JPH02104279A - ポリペプチドの製造における改良 - Google Patents

ポリペプチドの製造における改良

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JPH02104279A
JPH02104279A JP1112294A JP11229489A JPH02104279A JP H02104279 A JPH02104279 A JP H02104279A JP 1112294 A JP1112294 A JP 1112294A JP 11229489 A JP11229489 A JP 11229489A JP H02104279 A JPH02104279 A JP H02104279A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、組換ＤＮＡ技術の分野に関し、そして特に、
遺伝子操作された酵母細胞によるポリペプチドの製造の
ための改良された方法、該遺伝子操作された細胞、及び
該酵母細胞の製造方法に関する。
〔従来の技術〕
最近、非常に多数の異種蛋白質が、該蛋白質、例えばα
−インターフェロン（ＩＦＮα、　１ｌｉｔｚｅ削ａｎ
等（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ　２９４．７１７−７２
２）　、リゾチーム（Ｏｂｅｒｔｏ等（１９８５）　Ｇ
ｅｎｅ　４０．５７−６５）　、ａ−アミラーゼ（Ｓａ
ｔｏ等（１９８６）　Ｇｅｎｅ　５Ｑ、　２４７−２５
７）　、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ、
ヨーロッパ特許出１１１Ｎｏ、　１４３．０８１）　、
又はデスルファトヒルジン〔ヨーロッパ特許出願Ｎα２
２５　、６３３　）をコードするＤＮＡ配列を含んで成
る適当な発現ベクターによる酵母細胞の形質転換後に酵
母において発現されている。しかしながら、多くの場合
、異質蛋白質は純粋な形では合成されず、Ｃ−末端が短
縮された蛋白質のごとく部分的に分解された蛋白質の混
合物として合成される。例えば、ヒト心房性ナトリウム
利尿ペプチド（ｈＡＮＰ）の酵母での発現は、Ｃ−末端
を異にする２つの形の成熟ｈＡＮＰの分泌をもたらす（
Ｖｌａｓｕｋ等（１９８６）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ
ｅｍ。
％３１．４７９８−４７９６）。主たる形は該蛋白質の
最後の２個のアミノ酸（Ａｒｇ　１５０及びＴｙｒ　１
５１）を欠いており、他方少い方は完全な長さの物質で
ある。酵母における表皮成長因子（ＥＧＦ）の発現の後
に同様の結果が得られ（Ｇｅｏｒｇｅ−Ｎａｓｃｉｍｅ
ｎｔｏ等（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７
．７９７−８０２）　、この場合、最後のアミノ酸（Ａ
ｒｇ　５３）又は最後の２個のアミノ酸（Ｌｅｕ　５２
及びＡｒｇ　５３）が欠けており、そして完全な長さの
ＥＧＦが生産されなかったという意味において、分泌さ
れた発現生成物は不均一であった。
非常に最近分子生物学者から大きな注目をあびたポリペ
プチドはヒルジンである。
ヒルジンはヒル〔ヒルド・メディシナリス（Ｈｉｒｕｄ
ｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）中に自然に存在する抗凝
固物質である。ヒルジンは単一のポリペプチド種ではな
く、ヒルジン変形体１（ＨＶ１）、ヒルジン変形体２　
（ＨＶ２）（ヨ　０７パ特許出願Ｎａ　１５８，５６４
を参照のこと）、ヒルジン変形体Ｐ　Ａ　（ＰＣＴ出願
Ｎ０８６１０３４９３を参照のこと）及びｄｅｓ　−（
Ｖａｌｔ　−ヒルジン（ヨーロッパ特許出願Ｎα１５８
９８６を参照のこと）と称する少なくとも４種類の代表
から成る同様な作用を有するポリペプチドの類である。
これらの変形体はアミノ酸の数により相互に構造を異に
する（具体的には、ＨＶＩのＮ−末端配列はＶａ　ｌ　
−Ｖａ　（！−Ｔｙｒであり、ＨＶ２及びＰＡのそれは
ｌ　ｌｅ　−Ｔｈｒ　−Ｔｙｒであり、そしてｄｅｓ　
−（Ｖａ　Ｉｌ　）ｚ−ヒルジンのそれはＴｈｒ　−Ｔ
ｙｒである）が、しかしながらＮ−末端における疎水性
アミノ酸の蓄積、Ｃ−末端における極性アミノ酸の蓄積
、硫酸モノエステルとして存在するチロシン残基（Ｔｙ
ｒ”）、３個のジスルフィド橋及び抗凝固活性を共通に
有する。
最近、ヒルジン変形体をコードするｃＤＮＡ及び合成遺
伝子がクローン化されそして微生物宿主中で発現されて
いる。発現生成物はＴｙｒ１１３の硫酸モノエステルを
欠き、・・・そしてそれ故に「デスルファトヒルジン」
と称される・・・が、これらは天然の硫酸基を有するヒ
ルジンとおよそ同じ生物学的活性を示す。デスルファト
ヒルジン変形体ＨＶＩは大腸菌（ｆ！５ｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　ｃｏｌｔ）（ヨーロッパ特許出願に１５８．５６
４及びＮα１６Ｂ、３４２）において、及びサッカロミ
セス・セレビシエー（勤基江μｍ匹競ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）　（ヨーロッパ特許出願Ｎα１６８，３４２　、
　ｋ２００．６５５　、　Ｎα２２５，６３３、及びＮ
α２５２．８５４）において発現されている。同様に、
デスルファトヒルジンＨＶ２は大腸菌において（ヨーロ
ッパ特許出願Ｎα１５Ｂ、５６４）　、及びサッカロミ
セス・セレビシエーにおいて（ヨーロッパ特許出願Ｎα
２００，６５５、及びＰＣＴ出願Ｎｏ、８６／　０１２
２４）発現されており、そしてｄｅｓ　−（Ｖａｊｎｚ
−デスルファトヒルジンは大腸菌において（ヨーロッパ
特許出願Ｎα１５８．９８６　）発現されている。
一般に、ヒルジン化合物の発現効率及び収量は、宿主微
生物としてＳ、セレビシェ−（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）が選択される場合に高い。しかしながら、使用さ
れる特定の酵母株とは無関係に、発現生成物はＣ−末端
配列を相互に異にする複数のデスルファトヒルジン種の
不均一混合物である。例えば、ヒルジン変形型Ｈｖ１遺
伝子を含有する培養された酵母から得られる培養液は、
Ｃ−末端アミノ酸Ｃ１ｎｂ５、又はＣ−末端アミノ酸Ｌ
ｅｕ６４及びＧｌｎ”を欠くかなりの量の類似体が夾雑
したデスルファトヒルジンＨＶＩを含むことが見出され
た。
〔発明が解決しようとする課題〕
デスルファトヒルジン、ｈＡＮＰ又はＥＧＦのごとき完
全な長さの蛋白質及びこれらのＣ−末端が短縮された誘
導体の個々の成分への分離、並びにこれらの成分の均一
形態へのＩＮ製は多くの労力と時間を要する。これらの
付帯的な費用を考慮して、酵母においてデスルファトヒ
ルジンのごとき均一な蛋白質の経済的な生産を可能にす
る改良された方法が必要とされている。酵母において均
一な異種蛋白質を製造する方法を提供するのが本発明の
目的である。
異種蛋白質のＣ−末端が短縮された誘導体が該蛋白質を
コードする対応するＤＮＡ配列を含有する形質転換され
た酵母の培養液から単離されるのは、完全なデスルファ
トヒルジンのごとき一次発現生成物に対する内因性（６
ｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　）酵母プロテアーゼの翻訳後作用
に基くものであるが、Ｃ−末端分解を行う特定のプロテ
アーゼはまだ同定されていない。一般に蛋白質分解に関
与する最も重要な酵母プロテアーゼはエンドペプチダー
ゼｙｓｃＡ及びｙｓｃＢ並びにカルボキシエキソペプチ
ダーゼｙｓｃ〜及びｙｓｃＳである。プロテアーゼＡ、
Ｂ、Ｙ及び／又はＳ活性を欠く酵母株の使用によりデス
ルファトヒルジンのごとき外来遺伝子産物のランダムな
分解を部分的に減少せしめることができる。しかしなが
ら、Ｃ−末端において１個又は２個のアミノ酸を欠くか
なりの量の蛋白質がなお観察される。
驚くべきことに、カルボキシペプチダーゼｙｓｃα活性
を欠く酵母変異株は異種蛋白質のＣ−末端からアミノ酸
を除去することができず、そしてそれ故に完全な（真正
な）蛋白質を生じさせることが今や見出された。カルボ
キシペプチダーゼｙｓｃαは膜結合エキソペプチダーゼ
であり、そしてよく知られているように、キラー・ファ
クター（ｋｉｌｌｅｒｆａｃｔｏｒ）及びメイテイング
・ファクター（ｍａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ）αの成熟に
おいて重要な役割を演する（Ｊ、　Ｃ，Ｗａｇｎｅｒ及
びり、　）１．　Ｗｏｌｆ（１９Ｂ？）、　ＦＥＢＳＬ
ｅｔｔｅｒｓ　２２１．４２３を参照のこと〕。このも
のはＸＥＸＩ遺伝子の発現生成物である。発表されたデ
ータ［Ｐ、　Ｓ、　Ｒｅｎｄｕｅｌｅｓ及びり、　Ｈ，
Ｗｏｌｆ（１９８８）。
ＦＩＥＭＳ　Ｍｔｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｒｅｖ、　５４＋
　１７３によれば、ｙｓｃ　αの作用はＣ−末端塩基性
アミノ酸残基（Ａｒｇ、　Ｌｙｓ）に強く限定される。
これらのデータ、及びデスルファトヒルジンのＣ−末端
アミノ酸が塩基性ではない（例えば、デスルファトヒル
ジン変形体ＨＶ１においてはＧ　１　ｎ及びＬｅｕであ
る）事実から、カルボキシペプチダーゼｙｓｃα活性を
欠く酵母変異株の使用によりＣ−末端が短縮されたデス
ルファトヒルジン類似体の面倒な分離を伴わないで均一
なデスルファトヒルジンを製造することができることは
全く驚くべきことであり予想外のことである。
カルボキシペプチダーゼｙｓｃα活性を欠く酵母変異株
が適当なベクターにより形質転換された場合に完全な長
さで生産される他の異種蛋白質、例えばｈＡＮＰ　、　
ＥＧＦ又は結合組織活性化ペプチド−■（ＣＴＡＰ　−
ＩＩＩ　、　Ｍｕｌｌｅｎｂａｃｈ等（１９８６）　Ｊ
、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋＋＋２６１、７１９−７２２
）についても同じことが言える。
〔課題を解決するための手段〕
従って、本発明は、酵母にとって異種性である蛋白質の
製造のための改良された方法に関し、この方法は、カル
ボキシペプチダーゼｙｓｃαを欠いておりそして該異種
蛋白質をコードするＤＮＡ配列に作用可能に連結された
（ｏｐｅｒａｂｌｙ　１ｉｎｋｅｄ）酵母プロモーター
を含んで成るハイブリドベクターにより形質転換されて
いる酵母株を培養し、そして該異種蛋白質を単離するこ
とを特徴とする。
本発明は特に、酵母にとって異種性の蛋白質を均一な形
で製造するための改良された方法に関し、この方法は、
酵母プロモーター、該プロモーターに使用可能に連結さ
れたシグナルペプチドをコードする第一ＤＮＡ配列、該
第一ＤＮＡ配列に適切なリーディングフレーム内に連結
された該異種蛋白質をコードする第二ＤＮＡ配列及び酵
母転写停止シグナルを含有するＤＮＡ配列を含んで成る
ハ、　イブリドベクターにより形質転換された前記の酵
母株を培養し、そして該異種蛋白質を単離することを特
徴とする。
本発明の方法により製造することができる異種蛋白質は
、酵母における発現の後に、カルボキシペプチダーゼｙ
ｓｃαによる翻訳後Ｃ−末端分解に対して怒受性の蛋白
質である。この様な異種蛋白質は、Ｌｙｓ、　Ａｒｇ＋
　Ｔｙｒ、　Ａｌａ、　Ｌｅｕ、　Ｇｉｎ、　Ｇｌｕ、
　Ａｓｐ＋Ａｓｎ及びＳａｒから成る群から選択される
２個のＣ−末端アミノ酸により特徴付けられる。好まし
い異種蛋白質は上記のもの、特にデスルファトヒルジン
である。
最も好ましい観点において、本発明はデスルファトヒル
ジンの改良された製造方法に関し、この方法は、カルボ
キシペプチダーゼｙｓｃα活性を欠く酵母株であって、
酵母プロモーター、該プロモーターに作用可能に連結さ
れたシグナルペプチドをコードする第一ＤＮＡ配列、該
第一ＤＮＡ配列に適切なリーディングフレーム内に連結
されたデスルファトヒルジンをコードする第二ＤＮＡ配
列及び酵母転写停止シグナルを有用するＤＮＡ配列を含
んで成るハイブリドベクターにより形質転換された該酵
母株を培養し、そしてデスルファトヒルジンを単離する
ことを特徴とする。
「デスルファトヒルジン」なる語は、文献に記載されて
いるか、又はデスルファトヒルジンをコードするＤＮＡ
を含有する形質転換された微生物株から得られるデスル
ファトヒルジン化合物を包含する意味に用いられる。こ
のようなデスルファ　　。
トヒルジンは例えば、デスルファトヒルジン変形体ＨＶ
１、　ＩＩＶＩ　（修飾形ａ　、　ｂ）　　、ＨＶ２．
　ＨＶ２　（修飾形ａ　、　ｂ　、　ｃ）　、ＰＡ、Ｐ
Ａの変形体、及びｄｅｓ　（Ｖａ　１２　ｚ）−デスル
ファトヒルジンである。
好ましいデスルファトヒルジンは次の式（■）：Ｌ　Ｔ
ｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅ
ｒ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ＾ｓｎ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　
Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　ＶａｌＣｙ
ｓ　　Ｇｌｙ　　Ｇｉｎ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｎ　　Ｘｚ
　　Ｃｙｓ　　Ｉｌｅ　　Ｌｅｕ　　ＧｌｙＳｅｒ　Ａ
ｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｘｚ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ
　Ｖａｌ　ＴｈｒＧｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐ
ｒｏ　Ｘａ　Ｐｒｏ　Ｇｔｎ　Ｓｅｒ　Ｘ。
Ａｓｎ　　Ａｓｐ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｐ　　Ｐｈｅ　　
Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　ｌｌｅ　　Ｐｒｏ　　ＧｌｕＸ。
〔式中 （ａ）Ｘ＋はジペプチド残１’Ｊａ　ｌ　−Ｖａ　１を
表わし、Ｘｌ、Ｘｚ及びｘ４はそれぞれＬｙｓであり、
Ｘ、はＨｉｓであり、そしてＸ、はペプチド残基Ｇｌｕ
−Ｔｒｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎであり（ＨＶＩ　）ｉあるい
は、（ｂ）Ｘｌがｌｉｅ又はＧｌｕであり、そしてＸｌ
及びＸ、〜Ｘ、が（ａ）において定義した通りであり（
ＨＶＩ修飾形ａ〕　；あるいは、（ｃ）Ｘ、がＩｌｅ又
はＧｌｕであり、そしてＸ＋、Ｘｚ及びＸ４〜Ｘｂが（
ａ）において定義した通りであり（ＨＶＩ修飾形ａ］　
；あるいは、（ａ）ｘ４がｌｉｅ又はＧｌｕであり、そ
してＸ＋　”’Ｘ３　　、Ｘｓ及びＸ、が（ａ）におイ
テ定義した通りであり（ＨＶＩ修飾形ａ）　；あるいは
、（ｅ）ｘｓがＬｅｕ又はＡｓｐであり、そしてＸ１〜
Ｘ４及びＸａが（ａ）において定義した通りであり（Ｈ
ＶＩ修飾形ａ〕　；あるいは、（ｒ）ｘｉがＧｌｕ−Ｔ
ｙｒ　、　Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ　、　Ｇｌｕ−Ａｓ
ｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ　　、　　Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ
−Ｇｉｎ　　、　Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−八ｒｇｓＧ
ｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ　　、　　Ｇｌｕ−Ｌｙ
ｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ　　、　　Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ
−Ｔｙｒ　＋、Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ　、　
Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ及びＧｌｕ−
Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇから成る群から選択さ
れ、そしてＸ、〜Ｘｓが（ａ）において定義した通りで
あり（ＨＶＩ修飾形ｂ〕り；あるいは、（ｇ）Ｘ＋がＴ
ｈｒを表わし、そしてＸ２〜Ｘｂが（ａ）において定義
した通りである（ｄｅｓ　（Ｖａ　ｊ！　、）−デスル
ファトヒルジン））で表わされるデスルファトヒルジン
化合物；あるいは 次の式（■）： Ｙ、　　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇ
ｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ八ｓへ　　Ｌｅｕ　　Ｃ
ｙｓ　　Ｌｅｕ　　Ｃｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｙ　　Ｓ
ｅｒ　　Ａｓｎ　　ＶａｔＣｙｓ　　Ｇａｙ　　Ｌｙｓ
　　Ｇｌｙ　　Ａｓｎ　　Ｌｙｓ　　Ｃｙｓ　　Ｉｌｅ
　　Ｌｅｕ　　ＧｌｙＳｅｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ
　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　ＴｈｒＧ
ｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｙ、　　Ｐｒ
ｏ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ、１ｌｉｓＡｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ
　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　
ＧｌｕＧｌｕ　Ｙｚ　　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ （ＩＩ） 〔式中、 （ａ）Ｙ＋がＮ−末端ペプチド残基１１ｅ−Ｔｈｒを表
