada a 25°C durante uma hora para completar a inibição. após a determinação da concentração de proteína, duas amostras com inibidor e uma amostra sem inibidor como controle de cada amostra adicionou-se tampão NaPi O,1M pH 7,4 até 50 ^il para receberem igual quantidade de proteína. A estas soluções de proteína adicionou-se as seguintes soluções a testar:

500 ^il solução a testar I:

L-aminoácido-oxidase peroxidase de rábano silvestre 0,01 mM NnCÍ2 em tampão 0,lM NaPi, pH 7,4 ^1 solução a testar II o-diamisidina

0,24 mg7ml 0,40 mg/ml mg/ml em agua

500 jil solução a testar III 20 mM Cbz-Gli-Leu em tampão fosfato de potássio 0,2M, pH 7,4 durante uma hora a 20% para parar a 405 nm.

As misturas foram incubadas a 28oC e após a adição de 100 ^ul de Triton X-100 a reacção, foram medidas as absorvâncias

Para fins de subsequente transformação avaliou-se uma marca auxotrófica de aminoácidos para leu cina com a técnica de transferência em placas de meio mínimo suplementado com adenina, treonina , lisina e histidina e com ou sem leucina .

-36Por meio dos ensaios acima descritos, isolaram-se mutantes designados S_. cerevisiae BYSKexl, os quais apresentam uma deficiência quadrupla em protease ( o/ , prb-1, prc-1, cps-3, Kexl) e uma necessidade adicional de leucina.

Exemplo 3 : Transformação do mutante de Saccharomyces cerevisiae com uma deficência quádrupla de protease plasmideo pJDB207/PHO5-HIR (Pedido de Patente Europeia NS 225.633) foi introduzido no mutante BYSKexl com deficiência quadrupla de proteases ( X , prb-1 prc-1, cps-3, Kex-1, leu 2) e na estirpe selvagem KEX1 BYS232-31-42 ( q/ , prb-1, prc-1, cps-3, lis 2, leu 2, his 7) como controle usando o protocolo de transformação descrito por Hinnen et al / Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75, 1929 (1978)7.

ml no agitador (110 revs/min) min. Com intervalos de 5 min

As duas estirpes de levedura diferentes foram colhidas na fase logafitmica precoce em 100 ml de meio YPD (ϋΟ^θθ = 0,2), lavadas com 25 ml de sorbitol 0,8M e ressuspensos em 5 ml da mesma solução de sorbitol. A este 5 ml de suspensão de células adicionou-se 30 ^il de zimoliase (ZYMOLYASE-100 T de Arthrobacter Lutens, Seikagaku Kogyo Co., LTD; 100 mg/ml em sorbitol 0,8M). Estas misturas foram agitadas suavemente em balões de agitação de 100 a 30°C durante cerca de 30 retirou-se uma amostra, diluiu-se em 10 ml de água destilada e mediram-se as absorvâncias dos diluidos a 600 nm para controlar o curso progressivo da formação de esferoplastos. Para se obter uma boa formação de esferoplastos, a diferença de absorvância antes e após o tratamento com zimoliase deve ser superior a um factor de

10. As células da forma de esferoplastos foram lavadas duas vezes com sorbitol 0,8M, ressuspensas em 25 ml de meio HE 30 (sorbitol 2M, em meio YPD) e incubadas num frasco de agitação de 100 ml com agitação suave no agitador (110 revs/min) a 30°C durante uma hora. As células foram centrifugadas (3000 rpm, 5 min) e ressuspensas em 1 ml de solução HE31 (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM CaC^, 0,9M sorbitol) com cuidado. A 100 ^liI desta suspensão de células adicionou-se 4 ug de DNAs de plasmideo. A mistura foi incubada durante 15 min. à temperatura ambiente. A cada um dos tubos adicionou-se 1 ml de polietilenoglicol (PEG) 4000 a 20% e incubou-se durante mais 30 min. à temperatura ambiente, centrifLgou-se (3000 rpm 3 min) e ressuspendeu-se em 500 ^il de sorbitol 0,8M. Os esferoplastos com DNA foram misturados com 10 ml de agar de regeneração (manitol IM, 6,8 g/1 de base azotada para levedura W/O AA (Difco), 10 g/1 de L-asparagina, 9,0 g/1 de L-histidina, 1,0 g71 , de adenina, 1,0 g/1 de treonina,

1,0 g/1 de lisina e 3% de agar) e vertidos como uma camada sobre placas contendo uma camada de agar básico da mesma composição. As placas foram incubadas a 30°C durante 96 horas até aparecerem as colónias transformantes.

Uma colónia de levedura transformada e isolada foi repicada e cultivada em meio mínimo sintético para leveduras (8,4 g/1 de base azotada para leveduras W/0 AA, 10 g/1 de L-asparagina e 1,0 g/1 de L-histidina) suplementado com adenina, treonina, lisina e histidina mas sem leucina. A colónia do mutante com deficiência quadrupla de proteases BYSKexl e a da estirpe controle com deficiência tripla de proteases BYSKEX1 são referidos como

Saccharomyces eerevisiae BYSKexl (pJDB207/PHO5-HIR e

Saccharomyces eerevisiae BYSKEXl/pJDB207/PHO5-HIR - respectivamente .

Exemplo 4: Cultura dos transformantes de Saccharomyces cerevisiae com pJDB207/PHO5-HIR

Células dos transformantes de

Saccharomyces cerevisiae BYSKexl/pJDB207/PHO5-HIR e

BYSKEXl/pJDB207/PHO5-HIR foram agitados como précultura em ml de meio completo para leveduras HE 41 / 4,5 g/1 de casaminoácidos , 4 g/1 de extracto de levedura, 20 g/1 de sa carose , 20 g/1 de glucose, 3,6 g/1 de (NH^J^SO^, 0,2 g/1 de

MgSO^.7H2O, 0,013 g71 de CaCl2-H2O e 1 ml/1 de mistura de micronutrientes (10 g/1 FeSO^.7H2O, 50 g/1 ZnSO^.7H2O, 3,3 g/1 CuSO₄.5H₂O, 3 g/1 MnSO H₂O, 2 g/1 CoCl₂.6H₂0 e 1 g/1 (NH, ) ,Mo-,0„ , . 4H„0 7 a 28°C e cultivadas durante cerca de 4 D / Z 4 Z — horas até atingirem a fase estacionária. As células colhidas foram lavadas em 0,9% NaCl. 50 ml do meio sintético para leveduras atrás descrito foram inoculados com um inóculo de 5%. As culturas foram inoculadas até uma densidade celular de = 0,3 e agitadas a 28°C até 77 horas a

350 revs/min.

Para remover a absorção de fundo na análise por HPLC usou-se o meio completo para leveduras HE41 .

-39Exemplo 5: Análise de hirudina-65 e dos seus produtos de degradação carboxi-terminal hirudina-64 e hirudina-63 das culturas de fermentação dos traisformantes de Saccharomyces cerevisiae BYSKexl/pJDB207/PHO5-HIR e BYSKEX1/pJDB207/ /PHO5-HIR usando HPLC de fase reversa

Preparam-se amostras de culturas líquidas de levedura por centrifugação para produzir uma solução clara que foi diluída a 1:10 (v/v) com ácido acético (IM) e foram sujeitas a análise pro HPLC nas condições que se seguem:

Encheu-se uma coluna HIBAR (MERCK) (4<125 mm) com material de sílica de poro largo em fase reversa (tipo 71252, 300-5-C18, MACHEREY-NAGEL), uma fase estacionária esférica com um diâmetro de partículas de 5 um e uma porosidade de 300A. Os extremos de coluna foram providos de filtros de aço inoxidável. A fase móvel A foi feita com água (Nanopure , BARNSTEAD) contendo 0,1% (v/v) de ácido trifluoroacético. A fase móvel B foi feita a partir de 20% de fase móvel A e 80% (v/v) de acetonitrilo (grau HPLC, FLUKA) contendo 0,08% (v/v) de ácido trifluoroacético .

As separações cromatográficas foram efectuadas a um fluxo de 1,5 ml/min correndo o gradiente que se segue e os eluentes foramc ontrolados por absorvância a 216 nm.

t(min)	% A	% B
0	90	10
1	79	21
9	79	21
17	67	33
20	0	100
22	0	100
24	90	10
32/0	90	10

calibração do dina pura em 1 injectados na calibrar o sis

Faz-se uma sol sistema dissolvendo 1 mg ml de água. 50 μΐ desta coluna e cromatografados tema .

ução padrão para a de dessulfato-hirusolução padrão foram como descrito para

Na Figura 1 estão apresentados os cromatogramas da cromatografia liquida analítica de fase reversa de hirudina colhidas de culturas de S. cerevisiae BYSKexl/pJDB207/PHO5-HIR e S. cerevisiae BYSKEX1/pJDB207/ /PHO5-HIR. As condições da cromatografia são as mesmas descritas atrás, é evidente que, ao contrário da estirpe BYSKEX1/pJDB207/PHO5-HIR, a estirpe negativa para a peptidase ysc BYSKexl/pDB207/PHO5-HIR produz um produto dessulfato-hirudina (HIR-65) essêncialmente livre dos produtos secundários dessulfato-hirudina HIR-64 por encurtamento C-terminal não possuindo o aminoácido C-terminal Glu e HIR-63 sem os aminoácidos C-terminais Leu e Gin.

-41Exemplo 6: Síntese in vitro do gene da hirudina HV1 com codões preferidos das leveduras

A sequência codificadora da cassete de expressão da hirudina foi feita com os codões preferidos das leveduras /~B. Hall (1982) J. Biol. Chem. 257,

30267 para garantir tradução óptima do mRNA da hirudina. A sequência codificadora contem a sequência sinal de PHO5 na mesma grdia de leitura da sequência codificadora da dessulfato-hirudina HV1 . O extremo 51 do DNA sintético contem os extremos coesivos do sítio de restrição EcoRI.

No extremo 3', o codão de paragem TAG é imediatamente seguido dos extremos coesivos do sítio BamHI. Na Fig. 2 está apresentada a sequência do fragmento de DNA EcoRI-BamHI de 257 pb.

A Fig. 2 também indica a estratégia para a síntese do fragmento de DNA de cadeia dupla. Sintetizaram-se 21 oligodesoxinucleotídeos usando o método de fosforamideto / M.H. Caruthers, em: Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments (H.G. Gassen e A. Lang. Eds), Verlag Chemie, Weiheim , FRG (1982) 7 num sintetizador Applied Biosystems Model 380B. A sequência dos oligonucleotídeos individuais está apresentada na Fig. 2. As sobreposições são únicas. Os oligonucleotídeos liofilizados foram redissolvidos em 50 mM Tris-HCl pH 8,0 numa concentração de 10 pmoles/gl. Os 21 oligonucleotídeos foram distribuídos por dois grupos; / A7 N° 1-11 representando a metade 5' do fragmento de DNA, / B_7 N2 12-21 para a metade 3'. Os dois grupos foram tratados separadamente. Misturaram-se 10 pmoles de cada um dos oligonucleotídeos de um grupo. Os oligos foram fosforilados em 20 ^ul de 25 mM Tris-HCl pH 8,0, lOmM MgC^, 10 mM NaCl, 3 mM DTT, 0,4 mM ATP e 8 unidades de polinucleotídeos-cinase (Boehringer) durante lha 37°C. Após 30 min à temperatura ambiente ambas as misturas (A e B) fo-

-42ram aquecidas durante 5 min a 95 C num banho-maria.

Deixou-se as amostras arrefecerem lentamente até à temperatura ambiente no banho-maria durante a noite. As misturas de oligonucleotídeos emparelhados A e B foram então guardadas em gelo.

plasmideo pBR322 foi completamente cortado com EcoRI e BamHI, Isolou-se o fragmento grande de 4 kb num gel preparativo de 0,6% de agarose. O DNA foi recuperado por electroeluição, purificado por cromatografia de permuta iónica em DE52 e precipitado com etanol como descrito no Exemplo 7. .0 DNA foi redissolvido em H2O numa concentração de 0,4 pmoles/pl.

^j1 da mistura de oligonucleotídeos emparelhados A (5 pmoles de cada um dos oligos 1-11), 9,5 ^ul da mistura B (5 pmoles de cada um dos oligos 12-21), 0,4 pmoles do fragmento EcoRI-BamHI de 4 kb do pBR322 e 400 unidades de DNA-ligase de T4 (Biolabs) foram incubados durante 16 h a 15°C.

Usou-se amostras de 10 μΐ para transformar células competentes Ca⁺⁺ de E. coli HB101 12 colónias transformadas resistentes à ampicilina foram cultivadas individualmente em meio LB contendo 100 ug7ml de ampicilina. O DNA de plasmideo foi preparado pelo método de Holmes et al., / Anal. Biochem. 114, 193 (1981)), e analisado por digestão com as enzimas de restrição EcoRI e BamHI os DNAs de plasmideo com a inserção EcoRI-BamHI de 257 pb foram ainda analisados por sequenciação de DNA em ambos, as cadeias. Os oligonucleotídeos 3,11, 12, 14 e 20 (ver Fig.

2) foram usados como iniciadores de sequenciação. Um clone com uma sequência correta em ambas ascadeias de DNA foi selecccionado e referido como pBR322/YHIR.

-43Exemplo 7: Construção do plasmideo pJDB2Q7/GAPEL-YHIR pJDB207/GAPEL-YHIR é um plasmideo de levedura para a expressão da variante de dessulfato-hirudina HVl sob o controle de um promotor constitutivo curto do gene da gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH) de levedura. A sequência codificadora da dessulfato-hirudina consiste nos codões preferidos das leveduras.

jaq do plasmideo pBR322/YHIR foram digeridos com endonucleases de restrição BamHI e EcoRl.

O fragmento Ec-oRI-BAMHI de 257 pb foi separado dos outros fragmentos de DNA num gel preparativo de 1,2% de agarose.

As bandas de DNA foram coradas com brometo de etídio e visualizadas sob luz UV a 360 nm. A banda de DNA de 257 pb foi cortada do gel e electroeluida em tampão TBE 0,2χ (TBE:

mM base Tris, ácido bórico 90 mM, EDTA 2,5 mM, pH 8,3) durante 45 min. a 100 mA. Após mudança da polaridade durante 45 seg., a siução de DNA foi colhida e ajustada a 0,15M NaCl. 0 DNA foi adsorvido a uma almofada de permutador iónico DE52 (Whatman) e eluido em 400 ^jl de tampão de alta concentração salina (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 1,5M NaCl). O DNA foi precipitado com etanol e ressuspenso em H2O numa concentração de 0,1 pmoles/^il.

O plamídeo pJDB207/GAPFL-HIR /Pedido de Patente Europeia N° 225 6337 contem o gene sintético da dessulfato hirudina (baseado na utilização de codões de E. coli) fundido na mesma grelha de leitura à sequência sinal da fosfatase ácida (PHO5) de levedura. O gene foi expresso sob o controle de um promotor curto constitutivo da gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GAPFL) de levedura nos vector vai-vem pJDB207 10 ^ug do plasmideo pJDB207/GAPFL-HIR foram digeridos com Sall e EcoRl. O fragmento SalI-EcoRI de 478 pb contem a parte Sal-Bam do pBR322 e o promotor GAPFL.

-440 fragmento de DNA foi isolado num gel preparativo de 0,8% de agarose e electroeluido e purificado por cromatografia em DE52 e precipitação com etanol. O DNA foi ressuspenso em H₂O numa concentração de 0,1 pmoles/^il. 5 ^ig do pJDB207/ /GAPFL-HIR foram digeridos com Sall e BamHI. O fragmento vector grande de 6,7 kb foi isolado como descrito atrás.

0,2 pmoles do fragmento promotor SalI-EcoRI de 478 pb, 0,2 pmoles do fragmento EcoRI-BamHI de 57 pb contendo a sequência sinal de PHO5 e o gene sintético da hirudina (codões de levedura) e 0,1 pmoles do fr gmento vector de 6,7 kb foram ligados em 10 yul de 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM Mgcl₂ ,. 5 mM DTT, 1 mM ATP e 200 unidades de DNA-ligase de T4 (Biolabs) durante 6 h a 15°C . Uma amostra de 1 pl da mistura de ligçaão foi usado para transformar células competentes de E. coli HB101.

colónias transformadas resistentes à ampicilina foram cultivadas individualmente em meio LB contendo 100 yug de ampicilina. O DNA de plasmideo foi preparado pelo método de Holmes et al (supra) e analisado por dupla digestão com SalI/HindIII. Um clone isolado com o padrão de restrição foi designado pJDB207/GAPFL-YHIR.

De modo análogo a construção pode ser efectuada com um fragmento de promotor SalI-EcoRI de 543 pb do plasmideo pJDB207/ /GAPFL-HIR / Pedido de Patente Europeia NS 225.6337· O novo plasmideo resultante foi designado pJDB207/GAPFL-YHIR.

Exemplo 8: Construção do plasmideo pJDB207/PHO5(-173)-HIR pJDB207/PHO5(-173)-HIR é um plasmídeo de levedura para a expressão da variante de dessulfato-hirudina HV1 sob o controle de um promotor PHO5 curto. 0 elemento promotor PHO5(-173) compreende a sequência de nucleotídeos do promotor PHO5 de levedura da posição -9 a-173 (sítio de restrição BstEII), mas não tem sequências reguladoras a montante (VAS). Assim o promotor PHO5 (-173) comporta-se como um promotor constitutivo.

plasmideo pJDB207/PHO5 (Eco)-HIR (EP 225 633) contem o promotor PHO5 regulado de tamanho completo com um sítio EcoRI introduzido na posição -8 em relação aoATG sa sequência sinal de PHO5 e a sequência codificadora da dessulfato-hirudina que é seguida do fragmento de terminação da transcrição de PHO5 . Este exemplo descreve a substituição do promotor PHO5 regulado pelo elemento promotor curto PHO5 (-173).

jjg do plasmideo pJDB207/PHQ5(Eco)-HIR foram digeridos com BstEEI. Os extremos coesivos dos fragmentos de restrição foram preenchidos numa reacção com DNA-polimerase Klenow (1 unidade/mg de DNA) em 200 ^1 de 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂, dATP, dCTP, dGTP, TTP ,

0,1 mM cada, durante 30 min à temperatura ambiente. A pós extracção com fenol o DNA foi purificado com etanol.

4,16 ^ig do adaptador BamHI (5 ' -CGGATCCG-3¹, Biolabs) foram fosforilados em 100 pi de 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂ , 5 mM DTT, 0,5 mM ATP e 18 unidades de polinucleotídeo-cinase de T4 (Boehringer) durante 45 min. a 37°C. Após 10 min a 75°C a mistura de reacção foi lentamente arrefecida até à temperatura ambiente. Os oligonucleotídeos adaptadores emparelhados foram guardados

-46a -20C.

pmoles dos fragmentos / BotEIl7/ extremo cerse do plasmideo pJDB207/PHQ5(Eco)-HIR foram incubados durante 16 horas a 15°C com um excesso de 100 vezes de adaptador BamHI fosforilado e emparelhado em 208 ^il de 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgC^ , 5 mM DTT, 3,5 mM ATP e 800 unidades de DNA-ligase de T4 (Biolabs). Após inactivação da ligase durante 10 min a 85°C o excesso de adaptadores foi removido por precipitação do DNA na presença de 10 mM EDTA, acetato de sódio 300 mM pH 6,0 e 0,54 volumes de isopropanol. 0 DNA foi digerido com BamHI e EcoRI. Os fragmentos de DNA foram separados num gel preparativo de 0,8% de agarose. 0 fragmento promotor BamHI-EcoRI de 172 pb foi recuperado do gel por electroeluição e precipitação com etanol. O DNA foi ressuspenso numa concentração de 0,1 pmoles/pl .