わし、Ｙ２がＡｓｎであり、そしてＹ、がＴ）１ｒであ
り（ＨＶ２）ｉあるいは、 （ｂ）’ｙｇがＬｙｓ、　Ａｒｇ又はＨｉｓであり、Ｙ
。
及びＹ、が（ａ）において定義した通りであり（ＨＶ２
修飾形ａ）　；あるいは （ｃ）ＹｚがＧｌｕ又はＡｓｐであり、そしてＹｌ及び
Ｙ２が（ａ）において定義した通りであ°　　リ（ＨＶ
２修飾形ｂ〕り：あるいは（ａ）ｙ、がＮ−末端ジペプ
チド残基νａｌ　−Ｖａｊ２であり、そしてＹ、及びＹ
３が（ａ）において定義した通りである（ＨＶ２修飾形
Ｃ））で表わされるデスルファトヒルジン化合物：ある
いは、 次の式（■）： １１ｅ　　Ｔｈｒ　　Ｔｙｒ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｐ　　
Ｃｙｓ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｕ　　Ｓｅｒ　　ＧｌｙＧｌ
ｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ
　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　ＡｓｎＶａｌ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌ
ｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　ｉｌｅ　Ｌｅ
ｕＧｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　
Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　ＶａｌＴｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌ
ｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ
　５ｅｒ１１ｉｓ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　
Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　ｌｉｅ　Ｐｒ。
Ｇｌｕ　　Ａｓｐ　　Ａｌａ　　Ｔｙｒ　　Ａｓｐ　　
Ｇｌｕ（ＩＩＩ） で表わされるデスルファトヒルジン化合物（ＰＡ）、及
びＮ−末端における１もしくは２個のアミノ酸の又はＣ
−末端における１８，１０．９　、６　、４もしくは２
個のアミノ酸の一次構造の短縮により特徴付けられる該
ＰＡの変形体である。
最も好ましいデスルファトヒルジン化合物は、Ｘ１〜Ｘ
、が（ａ）において定義した通りである式（１）の化合
物である。
酵母宿主株、及びハイブリドベクターの構成成分は後に
詳細に記載する。
形質転換された酵母株は当業界において知られている方
法を用いて培養される。
すなわち、本発明の形質転換された酵母株は、資化性炭
素源、窒素源及び無機塩を含有する液体培地中で培養さ
れる。
種々の炭素源を使用することができる。好ましい炭素源
の例として、資化性炭水化物、例えばグルコース、マル
トース、マンニトール、フラストースもしくはラクトー
ス、又は酢酸塩、例えば酢酸ナトリウムが挙げられ、こ
れらは単独で、又は適当に混合して使用される。適当な
窒素源には、例えばアミノ酸、例えばカザミノ酸、ペプ
チド及び蛋白質並びにそれらの分解生成物、例えばトリ
プトン、ペプトン又は肉エキス、さらに酵母エキス、マ
ルトエキス、コーンスチーブリカー、並ヒにアンモニウ
ム塩、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム又は
硝酸アンモニウムが含まれ、これらは単独で又は適当に
混合して使用される。
使用することができる無機塩には、例えばナトリウム、
カリウム、マグネシウム及びカルシウムの硫酸塩、塩化
物、リン酸塩及び炭酸塩が含まれる。
さらに、栄養培地はまた増殖促進物質を含有することが
できる。増殖促進物質には、例えば微量因子、例えば鉄
、亜鉛、マンガン等、又は個々のアミノ酸が含まれる。
内因性２ミクロンＤＮＡとそのレプリコンを担持するハ
イブリドベクターとの間の非適合性のため、この様なハ
イブリドベクターにより形質転換された酵母細胞は該ハ
イブリドベクターを喪失する傾向がある。この様な酵母
細胞は選択的条件下、すなわち増殖のためにプラスミド
によりコードされた遺伝子の発現を必要とする条件下で
増殖せしめなければならない。現在使用されておりそし
て本発明のベクター中に存在するほとんどの選択マーカ
ー（後記）は、アミノ酸合成又はプリン合成の酵素をコ
ードする遺伝子である。これは、対応するアミノ酸又は
プリン塩基を欠く合成最少培地を使用することを必要と
する。しかしながら、適当な殺生物剤に対する耐性を付
与する遺伝子も同様に使用することができる。抗生物質
耐性遺伝子を含有するベクターで形質転換された酵母細
胞は対応する抗生物質を含有する複合培地中で増殖し、
そのためより速い増殖速度及びより高い細胞密度が達成
される。
完全な２ミクロンＤＮＡ　（機能的複製起点を含む）を
含んで成るハイブリドベクターは内因性２ミクロンプラ
スミドを欠くサッカロミセス・セレビシエーの株（いわ
ゆるｃｉｒ’株）に安定に維持され、従って非選択的増
殖条件下、すなわち複合培地中で培養を行うことができ
る。
構成的プロモーター（例えばり財、り月狙）を有するバ
イブリドプラスミドを含有する酵母細胞は、異種蛋白質
をコードするＤＮＡを該プロモーターによる制御のもと
に誘導を必要としないで発現する。しかしながら、前記
ＤＮＡが抑制されるプロモーター（例えばＰＧＫ又は■
匹）の制御のもとにある場合は、増殖培地の組成をｍＲ
ＮＡ転写物の最大レベルが得られるように適合させなけ
ればならない。すなわち、％プロモーターを使用する場
合、増殖培地は、このプロモーターの抑制解除のために
低濃度の無機リン酸塩を含有しなければならない。
培養は常法により行われる。培養条件、例えば温度、培
地のｐＨ及び発酵時間は、最高レベルの異種蛋白質が生
産されるように選択される。選択された酵母株は、好ま
しくは、振とう又は撹拌を伴う液深培養において、好気
的条件下で、約２５°Ｃ〜３５°Ｃ１好ましくは約２８
°Ｃの温度で、ｐＨ４〜７、例えばおよそｐ１１５にお
いて、少なくとも１時間から３日間、好ましくは満足す
べき量の蛋白質が得られるまで培養する。
酵母中で発現される異種蛋白質は細胞内に蓄積され又は
培地中に分泌される。デスルファトヒルジンの場合、使
用される酵母株、プロモーター及びシグナルペプチドに
関係なく、生産されたデスルファトヒルジンのほとんど
が培地中に分泌され、わずかな部分のみが細胞に結合し
たまま残る。分泌される化合物と細胞に細胞した化合物
との正確な比率は発酵条件、及び適用される回収方法に
依存する。一般に、これは８：１以上となる。従って、
分泌されるデスルファトヒルジンが常に支配的である。
異種蛋白質は培地から常用手段によって単離することが
できる。例えば、第一段階は一般に、培養液から遠心分
離により細胞を分離することから成る。得られる上清を
ポリエチレンイミンで処理してほとんどの非−蛋白質性
物質を除去しそして硫酸アンモニウムにより液を飽和し
て蛋白質を沈澱せしめることにより、異種蛋白質を濃縮
することができる。宿主の蛋白質は、もし存在すれば、
酢酸による酸性化（例えば、０．１％、ｐＨ４〜５）に
より沈澱せしめることができる。異種蛋白質の更なる濃
縮は、該酢酸上清をｎ−ブタノールで抽出することによ
り達成することができる。他の精製段階は、例えば脱塩
、クロマトグラフ法、例えばイオン交換クロマトグラフ
ィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、分配クロマトグラ
フィー、逆相＋１ＰＬＣ等を包含する。混合物の構成成
分の分離はまた、透析により、ゲル電気泳動もしくはキ
ャリヤー−フリー電気泳動により電荷に従って、適当な
セファデックスカラムにより分子サイズに従って、アフ
ィニティークロマトグラフィーにより、例えば抗体、特
にモノクローナル抗体を用いるアフィニティークロマト
グラフィーにより、又はアフィニティークロマトグラフ
ィーのために適当なキャリヤーに結合したトロンビンを
用いて、あるいは他の方法、特に文献に記載されている
方法により、行われる。
異種蛋白質が分泌されない場合、又は細胞に結合してい
る追加の異種蛋白質、すなわち細胞内又はペリプラズム
空間に蓄積している異種蛋白質を単離することが望まし
い場合、幾つかの補完的精製段階が必要である。すなわ
ち、異種蛋白質が細胞内に蓄積されている場合、その回
収の第一段階はそれを細胞内から遊離せしめることから
成る。
はとんどの方法において、まずグルコシダーゼ（後記）
消化によって細胞壁が除去される。次に、生ずるスフェ
ロプラストがトリトンのごとき洗剤により処理される。
あるいは、細胞を破壊するために機械的力、例えば剪断
力（例えば、メープレス、フレンチプレス）、又はガラ
スピーズとの振とうが適当である。異種蛋白質が酵母宿
主によりペリプラズム空間に分泌される場合、単純化さ
れた方法を用いることができる。すなわち、異種蛋白質
は細胞溶解を伴わないで、細胞壁の酵素的除去により、
又は細胞壁を損傷して生成分の放出を可能にする化学物
質、例えばチオール試薬又はＥＤＴＡでの処理により、
回収される。
得られた異種蛋白質の混合物は、常用手段、例えばクロ
マトグラフ法、例えば逆相クロマトグラフィー、イオン
交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー
及び疎水性相互作用クロマトグラフィー、を適用するこ
とにより分離され得る。
デスルファトヒルジンの場合、抗−ヒルジン抗体又は抗
−デスルファトヒルジン抗体（例えば、ハイブリドーマ
細胞からのモノクローナル抗体）を用いる試験、トロン
ビン試験（Ｍ、ｔｌ、Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ編集、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍａｔｔｃ　Ａｎａｌｙｓｉ
ｓ＋　Ｖｏｌ　ＩＩ　＋３１４−３１６頁、Ｖｅｒｌａ
ｇＣｈｅｍｉｅ＋　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（西独）１９８３
）　、又は血液凝固試験（Ｆ、Ｍａｒｋｗａｒｄｔ等、
Ｔｈｒｏｍｂ、）ｌａｅｍｏｓｔ、　［、２２６（１９
８２）　）を用いて、精製過程で得られる両分中のヒル
ジン活性を検出することができる。他の異種蛋白質の検
出のために文献中に知られている類似の測定法を用いる
ことができる。
本発明の形質転換された酵母宿主細胞は、◎　異種蛋白
質をコードするＤＮＡ配列に作用可能に連結された酵母
プロモーターを含んで成るバイブリドプロモーター、特
に、酵母プロモーター、該プロモーターに作用可能に連
結されたシグナルペプチドをコードする第一ＤＮＡ配列
、該第一ＤＮＡ配列と適切なリーディングフレーム内に
連結された第二ＤＮＡ配列及び酵母転写停止シグナルを
含有するＤＮＡ配列を含んで成るハイブリドベクター、
を用意し； ◎　必要であれば、カルボキシペプチダーゼｙｓｃα活
性を欠く酵母変異株を用意し；◎　得られた酵母変異株
を前記ハイブリドベクターにより形質転換し；そして、 ◎　未形質転換酵母細胞から形質転換された酵母細胞を
選択する。
欠斐５久久二 本発明の酵母ハイブリドベクターは異質蛋白質をコード
するＤＮＡに作用可能に連結された酵母プロモーターを
含んで成る。好ましいハイブリドベクターは、酵母プロ
モーター、該プロモーターに使用可能に連結されたシグ
ナルペプチドをコードする第一ＤＮＡ配列、該第一ＤＮ
Ａ配列に適切なリーディングフレーム内に連結された異
種蛋白質例えばデスルファトヒルジンをコードする第二
ＤＮＡ配列及び酵母転写停止シグナルを含有するＤＮＡ
配列を含んで成る。
酵母プロモーターは、ＰＨＯ５、ＭＦ　αｌ　もしくは
Ｇ　／ｌ　Ｌ　１プロモーターのごとき抑制されるプロ
モーター、又は構成的プロモーターである。デスルファ
トヒルジンの発現の場合、構成的プロモーターが好まし
い。
構成的酵母プロモーターは好ましくは、高度に発現され
る酵母遺伝子、例えば解糖系酵素をコードする遺伝子に
由来し、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３
−ボスフェート・デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ（ｌＩ（）
　、３−ホスホグリセレート・キナーゼ（ＰＧＫ）　、
ヘキソキナーゼ、ピルベート・デヒドロゲナーゼ、ホス
ホフラクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェート・
イソメラーゼ、３−ホスホグリセレート・ムターゼ、ピ
ルベート・キナーゼ、トリオースホスフェート・イソメ
ラーゼ、ホスホグルコース・イソメラーゼ及びグルコキ
ナーゼの各々の遺伝子のプロモーター、さらにはＡＤ）
Ｉ　Ｉ又はＴＰＰ　Ｔプロモーター、及び上流活性化部
位が除去された短縮された酸性ホスファターゼＰＨＯ５
プロモーターである。特に好ましいプロモーターは、す
」肌プロモーター、及びＧ　Ａ　Ｐ　Ｄ　ＩＩ遺伝子の
−５５０と−１８０との間のヌクレオチド、特にヌクレ
オチド−５４０、−２６３又は−１９８から始まりそし
てヌクレオチド−５で終るその機能的断片、並びに■匹
遺伝子の−２００と−１５０との間のヌクレオチド、特
に−１７３のヌクレオチドから始まりそしてヌクレオチ
ド−９で終る短縮された構成的Ｐ　Ｈ０５プロモーター
である。
シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列（「シグナル
配列」）は好ましくは、通常分泌されるポリペプチドを
コードする酵母遺伝子に由来するものである。ヒルのゲ
ノムＤＮＡから得られるヒルジン・シグナル配列も選択
され得る。酵母シグナル配列は例えば酵母インベルター
ゼ、Ｑ’　−ファクター、フェロモンペプチダーゼ（Ｋ
ＨＸ１）、「キラートキシン（ｋｉｌｌｅｒ　ｔｏｘｉ
ｎ）Ｊ及び抑制性酸性ホスファターゼ（皿）の各遺伝子
シグナル配列及びプレプロ配列、並びにアスペルギルス
・アワモリ（匙Ｂ」庄■ｕｓ　ａｗａｍｏｒｉ）からの
グルコアミラーゼシグナル配列である。あるいは、使用
されるプロモーターに天然にリンクしている遺伝子（例
えば皿部）のシグナル配列（もし存在すれば）の部分と
ヒルジンシグナル配列の部分との連絡により融合シグナ
ル配列を構成することができる。
シグナル配列とデスルファトヒルジンのアミノ酸配列と
の間の正確な開裂を可能にする組み合わせが好ましい。
特異的なプロセシングシグナルを担持しているか又は担
持していないプロ配列又はスペーサー配列のごとき追加
の配列を構成物中に含めることにより前駆体分子の正確
なプロセシングを促進することもできる。あるいは、生
体内又は生体外で適正な成熟を可能にする内部プロセシ
ングシグナルを含有する融合蛋白質を生じさせることも
できる。例えば、プロセシングシグナルは、ゴルジ（Ｇ
ｏｌｇｉ　）膜中に存在する酵母エンドペプチダーゼに
より認識されるＬｙｓ−Ａｒｇ残基を含有する。
本発明の好ましいシグナル配列は、次の式：％式％ で表わされるシグナルペプチドをコードする酵母ＰＨ０
５遺伝子のシグナル配列、及び次の式：％式％ で表わされるシグナルペプチドをコードする酵母インベ
ルターゼ遺伝子のシグナル配列である。
異種蛋白質をコードするゲノムＤＮＡ配列は天然源から
単離することができ、あるいはコピーＤＮＡ　（ｃＤＮ
Ａ）を対応する相補的ｒＰＲＮＡから生産することがで
き又は化学的及び酵素的方法により生産することができ
る。これらはそれ自体知られている方法により行うこと
ができる。
例えば、デスルファトヒルジンをコードするＤＮＡ配列
はヒルのゲノムＤＮＡから単離することができ、あるい
はデスルファトヒルジン相補的な二本鎖デスルファトヒ
ルジンＤＮＡ　（デスルファトヒルジンｄｓ　ｃＤＮＡ
）を調製することができ、あるいはデスルファトヒルジ
ンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を化学的方法及び
酵素的方法で調製することができる。
酵母転写停止シグナルを含有するＤＮＡ配列は好ましく
は、転写停止及びポリアゾニレ−ジョンのための適切な
シグナルを含有する酵母遺伝子の３′フランキング配列
である。適当な３′フランキング配列は例えば使用され
るプロモーターに天然にリンクしている酵母遺伝子のそ
れである。好ましいフランキング配列は酵母ｇ遺伝子の
それである。
酵母プロモーター、シグナルペプチドをコードする任意
的ＤＮＡ配列、異種蛋白質をコードするＤＮＡ配列及び
酵母転写停止シグナルを含有するＤＮＡ配列が作用可能
に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結される。
すなわち、これらがその正常な機能を維持する態様で並
置（ｊｕｘｔａｐｏｓｅ）される。この並びは、プロモ
ーターがシグナル配列−異種蛋白質遺伝子複合体の適切
な発現を行い、転写停止シグナルが転写及びポリアゾニ
レ−ジョンの適切な停止を行い、そしてシグナル配列が
適当なリーディングフレーム内で異種蛋白質遺伝子に連
結していて該シグナル配列の最終コドンが異種蛋白質の
遺伝子の第一コドンに直接に結合しており、そして該蛋
白質の分泌が起こる、こととなる様な並びである。プロ
モーター及びシグナル配列が異る遺伝子に由来する場合
、プロモーターは好ましくは、主要ｍＲＮＡ開始（ｍｏ
ｊｏｒ　ｍＲＮＡ　ｓｔａｒｔ）と該プロモーターに天
然にリンクしている遺伝子のＡＴＧとの間でシグナル配
列に連結される。シグナル配列は翻訳開始のためにそれ
自身のＡＴＧ有すべきである。これらの配列の連結は、
エンドヌクレアーゼの認識配列を担持する合成オリゴヌ
クレオチドリンカーにより行うことができる。
発現カセットとは別に、本発明のハイブリドベクターは
酵母複製起点を含んで成る。従って、このハイブリドベ
クターは複製起点を含有する２ミクロンＤＮＡ由来のＤ
ＮＡセグメントを、又は２ミクロンＤＮＡを有しない酵
母株を使用する場合には全２ミクロンＤＮＡを含んで成
る。後のタイプのベクターが好ましい。
本発明の好ましいハイブリドベクターは中断されない形
の完全な２ミクロンＤＮＡを含有する。