O plasmideo pJDB207/PHQ5(Eco)-HIR foi digerido com EcoRI e HinlII. O fragmento EcoRI-HindIII do 643 pb foi isolado como descrito atrás. O fragmento de DNA contem a sequência sinal de PHO5 fundida na mesma grelha de leitura à sequência codificadora da dessulfato-hirudina e ao fragmento de terminação da transcrição de PHO5.

O plasmideo foi também cortado com HindIII e BamHI. Isolou-se o fragmento vector de 6,6 kb.

fragmento BamHI-EcoRI de 172 pb e o fragmento EcoRI-HindIII de 643 pb, 0,2 pmoles de cada, e 0,1 pmoles do fragmento vector de 6,6 kb foram ligados em 10 ^ul. de 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgC^ , 5 mM DTT, 1 mM ATP e 400 unidades de DNA-ligase de T4 (Biolabs) durante 6 h a 15°C. Uma amostra de um ^1 da mistura de ligação foi adicionada a 100 ^ul de células de e. coli HB101 tratadas com cálcio e competentes por transformação.

-4712 colónias transformadas resistentes à ampicilina foram cultivadas em meio LB contendo 102 yag/ml de ampicilina. Preparou-se DNA de plasmideo que se analisou por digestão com BamHI e SalI/HindIII . Um clone com os fragmentos de restrição esperados foi seleccionado e referido como pJDB207/PHQ5 (-173)-HIR.

Exemplo 9: Construção do plasmideo pDP34

O DNA circular covalentemente fechado de 2 micron de levedura foi isolado a partir de Saccaromyces cerevisiae estirpe S288C. As células foram incubadas com 5 pg/ml de Zymolyase (100 000 unidades/^ig) durante 20 min a 37°C para digerir as paredes celulares. Os esferoplastos foram lisados com 2% SDS. Adicionou-se então EDTA para 25 mM, brometo de etídio pares 1 mg/ml e cloreto de césio para uma densidade final de 1,55 g/ml. 0 DNA de plasmideo foi separado do DNA cromossómico por ultracentrifug ção durante 42 horas, a 42000 rpm a 15°C. O DNA do plasmideo 2 micron foi retirado do gradiente com uma seringa. O brometo de etídio foi removido por extracção com isopropanol saturado com NaCl e o DNA de plasmideo foi finalmente precipitado com etanol. O DNA do plasmideo 2-micron purificado foi então linearizado com PstI e clonado no sítio PstI de pUC19 / J. Norrander et al. , Gene 26 (1983) , 1017 para dar o plasmideo pDP31.

plasmideo pJDB207 foi digerido com as enzimas de restrição Kpml e Hpal . O fragmento Hpal-Kpml de 0,55 Kb resultante contem a junção entre a sequência de 2 micron e o promotor defectivo do gene dLEU2.

-480 plasmideo pUC7/LEU2 contem o fragmento genómico Xhol-Sall de 2,2 kb de levedura do gene LEU2 /^—A . Andreadis et áL (1982) Cell 31, 3197 clonado no sítio Sali do plasmideo pUC7 / J. Vieira et al, (1982) Gene

19, 2597. 0 plasmideo pUC7/LEU2 foi cortado com Kpnl e Hpal .

O fragmento Kpnl-Hpal de 4,25 Kb foi ligado ao fragmento Hpal-Kpnl de 0,55 kb do pJDB207. Isto resulta no plasmideo pDP30 onde a fusão original dois-micron/dLEU2 como no plasmídeo pJDB207 é colocada a seguir ao gene LEU2 com o seu terminador completo, pDP30 foi figerido com Hpal e Sali e o fragmento de .1,85 kb contendo o gene LEU2 completo foi purificado e clonado no fragmento Sall-Hpal de 8,7 kb do plasmideo pDP31. O plasmideo resultante, pDP33 (ver Fig. 3) foi linearizado por digestão parcial com HindIII na presença de 50 ^Lig/ml de brometo de etídio /^_M. Gesterlund et al (1982 ) Gene 20 , 1217 e ligado ao fragmento HindIII de 1,17 kb contendo o gene URA3 / M. Rose et al (1984) Gene 29, 1137· A inserção do gene URA3 foi seleccionada por transformação de E. coli estirpe pyrF / m. Rose et al., supra7. Om clone positivo foi referido como plasmideo pDP34 (ver Fig. 4).

pDP34 é um vector vai-vem para levedura-E.coli com a marca de resistência à ampicilina para E. coli e as marcas selectivas URA3 e dLEU2 para levedura. Ele contem a sequência completa de 2 micron na forma A e é proficiente para REP1, REP2 e FLP.

-49Exemplo 10: Cionagem de cassetes de expressão da hirudina em pDP34 .

plasmideo pDP34 foi digerido com BamHI. Os extremos coesivos do sítio de restrição foram preenchidos numa reacção com DNA-polimerase Klenow (T. MaA Laboratory Manual 0 DNA foi ainda corniatis et al., em: Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). tado com Sall e o fragmento vector de 11,8 kb foi isolado num gel preparativo de 0,6% de agarose. O DNA foi recuperado por electroeluição e precipitação com etanol. Diferentes cassetes de expressão foram clonadas no fragnento vector pDP34 entre os sítios Sall e./ BamHl7 extremo cerse.

O plasmideo pJDB207/GAPFL-YHIR foi digerido com HindIII. Os extremos coesivos foram convertidos em extremos cerses com DNA-pdimerase Klenow. 0 DNA foi precipitado com etanol e ainda digerido com Sall. O fragmento Sall-/ HindIIl7/extremo cerse de 1,1 kb contem a cassete de expressão completa com sequências de pBR322, o promotor GAPFL, a sequência sinal de PHO5 fundida na mesma grelha de leitura à sequência codificadora (codões preferidos das leveduras) da dessulfato-hirudina e ao fragmento de terminação da transcrição de PHO5. O fragmento de 1,1 kb foi isolado num gel preparativo de 0,8% de agarose, recuperado do gel por electroeluição e purificação por cromatografia de permuta iónica em DE52 e precipitação com etanol. o, 2 pmoles do fragmento de l,lkb pmoles do fragmento vector de 11,8 kb foram ligados em 10 ^nl de 60 mM Tris-HCl pH 7,5, mM MgCl^, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP e 400 unidades de DNA-ligase de T4 (Biolabs) durante 16 h a 15°C. Usou-se uma amostra de um ^ul para transformar células E. coli HB101 Ca^⁺. Foram analisados 5 colónias transformadas resistentes à ampicilina. O DNA de plasmideo foi digerido com BamHI e SalI/BamHI. Um clone com os fragmentos derestrição correctos foi seleccionado e referido como pDP34/GAPFL-YHIR (ver Fig.5)

-50De modo análogo o fragmento

SalI-/^-HindIIl7/extremo cerse de l,2kb do pJDB207/GAPEL-YHIR (ver Exemplo 7) foi clonado no vector pDP34 que resulta no plasmideo pDP34/GAPEL-YHIR.

O plasmideo pJDB207/PHO5 (-173Í-HIR foi digerido com Sall e EcoRI.

fragmento SalI-EcoRI de 448 pb foi isolado como descrito. O fragmento de DNA contem a parte SalI-BamHI do pBR322 e um curto promotor constitutivo PHO5(-173) (ve'r Exemplo 8). 0 plasmideo pJDB207/GAPFL-YHIR foi digerido com HindIII. Os extremos coesivos foram convertidos em extremos cerses com DNA-polimerase Klenow. O DNA foi ainda digerido com EcoRI. Isolou-se o fragmento EcoRI-/^_HindIIl7extremo cerse de PHO5. Ela contem a sequência sinal de PHO5, a sequência codificadora da dessulfato hirudina (com os codões preferidos das leveduras), e ofragmento de terminação da transcrição de PHO5. O fragmento SalI-EcoRI de 448 pb e o fragmento EcoRI-extremo cerse de 642 pb, 0,2 pmoles de cada, e 0,1 pmoles do fragmento vector SalI-/^-BamHl7/extremo cerse foram ligados. Amostras de mistura de lgiação foram transformar células E. coli HB101 Ca⁺⁺. 0 DNA de plasmideo de 12 transformantes foi analisado por digestão com BamHI e SalI/BamHI. Um clone com o plasmideo correcto foi seleccionado e referido com pDP34/ /PHO5(-173)-YHIR (ver Fig. 6).

-51Exemplo 11: Outros plasmídeos de expressão para o gene da hirudina com codões de E. coli

Plasmídeos de expressão contendo o gene sintético da variante da dessulfato-hirudina HVl baseados na frequência de utilização de codões de E .coli foram construídos de modo análogo ao descrito no Exemplo 10. O fragmento SaiL-/ HindIIl7/extremo cerse de 1,1 kb do pJDB207/GAPFL-HIR (pedido de Patente Europeia NS 225.633 ) foi isolado e clonado no vector pDP34. O plasmideo de expressão resultante pDP34/GAPFL-HIR compreendendo o gene sintéti o da dessulfato-hirudina com base nos codões preferidos de E.coli expresso sob o.controle do promotor constitutivo GAPFL.

Para uma construção semelhante o fragmento Sali-/ HindIIl7/extremo cerse de 1,1 kb do pJDB207/PHQ5(-173)-HIR (ver Exemplo 8) foi clonado em pDP34. O plasmideo resultante pDP34/PHO5 (-173)-HIR contem o gene sintético da dessulfato-hirudina (codões de E. coli ) sob o controle do promotor constitutivo curto PHO5 (-173).

Exemplo 12: A cassete de expressão da hirudina clonada no plasmideo pDP92

Os vectores contendo a sequência de dois micron completa não expressam necessáriamente todas as funções do círculo de dois-micron genuíno de levedura.

As grelhas de leitura abertas podem ser destruídas por clonagem. Uma vez que até agora não se conhece qualquer função para o produto genético da grelha de leitura D o sítio único PstI dentro deste gene foi usado para clonagem do gene dLEU2 /“ Beggs, J.D. (1978) Nature 275, 104-1097 ou in_

serção da parte do vector pUC19 como no plasmideo pDP31, (ver Exemplo 9). Apenas recentemente foi sugerido que o produto do gene D regula a expressão do produto do gene FLP /J.A.H. Murray et al . , (1987) EMBO J. 5^, 42057. Para tirar total vantagem do círculo dois-micron construiu-se um vector que é proficiente para todas as funções de dois-micron conhecidas incluindo o produto do gene D.

a) Construção do plasmideo pDP92 (ver Fig. 7) plasmideo pDP31 (Exemplo 9) foi digerido com PstI e Hpal resultando em très fragmentos . O plasmideo pKl9 / que confere resistência à canamicina; Pridmore, R.D. (1987) Gene 56 , 309-3127 foi linearizado com Smal. Os fragmentos de DNA de ambas as digestões foram extraídos com fenol e precipitados com etanol. Misturaram-se e ligaram-se os fragmentos de DNA. A mistura de ligação foi usada para transformar /Hanahan, D.J. 1983) Mol. Biol. 166, 557-5807 células competentes de ÍS. coli JM101 / Yanisch-Perron, C. et al (1985) Gene 33 , 103-1197 expressa durante 2 h a 37°C em meio LB e depois semeadas em placas de agar LB suplementado com 50 ug/ml de canamicina, 30 jig/ml de X Gal e 7 ug/ml de IPTG.

colónias brancas resistentes à canamicina foram cultivadas. O DNA de plasmideo foi analisado por digestão com Xbal e BamHI/Kpnl. Um clone isolado que perdeu a parte do vector pUC19 do sítio pDP31, restaurou a grelha de leitura D de dois micron por religação do sítio PstI e que tem o extremo cerse do plasmideo pKl9 inserido no sítio Hpal foi referido como pDP91. O plasmideo contem os fragmentos grandes Hpal-PstI e o pequeno PstI-Hpal do plasmideo de dois-micron clonado no sítio Smal de pKl9 . Por religação dos sítios PstI reconstituiu-se a grelha de leitura D.

-530 gene URA3 foi isolado num fragmento HindIII de 1,17 kb do plasmideo pDP34 (ver Exemplo 9) e clonado no sítio único HindIII do plasmideo pUC12. Um clone com o gene URA3 inserido na mesma orientação do gene de resistência à ampicilina foi referido como pUC12/URA3.

O plasmideo pDP91 e pUC12/URA3 foram ambos digeridos com Saci e BamHI resultando em dois fragmentos cada. Os fragmentos de DNA foram misturados e ligados e usados para transformar células competentes 12. coli JM109 . As células foram semeadas em placas de agar LB suplementado com 100 jug/ml de ampicilina, 30 jjg/ml de XGal e 7 pg/ml de IPTG.

Cultivaram-se 12 colónias brancas resistentes à ampicilina. O DNA de plasmideo foi analisado por digestão com HindIII e Pvul. Um clone isolado foi referido como pDP92, compreendendo a sequência completa de dois micron proficiente para todas as funções conhecidas e o gene URA3 clonado no vector pUC.

b) Clonagem de cassetes de expressão da hirudina em pDP92

De modo análogo ao Exemplo 10 pDP92 foi digerido com BamHI. Os extremos coesivos foram preenchidos numa reacção com DNA-polimerase Klenow. O DNA foi ainda cortado com Sall. Isolou-se o fragmento vector de 10,2 kb. O fragmento Sall-(HindIIl7/extremo cerse de 1,1 kb do plasmideo pJDB207/GAPFL-YHIR foi isolado e ligado ao fragmento vector.

Analisaram-se 6 colónias transformadas resistentes à ampicilina. 0 DNA de plasmideo foi digerido com BamHI, PstI e SalI/BamHI. Um clone com os fragmentos de restrição esperados foi seleccionado e referido como pDP92/GAPFL-YHIR. De modo semelhante o plasmideo pDP92/GAPFL-YHIR é obtido usando o fragmento SalI_/^_HindIIl7-

-54/extremo cerse do pJDB207/GAPFL-YHIR (ver Exemplo 7).

plasmideo pDP92/PHO5 {-173)-YHIR foi construído como descrito no Exemplo 10 usando o fragmento vector Sall-/ BamHl7/ext.remo cerse de 10,2 kb do pDP92 (ver atrás) .

Exemplo 13:

Construção de estirpes hospedeiras de Saccharomyces cerevisiae sem DNA de dois-micron

Para remover o plasmideo endógeno dois-micron, num primeiro passo introduziu-se uma delecção no gene URA3 da estirpe HT246 (DSM 4084; , leu 2-3, leu 2-112, prb) para tornar a estirpe auxotrófica para uracilo. HT246 foi transformada σκι 1 pg do plasmideo YePl3 / Broach, J.R., Strathern, J.N., Hicks, J.B. (1979) Gene 8, 121-1237 usando o ptotocolo de transformação descrito por Hinnen et al. /Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75, 1929 (1978) 7 · 10 pg do plasmideo pUC12ura3 Δ contendo uma delecção no gene URA3 / Sengstag, Ch., Hinnem, A. (1987) Nucleic Acids Research 15 , 233-2467 foram adicionados juntamente com o plasmídeo YEP13 . Aproximadamente 3000 transformantes prototróficos para leucina foram ressuspensos em 5 ml de meio mínimo (Difco Yeast Nitrogen Base sem aminoácidos a que se adicionou 2% de glucose, 0,1% de leucina, 0,1% de uracilo e 0,25% de ácido fluoroorótico) num pequeno frasco de agitação e incubados durante 60 horas a 30°C e 180 rpm. Os transformantes que cresceram são resistentes ao análogo teórico do ácido fluoroorótico e são portanto portadores de uma substituição no gene URA3 cromossómico por ura3 Δ . As células crescidas foram semeadas em meio completo composto por (g/1): Peptona 20, extracto de levedura 10, glucose 20 e após crescimento durante 48 h a 30°C replicadas em meio mínimo (Difco)

-55de base azotada para leveduras sem aminoácidos (suplementado com 2% de glucose e 0,1% de leucina) para detectar auxotróficos para uracilo. Vários auxotróficos foram repicados e testados quanto à perda do plasmideo YEP13 que confere auxotrofia para leucina. Uma colónia individual (designada Tr889) que requere leucina e uracilo foi repicada e usada para experiência posteriores.

Tr889 foi transformada com oplasmídeo pDP38 / obtido a partir do plasmideo pDP34 por digestão com Sphl e religação do fragmento resultante de 8,4 kb ; ver Fig. 47, a qual é portadora dos genes marcadores LEU2 e URA3 (protocolo de transformação atrás). As células de levedura transformadas foram primeiro seleccionadas em placas de meio mínimo para leveduras deficientes em uracilo, suplementado com leucina e suplementado com uracilo 10 colónias que cresceram muito pouco foram repicados e cultivados individualmente em meio líquido completo (supra) durante cerca de uma centena de gerações. Ao fazer-se isto as células perderam o plasmideo pDP38 e - até certas percentagens - também simultaneamente o plasmideo endógeno dois micron.

colónias'que requerem uracilo e leucina foram repicadas, o DNA preparado, digerido totalmente com PstI e despistado com DNA de dois-micron de leve32 dura marcado com P em transferencia Southern. Um isolado sem qualquer sinal de hibridação foi referido como H449 (a, leu 2-3, leu 2-112, ura3 , prb, cir°), um derivado isogenico sem dois-micron (cir°) da estirpe de levedura HT246.

-56Exemplo 14: Preparação de uma variante Kexl de S. cerevisiae H449 por destruição do gene genómico KEX1

A actividade de carboxipeptidase yscK foi eliminada de S. cerevisiae estirpe H449 (prb, leu2 , ura3, cir°) através da destruição do gene genómico KEX1. Com esta finalidade o gene KEXl foi identificado numa biblioteca genómica de levedura e clonado num vector adequado.. 0 gene URA3 que serve como marca selectiva, é inserido no gene estrutural de KEX1 para destruir a sua grelha de leitura. O DNA do plasmideo híbrido compreendendo o gene URA3 delimitado de ambos os lados por sequências KEX1 foi introduzido na estirpe de levedura H449 Ura^-. A.homologia de sequências do gene KEX1 no plasmideo e no cromossoma permite recombinançaõ in vivo, a qual transforma células de levedura Ura^- em Ura ⁺ e concomitantemente passam de KEX1 a Kexl. As estirpes com um gene Kexl destruído não sintetizam uma proteína yscX funcional.

gene codificador de KEX1 foi clonado a partir de uma biblioteca genómica de levedura /no vector vai-vem com centrómero pCS19; Sengstag, C. et al., (1987) Nucl. Acids Res. 15 , 2337 por hibridação de colónias com uma oligonucleotídeo sonda específica para KEX1. A sequência do oligonucleotídeo que se segue

5' -CTCGAATCCCCCCCTTTTAGGGTGAATTCA- 3’ deriva da sequência publicada para KEX1 / cf. Dmochowska, A. et al . , (1987) Cell 50 , 5737 e foi seleccionada a partir da sequência completa pela sua homologia particularmente baixa com a sequência de ysc Y . Ela híbrida com DNA de KEX1 a montante do sítio de restrição EcoRV o qual foi usado para inserção do gene URA3 . O mesmo oligonucleotídeo pode ser

-57usado como iniciador de sequenciação para a confirmação da inserção do fragmento URA3 . Este oligonucleotideo sintético foi marcado radioactivamente e usado no despiste da biblioteca de genes.