すなわち、２ミクロンＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼ
により一度開裂され、この線状化されたＤＮＡがベクタ
ーの他の成分と連結された後に両速化される。ｌ？ＥＰ
ｌ　、　ＲＥＰ２及びＦＬＰ遺伝子並びに０１１１、　
ＳＴＢ、　ＩＲＩ及びＩＲ２部位の正常な機能が維持さ
れる様に当該制限部位が選択される。場合によっては、
該制限部位はＤ遺伝子も無傷のまま維持されるように選
択される。好ましい制限部位は、Ｄ遺伝子内に位置する
ユニークＰｓｔ１、並びに前記すべての遺伝子及び部位
の外側に位置するユニーク１ｌｐａ　　１部位及び５ｎ
ａ８１部位である。
好ましくは、本発明のハイブリドベクターは、１個又は
複数個の、特に１個又は２個の酵母用選択遺伝子マーカ
ー並びに細菌宿主、特に大腸菌用の選択遺伝子マーカー
及び複製起点を含有する。
酵母用選択遺伝子マーカーについては、マーカー遺伝子
の表現型発現に基いて形質転換体の選択を容易にする任
意のマーカー遺伝子を使用することができる。酵母のた
めの適当なマーカーは例えば、抗生物質耐性を発現する
もの、又は栄養要求性酵母変異株の場合には宿主の障害
を補完する遺伝子である。対応する遺伝子は例えば抗生
物質Ｇ４１８、ハイグロマイシンもしくはプレオマイシ
ンに対する耐性を付与し、又は栄養要求性酵母変異株に
原栄養性、例えばＵＲＡ３　、　ＬＥＵ２　、　ＬＹＳ
２又は±１遺伝子を提供する。
ハイブリドベクターの増幅が大腸菌中で便利に行われる
ように、大腸菌遺伝子マーカー及び大腸菌複製起点を含
めるのが有利である。これらは、大腸菌複製起点及びア
ンピシリンのごとき抗生物質に対する耐性を付与する大
腸菌遺伝子マーカーの両者を含有する、大腸菌プラスミ
ド、例えばｐＢＲ３２２、又はｐｔｌｃプラスミド、例
えばｐＵｃ１８もしくはｐＵｃ１９から得ることができ
る。
本発明のハイブリドベクターは当業界において知られて
いる方法により、例えば異種蛋白質をコードするＤＮＡ
配列に作用可能に連結された酵母プロモーターを含んで
成る発現カセットと、酵母用選択遺伝子マーカー並びに
酵母宿主用及び細菌宿主用複製起点を含有するＤＮＡ断
片とを所定の順序に連結することにより製造することが
できる。
カルボキシペプチダーゼ　ＳＣαゞ 本発明の酵母株はカルボキシペプチダーゼｙｓｃα活性
を欠くものである。好ましくは、本発明の酵母株は二重
、三重又は四重変異株である。すなわち、他のペプチダ
ーゼ活性をも欠いている。
広範囲の種類のプロテアーゼが酵母サッカロミセス・セ
レビシエーにおいて特徴付けられている（Ｔ、　Ａｃｈ
ｓｔｅｔｔｅｒ及びり、　）１．　Ｗｏｌｆ　（１９８
５）　、　Ｙｅａｒｔｌ　、　１３９−１５７を参照の
こと］。これらのほとんどのプロテアーゼの活性を欠く
変異株が単離されそして生化学的に研究されている。あ
る種のプロテアーゼの不存在の結果が解明され、そして
幾つかの性質はプロテアーゼ欠損変異株を新たに単離す
るために有用であることが証明されている。自然に生ず
る変異の頻度は低いから、酵母は変異原、例えばＸ−線
もしくはＵ、　　Ｖ照射により、又は非常に効率的なそ
して多くの死滅を伴わないで遺伝子当りｌＸｌ０−’〜
１０−３の率で変異を誘発することができる化学変異剤
により処理される。本発明の酵母株において欠けている
プロテアーゼは細胞代謝において必須の機能を行わず、
従ってこれらの蛋白質の活性を完全に破壊する変異菌は
致死的ではない。記載されるプロテアーゼ（ｙｓｃα、
　ｙｓｃＢ。
ｙｓｃＡ、　ｙｓｃＹ及びｙｓｃＳ　）の各変異株タイ
プを変異誘発後に別々に単離するとこができる。単離及
び選択は、当業界においてよく知られているコロニー・
スクリーニング・アッセイに基く。
所望の単一の又は複数のプロテアーゼ欠損を誘導する第
二のそして一層効率的な方法は、部位特定変異誘発（ｓ
ｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）
又は遺伝子中断（ｇｅｎｅ−ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ　）
もしくは遺伝子置換（ｇｅｎｅ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎ
ｔ）である。プロテアーゼｙｓｃＢ。
カルボキシペプチダーゼｙｓｃＹ及びカルボキシペプチ
ダーゼｙｓｃαの場合の様に遺伝子配列が知られている
時には、適切に設計されたオリゴデオキシヌクレオチド
の調製を用いる良く知られた部位特定変異誘発法〔例え
ば、Ｍ、　Ｊ、　Ｚｏｌｌｅｒ及びＭ、　Ｓｍ１ｔｈ（
１９８３）、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１
００．４６８）を用いる挿入、置換又は欠失によりゲノ
ム性プロテアーゼ遺伝子を欠損させることができる。あ
るいは、ゲツム性プロテアーゼ遺伝子を外来ＤＮＡによ
り置き換えることができ、又は該外来ＤＮＡを該プロテ
アーゼ遺伝子の適当な制限酵素部位に挿入することがで
きる。例えば、ペプチダーゼｙｓｃα活性を欠く酵母変
異株（ｋｅｘ−変異株）を調製するため、ゲノムＫＥＸ
Ｉ遺伝子中に存在する適当な制限酵素部位に外来ＤＮＡ
を挿入する。使用される酵母株がアミノ酸又はプリン合
成の酵素をコードする染色体遺伝子中に欠陥を有する場
合、対応する無傷の遺伝子を染色体Ｋｆ！ＸＩ遺伝子に
挿入し、そして栄養要求酵母株に原末菌性を付与しそし
て同時にＫＥＸＩからｋｅｘｌへの遺伝子型の変化を行
うことができる。
遺伝子ＷｖＡ法又は部位特定変異誘発は当業界において
一般に用いられ、そして絶対的に再現性がある。
多重プロテアーゼ欠損株、例えばｙｓｃα活性及びｙｓ
ｃＢ活性を欠く株を作製するための現在の方法は減数分
裂交配（ｍｅｉｏｔｉｃ　ｃｒｏｓｓｉｎｇ）及びそれ
に続く４分子分析（ｔｅｔｒａｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ）
である。二倍体細胞に由来する４分子（ｔｅｔｒａｄ）
を標準的な遺伝的方法によって分１１ｆ（ｄｉｓｓｅｃ
ｔ）する。４分子（ｔｅｔｒａｄ）の４個の胞子間のラ
ンダム類別（ａｓｓｏｒｔ−ｍｅｎ　ｔ　）が次の交配
における二重変異株及び多重変異株の構成を可能にする
。これに代る系として、ランダム胞子分析を使用するこ
ともできる。
個々のプロテアーゼを欠く変異株及び二重変異株をも酵
母遺伝子貯蔵機関から入手可能であるから、三重変異株
及び四重変異株を、既知の逐次的な減数分裂交配法によ
り再現可能に構成することができる。
サッカミセス・セレビシェ−の適当な出発株には、例え
ば、Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎ
ｔｅｒ、　Ｂｅｒ−ｋｅｌｅｙ　ｓから得られるｋｅｘ
ｌ　９６株：酵母ペプチダーゼＡ　（ｙｓｃＡ）陰性株
ＡＢ１０３（ＡＴＣＣ２０６７３）及び＾１１１１０　
（ＡＴＣＣ２０７９６）　；酵母ペプチダーゼＢ　（ｙ
ｓｃＢ）陰性株ＨＴ２４６．　Ｈ４２６及び）１４４９
　（後者はさらにｃｉｒ’である）（Ｄｅｕｔｓｈｅ　
Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓ
ｍｅｎ＋Ｂｒａｕｎｓｈｉｗｅｉｇ＋　　西独に、それ
ぞれＤＳＭ　Ｎｏ、４０８４　。
４２３２及び４４１３として寄託されている）；酵母ペ
プチダーゼＡ、Ｙ及びＳ　（ｙｓｃＢ、　ｙｓｃＹ及び
ｙｓｃＳ　）陰性株ＢＹＳ２３２−３１−４２）　　ｉ
並びに酵母ペプチダーゼＡ。
Ｂ、Ｙ及びＳ　（ｙｓｃＡ＋　ｙｓｃＢ＋　ｙｓｃＹ及
びｙｓｃＣ）陰性株ＡＢＹＳが含まれる。
前記のごとく、本発明の好ましい酵母株は内因性２ミク
ロンＤＮＡを欠いている。２ミクロンプラスミドは、サ
ッカロミセス・セレビシエーのほとんどの株に含まれて
いる高コピー数の自己複製性染色体外ＤＮＡ要素である
。２ミクロンプラスミドの最も顕著な構造的特徴は、該
プラスミドを異る長さの２つのＤ　Ｎ　Ａ　ｅｆｆ域に
分ける各５５９ｂｐの２つの逆方向反復配列（ＴＲＩ及
びＩＲ２）である。これらの２つの！Ｒ配列間の相同性
組換えが２つの分子異性体（Ａ形及びＢ形）の生成をも
たらす。２ミクロンプラスミドの安定性はプラスミドに
よりコードされた３つの機能により与えられる。ＲＥＰ
Ｉ遺伝子産物及びＲＢＰ２遺伝子産物は、２ミクロンプ
ラスミドの安定な分配のために必要なトランス（ｔｒａ
ｎｓ　）−作用蛋白質である。これら２つの内、分配の
効率がＲＢＰＩ遺伝子産物の遺伝子量に依存する〔＾、
　Ｃａｓｈｍｅｒｃ等（１９８６）　Ｍｏ１．　Ｇｅｍ
、　Ｇｅｎｅｔ。
、　％）３．１５４）点において、ＲＣＰＩがおそらく
一層重要である。これら２つの蛋白質は、該プラスミド
に対する重要なシス（ｃｉｓ）−作用要素である５ＴＢ
（ＲＩｓＰ３）に作用する（Ｍ、　Ｊａｙａｒａｍ等（
１９８５）、　Ｍｏｌ。
Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　ｉ、　２４６６−２４７５；
　Ｂ、　Ｖｉｅｔ等（１９８５）　。
Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　　５　、２１９０
−２１９６）。
サッカロミセス・セレビシエーのこのようなｃｉｒ”株
は知られており、又は当業界において知られている方法
により調製することができる〔例えば、Ｃ，Ｐ、　Ｈｏ
１ｌｅｎｂｅｒｙ　（１９８２）　Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ
。
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉ＋ｎｍｕｎ、　９６＋　１１
９）。
次に記載する別法は、第二のプラスミドによる２ミクロ
ンプラスミドのキユアリング（ｃｕｒｉｎｇ）がＳＴＢ
部位の増加に関与してＲＥＰＩ蛋白質及びＲＥＰ２蛋白
質を消耗（ｔｉｔｒａｔｅ　ｏｕｔ）するという仮定に
基いている。ＲＥＰＩ蛋白質及びＲＥＰ２蛋白質の相対
的減少が内因性２ミクロンプラスミドの不安定性を導く
であろう。
好ましくは、使用される第ニブラスミドはＲＥＰ２遺伝
子に欠陥を有するか該遺伝子を欠くものである。この様
なプラスミドの例として、ＲＥＰＩ遺伝子とは別に逆方
向反復配列（ＩＲ２）を欠＜　ｐＤＰ３Ｂが挙げられる
。これはその高コピー数発現を内因性２ミクロンプラス
ミドによるＲＥＰＩ蛋白質の補完に依存せしめる。この
ものは、２個の酵母遺伝子マーカー、すなわち、高コピ
ー数状態及び低コピー数状態の両方において用いられる
ＯＲ＾３、並びに高コピ数状態においてのみ用いられる
ｄＬＥＩＪ　２を含有する（Ｅ、Ｅｒｈａｒｔ等、Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　（１９６３）６２５）。
Ｕｒａ−及びＬｅｕ−である酵母株をプラスミドｐＤＰ
３Ｂにより形質転換し、そしてｔｌｒａ　”コロニーを
選択する。ウラシル不含有プレート上での選択（Ｕｒａ
選沢）が、ロイシン不含有プレート上での選択（Ｌｅｕ
選択）に比べて非常に良好な形質転換頻度を与える。ｔ
ｌＲＡ３遺伝子は欠陥ｄＬＥｔｌ　２遺伝子よりも非常
に良好に発現されるからである。単一コロニーを選択し
、そしてＬｅｕ選択プレート上にストリークする。これ
により種々のサイズ及び形態のコロニーが生ずる。最も
小さいコロニーの幾つかをＵｒａ選択プレート上に再ス
トリークし、そしてＬｅｕ選沢プレート上にレプリカプ
レートする。
Ｕｒａ選択のもとで増殖することができるがしかしＬｅ
ｕ選択のもとでは非常に緩慢にのみ増殖することができ
るコロニーを選択する。ｔｌｒａ選択プレート上での増
殖はプラスミドｐＤＰ３Ｂがなお存在すること、及びＬ
ｅｕ選択のもとでの緩慢な増殖がこのプラスミドの喪失
に基くものではないことを示しており、そしてＬｅｕ選
沢のもとての増殖の失敗はｐＤＰ３８がこのマーカーを
補完できないことを意味する。後者の事実は二様に説明
することができる、Ａ　：　　ｐＤＰ３８上のＬＥＵ２
遺伝子が変異している；又はＢ：このプラスミドはその
コピー数を上昇せしめることができないためにＬｅｕ２
を補完することができず、ＲＥＰＩ遺伝子産物を補完す
るために２ミクロンプラスミドが利用されない（すなわ
ち失われている）ことを意味する。
これら２つの可能性は非常に容易に区別することができ
る。第一の場合、前記コロニーに見られる最小の増殖（
ｐＤＰ３８を有しない細胞が全く増殖しないのに対して
）は、幾らかのＬＥυ２の発現が存在することを示す。
第二の点は直接に試験することができる。なぜなら、２
ミクロンプラスミドの非存在下においてはｐＤＰ３Ｂは
ＡＲＳタイプのプラスミドとしてのみ機能する、すなわ
ちそれは非常に不安定であって少数世代の後はとんどの
コロニーはそれを失うからである。従って、単一コロニ
ーをＹＰＤプレート上にストリークし、単一コロニーを
取り、そしてウラシル不含有プレート上にレプリカプレ
ートした場合、少数のみがＬｌｒａ選択のもとで増殖す
るであろう。増殖しないコロニーをｐＵＣ及び２ミクロ
ン配列についてのハイブリダイゼーションによりチエツ
クする。ハイブリダイゼーシゴンシグナルを示さないコ
ロニーはプラスミドｐＤＰ３Ｂ及び内因性２ミクロンプ
ラスミドを含有しない（ｃｉｒ”株）。
ｙｓｃα活性の欠損に加えて、本発明の好ましい酵母株
はさらに、ｙｓｃＡ　、　ｙｓｃＢ　、　ｙｓｃＹ及び
ｙｓｃＳから成る群から選択されたペプチダーゼ活性を
さらに欠いており、さして２ミクロンＤＮＡを欠いてい
る。最も好ましい酵母株はｙｓｃα活性及びｙｓｃｖ活
性を欠いており、そして場合によってはさらにｙｓｃＢ
活性及びｙｓｃＳ活性、又はｙｓｃＡ活性及びｙｓｃＢ
活性を欠いており、そして２ミクロンＤＮＡを欠いてい
る。
本発明の酵母株は異種蛋白質の製造のために有利に使用
することができる。驚くべきことには、酵母にとって異
種性の蛋白質をコードする遺伝子を含有するハイブリド
ベクターを担持する本発明のｋｅｘ１株は該蛋白質を均
一な形で、すなわちＣ−末端が短縮されたいかなる副生
成物も伴わないで生産する。
ノ　　　　−　　　　　　　　　た 本発明はさらに、カルボキシペプチダーゼｙｓｃα活性
を欠いており、そして異種蛋白質をコードするＤＮＡ配
列に作用可能に連結された酵母プロモーターを含んで成
るハイブリドベクターにより形質転換されている酵母株
に関する。
本発明の酵母宿主株には、カルボキシペプチダーゼｙｓ
ｃα及び場合によっては更なるペプチダーゼ活性を欠い
ており、そして場合によっては内因性２ミクロンプラス
ミド（前記参照のこと）が除去されているサッカロミセ
ス・セレビシエーの株が含まれる。
前記の形質転換された酵母株の製造方法は、カルボキシ
ペプチダーゼｙｓｃα活性を欠く酵母株を前記ハイブリ
ドベクターにより形質転換することを含む。
本発明のハイブリドベクターによる酵母の形質転換は、
１ｌｉｎｎｅｎ等（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、　ＵＳＡ　７５＋１９２９　（１９７８）　）に
より記載されている方法により行うことができる。この
方法は次の３つの段階に分けることができる。
（１）グルコシダーゼの種々の調製物、例えばカタツム
リの腸液（例えば、グルスラーゼ（Ｇｌｕｓｕｌａｓｅ
）又はヘリカーゼ（Ｈｅｌｉｃａｓｅ）　）又は微生物
からの酵素混合物〔例えばチモリアーゼ（Ｚｙｍｏｌｙ
ａｓｅ）　］を浸透圧的に安定な溶液中で用いて酵母細
胞壁又はその部分を除去する。
（２）「裸の」酵母細胞（スフェロプラスト）をＰＥＧ
（ポリエチレングリコール）及びＣａ”イオンの存在下
でＤＮＡベクターにより処理する。
（３）寒天の固層中で、細胞壁を再生しそして形質転換
された細胞を選択する。この再生は便利にはスフェロプ
ラストを寒天中に包埋することにより行われる。例えば
、溶融した寒天（約５０°Ｃ）をスフェロプラストと混
合する。この溶液を酵母増殖温度（約３０°Ｃ）に冷却
した後固層が得られる。この固層は、スフェロプラスト
からの必須巨大分子の象、速な拡散及び喪失を防止し、
そしてこれによって細胞壁の再生を促進するためのもの
である。しかしながら、あらかじめ形成された寒天層の
表面にスフェロプラストをプレートすることによっても
（効率は低いが）細胞壁の再生を行うことができる。
好ましくは、再生寒天は、再生及び形質転換された細胞
の選択が同時に可能なように調製される。
アミノ酸又は核酸生合成経路の酵素をコードする酵母遺
伝子が一般に選択マーカー（前記）として使用されるか
ら、再生は好ましくは酵母最小寒天中で行われる。非常
に高効率の再生が必要な場合、次の二段階法、すなわち
、（１）冨複合培地中での細胞壁の再生、及び（２）選
択寒天プレート上への細胞層のレプリカによる形質転換
された細胞の選択、を用いる方法が有利である。
本発明の他の態様は（ＩＶ）： Ｘ＋　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌ
ｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　ＧｉｎＡｓｎ　　Ｌｅｕ　　Ｃｙ
ｓ　　Ｌｅｕ　　Ｃｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｙ　　Ｓｅ
ｒ　　Ａｓｎ　　ＶａｌＣｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｇｌ
ｙ　Ａｓｎ　Ｘ、　Ｃｙｓ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　ＧｌｙＳ
ｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｘ、＾ｓｎ　Ｇｌｎ　
Ｃｙｓ　Ｖａｌ　ＴｈｒＧｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈ
ｒ　Ｐｒｏ　Ｘ４　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｘ５＾ｓ
ｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ
　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ（Ｔｔ／） （式中、Ｘｌはジペプチド残基Ｖａｊ！−Ｖａｎを表わ
し、Ｘｔ、Ｘ、及びＸ４は、Ｌｙｓであり、Ｘ。
はＨｉｓであり、そしてＸ、はＧｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ
−八ｒｇ。
Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ及びＴｒｐ−Ｇｌｕ−
Ｌｅｕ−Ａｒｇから成る群から選択される） で表わされるデスルファトヒルジンに関する。
本発明の方法により得られる既知の異種蛋白質はそれ自
体既知の方法でヒト及び動物の疾患の治療及び予防のた
めに使用することができる。例えば、ヒ）ＡＮＰはナト
リウム利尿活性、利尿活性及び血管弛緩活性を有し、そ
して心臓血管系の恒常性調節のために使用することがで
きる。
本発明の方法により得られるデスルファトヒルジン化合
物は、ヨーロッパ特許出願Ｎα１６８，３４２に記載さ
れているように、天然ヒルジンと同様に、血栓症の治療
及び予防のため、急性ショック療法のため、消費凝結皿
状症の療法等のために使用することができる。
本発明はさらに、例に記載されているような、形質転換
された酵母株、該ハイブリドベクター及び該形質転換さ
れた酵母株の製造方法、並びにデスルファトヒルジン化
合物の製造方法に関する。
次の実験の部において、本発明の種々の態様を図面に言
及しながら説明する。
実１し１皿 Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅ
ｒ、バークレー、米国、から得られるＳ、セレビシェ−
ｋｅｘｌ変異株９６　（ａ　、　ｋｅｘｌ　、　ａｃｔ
ｅ２　、　ｔｈｒｌ）を、野性型ＫＥＸＩ対立遺伝子を
担持するＳ、セレビシェ−株ＢＹＳ２３２−３１−４．
２（α、　ｐｒｂｌ−１、ｐｒｃＬｌ　、　ｐｃｓｌ−
３、１ｙｓ２　、　Ｉｅｕ２゜ｈｉｓ７）　　（Ａｃｈ
ｓｔｅｔｔｅｒ、　Ｔ、及び−ｏｌｆ、　Ｄ、　Ｉｌ、
　（１９８５）。
ＥＭＢＯＪ、　　４．１７３−１７７　；　Ｗｏｌｆ、
　Ｄ、　ｌ！、及びＥｈｍａｎｎ。
Ｃ，（１９８１）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１４
７４１８−４２６）に交配する。遺伝子型がｋｅｘｌ／
ＫＥＸＩである二倍体へテロ接合細胞をこの交配から単
離する。この二倍体細胞に由来する４分子（ｔｅｔｒａ
ｄ　）を標準的な遺伝的技法（Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ、　
ｏ、　ｃ、及びＭｏｒｔｉｍｅｒ、　Ｒ，Ｋ。
（］９６０）、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　４５．１０８５
−１１１０　；　Ｍｅｔｈｏｄ　１ｎＹｅａｓｔ　Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ　１９８６　（Ｓｈｅｒｍ、　Ｆ、等鴫集
）　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、　Ｎ、　Ｙ、　］に従って分離（ｄｉｓｓ
ｅｃｔ）する。
各４分子（ｔｅ　ｔｒａｄ　）の４個の胞子を、α−フ
ァクターを分泌するそれらの能力について試験する。
ＫＥＸＩ野性型コロニーとｋｅｘｌ変異株コロニーとを
区別するため、フェロモン−超惑受性試験株Ｓ、セレビ
シェ−ＲＣ６２９（ａ　、　５ｓｔ−２，ａｄｅ２−１
．　ｖｒａｌ。
ｈｉｓ６．　ｍｅｔＬ　ｃａｎｌ、　ｃｙｈ２．　ｒｍ
ｅ）を用いる〔ｃｈａｎ＋Ｒ０に、及び０ｔｔｅ、　Ｃ
，Ｋ、　（１９８２）、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉ
ｏｌ。
７、１１−２０　；　Ｃｈａｎ、　Ｒｏに、及び０ｔｔ
ｅ、　Ｃ，Ｋ、　（１９８２）。
Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、＋　　：Ｌ　２１−
２９］　ｏ単一核遺伝子によりコードされた形質から予
想されるように、分析したすべての４分子（ｔｅｔｒａ
ｄ）から、各４分子（ｔｅｔｒａｄ）の２個の胞子はａ
−ファクターを分泌し、他方、他の２個の胞子はα−フ
ァクターを分泌する。α−メイティングタイプの野性型
ＫＥＸＩコロニーは試験株の増殖を大巾に阻害し、そし
てそれ故に自らの周囲に大きなハローを形成する。
なぜなら、それらはα−ファクター前駆体を完全に生産
することができそして１個の前駆体分子から４個の活性
なα−ファクター分子を生成するからである。これに対
して、ｋｅｘｌ変異体コロニーは試験株の増殖をあまり
阻害せず、そしてそれ故に自らの周囲に小さいハローを
形成する。なぜなら、これらは１個の前駆体分子から１
個の成熟α−ファクター分子を生成することができるだ
けであるからである。
前記のファロモン測定においてｋｅｘｌ遺伝子において
欠陥がある（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）と同定された幾つか
の完全な４分子（ｔｅｔｒａｄ）の胞子をカルボキシペ
プチダーゼｙｓｃαΦ比活性について最終的に試験する
。細胞を増殖せしめ、その膜を調製し、そしてＷａｇｎ
ｅｒ＋　Ｊ、　Ｃ，及びＷｏｌｆ、　Ｄ、　Ｈ，（１９
Ｂ？）　ＦＥＢＳＬｅｔｔ、、　２２１．２．４２３−
４２６に記載されているようにして基質としてＣｂｚ−
Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−＾ｒｇを用いてカルボキシペプチダー
ゼについて試験する。カルボキシペプチダーゼｙｓｃα
の活性がｋｅｘｌ変異株細胞において欠けているという
事実はにＩＥＸＩがこの酵素の構造遺伝子であることを
示すものである。このことは、カルボキシペプチダーゼ
ｙｓｃαがα−ファクターのカルボキシ末端のプロセシ
ングに確かに関与していることを意味する。
■１　プロー−ゼｃｓＢｓｃＹ　　コー攬汚Ｉ広ｌＳ、
セレビシェーｋｅｘｌ変異株を、他のプロテアーゼ（プ
ロティナーゼｙｓｃＢ、カルボキシペプチダーゼｙｓｃ
Ｙ及びカルボキシペプチダーゼｙｓｃｓ）並びに追加の
増殖因子要求に関して分類する。
ＹＰＤ　（デイフコ）培地での定常期から調製したｋｅ
ｘｌ変異株の細胞材料を、エッペンドルフ小遠心管中の
２００μｌの２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ緩衝液（ｐ
１１７．２）中に懸濁し、そしてガラスピーズ（直径０
、４　ｍｍ　）を体積の３分の２まで加える。この懸濁
液をポルテックスミキサー上で１分間ずつ３回激しく振
とうし、振とうと振とうとの間に氷上で冷却する。
５分間の遠心分離により上清粗抽出物が回収される。プ
ロテアーゼを活性化しそして抽出物からの遊離アミノ酸
を除去するため、０．１　ｍＭ　ＺｎＣｌ２２を含む０
．１　Ｍイミダゾ−／Ｉ／−Ｈｉ緩衝液（ｐＨ５，２）
に対して前記抽出物を透析する。
プロテアーゼｙｓｃＢ活性をアゾコーノ喧Ａｚｏｃｏｌ
ｌ）テスト（Ｒ，Ｅ、　Ｕｌａｎｅ等（１９７６）、　
Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ。
２５１．３３６７；　Ｅ、　Ｃａｂｉｂ等（１９７３）
、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ−ｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、
　Ｃｏｍｍｕｎ、　５０＋　１８６　；　Ｔ、　５ａｈ
ｅｋｉ等（１９７４）、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅＩＩ＋、　４２．６２１）により測定する。蛋白質濃
度を測定した後、各サンプルのアリコートを０．１Ｍリ
ン酸ナトリウム（ＮａＰｉ　）緩衝液（ｐＨ７，０）に
より１００Ｉまでに満たして必要な同じ蛋白質濃度に調
整する。この蛋白質溶液に５００４のアゾコール（Ａｚ
ｏｃｏｌｌ）の懸濁液Ｎ　ＯｄのＯ，ｌ　Ｍ　　ＮａＰ
ｉ緩衝液（ｐ）１７．０）中２４０ｍｇ）を加える。こ
れらの混合物を３０°Ｃにて１時間振とうしながらイン
キュベートする。５００　ｍの１０％トリクロロ酢酸を
添加して反応を停止させた後、この混合物を２回遠心し
、そして上清の５２０ｎｍにおける吸収スペクトルを測
定する。
カルボキシペプチダーゼｙｓｃＹ及びｙｓｃＳの活性を
、発色基質Ｃｂｚ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕを用いて測定する（
Ｄ、　ＨｌＷｏｌｆ等（１９７８）、　ＦＥＢＳ　Ｌｅ
ｔｔ、　９１．５９　；　Ｄ、　Ｉｌ、　Ｗｏｌｆ等（
１９７７）、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　［ｌｉｏｃｈｅｍ、　
７３．５５３］　、透析された抽出物を３分割し、それ
らの内の２つにフェニルメチルスルホニルフルオリド（
ＰＭＳＦ＞を最終濃度１ｍＭに、又はＥＤＴＡを最終濃
度５１１ＩＭに加えて２種類のプロテアーゼ活性を選択
的にブロックする。
すなわち、ＰＭＳＦはカルボキシペプチダーゼｙｓｃＹ
活性を阻害し、そしてＥＤＴＡはカルボキシペプチダー
ゼｙｓｃＳの活性を阻害する。阻害剤との混合物をそれ
ぞれ２５°Ｃにて１時間インキュベートして阻害を完結
する。蛋白質濃度を測定した後、阻害剤を伴う２つのア
リコート、及び各サンプルの対照としての阻害剤を伴わ
ない１つのアリコートを０．１Ｍ　ＮａＰｉ緩衝液（ｐ
Ｈ７，４）により５０ｍまで満たして同じ蛋白質量にす
る。これらの蛋白質溶液に次の試験溶液を加える。
５００ｍの試験溶液Ｉ： ０、　Ｉ　Ｍ　　ＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ７，４）中Ｌ−
アミノ酸オキシダーゼ　　　０．２４ｍｇ／ｄ西洋ワサ
ビ・パーオキシダーゼ　０．４０■／ｄＯ，０１ｍＭ　
　ＭｎＣｌ　！ ５０ｄの試験溶液■： 水中 ０−ジアニシジン　　　　　　　　２■／成５００μｌ
の試験溶液■： ０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，４）中２０ｍ
Ｍ　　Ｃｂｚ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ これらの混合物を２８°Ｃにて１時間インキュベートし
、そして１０Ｑ１１！の２０％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１０
０を添加して反応を停止させた後、４０５ｎｍにおける
吸光度を測定する。
その後の形質転換のため、アデニン、スレオニン、リジ
ン及びヒスチジンが供給されておりそしてロイシンを含
有するか又は含有しない最少培地プレート上でのレプリ
カ法により、ロイシンについてアミノ酸栄養要求マーカ
ーをスコアーする。
上記のアッセイにより、四重のプロテアーゼ欠損（ｃｒ
　＋　ｐｒｂ−１＋　ｐｒｃ−Ｌ　ｃｐｓ−３，ｋｅｘ
ｌ）及びさらにロイシン要求を示すＳ、セレビシェ−Ｂ
ＹＳｋｅｘ　１　ト称する変異株を単離する。
プラスミドｐＪＤＢ　２０７／ＰＨ０５−ＨＩＲ（ヨー
ロッパ特許用＃　Ｎｏ、２２５６３３　）を、プロテア
ーゼ四重欠損株ＢＹＳｋｅｘｌ（α、　ｐｒｂ−１，ｐ
ｒｃ−１，ｃｐｓ−３＋　ｋｅｘ−１＋　１ｅｕ２）及
び対照としてのＫＥＸＩ野性型株ＢＹＳ２３２−３１−
４２　（α。
ｐｒｂ−１＋　ｐｒｃ−Ｌ　ｃｐｓ−３＋　１ｙｓ２．
１ｅｕ２．　ｈｉｓ７）に、Ｈｉｎｎｅｎ等（Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ　７５
．１９２９（１９７８）　）により記載された形質転換
法を用いて導入する。
上記２種類の異る酵母株を１００ｄのＹＰＤ培地中初期
対数期（ＯＤ、。。＝　０．２　）から収得し、２５ｄ
の０．８　Ｍソルビトールにより洗浄し、そして５戚の
同じソルビトール溶液中に再懸濁する。これらの５Ｉｄ
、細胞懸濁液に３０Ｉ１１のチモリアーゼ（ｚｙｏ＋ｏ
ｌｙａｓｅ）　　（アースロバフタ−・ルテウス（八ｒ
ｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　１ｕｔｅｕｓ）からのＺＹＭＯ
ＬＹＡＳＥ−１００Ｔ。
生化学工業株式会社；１０■／ｌｅ０．８Ｍソルビトー
ル〕を加える。これらの混合物のそれぞれを、１００ｄ
の振とうララスコ中振とう機上（１００回／分）上３０
″Ｃにて約３０分間撹拌する。５分間の間隔で１００ｐ
ｆのサンプルを採取し、１０ｍｆｔの蒸留水中に懸濁し
、そして６００ｎｍでの稀釈物の吸光度を測定してスフ
ェロプラスト化の進行過程を調節する。
良好なスフェロプラスト形成を得るためには、チモリア
ーゼによる処理の前後の吸光度の差が１０の係数より大
でなければならない。スフェロプラスト化された細胞を
０．８Ｍソルビトールにより２回洗浄し、２５緘のＨＥ
　３０培地（ＹＰＤ培地中２Ｍソルビトール）に再懸濁
し、そして１ｏｏｙの振とうフラスコ中で振とう機（ｌ
ｌＯ回／分）上で緩和に撹拌しながら３０°Ｃにて１時
間インキュベートする。細胞を遠心分離しく３０００ｒ
ｐｍ、５分間）、そして１戚のｕｃ３１？容ン夜（１０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１Ｃｊ！　　（ｐＨ７，５）、１０
ｍＭ　ＣａＣ１ｚ　、０．９　Ｍソルビトール〕中に注
意深く再懸濁する。これらの１００１１１の細胞懸濁液
に４■のプラスミドＤＮＡを加える。この混合物を室温
にて１５分間インキュベートする。１　ｍｌｌの２０％
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）　４０００を各チュ
ーブに加え、そしてさらに３０分間室温にてインキュベ
ートし、遠心しく３０００ｒｐｍ、　３分間）、そして
５００ハの０．８　Ｍソルビトールに再懸濁する。
スフアトブラストをＤＮＡと共に１０蔵の再生寒天（１
Ｍマンニトール、６．８ｇ／Ｉ！　　イースト・ニトロ
ゲン・ベース−１０ＡＡ　（デイフコ）、Ｌｏｇ／ｌ　
　Ｌ−アスパラギン、１−０ｇ／Ｉ　　Ｌ−ヒスチジン
、１．０ｇ／ｊ２　７テニン、１．０ｇ／ｌ　　スレオ
ニン、ｔ、ｏｇ／ｆｆｉリジン及び３％寒天）と混合し
、そして同じ組成の基礎寒天層を含むプレート上上層と
して江別する。このプレートを、形質転換体コロニーが
出現するまで３０’Ｃにて９６時間インキュベートする
。
単一の形質転換された酵母コロニーを拾い、そしてアデ
ニン、スレオニン、リジン及びヒスチジンが補充されて
いるがロイシンを含有しない酵母合成最少培地（８，４
ｇ／βイースト・二トロゲン・ベース−１０ＡＡ、１０
ｇ／ｆ　　Ｌ−アスパラギン及び１．Ｏｇ／ｊ２　　Ｌ
−ヒスチジン）中で増殖せしめる。プロテアーゼ四重欠
損株ＢＹＳｋｅｘ　１からのコロニー、及びプロテアー
ゼ三重欠損対照株ＢＹＳＫＥＸ　１からのそれを、それ
ぞれサッカロミセス・セレビシエーＢＹＳｋｅｘｌ／ｐ
ＪＤＢ２０７／ＰＩＩ０５−１１１Ｒ，及びサツ力ロミ
（！ス＝−ｔ！レビシＸ　−ＢＹＳＫＥＸＩ／ｐＪＤＢ
２０７／Ｐｔ１０５−ＨＩＲと称する。
サッカロミセス・セレビシエーの形質転換体ＢＹＳｋｅ
ｘｌ／ｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−）ＩＩＲ及びＢＹＳ
ＫＥＸＩ／ｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−ＨＩＲの細胞を
前培養として１０戚の酵母完全培地＋１Ｅ４１　（４，
５ｇｅｌ　　カザミノ酸、４ｇ／ｌ酵母エキス、２０　
ｇ／Ａ　　サッカロース、２０ｇ／！　グルコース、３
．６　ｇｅｌ　　（ＮＨ，）、Ｓ０４．０．２ｇ　／　
ｌ　ＭｇＳＯ４・７１１ｚＯ１０，０１３ｇ　／　ｌ　
ＣａＣｌ　ｔ　　−１１２０及び１！ｄ／ｉ！、微量元
素混合物（１０ｇ　／　４２　（７）ＦｅＳＯｎ　・７
Ｈ２Ｏ，５０ｇｅｌのＺｎＳＯ４・７８ｚＯ１３，３ｇ
／４２のＣｕＳＯ４・５ＨｚＯ１３ｇ／ｆｆｉノＭｇ５
Ｏａ・Ｈｚｏ、　２ｇ／ｊ２のＣｏＣｌ　ｔ　・６８ｚ
Ｏ及び１　ｇ’／　ｌ　　（Ｎｌ（４）ＪｏＪｚ４　・
４）１！０）　］中で撹拌しそして約４８時間、定常期
に対するまで培養する。収得した細胞を０．９％ＮａＣ
１中で洗浄する。５０ｄの上記酵母合成培地に５％種接
材料を接種する。培養物を０Ｄｈｏｏ　＝　０．３の細
胞密度まで接種し、そして２　Ｂ　’Ｃ、２５０ｒｐｍ
にて７２時間まで撹拌した。
酵母完全培地ＨＥを用いてＨＰＬＣ分析におけるバック
グラウンド吸収を除去する。
液体酵母培養物からのサンプルを遠心により調製して透
明な溶液を生成せしめ、これを１Ｍ酢酸により１：１０
（ｖ／ν）で稀釈し、そして次の条件下でＩＩＰＬＣ分
析にかける。
＋＋１８ＡＲ（メルク）カラム（４Ｘ　１２５ｍｍ）に
逆相床孔シリカ材料（タイプ７１２５２．３００−５−
Ｃ１８、　ＭＡＣＩＩＥＲＥＹ−ＮＡＧ［！Ｌ）、５１
Ｍの粒子直径及び３００Ａのポロシティ−を有する球状
固定相、を充填する。カラムの端にステンレス鋼製のフ
リットを装着する。移動相Ａは０．１％（ｖ／ｖ）　　
トリフルオロ酢酸を含有する水（Ｎａｎｏｐｕｒｅ　（
商標）　、ＢＡＲＮＳＴＥＡＤ　）から成る。移動相Ｂ
は０．０８％のトリフルオロ酢酸を含有する８０％（ｖ
／ｖ）のアセトニトリル（ＨＰＬＣグレード、ＦＬＵに
＾）及び２０％の移動相Ａから成る。
クロマトグラフ分離を下記のグラジェントで１．５ｄ／
分の流速で行い、そして溶出液を２１６ｎｎ＋における
吸光度によりモニターする。
系の検定のための標準溶液を、１ｄの水に１■の純粋な
デスルファトヒルジンを溶解することにより調製する。
５０Ｉのこの標準溶液をカラムに注入し、そして上記の
ようにクロマトグラフ処理して系を検定する。
第１図に、Ｓ、セレビシェ−ＢＹＳｋｅｘｌ／ｐＪＤＢ
２０７／Ｐｌ＋０５−ＨＩＲ，及びＳ　、　セＬ／　ヒ
’／　ｘ　−ＢＹＳＸＥＸＩ／ｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０
５−ＨＩＲの培養物から得たヒルジン類の分析的逆相液
体クロマトグラフを示す。クロマトグラフィー条件は上
記の通りである。これから明ら、がなように、ＩＩＹＳ
ＫＨχ１／ｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−１ｌＩＩ株とは
異り、ペプチダーゼｙｓｃα陰性株ＢＹＳｋｅｘｌ／ｐ
ＪＤＢ２０？／ＰＨ０５−ＨＩＲは、Ｃ−末端アミノ酸
Ｇｌｕを欠くｃ−末端短縮形副生成物デスルファトヒル
ジン旧Ｒ−６４及びＣ−末端アミノ酸Ｌｅｕ及びＧｉｎ
を欠（旧Ｒ−６３を実質的に含有しないデスルファトヒ
ルジン性成物（ｒＨＩＲ−６５Ｊ　）を生産する。