Cerca de 10 000 clones /~5 χ 2 000 clones/placa (0 = 140 mm) 7 foram despistados por hibridação de colónias / cf. Woods, D.E., et al (1982) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79 , 5661 e Whitehead A.S., et al (1983) Proc Natl. Acad. Sei USA 80 , 53877- A partir de dois processos de despiste repetidos isolaram-se 5 clones positivos independentes. Um deles foi designado pKEXl. Para remover um fragmento HindIII-BamHI específico de KEX1 (1380 pb), o DNA do plasmideo pKEXl foi digerido com as duas endonucleases correspondentes. O fragmento respectivo foi transferido para o vector Bluescript M13+ com poliadaptador SK e este clone foi sequênciado usando um iniciador universal para o vector M13 para confirmar o fragmento KEX1 e designado pKEX!M13.

O plasmideo pUC12/URA3 (ver exemplo 12a), contendo o gene URA3 clonado como um fragmento HindIII, foi digerido com HindIII para isolar o fragmento HindIII de 1170 pb /cf . Rose, M. et al. (1984) Gene 29 ,

1157. Os extremos coesivos do fragmento foram preenchidos com polimerase Klenow para criar extremos cerses. Por outro lado, o palsmídeo pKEXlM13 foi linearizado por digestão com a endonuclease EcoRV, pelo que o fragmento HindIII-BamHI de KEX1 foi cortado e desfosforilado com fosfatase alcalina para evitar auto-ligação. Em seguida estes dois fragmentos de DNA foram misturados, ligados e usados para transferir E. coli estirpe JM103.

Os transformantes foram analisados por digestão dupla com HindIII e BamHI onde o tamanho do fragmento HindIII-BamHI considerado aumenta de 1380 pb para

2530 pb. O DNA de um clone correcto foi sequenciado usando o oligonucleotídeo atrás descrito como iniciador de sequênciação para confirmar a inserção do fragmento URA3 no gene KEX1 na posição do sítio de corte por EcoRV. O plasmideo foi designado pKEXlM13-URA3.

O DNA de pKEXlM13-URA3 foi digerido com HindIII e BamHI para remover o fragmento híbrido KEX1-URA3 e sem separação do vector introduzido em S. cerevisiae H449 de acordo com o método atrás referido (ver Exem pio 3). Após isolamento da fracção de membranas dos transformantes URA3⁺, a actividade de ysc A foi medida usando um substracto cromogénico (ver exemplo 1). Um transformante isolado, que não apresenta actividade de protease yscX foi designado S. cerevisiae H449 Kexl.

-59Exemplo 15: Transformação de S. cerevisiae estirpe H449Kexl

Saccharomyces cerevisiae estirpe H449Kexl foi transformada com os plasmídeos pD?34/?HO5(-173)-HIR pDP34/GAPFL-HIR pDP34/GAPEL-HIR dDP34/PHO5(-173)-YHIR pDP34/CAPFL-YHIR _pDP34/GAPEL-YHIR pPP92/PHO5(-I73)-YHIR _PDP92/GAPFL-YHIR pDP92/GAPFL-YHIR

-60usando o protocolo de transformação descrita por Hinnen et al . , (supra). As células de levedura transformadas foram seleccionadas em placas de meio mínimo para leveduras suplementando com leucina mas sem uracilo. Células de levedura transformadas isoladas foram repicadas e designadas

Saccharomyces	cerevisiae
Saccharomyces	cerevisiae
Saccharomyces	cerevisiae
Saccharomyces	cerevisiae
Saccharomyces	cerevisiae
Saccharomyces	cerevisiae
Saccharomyces	cerevisiae
Saccharomyces	cerevisiae
Saccharomyces	cerevisiae

H449kexl/pDP34/PHO5(-l73)-HIR H449kexl/pDP34/GAPFL-HIR H449kexl/pDP34/GAPEL-HIR H449kexI/pDP34/PHO5(-173)-YHIR H449kexl/pDP34/GAPFL-YHIR H449kexl/pDP3A/GAPEL-YHIR H449kexl/pDP92/PHO5(-173)-YHIR H449kexl/pDP92ZGAPFL-YHIR H449kexl/pDP92/GAPEL-YHIR

Exemplo 16:

Fermentação de estirpes de leveduras transformadas numa escala laboratorial

As células de Saccharomyces cerevisiae H449Kexl/pDP34/PH05 (-173)-YHIR e de Saccharomyces cerevisiae H449 Kexl/pDP34/GAPFL-YHIR foram cultivadas em duas préculturas subsequentes de 10 ml de meio mínimo composto por (g/1):

-61Difco Yeast Nitrogen Base 6,7 asparagina 10 leucina 1 glucose 20 da durante 60 inoculada com 24 h a 28°C e

A primeira pré-cultura foi cultivah a 28°C e 180 rpm. A segunda pré-cultura foi 2% da primeira pré-cultura e incubada durante 180 rpm.

O meio de cultura principal é composto por (g/1 ) :

extracto de levedura 49 glucose 5 frutose 57

NH₄NO₃ 0,5

MgSO₄x7H₂O 1,0

CaCo₃ 5,0

Ca₃(PO₄)₂ 2,0

A cultura principal foi inoculada com cerca de 2x10^ células/ml e incubada até 72h a 28°C e g

180 rpm. Obtiveram-se cerca de 1x10 celulas/ml no fim da fermentação. A várias culturas no decurso da fermentação.

A várias alturas no decurso da fermentação retiraram-seamostras das culturas , as células foram removidas por centrifugação e a calda sobrenadante da cultura analisado guanto à dessulfato-hirudina por HPLC (infra).

-62Exemplo 17: Produção da variante de dessulfato-hirudina HV1 numa escala de 50 1

Um banco de células da estirpe de Saccharomyces cerevisiae sem dois-micron H 449Kexl/pDP34/ /GAPFL-YHIR, foi usado como fonte de inoculo para a produção de dessulfato-hirudina numa escala de 50 1.

As ampolas do banco de células foram preservadas na fase de vapor num contentor de azoto líquido. O conteúdo de uma ampola foi usado para inocular uma cultura em frasco de agitação compreendendo meio selectivo constituído em (g/1).

base azotada	para leveduras	8,4
mono-hidrato	de L-asparagina	11,4
L-histidina		1,0
L-leucina		o,i
mono-hidrato	de D-glucose	20,0

O frasco de 500 ml contem 100 ml de meio e foi incubado durante 48 h a 28°C num agitador orbital a uma velocidade de agitação de 180 rev/min.

frasco de cont idos O nível e os itador

A segunda pré-cultura em agitação contem o mesmo meio do qual 600 ml estão num frasco de 21o qual tem quatro anti-vectores. de inoculo da primeira pré-cultura é de 5% (30 ml) frascos foram incubados durante 48 h a 28°C num ag orbital a uma velocidade de 120 rev/min.

Uma terceira pré-cultura foi fermentada num bioreactor de 50 1 em ácido inoxidável equipado com quatro pás anti-vortex e um agitador de turbina de disco

-63único com um diâmetro de 115 mm. O meio acima foi também usado para esta cultura sendo o volume de partida de 30 1. Um único frasco de 2 1 contendo 600 ml de cultura foi usado para inocular o reactor de 50 1 (2%). A fermentação dura cerca de 42 h a uma temperatura de 28°C. A velocidade do agitador é de 600 rev/min, a velocidade de arejamento de 1 vvm e o reactor foi posto a funcionar com uma sobrepressão de 0,3 bar.

Um bio-reactor semelhante de 50 1, adicionalmente eguipado para processos de alimentação foi usado na fase,de produção da dessulfato-hirudina. Um meio consistindo em (g/1).

peptona de carne (Merck) 5,0 extracto de levedura 30 ,0 sulfato de amónio 6,0 hepta-hidrato de sulfato de magnésiol,0 cloreto de sódio 0,1 di-hidrogenofosfato de potássio 1,0 mono-hidrato de D-glucose 10,0 foi usado nesta fase (30 1). O nível de inóculo da terceira fase de precultura é facultativamente 2%. A fermentação dura cerca de 48 h a uma temperatura de 28°C, e a velocidade do agitador foi marcada a 750 rev/min. A sobrepressão foi incialmente estabelecida a 0,3 bar mas isto pode ser aumentado para 1,0 bar no decurso da fermentação para manter a tensão do oxigénio dissolvido acima de 20% da saturação.

O fluxo de ar inicial foi de 0,25 vvm mas isto foi aumentado para 1 vvm após nove horas de modo a assegurar um fornecimento de oxigénio adeguado.

valor do pH cai durante a fase inicial da fermentação para um valor de 5,0 no qual é manti do através da adição automática de hidróxido de amónio.

Numa cultura em batch simples o nível de biomassa atingido e consequentemente o título de dessulfato-hirudina, está dependente da quantidade da fonte de carbono que é colocada na fermentação inicialmente. Ist por sua vez é ditado pela capacidade de transferência da oxigénio do bio-reactor e pela necessidade de evitar produção excessiva de etanol pela levedura em crescimento. Estas limitações podem ser ultrapassadas usando tecnologia de fed-batch. Assim muito pouca glucose é incluída no meio de partida mas faz-se uma alimentação de glucose para suportar uma concentração de biomassa final considerávelmen te superior a um título de dessulfato-hirudina de aproximadamente três vezes o atingido na cultura em batch. Na prática a limentação é aumentada em intervalos de modo gradual até uma velocidade de alimentação final de 175 g/h de mono-hidrato de glucose.