ヒルジンｍＲＮＡの最適の翻訳を保証するため、ヒルジ
ン発現カセットのコード配列は好ましい酵母コドン（Ｂ
、Ｈａｌｌ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５７（１９
８２）３０２６）を用いて設計される。このコード配列
は、デスルファトヒルジンＨＶＩのコード配列にインフ
レーム融合した円１０５シグナル配列を含有する。合成
りＮＡの５′−末端はｎｃｏＲｌ制限部位の接着末端を
含有する。３′末端において、終止コドンＴＡＧのすぐ
後にＢａ１ｌＩＩ　Ｉ部位の接着末端が存在する。
２５７ｂｐのＨｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩ　　ＤＮＡ断片
の配列を第２図に示す。
第２図はまた、二本鎖ＤＮＡ断片の生体外合成のための
方法を示す。アプライド・バイオシステムズ・モデル３
８０Ｂ合成機上でホスホルアミダイト法（Ｍ、Ｈ，Ｃａ
ｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｅｎｚ
ｙｍａｔｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｆ
ｒａｇｍｅｎｔｓ（Ｉｌ、Ｇ、Ｇａ５５ｅｎ及びＡ、Ｌ
ａｎｇＩ集）を用いて２１種類のオリゴヌクレオチドを
合成する。個々のオリゴヌクレオチドの配列を第２図に
示す。オーバーラツプはユニークである。凍結乾燥され
たオリゴヌクレオチドを５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　　
（ｐＨ８，０）中に１０　ｐｍｏｌ／　ｔｔｌの濃度で
溶解する。２１種類のオリゴヌクレオチドは２つのグル
ープ、すなわち（Ａ）ＤＮＡ断片の５′−側半分を代表
するＮｏ、　１〜１１、及び（Ｂ）３’　−側半分のた
めのＮα１２〜２１、に配分される。２つのグループを
別々に処理する。１つのグループの１０Ｉｍｏｌずつの
オリゴヌクレオチドを混合する。
オリゴヌクレオチドを２０ｊ１１の２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−ＩＣ１（ｐＨ８，０）　、　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．
１０ｍＭ　ＮａＣ１、３ｍＭ　ＤＴＴ。
０．４ｍＭ＾ＴＰ及び８ユニツトのポリヌクレオチドキ
　□ナーゼ（ベーリンガー）中で３７°Ｃにて１時間リ
ン酸化する。室温にて３０分分間−た後、両温合物（Ａ
及びＢ）をそれぞれ水浴中で９５°Ｃにて５分間加熱す
る。サンプルを水浴中に一装置いて室温まで徐々に放冷
する。次に、アニールされたオリゴヌクレオチド混合物
Ａ及びＢを氷上に貯蔵する。
プラスミドｐＢＲ３２２を［ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨｌ
により完　□′全に切断する。４ｋｂの大断片を分取用
０．６％アガロースゲル上で単離する。ＤＮＡを電気溶
出により回収し、０Ｅ５２イオン交換クロマトグラフイ
ーにより精製し、そして例７に記載するようにしてエタ
ノール沈澱する。ＤＮＡを０．４　ｐｍｏ　ｌ　／　Ｊ
の濃度で水に再溶解する。
１０ＪＩＩのアニールされたオリゴヌクレオ（−）’Ａ
（Ｓ　ｐｍｏｌずつのオリゴヌクレオチド１〜１１）、
９．５４の混合物Ｂ（Ｓｐｍｏｌずつのオリゴヌクレオ
チド１２〜２１）　、０．４　ｐｍｏｌの４　ｋｂ　Ｅ
ｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩｐＢＲ３２２断片及び４００ユ
ニツトの７４　ＤＮＡリガーゼ（バイオラプス）を１５
°Ｃにて１６時間インキュベートする。
１０ｍのアリコートを用いてコンピテント大腸菌１１８
ＩＯＩ　Ｃａ”株を形質転換する。１２個の形質転換さ
れたアンピシリン耐性コロニーを別々に、１００ｉ／ｍ
のアンピシリンを含有するＬＢ培地中で増殖せしめる。
プラスミドＤＮＡをｔｌｏｌｍｅｓ等〔八ｎａ　１　、
　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ　、月、４　（１９８１）　１９３
　）の方法により調製し、そしてＥｃｏＲＩ及びＢａ１
ｌ！　Ｔ制限消化により分析する。２５７ｂｐ　Ｅｃｏ
ＲＩ　−Ｂａｍ）ｌ　Ｉ挿入部を有するプラスミドＤＮ
Ａを両鎖についてのＤＮＡ配列決定によりさらに分析す
る。オリゴヌクレオチド３゜１１　、１２　、１４及び
２０（第２図を参照のこと）を配列決定プライマーとし
て用いる。両ＤＮＡｔＭについて正しい配列を有する１
個のクローンを選択し、そしてｐＢＲ３２２／　ＹＨＩ
Ｒと称する。
炭エ　プラスミド　ＪＰＤ２０７　　ＧＡＰＦＬ−ＹＩ
ＩＩＲの　−１ｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−ＹＩＩＩ
Ｒは、酵母グリセルアルデヒド−３−ホスフェート・デ
ヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤｌｌ）の短い構成的プロモー
ターの制御のもとにデスルファトヒルジン変形体ＨＶＩ
を発現するための酵母プラスミドである。デスルファト
ヒルジンのコード配列は好ましい酵母コドンから成る。
１１０１ｒのプラスミドｐＢＲ３２２／　ＹＩＩＩＲを
制限エンドヌクレアーゼＢａｍ１（Ｉ及びＥｃｏＲＩに
より消化する。
２５７ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−Ｂａｍｔｌ　Ｉ断片を１．
２％分取用アガロースゲル上で他のＤＮＡ断片から分離
する。ＤＮＡのバンドを臭化エチジウムにより染色し、
そして３６０ｎｍのＵＶ光のもとて可視化する。２５７
ｂｐ　ＤＮ八へンドをゲルから切り取り、そして０．２
　Ｘ　ＴＢＥ緩衝液（ＴＢＥ　：　９０ｍＭ　Ｔｒｉｓ
塩基、９０ｍＭ硼酸、２．５ｍＭＩＥＤＴＡ　、　ｐ＋
＋　８．３　）中に１００ｍＡにて４５分間電気？容出
する。４５秒間極性を変えた後、ＤＮＡ溶液を集め、そ
して０．１５Ｍ　ＮａＣ１に調製する。このＤＮＡをＤ
Ｅ５２イオン交換体（ワットマン）のベツド１００Ｉに
吸着せしめ、そして４００μｌの高温緩衝液〔１０ｍＭ
　　Ｔｒｉｓ−１１（Ｊ　　　（ｐＨ８，０）　　　、
　　１ｍＭ　　［ＥＤＴＡ、　　１．５ＭＮａＣ／　）
中で溶出する。ＤＮＡをエタノール沈澱せしめそして０
．１　ｐｍｏｌ／　ｔｉの濃度で水に再懸濁する。
プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−１１１Ｒ（ヨ
ーロッパ特許出願Ｎｏ、　２２５．６３３）は、酵母酸
性ホスファターゼ（ＰＨ０５）のシグナル配列にインフ
レーム融合したデスルファトヒルジンの合成遺伝子（大
腸菌のコドンの使用に暴く）を含有する。この遺伝子は
、シャトルベクターｐＪＤＢ２０？上の酵母の短い構成
的グリセルアルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロゲ
ナーゼ（ＧＡＰＦＬ）プロモーターの制御のもとに１　
発現される。１０ＩＪ１のプラスミドｐＪＤＢ２０７／
ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲを５ａｆｌ及びＥｃｏＲＩで消化す
る。４７８ｂｐ　Ｓａｌ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片は５ａ１
−Ｂａｎ　ｐＢＲ３２２部分及びＧＡＰＦＬプロモータ
ーを含有する。このＤＮＡ断片を０．８％分取用アガロ
ースゲル上で単離し、電気溶出し、そしてＤＩ！５２ク
ロマトグラフィー及びエタノール沈澱により精製する。
ＤＮＡを０．１　ｐｍｏｌ／　ｕｌの濃度で水中に再懸
濁する。５μｇのｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−ｔｌｌ
Ｒを５ａｆｆｉ！及びＢａｍ１ｌ　Ｉにより消化する。
大６．７ｋｂベクター断片を上記のようにして単離する
。
０、２　ｐｍｏｌの４７８ｂｐ　Ｓａｄ　Ｉ　−Ｅｃｏ
ＲＩプロモーター断片、ＰＩ＋０５シグナル配列及び合
成ヒルジン遺伝子（酵母コドン）を含有する２５７ｂｐ
　ＥｃｏＲＩ　−Ｂａｍｔｌ　Ｉ断片０．２　ｐｍｏｌ
、並びに０．１　ｐｍｏｌの６．７ｋｂベクタ一断片を
１０ｍの６０ｍＭ　Ｔｒｙｓ−ｔｌｃ／　　（ｐＨ７，
５）　　、　１０ｍＭ　ＭｇＣ２□、　５ｍＭ　ＤＴＴ
　、　１ｍＭ＾ＴＰ及び２００ユニツトのＴ４　ＤＮＡ
リガーゼ（バイオラプス）中で１５°Ｃにて６時間連結
せしめる。連結混合物のＩＩＩＩのアリコートを用いて
コンピテント大腸菌ＨＢＩＯＩ細胞を形質転換する。
１２個の形質転換されたアンピシリン耐性コロニーを別
々に、１００ｇ／ｍのアンピシリンを含有するＬＢ培地
中で増殖せしめる。プラスミドＤＮＡを）Ｉｏｌｍｅｓ
等（前掲）の方法により調製し、そして５ａ１１／旧ｎ
ｄｎｌ二重消化により分析する。予想通りの制限パター
ンを有する単一クローンをｐＪＤＢ２０？／ＧＡＰＦＬ
−ＹＨＩＲと称する。
同様にして、プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＥＬ−
ＨＩＲ（ヨーロッパ特許出願Ｎα２２５，６３３）の５
４３ｂｐＳａ　１１−ＥｃｏＲＩプロモーター断片を用
いて作製を行うことができる。生ずる新しいプラスミド
をｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＩＩ！Ｌ−ＹＨＩＲと称する
。
１）ＪＯＢ２０？／展（−１７３）　−ＩＩ　ＩＲは、
短い展プロモーターの制御のもとにデスルファトヒルジ
ン変形体ＨＶＩを発現せしめるための酵母プラスミドで
ある。ＰＨ０５（−１７３）プロモーター要素は酵母Ｐ
　ＩＩ　０５プロモーターの一９位から一１７３位（Ｂ
ｓｔＥ］ｌ制限部位）のヌクレオチド配列を含有するが
しかし上流制御配列（ＵＡＳ　）を有しない。従ってＰ
Ｈ０５（−１７３）プロモーターは構成的プロモーター
のように挙動する。
プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨ匹（Ｅｃｏ）−ｔｌｌ
Ｒ（ＥＰ　２２５　。
６３３）は、ＰＨ０５シグナル配列のＡＴＧに対して一
８位にＥｃｏＲ１部位が導入されている完全な長さの制
御されるＰＨＯ５プロモーター、デスルファトヒルジン
のためのコード配列、及びこれに続（Ｐ１１０５転写停
止断片を含有する。この例は、短いＰＨＯ５（−１７３
）プロモーター要素による制御される脳プロモーターの
置換を記載する。
２０鱈のプラスミドｐＪＤＢ２０？／ＰＨ０５（Ｅｃｏ
）−ＨＩＲをＢｓｔｔ！ＩＩにより消化する。制限断片
の接着末端を、２００　ｄの６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７，５）　、　１０ｎ＋Ｍ・ＭｇＣ１ｚ　。
０．１ｍＭずつのｄＡＴＰ　、　ｄＣＴＰ　、　ｄＧＴ
Ｐ及びＴＴＰ中で室温にて３０分間、Ｋｌｅｎｏｗ　Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（１ユニツト／＊０ＮＡ）と反応せし
めることによりフィルインする。フェノール抽出の後、
ＤＮＡをエタノール沈澱せしめる。４．１６ｘのＢａｍ
１ｌ　Ｉリンカ−（５′−ＣＧＧＡＴＣＣＧ−３’　　
；バイオラプス）を、１００μｌの６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐｌ！７．５　）　　、　１０ｍＭ　ＭｇＣ
ｆｇ　、　５ｍＭＤＴＴ　、　０．５　ｍＭ＾ＴＰ及び
１８ユニツトのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリ
ンガー）中で３７°Ｃにて４５分間リン酸化する。７５
°Ｃにて１５分間の後、反応混合物を室温まで徐々に冷
却する。アニールされたオリゴヌクレオチドリンカーを
−２０’Ｃにて貯蔵する。
プラスミドｐＪＤＢ２０？／Ｐ１１０５（Ｅｃｏ）−Ｈ
ＩＲの（ＢｓｔＥＩＩ：１／平平滑末端片４　ｐｍｏｌ
を１５°Ｃにて１６時間、１００倍過剰のリン酸化され
そしてアニールされたＢａｍＨＩリンカ−と共に、２０
８μＺの６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１ＩＣｊ！　（ｐＨ７，
５）＋１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ、　５ｍＭ　ＤＴＴ、　３
．５ｍＭ　ＡＴＰ及び８００ユニツトの７４　ＤＮＡリ
ガーゼ（バイオラプス）中でインキュベートする。８５
“Ｃにて１０分間リガーゼを不活性化した後、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、　　３００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６，０
）及び０．５４容量のイソプロパツールの存在下でのＤ
ＮＡの沈澱により過剰のリンカ−を除去する。ＤＮＡを
Ｂａｍ１ｌ　ｌ及びＥｃｏＲＩにより消化する。ＤＮＡ
断片を０．８％分取用アガロースゲル上で分離する。１
７２ｂｐのＢａｍ１（Ｉ　−ＥｃｏＲＩプロモーター断
片を電気溶出及びエタノール沈澱によりゲルから回収す
る。このＤＮＡを０．１　ｐｍｏｌ／　ｔｌの濃度に再
懸濁する。
プラスミドｐＪＤＢ２０７／Ｐ）Ｉ旺（ｔ！ｃｏ）　−
ＨＩＲをＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄｌＩ［により消化する。
６４３ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−ｔｌｉｎｄ■断片を前記の
様にして単離する。このＤＮＡ断片はデスルファトヒル
ジンのコード配列にインフレーム融合したＰＨ０５シグ
ナル配列及びＰＨ０５転写停転写停止台有する。該プラ
スミドをまた旧ｎｄＩＩ［及びＢａｍ１ｌ　Ｉで切断す
る。６．６ｋｂベクタ一断片を単離する。
０、２　ｐｍｏｌずつの１７２ｂｐ　Ｂａｍ）ｌ　Ｉ　
−ＥｃｏＲＩ断片及び６４３ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−１１
ｉｎｄＩＩ［断片並びに０．１　ｐｍｏｌの６．６ｋｂ
ベクタ一断片を、１０ｍの６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−＋１ｃ
ｊ７（ｐｌ＋７．５）　　、１０ｍＭ　ＭｇＣｆｆ１ｚ
、　５ｆｆｉＭ　ＤＴＴ、１　ｍＭ　ＡＴＰ及び４００
ユニツトのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（バイオラプス）中で
１５°Ｃにて６時間連結する。この連結混合物のＩＩの
アリコートを１ｏｏｕ！のカルシウム処理された形質転
換コンピテント大腸菌ＨＢＩＯＩ細胞に加える。
１２個の形質転換されたアンピシリン耐性コロニーを、
１００ｎ／ｍｅのアンピシリンを含有するＬＢ培地中で
増殖せしめる。プラスミドＤＮＡを調製し、そしてＢａ
ｍＨＩ及びＳａｆ　Ｉ　／Ｈｉｎｄｌｌ［消化により分
析する。予想通りの断片断片を有する１つのクローンを
選択し、そしてｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５（−１７３）
−旧Ｒと称する。
Ｈ班　ブースミ゛　ＤＰ３４の　１ 酵母２ミクロンの共有結合で閉環されたＤＮＡをサッカ
ロミセス・セレビシエー５２８８Ｃ株から単離する。細
胞を５ｎ／−のチモリアーゼ（１００，０００ユニット
／河）と共に３７°Ｃにて２０分間インキュベートして
細胞壁を消化する。スフェロプラストを２％ＳＤＳによ
り溶解する。次にＥＤＴＡを２５ｍ１１１に加え、臭化
エチジウムを１ｍｇ＃２に加え、そして塩化セシウムを
１．５５ｇ／ｍの最終密度に加える。プラスミドＤＮＡ
を、４２．ＯＯＯｒｐｍ　、　１５°Ｃにて４２時間の
遠心分離により染色体ＤＮＡから分離する。２ミクロン
プラスミドをシリンジにより勾配から切り出す。Ｎａ（
Ｊ！飽和イソプロパツールによる抽出によって臭化エチ
ジウムを除去し、そしてプラスミドＤＮＡを最終的にエ
タノール沈澱せしめる。次に、精製された２ミクロンプ
ラスミドＤＮＡをＰｓｔ　１により線状化し、そしてｐ
ｔｌｃ１９（Ｊ　、　Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ等、Ｇｅｎｅ
　２６（１９８３）、　１０１）のＰｓｔ１部位にクロ
ーニングしてプラスミドｐＤＰ３１を得る。
プラスミドｐＪＤ１１２０７を制限酵素にｐｎｌ及びＨ
ｐａ　Ｉにより消化する。生ずる０、５５ｋｂ　ｔｌｐ
ａ　Ｉ　−Ｋｐｎ　ｌ断片は２ミクロン配列とｄＬＥυ
２遺伝子の欠陥プロモーターとの間の連結部を含有する
。
プラスミドｐＵｃ７／ＬＥｔ１２は、プラスミドｐＵｃ
７　（Ｊ。
Ｖｉｅｉｒａ等、Ｇｅｎｅ　Ｌ！１（１９Ｂ２）、　２
５９）の５ａｆｆｉ１部位にクローン化されたＬＥＵ２
遺伝子（Ａ、Ａｎｄｒｅａｄｉｓ等、Ｃｅ１ｌ、　３Ｈ
１９８２）、　３１９）の酵母ゲノム性２．２ｋｂＸｈ
ｏ　Ｉ　−Ｓａ　ｌｌ断片を含有する。プラスミドｐＵ
ｃ７／ＬＥｔ１２をＫｐｎ　Ｉ及びＨｐａ　Ｉにより切
断する。４．２５ｋｂ　Ｋｐｎ　Ｉ　−ｔ（ｐａ　ｌ断
片をｐＪＯＢ２０７の０．５５ｋｂ　ｌ１ｐａ　Ｉ−に
ｐｎｌ断片に連結する。これによりプラスミドｐＤＰ３
０が生じ、このプラスミドにおいては、プラスミドｐＪ
ＤＢ２０７中のもとの２ミクロン／ｄＬＥＵ　２融合が
、完全なターミネータ−を有するＬＥＵ２遺伝子の前に
置かれている。ｐＤＰ３０を１ｌｐａＩ及びＳａＩ！、
１により消化し、そして完全なＬＥ［］２遺伝子を含有
する１、８５ｋｂ断片を精製し、そしてプラスミドｐＤ
ｒ’３１の８．７ｋｂ　Ｓａｄ　Ｉ　−Ｈｐａ　ｌ断片
にクローニングする。生ずるプラスミドｐＤＰ３３　（
第３図を参照のこと）を、５０ｎ／ｄの臭化エチジウム
の存在下での旧ｎｄｌｌによる部分消化〔門、０ｅｓｔ
ｅｒｌｕｎｄ等、Ｇｅｎｅ堕（１９Ｂ２）１２１　）に
より線状化し、そしてＵＲＡ３遺伝子（Ｍ、Ｒｏｓｅ等
、Ｇｅｎｅ　２９（１９８４）、　１１３）を含有する
１、１７ｋｂ　ＨｉｎｄｎＴ断片と連結する。１ＩＲＡ
３遺伝子の挿入は大腸菌株ｐｙｒＦ　（Ｍ、Ｒｏｓｅ等
、前掲）への形質転換により選択される。陽性クローン
をプラスミドｐＤＰ３４　（第４図を参照のこと）と称
する。
ｐ（ｌＰ３４ハ、大腸菌用のアンピシリン耐性マーカー
並びにυＲＡ３及びｃｌＬＥＵ　２酵母選択マーカーを
有する酵母−大腸菌シャトルベクターである。このプラ
スミドはＡ形において完全な２ミクロン配列を含有し、
そしてｌ？ＥＰ１　、　ＲＥＰ２及びＦＬＰプロフィシ
エンド（ｐｒｏｆ　１ｃｉｅｎ　ｔ）である。
±１０．　［へのヒルジン　　カセ・・　のクローニン
グ プラスミドｐＤＰ３４をＢａｍＨＩにより消化する。制
限部位の接着末端をＫｌｅｎｏｗ　ＤＮＡポリメラーゼ
との反応によりフィルインする（　Ｔ、　Ｍａｎ　ｉａ
　ｔ　ｉｓ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、
　Ａ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏｌ
ｄＳｐｒｉｎｇ　　ｔ（ａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ＋　　１９８２）　　ｈ　　ＤＮＡを５ａｆｌに
よりさらに切断し、そして１１．８ｋｂベクタ一断片を
分取用０．６％アガロースゲル上で単離する。ＤＮＡを
電気溶出及びエタノール沈澱により回収する。種々の発
現カセットをｐＤＰ３４ベクター断片のＳａｄ１部位と
（Ｂａｍｌｌ　Ｉ　〕／平滑末端部位との間にクローニ
ングする。
プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−ＹＨＩＲをｌ
ｌ１ｎｄＩ［［により消化する。接着末端をにｌｅｎｏ
ｗ　ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端に転換する。Ｄ
ＮＡをエタノール沈澱せしめ、そして５ａｆｌによりさ
らに消化する。
１、１ｋｂ　Ｓａｌ　１−　（旧ｎｄｌｌｌ）／平滑末
端断片は、ｐＢＲ３２２配列、ＧＡＰＦＬプロモーター
、デスルファトヒルジンのコード配列（好ましい酵母コ
ドン）にインフレーム融合したＰＩ４０５シグナル配列
及び面転写停止断片を有する完全な発現カセットを含有
する。１．１　ｋｂ断片を分取用０．８％アガロースゲ
ル上で単離し、電気溶出によりゲルから回収し、そして
ＤＥ５２イオン交換クロマトグラフィー及びエタノール
沈澱により精製する。０．２　ｐｍｏｌの１．１　ｋｂ
断片及び０．１　ｐｍｏｌの１１．８ｋｂベクタ一断片
を１０ｍの６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　　（ｐＨ７
，５）　　、　１０ｍＭ　ＭｇＣｆｚ　、　５ｍＭＤＴ
Ｔ　、　３．５　ｍＦＩ八Ｔへ及び４００ユニ・ントの
Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（バイオラプス）中で１５°Ｃに
て１６時間連結する。ＩＩのアリコートを用いて大腸菌
）ＩＢＩＯＩＣａ４４細胞を形質転換する。５個の形質
転換されたアンピシリン耐性コロニーを分析する。プラ
スミドＤＮＡをＢａｍ）ｌ　Ｉ及びＳａ　ｌ　Ｉ　／Ｂ
ａｍＨＩにより消化する。正しい制限断片壱有する１つ
のクローンを選択し、そしてｐＤＰ３４／ＧＡＰＦＬ−
ＹＩＩＩＲ（第５図を参照のこと）と称する。
同様にして、ｐＪＤＢ２０？／ＧＡＰＥＬ−ＹＨＩＲ（
例７を参照のこと）の１．２ｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ　−（Ｂ
ｉｎｄｌ［）　／平滑末端断片をｐＤＰ３４ベクターに
クローニングしプラスミドｐＤＰ３４／ＧＡＰＥＬ−Ｙ
ＨＩＲを得る。
プラスミドｐＪＤＢ２０７　／　ＰＨ並（−１７３）−
）１１Ｒを５ａｆｆｉｌ及びＥｃｏＲＩで消化する。前
記のようにして４４８ｂｐ　Ｓａ　ｌ　Ｉ　−ＥｃｏＲ
Ｉ断片を単離する。このＤＮＡ断片はｐＢＲ３２２のＳ
ａ　ｅ　Ｉ　−ＢａｍＨ１部分及び短い構成的ＰＨ０５
（−１’７３）−プロモーターを含有する。
（例８を参照のこと）、、プラスミドｐＪｏｏ２０？／
ＧＡＰＦＬ−ＹＩＩＩＲを旧ｎｄｌ［［により消化する
。接着末端をＫｌｅｎｏｗ　ＤＮ＾ポリメラーゼにより
平滑末端に転換する。このＤＮＡをＥｃｏＲＩによりさ
らに消化する。
６４２ｂｐ　ＢｃｏＲＩ　　（ｌｌｉｎｄＩ［Ｉ　］　
／平滑末端断片を単離する。このものはＰ１１０５シグ
ナル配列、デスルファトヒルジンのコード配列（好まし
い酵母コドンを有する）及びＰＨ０５転写停転写停止台
有する。０．２ｐｍｏｌずつの４４８ｂｐ　Ｓａ　ｌ　
１−ＥｃｏＲＩ断片及び６４２ｂｐＥｃｏＲＩ−平滑末
端断片並びに０．１　ｐｍｏｌの１１．８ｋｂＳａｌ　
Ｉ　　（ＢａｍＨＩ　）　／平滑末端ベクター断片を連
結する。連結混合物のアリコートを用いて大腸菌ＨＢＩ
ＯＩ　Ｃａ”細胞を形質転換する。１２個の形質転換体
のプラスミドＤＮＡをｌ（ａｍｔｌ　Ｉ及び５ａＱｌ／
Ｂａｍ１ｌ　Ｉ消化により分析する。正しいプラスミド
のクローンを選択し、そしてｐＤＰ３４／賄卯（−１７
３）−ＹＩＩＩＲと称する（第６図を参照のこと）。
大腸菌コドンの使用に基（デスルファトヒルジン変形体
ＨＶＩの合成遺伝子を含有する発現プラスミドを例１０
に記載したのと同様にして作製する。ｐＪＤＰ２０７／
ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ（ヨーロッパ特許出願Ｎα２２５．
６３３）の１．１　ｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ　−（ＨｉｎｄＩ
［［）　／平滑末端断片を単離し、そしてベクターｐＤ
Ｐ３４にクローニングする。生ずる発現プラスミドは、
構成的ＧＡＰＦＬプロモーターの制御のもとに発現され
る好ましい大腸菌コドンに基くデスルファトヒルジンの
合成遺伝子を含有するｐＤＰ３４／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ
である。
同様にして、ｐＪｔｌＢ２Ｑ７／鷹（−１７３）　−１
ｌｌＲ（例８を参照のこと）の１．１ｋｂＳａｆｆｉｌ
　　　（ｌＩｉｎｄＩ［Ｉ）／平滑末端断片をｐＤＰ３
４にクローニングする。生ずるプラスミドｐｏｐ３４／
皿匹（−１７３）−ＨＩＲは、短い構成的ＰＨ０５（−
１７３）プロモーターの制御のもとにデスルファトヒル
ジンの合成遺伝子（大腸菌コドン）を含有する。
炭肥、ブｊ≦（工」−ＤＰ９２　　のヒルジン　　カセ
・・上 完全な２ミクロン配列を含有するベクターが真正な酵母
２ミクロン環のすべての機能を発現するとは限らない。
クローニングによりオープンリーディングフレームが破
壊される場合がある。今まで、「ＤＪグリ−ィングフレ
ームの遺伝子産物の機能は知られていないので、この遺
伝子中のユニークＰｓｔ１部位を用いてｄＬＩＥυ２遺
伝子［Ｂｅｇｇｓ。
Ｊ、Ｄ、、　Ｎａｔｕｒｅ　ｒｌ（１９７Ｂ）１０４−
１０９）がクローニングされ、又はプラスミドｐＤＰ３
１　（例９を参照のこと）におけるようにｐＵｃ１９ベ
クタ一部分を挿入された。
やっと最近になって、Ｄ遺伝子産物がＦＬＰ遺伝子産物
の発現を制御することが示唆された（Ｊ、Ａ。
Ｈ，Ｍｕｒｒａｙ等、ＥＭＢＯＪ、　　６．４２０５（
１９８７））。２ミクロン環のすべての利点を得るため
、Ｄ遺伝子産物を含むすべての既知２ミクロン機能につ
いて堪能な（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）ベクターを作製す
る。
プラスミドル叶３１（例９）をＰｓｔＩ及びｌ１ｐａｌ
で消化して３つの断片を生じさせる。プラスミドｐＫ１
９　（カナマイシン耐性を付与する；　Ｐｒｉｄｍｏｒ
ｅ＋Ｒ，Ｄ、Ｇｅｎｅ　５６（１９Ｂ？）３０９−３１
２）をＳｍａ　Ｉにより線状化する。雨滴化物のＤＮＡ
断片をフェノール抽出し、そしてエタノールで沈澱せし
める。ＤＮＡ断片を混合し、そして連結する。連結混合
物を用いてコンピテント大腸菌ＪＭ１０９株細胞（Ｙａ
ｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｒ＋、　Ｇ、等、Ｇｅｎｅ　ｕ
（１９８５）１０３−１１９）を形質転換しくＨａｎｅ
ｈａｎ、　Ｄ、Ｊ、、　Ｍｏ１．８ｉｏ１．．１ｉ（１
９８３）５５７−５８０）、ＬＢ培地中で３７°Ｃにて
２時間発現せしめ、そしテ５０　ｔｔｇ／　ｔｒｄｌ（
Ｄカナマイシン、３０Ｉ１ｇ／蔵のＸＧａ　１及び７　
ｐｇ　／　ｍｌのＩＰＴＧが補充されたＬＢ寒天プレー
ト上にプレートする。
１２個の白色のカナマイシン耐性コロニーを増殖せしめ
る。プラスミドをＸｂａ　Ｉ消化及びＢａｍＨＩ／Ｋｐ
ｎｌ消化により分析する。ｐＤＰ３２のｐｌＪｃ１９ベ
クタ一部分を喪失しており、Ｐｓｔ１部位の再連結によ
り２ミクロンＤリーディングフレームを再生しており、
そして１ｌｐａ１部位に挿入されたｐＫ１９プラスミド
平滑末端を有する単一クローンをｐＤＰ９１を称する。
このプラスミドは、ｐＫ１９のＳｍａ　１部位にクロー
ニングされた２ミクロンプラスミドの大１１ｐａ　Ｉ−
Ｐｓｔ断片及び小Ｐｓｔ　Ｉ　−１１ｐａ　Ｉ断片を含
有する。Ｐｓｔ１部位の再連結によりＤリーディングフ
レームが再構成されている。
ＵＲＡ３遺伝子をプラスミドｐＤＰ３４（例９を参照の
こと）からの１．１７ｋｂ　ｌＩｉｎｄｌＩＩ断片上に
単離し、そしてプラスミドｐＵｃ１２のユニーク旧ｎｄ
Ｉ［部位にクローニングする。アンピシリン耐性遺伝子
と同じ方向に挿入されたＵＲＡ３遺伝子を有するクロー
ンをｐＨｃ１２／ＵＲＡ３と称する。プラスミドｐＤＰ
９３及びｐＵｃ１２１０Ｒ＾３の両者をＳａｃ　Ｉ及び
Ｂａｍ１ｌ　Ｉにより消化してそれぞれ２断片を生じさ
せる。ＤＮＡ断片を混合連結し、そしてそれを用いてコ
ンピテント大腸菌ＪＭ１０９細胞を形質転換する。この
細胞を、１００ｉ／ｄのアンピシリン、３０ｎ／ｍＲの
ＸＧａＡ及び７躍／戚のＩＰＴＧが補充されたＬＢ天然
プレート上にプレートする。
１２個の白色のアンピシリン耐性コロニーを増殖せしめ
る。プラスミドＤＮＡを旧ｎｄＩＩＩ消化及びＰｖｕ　
ＩＩ消化により分析する。すべての既知機能について堪
能な完全な２ミクロン配列及びｐＵＣヘクター中にクロ
ーニングされたＬＩＲＡ３遺伝子を含んで成る単一クロ
ーンをｐＤＰ９２と称する。
ｂ）　ＤＰ　△、のヒルジン　　カセ・・　の　ローニ
ング 例５と同様にして、ｐＤＰ９２を［３ａｍＨＩで消化す
る。
接着末端をにＩｅｎｏｗ　ＤＮＡポリメラーゼとの反応
によりフィルインする。ＤＮＡをさらに５ａｆｆｉｌで
切断する。１０．２ｋｂベクタ一断片を単離する。プラ
スミドｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−ＹＩＩＴＲの１．
１ｋｂ　ＳａＱ　Ｉ−（ｌＩｉｎｄｌＩＩ）／平滑末端
断片を単離し、そしてベクター断片に連結する。
６個の形質転換されたアンピシリン耐性コロニーを分析
する。プラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ。
Ｐｓｔｌ、及びＳａ　１１　／　ＢａｍＨＩで消化する
。予想通りの制■断片を有する１つのクローンを選択し
、そしてρＤＰ９２／ＧＡＰＥＬ−Ｙ）ＩＩＲと称する
。同様にして、ｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−ＹＨＩＲ
（例７を参照のこと）の１．２ｋｂＳａｊ２１　　　（
ＩＩｉｎｄｌＩ［）／平滑末端断片を用いてプラスミド
ｐＤＰ９２／ＧＡＰＥＬ−ＹＩＩＩＲを得る。
１０．２ｋｂ　Ｓａｄ　ｌ　−（ＢａｍＨＩ　］　／平
滑末端ｐＤＰ９２ベクター断片（上記参照のこと）を用
いて、例１０に記載したようにしてプラスミドｐＤＰ９
２　／　ＰＨＯ５（−１７３）−ＹＨＩＲを作製する。
内因性２ミクロンプラスミドを除去するため、第一段階
においてＩＩ　Ｔ　２４６株（ＤＳＭ　４０８４　；α
、ｂ狙２−３．　ｌｅｕ　２−１１２．　ｐｒｂ）のＵ
ＲＡ３遺伝子に欠失を導入してこの株をウラシルについ
て栄養要求性にする。
旧ｎｎｅｎ等（Ｐｒｏｃ、Ｎａｃｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、　ＵＳＡ　７５＋　１９２９（１９７８）　）により
記載された形質転換法を用いて、＋１７２４６をｌｕの
プラスミドＹＥｐ１３　（Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、Ｒ。
５ｔｒａｔｈｅｒｎ、　Ｊ、Ｎ、、　Ｈｉｃｋｓ、　Ｊ
、Ｂ、（１９７９）　Ｇｅｎｅ　８＋１２１−１２３３
により形質転換する。ＵＩ？Ａ３遺伝子中に欠失を有す
るプラスミドｐＵｃ１２ｕｒａ３Δ（Ｓｅｎｇｓｔａｇ
。
Ｃｈ、＋　Ｈｉｎｎｅｎ、　Ａ、＋　Ｎｕｃｌｅｃｉｃ
　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ長。
２３３−２４６（１９８７）　）　１０ｎをプラスミド
ＹＥｐ１３と共に加える。約３０００個のロイシン原栄
養性形質転換体を、小振とうスラスコ中の５ｄの最少培
地（アミノ酸を含有しないデイフコのイースト・ニトロ
ゲン・ベースに２％グルコース、０．１％ロイシン、０
．１％ウラシル及び０．２５％フルオロオロシン酸を添
加したもの）に再懸濁し、そして３０’Ｃ、１８０ｒｐ
Ｉｌｌにて６０時間インキュベートする。増殖する形質
転喚体は毒性類似体フルオロオロチン酸に対して耐性で
あり、そしてそれ故に染色体ＵＲＡ３遺伝子中にｕｒａ
３Δによる置換を有する。増殖した細胞を、ペプトン２
０ｇ／ｌ、酵母エキス１０　ｇ／ｌ及びグルコース２０
　ｇ／ｌを含む、完全培地上にプレートし、そして３０
゛Ｃにて４８時間の増殖の後、アミノ酸を含有しない最
少培地（デイフコ・イースト・ニトロゲン・ベース、２
％グルコース及び０．１％ロイシンが補充されたもの）
にレプリカしてウラシル栄養要求株を検出する。幾つか
の栄養要求株を拾い上げ、そしてロイシン栄養要求性を
付与するプラスミドＹＥｐ１３の喪失について試験する
。ロイシン及びウラシルを要求する１つのコロニーを拾
い、そしてその後の実験に使用する。
Ｔｒ８８９を、マーカー遺伝子ＬＥｔ１２及びｔｌＲＡ
３の両者を有するプラスミドｐＤＰ３８　（プラスミド
ｐＤＰ３４から、ｓｐｈ　Ｉによる消化及び生ずる８、
４ｋｂ断片の再連結により得られる；第４図を参照のこ
と〕により形質転換する（形質転換法は前記）。形質転
換された酵母細胞をまず、ウラシルを欠きそしてロイシ
ンが補充された酵母最少培地プレート上で選択し、そし
て次に、ロイシンを欠きそしてウラシルが補充された最
少培地上にレプリカプレートする。１０個の１週間培養
したコロニーを拾い上げ、そして別々に液体完全培地（
前記）中で約１００世代増殖せしめる。こうすることに
より、細胞はｐＤＰ３Ｂプラスミドを失い、そして−あ
る比率で一同時に内因性２ミクロンプラスミドをも失う
。ウラシル及びロイシンを要求するコロニー１０個を拾
い、ＤＮＡを調製し、このＤＮＡをＰｓｔＩにより完全
消化し、そしてサザンプロット上で″ｔｐ−ラベル化酵
母２ミクロンＤＮＡでプローブする。
ハイプリダイゼーシジンシグナルを全く示さない１個の
単離体をＨ４４９（ａ　、　ｌｅｕ　２−３．　ｌｅｕ
　２−１１２゜犯１３Δ＋　ｐｒｂ、　ｃｉｒ’　）と
称し、これは酵母株１１７２４６に相同な（ｉｓｏｇｅ
ｎｉｃ）　２ミクロン不含有（ｃｉｒ’　）誘導体であ
る。
鮨、　゛ツムにＥｌ　　−の　　によるＳ−丸に旦ゲノ
ムＫＥＸＩ遺伝子の中断によりＳ、セレビシェ−）１４
４９株（ｐｒｂ、　１ｅｕ２＋　ｕｒａ３＋　ｃｉｒ″
′）からカルボキシヘフチダーゼｙｓｃα活性を除去す
る。この目的のため、ＫＥＸＩ遺伝子を酵母ゲノムライ
ブラリー中に同定し、そして適当なベクター中にクロー
ニングする。選択マーカーとして機能するＯＲ＾３遺伝
子をＫＥＸＩの構造遺伝子挿入することによりそのリー
ディングフレームを中断する。ＫＥＸＩ配列により挟ま
れたＵＲＡ３遺伝子を含むバイブリドプラスミドＤＮＡ
を１ｉｒａ−酵母株Ｈ４４９に導入する。プラスミド上
及び染色体上のＫＥＸＩ遺伝子の配列相同性が生体内組
換えを可能にし、これが酵母細胞を１ｌｒａ−からＵｒ
ａ＋に、そして同時にＫＥＸＩからｋｅｘｌに形質転換
する。中断されたｋｅｘｌ遺伝子を有する株は機能的ｙ
ｓｃα蛋白質を合成しない。
ＫＥＸＩをコードする遺伝子を酵母ゲノムライブラリー
〔セントロマー（ｃｅｎｔｒｏ相ｅｒｅ　）シャトルベ
クターＰＣ３１９中；　Ｓｅｎｇｓｔａｇ、　ｃｏ等（
１９Ｂ？）　Ｎｕｃｌ。
＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、玉２３３）から、にＥＸＩ特遺伝
オリゴヌクレオチドプローブとのコロニーハイブリダイ
ゼーションによりクローニングする。次のオリゴヌクレ
オチド配列： ５　　’　　−ＧＴＣＧＡＡＴＣＣＧＧＣＣＣＴＴＴＴ
ＡＧＧＧＴＧＡＡＴＴＣＡ−３’は発表されているＫＥ
ＸＩ配列（Ｄｍｏｃｈｏｗｓｋａ、＾１等、（１９８７
）　Ｃｅ１１．　ｊ叶５７３）に由来し、そしてｙｓｃ
Ｙの配列への特に低い相同性により全体配列から選択さ
れたものである。このものはＫＥＸＩ　ＤＮＡのＥｃｏ
ＲＶ制限部位の上流にハイブリダイズし、この制限部位
はＯＲ＾３遺伝子の挿入のために使用される。ＵＲＡ３
断片の挿入の確認のための配列決定プライマーとして同
じオリゴヌクレオチドを用いることができる。この合成
オリゴヌクレオチドを放射能ラベルし、そして遺伝子ラ
イブラリーのスクリーニングのために用いる。約１０，
０００個のクローン〔５×２０００クローン／プレート
（＜６　＝　１４０ｍｍ）　）をコロニーハイブリダイ
ゼーション（Ｗｏｏｄｓ、　Ｄ、　Ｅ、等（１９８２）
、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　
ＵＳＡ、　７９．５６６１；及び−ｈｉｔｅｈｅａｄ　
Ａ、　Ｓ、等（１９８３）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。
＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｌｌ５Ａ、　１ｌｉｌ、　５３
８７）によりスクリーニングする。スクリーニング法の
２回の反復から５個の独立の陽性クローンが単離される
。その１つをｐＫＥＸ　１と同様する。にＥＸＩ特異的
旧ｎｄ　Ｉｎ　−Ｂａｍｔｌｌ断片（１３８０ｂｐ）を
切り出すため、ｐＫロＸＩプラスミドＤＮＡを対応する
２種類のエンドヌクレオーゼにより消化する。各断片を
ＳＫポリリンカーを有するブルースクリプト（Ｂｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔ）ベクターＭ１３＋に移行せしめ、そして
このクローンをＭ１３ベクターのための共通（ｕｎｉｖ