Pequenas adições de um anti-espumante baseado em silicone foram usadas para controlar a for mação de espuma quando necessário. Uma porção de gás que sai do fermentador foi analisado para dar informações acerca da tomada de oxigénio e velocidade da libertação de dióxido de carbono. A tensão do oxigénio dissolvido foi medida usando um eléctrodo esteriligável.

Retiraram-se amostras com intervalos de 6 horas ao longo do processo para permitir o controle das concentrações de glucose e de etanol, o título de desssulfato-hirudina por bioensaio e HPLC e também para tes tar a esterilidade. Conforme evidenciado por HPLC a dessul fato-hirudina produzida está essêncialmente livre de análogos encurtados no extremo C. No fim do processo de fermen-

-64tação a dessulfato-hirudina pode ser recuperada a partir do sobrenadante de cultura.

Exemplo 18: Recuperação de dessulfato-hirudina a partir de S. cerevisiae cultivada numa escala de 50 1

O caldo de cultura (ver Exemplo 17) foi misturado com Amberlite XAD-2 e foi sujeito a adsorção durante cerca de 4 horas a 25°C. As células foram separadas da resina numa coluna. Após lavagem com IM NaCl a resina foi eluida com tampão Tris (50 mM, pH 7,0-8,5). A fraeção principal (30 1) foi ajustada a pH 2,9 e aplicada numa coluna de S-Sepharose (Amicon PA, equilibrada com tampão formiato de amónio 25 mM, pH 2,9) tendo um volume de leito de 2 1. Após lavagem com tampão formiato de amónio (40 mM, pH 3,6) fez-se eluição com tampão formiato de amónio (50 mM, pH 3,8). A principal fraeção eluida (10 1) foi concentrada por meio de um sistema de ultrafiltraçao. Filtrou Minisette equipado com uma membrana JL 3K. Uma amostra de 0,5 1 da solução límpida de proteína resultante foi aplicada numa coluna de Bio-Gel P-6 fine (Amicon GF equilibrada com ácido acético a 0,5%) tendo um volume de leito de 1,5 1. A eluição foi feita com ácido acético a 0,5%. A fraeção principal do material eluido (1 1) foi concentrada por meio de ultrafiltração e subsequentemente aplicada numa coluna de fluxo rápido de Q-Sepharose (Amicon PA, equilibrada com tampão formiato de amónio 25 mM, pH 2,9) tendo um volume de leito de 2 1. A eluição foi feita com tampão formiato de amónio (50 mM, pH 4,2). A fraeção principal do material eluido foi concentrada por meio de ultrafiltraçao e subsequentemente diafiltrada contra água. A solução aquosa límpida resultante foi liofilizada. O sólido consiste em dessulfato-hirudina pura sem quantidades detectáveis de análogos encurtados no extremo C.

-65Exemplo 19: Disrupção do gene PRAl em S. cerevisiae H449

S_. cerevisiae estirpe H449 (DSM 4413; prb, leu2 , ura3, cir°) foi tornada deficiente em múltiplas proteases por meio da disrupção de genes. A disrupção de genes comparado com os cruzamentos meióticos tem a vantagem de introduzir estávelmente uma mutação mentendo ao mesmo tempo o fundo genético de uma dada estirpe idêntica.

Num primeiro passo, a actividade de proteinase yscA foi eliminada via disrupção do gene PRAl/ Ammerer; G. et al . (1986) Mol. Cell. Biol. 24907PRAl foi isolado a partir de DNA genómico total de levedura, digerido com Saci e PstI. Isolaram-se fragmentos de 2 kb a partir de um gel preparativo de 0,6% de agarose, electroeluiram-se e ligaram-se aos sítios PstI-SacI da região de poliadaptadores de pUC19. 0 vector foi usado para transfirmar E. coli JM109 e 280 colónias individuais foram repicadas. As colónias foram cultivadas individualmente em poços de placas de microtitulação contendo meio LB+amp. A hibridação de colónias foi efectuada essêncialmente como descrito / Woods, D.E. et al (1982) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79,

2

56517 com a sonda oligonucleotídica marcada com P que se segue

5'-AAGCCTAGTGACCTAGT-3' a qual deriva da sequência de PRAl publicada /~Ammerser et al . , supra7. 3 clones positivos foram repicados, o DNA de um -pUC19/PRAl - foi cortado com Saci e Xhol e o fragmento de 1,9 kb contendo todo o gene PRAl subclonado na região de poliadaptadores de KS do vector Bluescript M13 + (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA, USA). Um fragmento HindIII de 1,2 kb contendo todo o gene URA3 / Rose, M. et al (1984) Gene 29 , 1137) foi inserido no sítio HindIII único dentro da região codificadora da inserção PRAl. O plasmideo

-66resultante foi designado M13+/pral::URA3, Ml3+/pra::URA3 foi digerido com Sacl/Xhol e o fragmento de 3,1 kb sem separação do vector foi usado para transformar S. cerevisiae H449 como descrito (ver Exemplo 3). Os transformantes independentes de uracilo foram repicados, o DNA preparado e digerido com Sacl/Xhol foi testado quanto à disrupção correcta do gene PRAl por transferência Southern.

Um transformante com a alteração correcta do fragmento Sacl/Xhol hibridando com PRAl de l,5kb a 3,1 kb foi designado Trll86.

No passo seguinte Tr 1186-com a disrupção do seu gene PRA1 por pral::URA3 foi novamente tornado dependente de uracilo através da introdução de uma delecção na inserção do gene pral::URA3. Tr 1186 foi transformado com 1 pg do plasmideo YEpl3 / Broach, J.R. et al (1979) Gene £, 121) juntamente com 10 jjg do plasmideo pUCl2ura3delta contendo uma delecção de 200 pb no gene URA3 /Sengrtag, C. et al (1978) Nucleic Acids Research 15 , 2337 )- 3000 transformantes de levedura prototréficos para leucina foram ressuspensos em 5 ml de meio mínimo (base azotada para leveduras da Difco sem aminoácidos a que se destinou 2% de glucose, 0,1% de leucina, 0,1% de uracilo e 0,25% de ácido fluororótico) num pequeno frasco de agitação e incubados durante 60 horas a 30°C e 180 rpm. Os transformantes que cresceram são resisitentes no análogo tóxico ácido fluoroorótico e são portanto portadores de uma substituição na região pral::URA3 por ura3delta. As células cultivadas foram semeadas em meio completo composto por (g/1): Peptona 20, extracto de levedura 10, glucose 20 e após crescimento durante 48 horas a 30°C transferidos para meio mínimo (base azotada para levedura Difco sem aminoácidos, suplementado com 2% e 0,1% de leucina), para detectar auxotróficos para uracilo. Vários auxotróficos foram repicados e testados quanto à perda do plasmídeo YEpl3 conferindo auxotrofia para leucina. Uma colónia individual-designada Tr 1195 - requerido leucina e uracilo foi repicada e usada para experiências posteriores.

Exemplo 20: Disrupção do gene PRCl em Tr 1195

Em seguida, a actividade de carboxipeptidase YscY em Tr 1195 foi eliminada. PRC1 codificador de YscY / Rothman, J.H. et al. (1986) Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 83 , 32487 foi isolado a partir da biblioteca genómica de levedura no vector pCS19 com centrómero / Sengrtag, C. et al (1978) Nucleic Acids Research 15 , 2337 por hibridação de colónias com 2 oligonucleotídeos sintéticos,

5'-GAAAGCATTCACCAGTTTACTATGTGG -3' .

5'-CGAATGGATCCCAACCGGTTTCTCC -3' correspondendo aos extremos 5' e 3' da sequência codificadora de PRCl. Um clone positivo foi designado pCS19/cpy8.

O DNA de pCS19/cpy8 foi digerido com Clal/PvuII, aplicado num gel preparativo de 0,6% de agarose e isolado um fragmento de 2,6 kb gue se electroeluiu. Este fragmento Clal/PvuII contendo todo o gene PRCl foi ainda subclonado nos sítios Narl/Smal de pUC19. O plasmideo resultante pUCl9/PRCl foi cortado no sítio único StuI ao qual se ligou um fragmento URA3 de 1,2 kb (ver Exemplo 19). Com esta finalidade, os extremos coesivos HindIII do fragmento contendo URA3 foram preenchidos numa reacção com DNA polimerase Klenow para se adaptar ao sítio StuI de extremo cerse do pUC/PRCl.

-680 plasmideo resultante pUC19/pre::URA foi digerido com Aatll e o fragmento Aatll sem separação do vector foi usado para transformar S_. cerevisiae Tr 1195 como descrito. Um transformante independentemente de uracilo - Tr 1206 - foi testado quanto à disrupção correcta do gene PRC1 por transferência Shouthern e depois tornado novamente dependente de uracilo como descrito (ver Exemplo 19). A estirpe de S. cerevisiae resultante foi designado Tr 1210 (pral, prbl, prcl, ura3, leu2 , cir°).

Exemplo 21:

Preparação de uma variante Kexl de S. cerevisiae Tr 1210

A actividade de carboxipeptídase ysc foi eliminada da estirpe de S . cerevisiae Tr 1210 por disrupção do gene genómico KEX1 como descrito (ver Exemplo 14). A estirpe de j[. cerevisiae resultando, que não apresenta actividade de protease ysc foi designada Tr 1302 (pral, prbl, prcl, ura3, leu2, cir°, Kexl).