ｅｒｓａｌ）プライマーを用いて配列決定することによ
りＫＩＥＸＩ断片を確認し、そしテｐＫＥＸＩＭ１３と
命名する。
ｔｌｉｎｄ［断片としてＵＲＡ３遺伝子を含有するプラ
スミドｐＵｃ１２／ＵＲＡ３　（例１２ａを参照のこと
）を旧ｎｄＩＩＩで消化して１１７０ｂｐ　ＨｉｎｄＩ
［Ｉ断片を単離する（Ｒｏｓｅ。
Ｈ０等（１９８４）　、　Ｇｅｎｅ　２９　１１５を参
照のこと）。この断片の接着末端をＫｌｅｎｏ−ポリメ
ラーゼによりフィルインして平滑末端を形成する。他方
、プラスミドｐＫＥＸＩＭ１３をエンドククレアーゼＥ
ｃｏＲＶでの消化により線状化し、こうしてＫＥＸＩ　
ｔｌｉｎｄ　Ｉｆｆ　−ＢａｍＨＩ断片を切り出し、そ
して自己連結を防止するためにアルカリホスファターゼ
により脱リン酸化する。
次に、これら２種類のＤＮＡ断片を混合し、連結し、そ
して大腸菌Ｊ１１１０３株に形質転換する。形質転換体
を旧ｎｄｌＩ［及びＢａｍＨＩを用いる二重消化により
分析する。この場合、注目の旧ｎｄ　Ｉ［Ｉ　−Ｂａｍ
１ｌ　Ｉ断片の大きさは１３８０ｂｐから２５５０ｂｐ
に増加する。１つの正しいクローンのＤＮＡを、配列決
定プライマーとして上記のオリゴヌクレオチドを用いて
配列決定することにより、ＫＥＸＩ遺伝子中のＥｃｏＲ
Ｖ切断部位の位置へのｔｌＲＡ３断片の挿入を確認する
。このプラスミドをｐＫＥＸＩＭ１３−１ｌＲ八３と称
する。
このｐＫＥＸＩＭ１３−ＵＲＡ３プラスミドのＤＮＡを
旧ｎｄ■及びＢａｍＨＩで消化することによりＫＥＸＩ
−１］Ｒ３バイブリド断片を切り出し、そしてベクター
から分離することなくＳ、セレビシェ−１１４４９株に
導入する。
これは前記の方法（例３を参照のこと）により行う。Ｌ
Ｉｒａ３°形質転換体から膜画分を単離した後、発色基
ｉｆＣ例１を参照のこと）を用いてｙｓｃαの活性を測
定する。ｙｓｃαのプロテアーゼ活性を示さない単一の
形質転換体をサッカロミセス・セレビシエー１１４４９
ｋｅｘｌと命名する。
±１５．　３　　セレビシェ−１１４４ｋｅｘ　　のノ
　−サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍ　ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ｈ４４９ｋｅｘ１
株を、次のプラスミド：ｐＤＰ３４／罠匹（−１７３）
−）１１ＲｐＤＰ３４／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ ｐＤＰ３４／ＧＡＰＥＬ−ＨＩＲ ｐＤＰ３４／ＰＨ邦（−１７３）　−Ｙ）ＩＩＲｐＤＰ
３４　／　ＧＡＰＦＬ　−Ｙ！Ｉ　ＩＲｐＤＰ３４／Ｇ
ＡＰＥＬ−ＹＨＩＲ ｐＤＰ９２／ＰＨ並（−１７３）　−Ｙ）ｌ　ＩＲＰＤ
Ｐ９２／ＧＡＰＦＬ−Ｙ）ＩＩＲ ｐＤＰ９２／ＧＡＰＥＬ−ＹＩＩＩＲ を用いて、Ｈｉｎｎｅｎ等（前掲）により記載された形
質転換法により形質転換する。形質転換された酵母細胞
を、ロイシンが補充されておりそしてウラシルを欠いて
いる酵母最少培地プレート上で選択する。単一形質転換
細胞を単離し、そして次のように命名する。
サッカロミセス・セレビシエー！１４４９ｋｅｘｌ／ｐ
ＤＰ３４／制邸（−１７３）　−）Ｉｌｌ？ サッカロミセス・セレビシエー１１４４９ｋｅｘｌ／ｐ
ＤＰ３４／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ サッカロミセス・セレビシエー１１４４９ｋｅｘｌ／ｐ
ＤＰ３４／ＧＡＰＥＬ−＋１１Ｒ サッカロミセス・セレビシエー１１４４９ｋｅｘｌ／ｐ
ＤＰ３４／貫遼這−１７３）　−Ｙ）ＩＩＩ？ サンカロミセス・セレビシェ−ｔ１４４９ｋｅｘｌ／ｐ
ＤＰ３４／ＧＡＰＦＬ−Ｙｌ（ＩＲ サッカロミセス・セレビシエーＨ４４９ｋｅｘｌ／ｐＤ
Ｐ３４／ＧＡＰＥＬ−ＹＩＩＩＲ サッカロミセス・セレビシエー）１４４９ｋｅｘｌ／ｐ
ＤＰ９２／■知（−１７３）−ＹＩＲ サッカロミセス・セレビシエーＨ４４９ｋｅｘｌ／ｐＤ
Ｐ９２／ＧＡＰＦＬ−ＹＨＩＲ サッカロミセス・セレビシエーＨ４４９ｋｅｘｌ／ｐＤ
Ｐ９２／ＧＡＰＥＬ−Ｙ）ＩＩＲ １Ｌｆｑ、　　ノ　−　　れた　　　の　　　　　での
■ サッカロミセス・セレビシエーＨ４４９ｋｅｘｌ／　ｐ
ＤＰ３４／■匹（−１７３）　−ＹＨＩＲ及びサッカロ
ミセス・セレビシエーＨ４４９ｋｅｘｌ／　ｐＤＰ３４
／ＧＡＰＦＬ−ＹｆｌｌＲの細胞をそれぞれ、次の組成
（ｇ／ｌ　　： デイフコ　イースト・ニトロゲン・ベース　６．７アス
パラギン　　　　　　　　　　　　　　１０ロイシン　
　　　　　　　　　　　　　　　　１グルコース　　　
　　　　　　　　　　　　　２０を有する最少培地１０
ｄ中で２回前培養する。最初の前培養は２８°Ｃ、１８
Ｏｒ、ｐ、ｍにて６０時間行う。
第２前培養は２％の第一前培養物を接種して、２８’Ｃ
、１８Ｏｒ、ｐ、ｍにて２４時間行う。
主培養培地は次の組成を有する。
酵母エキス　　　　４９ グルコース　　　　　５ スラクトース　　　５７ ＮＨ４Ｎ（ｈ　　　　　　　０．５ Ｍｇ５Ｏａ　ｘ　７　Ｈ２０１，０ ＣａＣＯ３５，Ｏ Ｃａｗ（Ｐｏ４）ｚ　　　　　　　　２．０主培養に約
２Ｘ１０ｈ細胞／ｄを接種し、そして２８°Ｃ、１８Ｏ
ｒ、ｐ、ｍにて７２時間培養を行う。発酵の終りにおい
て約ｌＸｌ０’細胞／Ｉｄが得られる。発酵中の幾つか
の時点で培養物のサンプルを取り、遠心分離により細胞
を除去し、そして細胞上清のデスルファトヒルジンをＨ
ＰＬｃ　（後記）により分析する。
５ｏｅｍ模でのデスルファトヒルジンの製造のための接
種源として２ミクロンプラスミドを含有しないサッカロ
ミセス・セレビシエーＨ４４９ｋｅｘｌ／ｐＤＰ３４／
ＧＡＰＦＬ−Ｙ）ＩＩＲの貯蔵細胞を用いた。
貯蔵細胞のアンプルを液体窒素容器の蒸気相に貯蔵する
。アンプルの内容物を、次の組成（ｇ／２）： イースト・ニトロゲン・ベース　　　　　８．４Ｌ−ア
スパラギン・−水和物　　　　　１１．４Ｌ−ヒスチジ
ン　　　　　　　　　　　　１．ＯＬ−ロイシン　　　
　　　　　　　　　　０．ＩＤ−グルコース−水和物　
　　　　　　２０．０を有する選択培地を収容する振と
うフラスコに接種する。５００ｍｆｆ１のフラスコは１
００ｍＮの培養を含み、これを１８０回／分の振とう速
度の回転振とう機上で２８°Ｃにて４８時間培養する。
第二振とうフラスコ培養では、４個のバッフルを有する
２１フラスコ中で前記と同じ組成の培地６００戚を用い
る。第一培養からの接種レベルは５％（３０ｄ）であり
、そして１２０回／分の速度の回転振とう機上で２８°
Ｃにて４８時間培養する。
第三前培養物は、４枚のバッフルを有しそして直径１１
５Ｍの単一ディスクタービン撹拌機を有する５ＯＮのス
テンレス鋼製バイオリアクター中で発酵せしめる。この
培養のためにも前記培地を用い、始発容量を３０４２と
する。６００緘の培養物を含む２２フラスコ１本を用い
て５０１リアクターに接種する（２％）。２８°Ｃの温
度において発酵を４２時間続ける。撹拌速度は６００ｒ
、ｐ、ｍであり、通気量は１　ｒｒｍであり、そして０
．３バールの上圧をかける。
フィード−パッチ法のための装置をさらに備えた類イ以
の５０１バイオリアクターを用いてデスルファトヒルジ
ンの生産を行う。培地は次の成分（ｇ／ｆｆ１）を含有
する。
肉ペプトン（メルク）５．０ 酵母エキス　　　　　　　　　　　　　３０．０硫酸ア
ンモニウム　　　　　　　　　　　６．０硫酸マグネシ
ウム・五水和物　　　　　１．０塩化ナトリウム　　　
　　　　　　　　　０．１リン酸二水素カリウム　　　
　　　　　　１．ＯＤ−グルコース−水和物　　　　　
　　１０．０第三前培養段階からの接種量は任意に２％
である。２８°Ｃの温度及び７５０ｒ、ｐ、ｍの撹拌速
度で発酵を４８時間続ける。上圧は最初０．３バールに
設定するが、２０％飽和以上の溶存酸素を維持するため
に発酵中に１．０バールに上げることができる。
最初の通気量は０．２５ｒｒｍであるが、適切な酸素の
供給を保証するため９時間後にｌ　ｒｒｍに上げる。
ｐ１１値は発酵の初期において５．０に低下し、水酸化
アンモニウムの自動供給によりこのｐＨを保持する。
単純な回分式培養においては、達成される菌体量、及び
従ってデスルファトヒルシンカ価は最初に発酵槽に導入
された炭素源の量に依存する。今度はこの炭素源の量は
バイオリアクターの酸素移送容量及び増殖する酵母によ
るエタノールの過剰生産を回避する必要性により限定さ
れる。このような限界はフィード−パッチ法により克服
することができる。すなわち、始発培地にはグルコース
をほとんど導入せず、かなり高い最終バイオマス濃度及
び回分培養において達成されるのよりも約３倍高いデス
ルファトヒルシンカ価を支持するためにグルコースのフ
ィードを行う。実際には、−定間隔で段階的に、１７５
　ｇ　／時のグルコース−水和物の最終供給速度にまで
上げる。
必要な場合には、発泡を抑制するためにシリコーン性消
泡剤を少量添加する。発酵槽からの排気の一部分を分析
して、酸素の取り込み及び二酸化炭素の発生についての
情報を得る。溶存酸素は殺菌可能な電極を用いてオンラ
イン測定される。
サンプルを全工程を通して６時間間隔で採取してグルコ
ース及びエタノール濃度、バイオアッセイ及びＨＰ　Ｌ
　Ｃによるデスルファトヒルジンの力価、のモニターが
できるようにし、そしてさらに無菌性をチェフクする。
ＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃから明らかな通り、生産されたデスル
ファトヒルジンはＣ−末端が短縮された類似体を実質上
含有しない。発酵過程の終りにおいて、培養上清からデ
スルファトヒルジンを回収することができる。
培養液をアンバーライトＸＡＤ−７と混合し、そして２
５°Ｃにて約４時開眼着にかける。細胞をカラム中の樹
脂から分離する。１’Ｍ　Ｎａ（Ｊ’により洗浄した後
、樹脂をＴ　ｒ　ｉ　ｓ　緩衝液（５０ｍＭ　、　ｐＨ
７，０〜８．５　）により溶出する。主画分（３０ｎ）
をｐＨ２，９に鋼製し、そして２Ｉ！、のベツドボリウ
ムを有するＳ−セファロースカラム（２５ｍｈ蟻酸ア蟻
酸アンモニウム緩衝液ｐＨ２より平衡化されたアミコン
ＰＡ）に適用する。蟻酸アンモニウム緩衝液（４０ｍＭ
、ｐＨ３，６）で洗浄した後、蟻酸アンモニウム緩衝液
（５０ｍＭ　、　ｐＨ３，６）で溶出を行った。主溶出
画分（１０ρ）を、Ω３に膜を装着したフィルトロン・
ミニセント（Ｆｉｌｔｒｏｎ　Ｍｉｎｉｓｅｔｔ）限外
濾過により濃縮する。生ずる透明な蛋白質溶液の０．５
２部分を、１．５１のベツドボリウムを有するＢｌｏ−
Ｇｅ１　Ｐ−６フアインカラム（０，５％酢酸により平
衡化されたアミコンＯＦ）に適用する。０．５％酢酸に
より？客用を行う。主たる溶出画分（１）を限外濾過に
より溶出し、そして次に、２！のベツドボリウムを有す
るＱ−セファロース・ファスト・フロー・カラム（２５
ｍＭ蟻酸アンモニウム緩衝液ｐＨ２，９により平衡化し
たアミコンＰＡ）に適用する。蟻酸アンモニウム緩衝液
（５０ｍＭ　、　ｐＨ４，２）により溶出を行う。主た
る溶出画分を限外濾過により濃縮し、そして次に水に対
してダイアフィルトレージョンする。生ずる透明な水溶
液を凍結乾燥する。この固体は純粋なデスルファトヒル
ジンから成り検出される量のＣ−末端短縮類イ以体を含
有しない。
Ｓ、セレビシェ−Ｈ４４９株（ＤＳＭ　４４１３　；　
ｐｒｂ。
Ｉｅｕ２．　ｕｒａ３＋　ｃｉｒ’　）を遺伝子中断法
により多重プロテアーゼ欠損性にする。遺伝子中断は減
数分裂交叉に比べて、所与の株の遺伝的ハックグラウト
を同一に維持しながら変異を安定に導入するという利点
を有する。
第一段階において、ＰＲＡＩ遺伝子（Ａｍｍｅｒｅｒ、
　Ｇ。
等、（１９８６）、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ
、、　６．２４９０３の中断によりブロテイナーゼｙｓ
ｃＡ活性を除去する。
ＰＲＡＩを全ゲノム酵母ＤＮＡから単離し、Ｓａｃ　１
及びＰｓｔＩにより消化する。２キロ断片を分取用０、
６％アガロースゲルから単離し、電気溶出し、そしてｐ
［Ｉｃ１９のポリリンカー領域のＰｓｔ　Ｉ　−３ａｃ
　Ｉ部位に連結する。このベクターを大腸菌ＪＭ１０９
に形質転換し、そして２８０個の個別のコロニーを拾う
。これらのコロニーを別々に、ＬＢ＋ａｍｐ培地を含む
ミクロタイタープレートのウェル中で増殖せしめる。記
載されている方法（Ｗｏｏｄｓ、　Ｄ、　Ｅ。
等（１９Ｂ２Ｌ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、互。
５６５１　）と実質的に同様にして、公表されているＰ
Ｒ＾１配列（Ａｏ＋ｍｅｒｅｒ等、前掲）に由来する下
記の３ｔｌｐ−ラベル化オリゴヌクレオチドプローブ：
５′−＾ＡＧＣＣＴＡＧＴＧＡＣＣＴＡＧＴ−３’を用
いて、コロニーハイブリダイゼーションを行う。３個の
陽性クローンを拾い、その内の１個−ｐｔｌｃ１９／Ｐ
ＲＡＩ−のＤＮＡをＳａｃ　Ｉ及びＸｈｏ　Ｉにより切
断し、そしてＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターＭ１３＋（
Ｓｔｒａ−ｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ、サンジエゴ、カリホルニア）のＫＳポリリンカー
領域に、完全なＰＲＡＩ遺伝子を含有する１、９ｋｂ断
片をサブクローニングする。完全なＵＲＡ３遺伝子（Ｒ
ｏｓｅ、　Ｍ、等、（１９８４）　。
Ｇｅｎｅ　２９．１１３）を含有する１、　２　ｋｂ　
Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片を、ＰＲＡＩ遺伝子挿入部のコー
ド領域内のユニークＩＩ　ｉ　ｎ　ｄ■部位に挿入する
。生ずるプラスミドをＭ１３＋／ｐｒａｌ：　：ｔｌＲ
Ａ３と称するＭ１３＋／ｐｒａ　ｌ　：　：　ｔｌＲＡ
３をＳａｃ　Ｉ　／Ｘｈｏ　Ｉにより消化し、そして３
．１ｋｂ断片をベクターから単離しないで用いて、前記
のようにして（例３を参照のこと）Ｓ、セレビシェ−１
１４４９を形質転換する。
ウラシル非依存性形質転換体を拾い、ＤＮＡを調製し、
Ｓａｃ　Ｉ　／Ｘｈｏ　Ｉ消化し、そしてサザンブロッ
ティングによりＰＲＡＩ遺伝子の正しい中断について点
検する。ＰＲＡＩとハイブリダイズするＳａｃ　Ｉ　／
Ｘｈｏ　１断片の１．９ｋｂから３．１ｋｂへの正しい
シフトを有する１個の形質転換体をＴｒｌ１８６と称す
る。
次の段階において、Ｔｒｌ１８６　（そのＰＲＡＩ遺伝
子中にｐｒａｌ：　：ＵＲＡ３による中断を有する）を
、該ｐｒａｌ：：ＵＲＡ３遺伝子挿入部への欠失の挿入
により再びウラシル依存性にする。Ｔｒｌ１８６を１眉
のプラスミドＹＥ　ｐ１３　（Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、　
Ｒ，等（１９７９）　、　Ｇｅｎｅ　Ｂ　、　１２１　
）、及びＵＩ？Ａ３遺伝子中に２ｏｏｂｐの欠失を有す
るプラスミドｐＵｃ１２ｕｒａ３ｄｅｌｔａ　（Ｓｅｎ
ｇｓｔａｇ、　Ｃ，等（１９７８）　。
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ＋　１
５＋　２３３　）　１０　ｐｇにより形質転換する。３
０００個のロイシン非要求性（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｉ
ｃ）酵母形質転換体を小振とうフラスコ中５　ｍｆｔの
最少培地（アミノ酸を含有しないデイフコ・イースト・
ニトロゲン・ベースに２％グルコース、０．１％ロイシ
ン、０．１％ウラシル及ヒ０．２５％フルオロオロチン
酸を添加したもの）に再懸濁し、そして３０″Ｃ，１８
０ｒｐｍにて６０時間インキュベートする。増殖する形
質転換体は毒性類似体であるフルオロオロチン酸に対し
て耐性であり、そしてそれ故にｐｒａ　ｌ　：　：　Ｕ
ＲＡ３領域にｕｒａ３ｄｅｌｔａによる置換を有する。
増殖した細胞を、ペプトン２０ｇ／Ｉ！、、酵母エキス
１０ｇ／ｌ及びグルコース２０ｇ／ｌを含む完全培地上
にプレートし、そして３０°にて４８時間の増殖の後に
、最少培地（アミノ酸を含有しないデイフコ・イースト
・ニトロゲン培地に２％グルコース及び０．１％ロイシ
ンを補充したもの）上にレプリカ・プレートし、ウラシ
ス要求株を検出する。幾つかの要求株を拾い、そしてロ
イシン栄養要求性を付与するプラスミドＹＥｐ１３の喪
失について試験する。ロイシン及びウラシルを要求する
Ｔｒｌ１９５と称する１個のコロニーを拾い、そしてそ
の後の実験に用いる。
拠銭、　Ｔｒｌ１９５　　のＰＲＣＩ゛　　−の次に、
Ｔｒｌ１９５におけるカルボキシペプチダーゼｙｓｃＹ
活性を除去する。ｙｓｃＹをコードするＰＲＣＩ（Ｒｏ
ｔｈｍａｎ、　Ｊ、ｔｌ、等（１９８６）＋　Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、　ｊｌｓＡ、　８３．３２４８）を、セントロ
マーベクターｐｃｓ１９　（Ｓｅｎｇｓｔａｇ、　Ｃ，
等（１９７Ｂ）＋　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ
ｅａｒｃｈ、　１５＋　２３３３中の酵母ゲノムライブ
ラリーからＰＲＣＩコード配列の５′及び３′末端に対
応する次の２種類のオリゴヌクレオチド：５　’　−Ｇ
ＡＡＡＧＣＡＴＴＣＡＣＣＡＧＴＴＴＡＣＴＡＴＧＴＧ
Ｇ−３’及び５　’　−ＣＧＡＡＴＧＧＡＴＣＣＣＡＡ
ＣＧＧＧＴＴＴＣＴＣＣ−３’とのコロニーハイブリダ
イゼーションにより単離する。１つの陽性クローンをｐ
ｃｓ１９／ｃｐＶ８と称する。
ｐｃｓ１９／ｃｐＹ８のＤＮＡをＣ１ａ　ｌ　／Ｐｖｕ
　ＩＩで消化し、０．６％分取用アガロースゲルにかけ
、そして２．６ｋｂ断片を単離し、電気溶出する。完全
なＰＲＣＩ遺伝子を含有するこのＣ１ａ　Ｉ　／Ｐｖｕ
　ｕ断をｐｔｌｃ１９のＮａｒ　１／Ｓｍａ　１部位に
さらにサブクローニングする。生ずるプラスミドｐＬＩ
ｃ１９／ＰＲＣＩをユニーク５ｔｕ１部位で切断し、そ
してここに１．２ｋｂＵＲ＾３断片（例１９を参照のこ
と）連結する。この目的のため、ＵＲＡ３含有断片の接
着旧ｎｄｌＩ！末端をＫｌｅｎｏｗ　ＤＮ＾ポリメラー
ゼとの反応においてフィルインし、ｐＵｃ／ＰＲＣＩの
平滑末端化されたＳｔａ　１部位と適合させる。
生成するプラスミドｐＵｃ１９／ｐｒｃ：　：ＵＲＡ３
をＡａｔｌｌにより消化し、そしてそのＡａｔＩＩ断片
をベクターから分離することなく用いて、前記のごとく
ｓ。
セレビシェ−Ｔｒｌ１９５を形質転換する。１個のウラ
シル非依存性形質転換体（Ｔｒ１２０６）をサザンプロ
ッティングによりＰＲＣＩの正しい中断について試験し