Exemplo 22: Construção de mutantes de hirudina HVl-KR ,

HV1- SFRY, HV1-WQLR

Para avaliar ainda a degradação C-terminal mediada por ysc<\ de proteína heterólogas com diferentes aminoácidos C-terminais, criaram-se mutantes de hirudina com diferentes composições em aminoácidos C-terminais. Como método geral usou-se mutagénese dirigida específica de sítio, em principio como descrito /^_Bio-Rad Muta-Gene M13Kit, Bio-Rad Richmond Ca, USA 7.

-69Construiram-se os mutantes que se seguem:

1. HV1-KR correspondendo a variante de hirudina /^-Lis^^-Arg^^7

2. HVl-SFRY, correspondendo a / Ser^²-Fen^²-Arg^^-Tir^^7HVl

3. HVl-WQLR, correspondendo a / Trp^²-Glu⁶^-Leu⁶⁴-Arg^^7 HV1

As sequências de aminoácidos de todos os mutantes de hirudina correspondem à da variante de hirudina 1 até ao aminoácido 61 ou 63, respectivamente .

Em HVl-SFRY o extremo C é idêntico ao peptideo natriurético, atrial /^_Vlasuk et al (1986) J.

Biol. Chem. 261, 4789-47967 θ em HVl-WQLR o extremo C corresponde ao factor de crescimento epidérmico / George-Nascimento C. et al (1988) Biochemistry 2 7 , 797-8027 ambos são conhecidos como sendo degradados no extremo C por estirpes de levedura tipo selvagem contendo proteases.

Num primeiro passo , o plasmideo pJDB207/GAPFL-HIR / conforme divulgado no Pedido de Patente Europeia NQ 225633) foi digerido com SalI-HindIII dando um fragmento de 1,2 kb contendo a cassete de expressão da hirudina de tamanho completo. O fragmento SalI-HindIII de 1,2 kb foi subclonado em Blueseript M13+ cortado com Sall-HindlII contendo o poliadaptador SK. 0 plasmideo resultante M13+/HV1 foi usado para transfectar E. coli CJ 236 para incorporar uracilo como descrito (Bio-Rad Muta-Gene M13 Kit acima) . Isolou-se DNA de cadeia simples a partir de E. coli CJ 236 transformada usando o fago auxiliar M13 (stratagene supra).

-70Para construir HV1-KR usou-se o iniciador mutagénico

5'-CCGGAAGAATACAAGAGGTAGCAICCT-i

L HV1-STRY usou-se o inçados „u_t^n =o 5· -CAAGAAATCCGGGAATGTnCAGATACTAGGATCC-rGGTACG-Par aHVl~^wQ^LR 5 o iniciador mutagénico .^Γ.ΖΖτόοεο7ΑΑ';οο;ΑΑ_ετθΑθΑτΑθ_ΟΜοοτο_ΟΙΑθο-3· usou-se

200 pmoles de cada um dos iniciadores foram primeiro fosforilados num volume total de 30 pl contendo 3 pl de IM Tis-HCl pH 8,0, 0,3 pl de IM MgCl₂ ,

0,75 pl de DTT 0,2M, 0,6 pl de 20 mM ATP. Adicionou-se 4,5 unidades de polinucleotídeo-cinase de T4 e a mistura foi incubada a 37°C durante 45 min. e a 65°C durante 10 min.

Os oligonucleotídeos fosforilados foram então emparelhados com o DNA molde nas seguintes condições: 0,1 pmoles de DNA contendo aracilo derivado de M13+/ /HVl foram incubados com 2 pmoles de cada um dos iniciadores fosforilados num volume total de 10 pl de tampão de emparelhamento (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2 mM MgCl₂ , 50 mM NaCl). As misturas foram aquecidas num banho-maria a 80°C e depois deixadas arrefecer lentamente até à temperatura ambiente.

Formaram-se então cadeias complementares nas seguintes condições:

pl cada uma das misturas de emparelhamento foram incuba-

-71dos com 4 jjI de 2 mM dNTP's, 0,75 ^1 de 20 mM ATP, 0,75 ^il de 0,5M Tris-HCl pH 7,4, 0,75 jil de O,1M MgCl₂, 2,15 ^il de 0,2M DTT, 1 unidade de DNA-polimerase de T4 e 2 unidades de DNA-ligase de T4. As misturas depois a 25°C durante 5 min. e finalmente a 39°C durante 90 min. Os DNAs de cadeia dupla resultante foram usados para transformar E. coli JM101, uma estirpe gue remove eficazmente o molde contendo uracilo, deixando replicar a cadeia complementar mutagenizada (Bio-Rad supra). Os plasmideos foram preparados e tes tados guanto à ausência do sítio PstI gue deverá estar presente apenas nos dois últimos codões do DNA de HV1 tipo selvagem não mutagenizado.

A mutagénese correcta foi ainda confirmada por seguênciação dos novos mutantes de hirudina usando o seguinte iniciador:

5'-GAAGGTACCCCGAAACCGCA-3' gue corresponde à seguência codi ficadora da hirudina cerca de 20 pb a montante dos iniciadores mutagénicos.

Finalmente os três fragmentos SalI-HindIII mutagenizados foram removidos do Bluescript M13+ e realizados nos sítios SalI-HindIII em pJDB207.

Os três novos plasmideos foram designados .

1. pJDB207/GAPFL-HV1-KR

2. pJDB207/GAPFL-HVl-SFRY

3. pJDB207/GAPFL-HVl-WQLR

Como alternativa e para se poder transformar estirpes cir° tais como Tr 1302 (supra, ver

-72Exemplo 21) os mutantes de hirudina foram subclonados no vector pDP34 com 2 micron completo (ver Exemplo 9, supra), pDP34 foi cortado no sítio BamHI único e os extremos coesivos foram preenchidos com DNA-polimerase Klenow para criar extremos cerses. Os fragmentos SalI-HindIII do Bluescript M13+ codificador das seguências de hirudina mutagenizados (supra) foram também dotados de extremos cerses e ligados ao sítio BamHI de extremo cerse de pDP34. Os plasmideos resultantes foram designados

1. pJDB207/GAPFL-HV1-KR

2. pJDB2O7/GAPFL-HVl-SFRY

3. pJDB2O7/GAPFL-HVl-WQLR

Exemplo 23: Transformação de S. cerevisiae estirpes BYSKEX1 e BYSKexl com pJDB207/GAPFL-HIR, pJDB207/GAPFL-HV1-KR, pJDB207/GAPFL-HV1-SFRY e pJDB207/GAPFL-HV1-WQLR e de S. cerevisiae estirpes Tr 1210 e Tr 1302 com pDP34/GAPFL.-HV1-KR, pDP34/GAPFL-HV1-SFRY e pDP34/GAPFL-HV1-WQLR pJDB207/GAPFL-HV1-KR, pJDB207/GAPFL-HV1-SFRY, pDB207/GAPFL-HVl-WQLR e pJDB207/GAPFL-HIR foram usados para transformar S, cerevisiae BYSKEX1(=DSM 4583) e BYSKexl usando o protocolo convencional e selecção de leucina (ver Exemplo 3). Do mesmo modo pDP34/GAPFL-HV1-KR, pDP34/GAPFL-HV1-SFRY e pDP34/GAPFL-HVl-WQLR foram usados para transformar S. cerevisiae estirpes Tr 1210 e Trl302.

-73signados

As estirpes resultantes foram deAs estirpes

s.	cerevisiae
s.	cerevisiae
s.	cerevisiae
s.	cerevisiae
s.	ce revi s iae
s.	cerevisiae
s.	cerevi siae
s.	cerevisiae
s.	cerevisiae
s.	cerevisiae
s.	cerevisiae
s.	cerevisiae
s.	cerevisiae
s.	cerevisiae

resultantes foram designadas

BYSKEX1/pJDB2O7/GAPFL-HIR BYSKEX1/pJDB2O7/GAPFL-HVl -KR BYSKEX1/pJDB2O7/GAPFL-HVl-SFRY BYSKEX1/pJDB2O7/GAPFL-HVl-WQLR BYSkexl/pJDB2O7/GAPFL-HIR BYSkexl/pJDB2O7/GAPFL-HVl-KR BYSkexl/pJDB2O7/GAPFL-HVl-SFRY BYSkexl/pJDB2O7/GAPFL-HVl-WQLR

Tr1210/pDP3A/GAPFL-HVl-KR Tri210/pDP34/GAPFL-HVl-SFRY Trl210/pDP34/GAPFL-HVl-WQLR Tri302/pDP34/GAPFL-HVl-KR Tri302/pDP34/GAPFL-HVl-SFRY Tri302/pDP3A/GAPFL-HVl-WQLR

A fermentação das estirpes de S. cerevisiae foi efectuada em meio mínimo (précultura e cultura principal) como descrito (ver Exemplo 17).

Exemplo 24: Análise da variante de hirudina HV1 e suas mutantes a partir de culturas de fermentação dos transformantes de Saccharomyces cerevisiae

BYSKexl e BYSKEX1 usando HPLC de fase reversa

Apos 72 horas de fermentação preparam-se amostras das culturas líquidas de levedura por centrifugação para produzir uma solução límpida que foi diluída a 1:10 (v/v) com ácido acético (IM) e foram sujeitas a análise por HPLC nas condições que se seguem:

Uma coluna HIBAR (MERCK) (4x125 mm) foi cheia com material de fase reversa de sílica esférica MACHEREY-NAGEL), uma fase estacionária esférica com um diâmetro de partícula de 5 jjm e uma porosidade de 100A. As partes da coluna foram equipadas com filtros de aço inoxidável. A fase móvel A foi feita a partir de água (Nanopure®, BARNSTEAD) contendo 0,1% (v/v) de ácido trifluoroacético. A fase móvel B foi feita a partir de 20% de fase móvel A e 80% (v/v) de acetonitrilo (grau de pureza para HPLC, FLUKA) contendo 0,075% (v/v) de ácido trifluoroacético .

As separações cromatográficas foram feitas a um caudal de 1,5 ml/min fazendo corar o gradiente que se segue e os eluentes foram controlados por absorvância a 216 nm.

t(min)	% A	% B
0	90	10
1	79	21
9	79	21
1 7	64	36
20	0	100
22	0	100
24	90	10
' 32/0	90	10

Fez-se uma solução padrão para o sistema de calibração dissolvendo 1 mg de dessulfato-hirudina pura em 2 ml de água, 50 ^il desta solução padrão foram injectados na coluna e cromatografados como descrito para calibrar o sistema.

A Fig. 8 mostra os resultados que indicam os resultados que indicam que S_. cerevisiae BYSKexl produz hirudinas de tamanho completo (quer hirudina tipo selvagem HV1, quer os mutantes HV1-KR, HV1-SFRY, HV1-WQLR) com diferentes tempos de retenção diferentes dos produtos de degradação da hirudina produzidos por íà. cerevisiae BYSKEX1 . A hirudina HV-1 tipo selvagem mostra a mistura típica de HV1 de tamanho completo (tempo de retenção 17,5 min) e os dois produtos de degradação HIR-64 (tempo de ret. 17,8 min) e HIR-63 (tempo de ret. 15,33 min) em BYSKEX1. BYSKexl produz apenas HIR-65 (tempo de ret.17,05) No caso do mutante HV1-KR BYSKEX1 produz-se exclusivamente o produto de degradação sem os dois aminoácidos C-terminais (=HIR-63, tempo de ret. 15,9 min), enquanto que BYSKexl

-76produz HVl-KR de tamanho completo (tempo de ret. 14,4 min).

No caso do mutante HV1-WQLR BYSKEX1 mostra-se o produto de degradação com um tempo de retenção de 18,6 min; BYSKexl produz predominantemente HV1-WQLR de tamanho completo (tempo de ret. 17,3 min) e apenas vestígios do produto de degradação HVl-SFRY de tamanho completo encontra-se apenas em pequenas quantidades (tempo de ret. 17,1 min) em BYSKexl mostra apenas HVl-SFRY intacto (tempo de ret. 17,1 min). O pico grande (tempo de ret. 15,7 min) não está relacionado com HVl-SFRY.

Resultados análogos foram obtidos quando estirpes KEX1 de S_. cerevisiae Tr 1210/pDP34/GAPFL-HV1-KR, Tr 1210/pDP34/GAPFL-HV1-SFRY eTR 1210/pDP34/GAPFL-HV1-WQLR foram comparados com as correspondentes estirpes Kexl Tr 1302/pDP34/GAPFL-HV1-KR, Tr 1210/pDP34/GAPFL-HV1-SFRY e Tr 1302/pDP34/GAPFL-HV1-WQLR.

Depósito de microorganismos

As estirpes de microorganismos que se seguem foram depositadas na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg lb, D-3300 Braunsachweig tetas de depósito e números de acesso dados):

Saccharomyces cerevisiae H449: 18 de Fevereiro, 1988, DSM 4413 Escherichia coli JM109/pDP38: 19 de Fevereiro, 1988 DSM 4414; Escherichia coli JM109/pDP34; 14 de Março, 1988, DSM 4473. Saccharomyces cerevisiae BYS232-31-42: 6 de Maio,1988, DSM 4583

-Π-

Claims (21)

1. REIVINDICAÇÕES lâ. - Método para a produção de uma estirpe de levedura que não possui actividade de carboxipeptidase ysc e que foi transformada com um vector híbrido compreendendo um promotor de levedura operaciona3 mente ligado a uma sequência de DNA codificadora de uma proteína heteróloga, caracterizado por compreender a transformação da referida estirpe de levedura com o referido vector híbrido.
2. 2â. - Método para a produção de uma estirpe de levedura de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o vector híbrido compreender um promotor de levedura operacionalmente ligado a uma primeira sequência de DNA codificadora de um peptideo sinal ligado na grelha de leitura correcta a uma segunda sequência de DNA codificadora de uma proteína heteróloga e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação de transcrição de levedura .
3. 3ã. - Método para a produção de uma estirpe de levedura de acordo com a reivindicação 1, ca racterizado por a proteína heteróloga ser dessulfato-hirudina .
4. 4â. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzir uma estirpe de levedura que adicionalmente não possui actividade de peptidase seleccionadas do grupo constituido pelas actividades yscA , yscB, YscY e YscS.
5. 5â. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzir uma estirpe de levedura que não possui actividade de yscY.
6. 6a. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzir uma estirpe de levedura que não possui as actividades de yscY, yscB e yscS .
7. 7â. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzir uma estirpe de levedura que não possui as actividades de yscY, yscA e yscB .
8. 8â. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzir uma estirpe de levedura sem DNA de dois microns endógeno e que foi transformada com um vector híbrido compreendendo o DNA de dois microns completo incluindo os genes REPl, REP2 e FLP intactos, assim como sítios ORI, STB, IRl e IR2 intactos.
9. 9â. - Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por se produzir uma estirpe de levedura que não possui actividade yscY.

   lOâ. - Método de acordo com a reivindicação 8 , caracterizado por se produzir uma estirpe de levedura que não possui actividade yscY , yscB e yscS.

   llâ. - Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por se produzir uma estirpe de levedura que não possui actividade yscY, yscA e yscB.
10. 12â. - Método de acordo com a reivindi ação 1, caracterizado por se produzir uma estirpe de levedura em que o vector híbrido compreende um promotor de levedura seleccionado do grupo constituído pelo promotor MF .y( 1, promotor GALl, um promotor de um gene codificador de uma enzima glicolitica, promotor ADHI, promotor TRPl e o promotor PHO5 que foi facultativamente desprovido dos seus sítios de activação a montante.
11. 13â. - Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se produzir uma estirpe de levedura em que o vector híbrido compreende uma primeira sequência de DNA seleccionada do grupo constituído por sequência sinal da hirudina, as sequências sinal e prepro da invertase, de levedura, factor , feromona-peptidase (DEX1), toxina assassina e genes reprimíveis da fosfatase ácida (PHO5) de levedura e a sequência sinal da glucosamilase de Aspergillus awamori.
12. 14â. - Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se produzir uma estirpe de levedura em gue o vector híbrido compreende uma segunda sequência de DNA que codifica um composto de dessulfato-hirudina seleccionado do grupo constituído por variantes HV1, HV2 , HV2 (modificada, ab, c), PA da

    HV1(modifiçada a,b) dessulfato-hirudina -hirudina.

    variantes de PA e desíVa^Messulfato
13. 15ê. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzir uma estirpe de levedura em que o vector híbrido compreende uma ou mais mar cas genéticas selectivas para uma levedura.
14. 16ê. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzir uma estirpe de levedura em que o vector híbrido compreende uma marca genética selectiva, e uma origem de replicação para um hospedeiro bacteriano.
15. 17â. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzir uma estirpe de Saccharomyces cerevisiae de acordo com a reivindicação 1.
16. 18â. - Método para a produção de uma proteína heteróloga para levedura caracterizado por compreender a cultura de uma estirpe de levedura sem actividade de carboxipeptídase ysc χ e que foi transformada com um vector híbrido compreendendo um promotor de levedura operacionalmente ligado a uma sequência de DNA codificadora da referida proteína heteróloga e o isolamento da referida proteína heteróloga.
17. 19ê. - Método de acordo com a reivindica ão 18, caracterizado por se produzir uma proteína heteróloga para levedura em que o híbrido consiste num promotor de levedura operacionalmente ligado a uma primeira sequência de DNA codificadora de um peptideo sinal ligado na grelha de leitura corrente a uma segunda sequência de DNA codificadora da referida proteína heteróloga e uma sequência de DNA contendo os sinais de terminação da transcrição de levedura.
18. 20ã. - Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por a proteina heteróloga ser suceptivel de degradação C-terminal após tradução pela carboxipeptidase ysc
19. 21θ. - Método de acordo com a reivindicação 18 , caracterizado por os dois aminoácidos C-terminais da proteína heteróloga serem seleccionados do grupo constituído por Lis, Arg, Tir, Ala, Leu, Gin, Glu, Asp, Asn e Ser.
20. 22ã. - Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por se produzir uma proteína heteróloga para levedura em que a referida proteína heteróloga é dessulfato-hirudina.
21. 23ã. - Método de acordo com a reivindciação 22, caracterizado por se preparar um composto de dessulfato-hirudina seleccionado do grupo constituído por variante de dessulfato-hirudina HVl, HVl (modificada a, b), HV2 , HV2 (modificada a, b, c), PA, variante de PA e des(Vai2)-dessulfato-hirudina.

    24â. - Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por se preparar a variante HVl da dessulfato -hirudina. 25â. - Método de acordo com a rei

    vindicação 22, caracterizado por se preparar uma dessulfato-hirudina da fórmula

    Xi Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Gin Gly Asn X₃ Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu X₃ Asn Gin Cys Vai Thr Gly Glu Gly Thr Pro Xu Pro Gin Ser Xs Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu X₆

    (IV), em que representa o resíduo dipeptídico Val-Val, X^, X^ e X^ são Lis , Xç. é His e Xg é seleccionado do grupo constituído por Glu-Tir-Lis-Arg, Ser-Fen-Arg-Tir e Trp-Glu-Leu-Arg .

    Lisboa, 2 de Maio de 1989 rua victor CCROON. 10-A, 1.· 12C0 LISBOA

    FOLHA 1 (11 FOLHAS)

    J.

    Cromatografia liquida analítica de fase reversa da hirudina colhida das culturas de BYSKEXl/pJDB207/ PH05-HIR e BYSKEXl/pJDB207/PH05-HIR