、そしてその後、前記のようにして（例１９を参照のこ
と）再びウラシル依存性にする。生ずるＳ、セレビシェ
−株をＴｒ１２１０　（ｐｒａｌ　、　ｐｒｂｌ　、　
ｐｒｃｌ　。
ｕｒａ３　、１ｅｕ２　、　ｃｉｒ６）と称する。
１、ｓ、セレビシェ−Ｔｒ１２１０の＠製 記載されているようにして（例１４を参照のこと）ゲノ
ムＫＩ！ＸＩ遺伝子の中断によりＳ、セレビシェ−Ｔｒ
１２１０株からカルボキシペプチダーゼ活性を除去する
。ｙｓｃαのプロテアーゼ活性を示さない得られるＳ、
セレビシェ−株をＴｒ１３０２（ｐｒａｌ　、　ｐｒｂ
ｌ　。
ｐｒｃｌ　、　ｕｒａ３　、　Ｉｅｕ２　、　ｃｉｒ’
　　、　ｋｅｘｌ）と称する。
±互、　　ヒル’；　７　・／　　ＩＩＶＩ−ＫＲＩＩ
ＶＩ−ＳＦＲＹ　　ｔｌＶｌ−ＷＯＬＲ異るＣ−末端ア
ミノ酸を有する異種蛋白質のｙｓｃα−介在Ｃ−末端分
解をさらに評価するため、Ｃ−末端アミノ酸組成を異に
するヒルジン変異体を作製する。−船釣方法として、原
理的に記載されている部位特定生体外変異誘発を用いる
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｍｕｔａ−Ｇａｎｅ　Ｍ１７キツト
、Ｂｉｏ−Ｒａｄ　、リッチモンド、カリホルニア）。
次の変異体を作製する。
１、　　（Ｌｙｓ”−Ａｒｇ”　〕　ヒルジン変形体に
１に対応する＋ＩＶＩＬＫＲ ２、（Ｓｅｒ”−Ｐｈｅ”−Ａｒｇ”−Ｔｙｒ”　］Ｉ
ＩＶＩに対応する）ＩＶＩ−５ＦＲＹ ３、　　（Ｔｒｐ６ｚ−Ｇｌｕ”−Ｌｅｕ６４−＾ｒ　
ｇ　６″′］川に対応するＩＩＶＩ−ＷＱＬＲ すべてのヒルジン変異体のアミノ酸配列は、それぞれア
ミノ酸６１又は６３までのヒルジン変形体１のそれに対
応する。
）ＩＶＩ−ＳＦＲＹにおいて、Ｃ−末端は心房性ナトリ
ウム利尿性ペプチド（Ｖｆａｓｕｋ等（１９８６）、　
Ｊ、旧０１゜ｃｈｅｍ、　２６１．４７８９−４７９６
）と同一であり、ＩＩＶＩ−ＷＯＬＲにおいてＣ−末端
は上皮成長因子（Ｇｅｏｒｇｅ−Ｎａｓｃｉ−ｍｅｎｔ
ｏ、　Ｃ，等、（１９３３）、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｙ　２１．７９７−８０２）に相当し、この両者はプロ
テアーゼ含有野性型酵母株によりＣ−末端が分解される
ことが知られている。
第一段階において、プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰ
ＦＬ−ＨＩＲ（ヨーロッパ特許出願Ｎα２２５６３３に
記載されている）をＳａｌ　ｌ−ＨｌｎｄＩＩ［で消化
して、十分な長さヒルジン発現カセットを含有する１、
２ｋｂ断片を得る。
この１，２ｋｂのＳａｌ　ｌ−１１ｉｎｄＩ［［断片を
、５ａｆｆｉｌ−旧ｎｄＩ［Ｉで切断された、ＳＫポリ
リンカーを有する旧ｕｅｓ−ｃｒｔｐｔ　Ｍ１３＋にサ
ブクローニングする。記載されているようにして（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ　Ｍｕｔａ−Ｇｅｎｅ旧３キット、前記）、
生ずるプラスミドＭ１３＋／ＨＶＩを大腸菌ＣＪ２３６
にトランスフェクトしてウラシルを導入する。トランス
フェクトされた大腸菌ＣＪ２３６からの単鎖ＤＮＡを、
Ｍ１３へルバーファージ（Ｓ　ｔｒａ　ｔａｇｅｎｅ前
記）の使用によって単離する。
ＨＶＩ−にＰを作製するため、変異原プライマー：５　
　’　　−ＣＣＣＧＡＡＧＡＡＴ八ＣＡＡＧＡＧＧＴへ
ＧＧＡＴＣＣＴ−３’を使用する。
＋１Ｖ１−３ＦＲＹのためには変異原プライマｍ：５　
′　−Ｇ＾八へＡＡＡＴＣＣＣＧＧＡＡＴＣＴＴＴＣＡ
ＧＡＴＡＣＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧＴＡＣＧ　−３’を
使用する。
＋１１／１−ＷＱＬＩ？のためには変異原プライマー：
５　　’　　−ＧＡＡＧＡＡＡＴＣＣＣＧＧＡＡＴＧＧ
ＧＡＡＣＴＧＡＧＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧＴＡＣＧ−
３’を使用する。
２００ｐｍｏｌの各プライマーをまず、３ｊ１１のＩＭ
Ｔｒｉｓ−１１ｃｆｆｉ　（ｐＨ８，０）　、０．３１
のＬＭ　Ｍｇｃ４２ｚ　、０．７５４の０．２Ｍ　ＤＴ
Ｔ　、　０．６ｔｄの２０　ｍＭ　ＡＴＰを含有する３
０Ｊ１！の全容量中でリン酸化する。４．５ユニツトの
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを添加し、そしてこの混
合物を３７°Ｃにて１５分間及び６５゛ｃにて１０分間
インキュベートする。
次に、リン酸化されたオリゴヌクレオチドを次の条件下
で鋳型ＤＮＡとアニールせしめる。Ｍ１３＋／ＩＩＶＩ
由来の０．１　ｐｍｏ＋のウラシル含有ＤＮＡを２ｐｍ
ｏｌのリン酸化されたプライマーと共に全容［１０ｍの
アニール緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ
７，４）、２ｍＭ　ＭｇＣｊ！ｚ　、５０ｍＭ　Ｎａｃ
ｊ！　）中でインキュベートする。この混合物を水浴中
で８０°Ｃに加熱し、そして次に周囲温度に達するまで
徐々に放冷する。
次に、下記の条件下で相補鎖を形成する。１０Ｉの各ア
ニール混合物を、４Ｉの２ｍＭ　ｄＮＴＰ　。
０．７５ｍの２０ｍＭへＴＰ、　０．７５１１１の０．
５　Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１ＣＩ！。
（ｐＨ７，４）　、０．７５ｍの０．　Ｉ　Ｍ　ＭｇＣ
ｊ！　ｔ　、２，１５Ｊ１１の０、２Ｍ　ＤＴＴ　、　
　１ユニツトの７４　ＤＮＡポリメラーゼ及び２ユニツ
トのＴ４　ＤＮＡリガーゼと共にインキュベートする。
この反応混合物を、まず氷上で５分間、次に２５°Ｃに
て５分間、そして最後に３７°Ｃにて９０分間インキュ
ベートする。生ずる二本鎖ＤＮＡを大腸菌ＪＭＩＯＩに
形質転換する。この大腸菌株はウラシル含有鋳型を効率
的に除去し、変異した相補鎖を残す（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　
、前記）。プラスミドを調製し、そして未変異の野性型
１１ＶＩ　ＤＮ＾の最後の２コドン中にのみ存在すべき
Ｐｓｔ１部位の不存在についてチエツクする。
変異原プライマーの約２０ｂｐ上流のヒルジンコード配
列に対応する下記のプライマー：５　　’　　−ＧＡＡ
ＧＧＴＡＣＣＣＣＧＡＡＡＣＣＧＣ＾−３′を用いて新
たなヒルジン変異体を配列決定することにより正しい変
異誘発をさらに確認する。
最後に、３種類の変異した５ａｊｌ！　ｒ　　１Ｉｔｎ
ｄＩ［Ｉ断片をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｍ１３＋から切
り出し、そしてｐＪＤＢ２０７のＳａｌ　Ｉ　−Ｈ１ｎ
ｄｎ１部位に再連結する。
３種類の新しいプラスミドを、 １、　　ｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−ＨＶＩ−ＫＲ’
２、　　ｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−）ＩＶＩ−３Ｆ
ＲＹ３、　　ｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−ＨＶＩ−Ｗ
ＱＬＲと命名する。
別の方法として、そしてＴｒ１３０２　（前記、例２１
を参照のこと）のごときｃｉｒ”株を形質転換すること
ができるように、ヒルジン変異体を全長２ミクロンベク
ターｐＤＰ３４　（前記、例９を参照のこと）にサブク
ローニングする。ｐＤＰ３４をユニークＢａｍ１１１部
位で切断し、そして接着末端をにｌｅｎｏｗ　ＤＮＡポ
リメラーゼを用いてフィルインして平滑末端を生じさせ
る。変異したヒルジン配列（前記）をコードするＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔ　Ｍ１３＋からのＳａｌ　Ｉ　−１ｌｉ
ｎｄｌｌ［断片も平滑末端化し、そしてｐＤＰ３４の平
滑末端化（Ｂａｍｌｌｌ）部位に連結する。得られるプ
ラスミドを、１、　　ｐＤＰ３４／ＧＡＰＦＬ−ＨＶＩ
−ＫＲ２、ｐＤＰ３４／ＧＡＰＰＬ−ＩＩＶＩ−５ＦＲ
Ｙ３、　　　ｐＤＰ３４／ＧＡＰＦＬ−ＨＶＩ−ＷＱＬ
Ｒと命名する。
ｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−ＨＶＩ−ＫＲ，ｐＪＤＢ
２０７／ＧＡＰＦＬ−ＨＶＩ−３ＦＲＹ、　ｐＪＤＢ２
０７／ＧＡＰＦＬ−ＨＶＩ−ＷＱＬＲ及びｐＪＤＢ２０
？／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲをＳ、　セレヒシｘ−ＢＹＳＫ
ＥＸＩ（ＭＳＭ　４５８３）及びＢＹＳｋｅχ１に、標
準的方法及びロイシン選択（例３を参照のこと）を用い
て形質転換する。同様にして、ｐＤＰ３４／ＧＡＰＦＬ
−１１ＶＩ−ＫＲ，ｐＤＰ３４／ＧＡＰＦＬ−）ＩＶＩ
−ＳＦＲＹ及びｐＤＰ３４／ＧＡＰＰＬ−ＨＶＩ−ＷＱ
ＬＲをＳ、セレビシェ−Ｔｒ１２０１及びＴｒ１３０２
株に形質転換する。
得られる株を次の様に命名する。
Ｓ、−ｔ＝ｔ、ビシ１−　ＢＹＳＫＥＸＩ／ｐＪＤＢ２
０７／ＧＡＰＦＬ−１１１Ｒ３，セレビシｘ　−ＢＹＳ
ＫＥＸＩ／ｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦ１．４１Ｖ１４Ｒ
３，セレビシェ−ＢＹＳＫＥＸＩ／ｐＪＤＢ２０？／Ｇ
ＡＰＰＬ−ＨＶＩ−３ｔ’ＲＹＳ、セレビシェ−ＢＹＳ
ＫＩＥＸＩ／ｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−ＨＶＩ−Ｗ
ＱＬＲ８，セレビシェ−ＢＹＳｋｅｘｌ／９ＪＤＢ２０
７／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ３，セレビシェ−ＢＹＳｋｅｘ
ｌ／ｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−ＨＶＩ−ＫＲ３，セ
レビシェ−ＢＹＳｋｅｘｌ／ｐＪＤＢ２０？／ＧＡＰＦ
Ｌ−ＩＩＶＩ−ＳＦＲＹＳ、セレビシェ−ＢＹＳｋｅｘ
ｌ／ｐＪＤＢ２０？／ＧＡＰＰ１、−１１ＶＩ−ＷＱＬ
Ｒ３，セレビシェ−Ｔｒ１２１０／ｐＤＰ３４／ＧＡＰ
ＦＬ−）ＩＶ１４Ｒ３，セレビシェ−Ｔｒ１２１０／ｐ
ＤＰ３４／ＧＡＰＦＬ−ＨＶＩ−３ＦＲＹＳ、セレビシ
ェ−Ｔｒ１２１０／ｐＤＰ３４／ＧＡＰＰＬ−ＨＶＩ−
Ｗ口しＲ３，セレビシェ−Ｔｒ１３０２／ｐＤＰ３４／
ＧＡＰＦＬ−ＨＶＩ−ＫＲ３，セレビシェ−Ｔｒ１３０
２／ｐＤＰ３４／ＧＡＰＦＬ−ＨＶＩ−３ＦＲＹＳ、セ
レビシェ−Ｔｒ１３０２／ｐＤＰ３４／ＧＡＰＦＬ−ｔ
ｌＶｌ−ＷＱＬＲ８，セレビシェ−の発酵を前記の様に
して（例１７を参照のこと）最少培地中で（前培養及び
主培養）中で行う。
７２時間の発酵の後、酵母培養液から遠心分離によりサ
ンプルを調製して透明な溶液を得、この溶液を１Ｍ酢酸
により１：１０（ｖ／ν）で稀釈し、そして次の条件下
でＩＩＰＬｃ分析にかける。
１１１８ＡＲ（メルク）カラム（４Ｘ　１２５ｍｍ）に
逆相球状シリカ材料（ＭＡＣｔｌＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ
）　、５　ｔｓＯ：）粒子直径及び１００Ａのポロシテ
ィ−を有する球状固定相を充填する。カラムの端にステ
ンレス鋼フリットを装着する。移動相Ａは０．１％（ν
／ｖ）トリフルオロ酢酸を含有する水（Ｎａｎｏｐｕｒ
ｅ　（商標）、ＢＡＲＮＳＴＥＡＤ　〕から成る。移動
相Ｂは２０％の移動相Ａ、及び０．０７５％（ν／ν）
ノドリフルオロ酢酸を含有するアセｌ−二トリル（ＨＰ
ＬＣグレード、ＦＬＵＫＡ）　８０％（ｖ／ｖ）から成
る。
クロマトグラフ分離を次のグラジェントを用いて１．５
　ｍｌ　７分の流速において行い、そして溶出液を２１
６ｎｍにおける吸光度によりモニターする。
系の検定のための標準溶液を、ｌｄの水に１■の純粋な
デスルファトヒルジンを溶解することにより調製する。
５０メのこの標準液をカラムに注入し、そして上記のよ
うにクロマトグラフ処理して系を検定する。
第８図に示す結果が明らかにするところによれば、Ｓ、
セレビシェ−ＢＹＳＫＥＸＩにより生産されるヒルジン
分解生成物とは異る保持時間を有する全長ヒルジン（ヒ
ルジンＨＶＩ野性型、又は変異体ＨＶＩ−ＫＲ，ＨＶＩ
−ＳＰＲＹ、　ＩＩＶＩ−一ロＬｌ？）をＳ、セレビシ
ェ−ＢＹＳｋｅｘｌが生産する。野性型ヒルジンＨＶ−
１は、ＢＹＳＭＥＸＩ　ニおイテ、全長＋＋ｖ−１（保
持時間１７．０５分）並びに２種類の分解生成物ｒｌｌ
ｌＲ−６４Ｊ　　（保持時間１７．８分）及び「旧Ｒ−
６３Ｊ　　（保持時間１５．３３分）の典型的な混合物
を示す。ＢＹＳｋｅｘｌはｒ）ＩＩＲ−６５Ｊ（保持時
間１７．０５分）のみを生産する。変異体１１ＶＩ−Ｋ
Ｒの場合、ＢＹＳＫＥＸＩは２個のＣ−末端アミノ酸を
欠く分解生成物（「ＨＩＲ−６３」（保持時間１５．９
分］のみを生産し、他方ＢＹＳｋｅｘｌは完全な長さの
ＨＶＩ−ＫＲ（保持時間１４．４分）を生産する。変異
体１１ＶＩ−ＷＱＬＲ（７）場合、ＢＹＳＫＥＸＩは保
持時間１８．６分の分解生成物を示し、ＢＹＳｋｅｘｌ
は完全な長さのＨＶＩ−ＷＱＬＲ（保持時間１７．３分
）を支配的に生産し、そしてわずかに痕跡の分解生成物
を生産する。完全な長さのＩＩＶＩ−ＳＦＲＹはＢＹＳ
ＫＥＸＩでは痕跡（保持時間１７．１分）のみ見出され
、そしてＢＹＳｋｅｘｌは無傷のＩＩＶＩ−５ＦＲＹ（
保持時間１７．１分）のみを示す。大きなピーク（保持
時間１５．７分）はＩＩＶＩ−３ＦＲＹと無関係である
。
Ｓ、セレビシェ−のＫＥＸＩ株であるＴｒ１２１０／ｐ
ＤＰ３４／ＧＡＰＦＬ−ｉｌＶｌ−ＫＲ，Ｔｒ１２１０
／ｐＤＰ３４／ＧＡＰＦＬ４１Ｖ１−３ＦＲＹ及びＴｒ
１２１０／ｐＤＰ３４／ＧＡＰＦＬ−ＨＶＩ−Ｗ叶Ｒを
対応するｋｅｘ１株であるＴｒ１３０２／ｐＤＰ３４／
ＧＡＰＦＬ−１１ＶＩ−ＫＲ，Ｔｒ１３０２／ｐＤＰ３
４／ＧＡＰＬ−ＩＩＶＩ−ＳＦＲＹ及びＴｒ１３０２／
ｐＤＰ３４／ＧＡＰＦＬ−ＨＶＩ−ＷＱＬＲと比較した
場合に類似の結果が得られる。
微生立夏昇圧 次の微生物がＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖ
ｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒ−ｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭ）、
　Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ　Ｗｅｇ　ｌｂ、　Ｄ−３３
００Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇに寄託されている。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｆｓｉａｌ　
１１４４９　：　１９８８年２月１８日寄託、　ＤＳＭ
　４４１３゜ ！！５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　ＪＭ１０９／ｐ
ＤＰ３８　；　１９８８年２月１９日寄託、　ＤＳＭ　
４４１４゜ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ旦ＪＭ１０９／ｐＤＰ３
４　；　１９Ｂ８年３月１４日寄託、　ＤＳＭ　４４７
３゜ Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｌ　
ＢＹＳ２３２−３１−４２　；　１９８Ｂ年５月６日寄
託、　ＤＳＭ　４５８３゜
【図面の簡単な説明】
第１図は、Ｓ、セレビシェ−の形質転換されたＫＥＸＩ
株及びｋｅｘ１株から得られたデスルファトヒルジンの
クロマトグラフを示す。 第２図は、好ましい酵母コドンを有するＰＨＯシグナル
配列を含有するヒルジンＨＶＩ遺伝子の生体外合成を示
す模式図である。使用される２１オリゴデオキシヌクレ
オチドは、それぞれ番号を付した線及び点線により示さ
れる。 第３図は、プラスミドｐＤＰ３３の作製方法を模式第４
図は、プラスミドｐＤＰ３４及びｐＤＰ３Ｂの作製方法
を模式的に示す。 第５図は、発現プラスミドｐＤＰ３４／ＧＡＰＦＬ−Ｙ
ＨＩＲの作製方法を模式的に示す。 第６図は、発現プラスミドｐＤＰ３４／ＰＨ０５（−１
７３）−ＹＨＩＲの作製方法を模式的に示す。 第７図は、プラスミドｐＤＰ９２の作製方法を模式第８
図は、Ｓ、セレビシェ−ＢＹＳＫＥＸＩ及びＢＹＳｋｅ
ｘｌの培養からのヒルジン変異体ＨＶＩ−ＫＲ，ＩＩＶ
Ｉ−ＷＱＬＲ及びＩＩＶＩ−ＳＦＲＹ並びに野性形ヒル
ジンのクロマトグラフを示す。 二を石ｊｉ 時　　間　（ラナノ ニＬ万ｒ２Ｉ ＢａｍＨに Ｌ万ｒ３； 二を石ｒＳ； 二しシｒＥ： 二ｔ４ｒ１： ｐ［ｌＰｎ４ 二Ｍり１ＪＩ（その１） 野性型ヒルジンＨＶＩ ニｌグ］Ｊ９（その２） ヒルジン変異体ＨＶ　ｌ　−ＫＲ 時間（分） ニＪｉｊζＢ（その４） ヒルジン変異体Ｈ＋−ＷＱＬＲ 時間（分）

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、カルボキシペプチダーゼｙｓｃα活性を欠き、そし
    て異種蛋白質をコードするＤＮＡ配列に作用可能に連結
    された酵母プロモーターを含んで成るハイブリドベクタ
    ーにより形質転換された酵母株。 ２、前記ハイブリドベクターが、酵母プロモーター、該
    酵母プロモーターに作用可能に連結されているシグナル
    ペプチドをコードする第一ＤＮＡ配列、該第一ＤＮＡ配
    列と適切なリーディングフレーム内に連結されている異
    種蛋白質をコードする第二ＤＮＡ配列、及び酵母転写終
    止シグナルを含有するＤＮＡ配列を含んで成る、請求項
    １に記載の酵母株。 ３、前記異種蛋白質がデスルファトヒルジンである、請
    求項２に記載の酵母株。 ４、ｙｓｃＡ、ｙｓｃＢ、ｙｓｃＹ及びｙｓｃＳ活性か
    ら成る群から選ばれたペプチダーゼ活性をさらに欠いて
    いる、請求項１に記載の酵母株。 ５、内因性２ミクロンＤＮＡを含まず、そして無傷のＲ
    ＥＰ１、ＲＥＰ２及びＦＬＰ遺伝子並びに無傷のＯＲＩ
    、ＳＴＢ、ＩＲ１及びＩＲ２部位を含有する完全な２ミ
    クロンＤＮＡを含んで成るハイブリドベクターにより形
    質転換されている、請求項１に記載の酵母株。 ６、ｙｓｃＡ、ｙｓｃＢ、ｙｓｃＹ及びｙｓｃＳ活性か
    ら成る群から選ばれたペプチダーゼ活性をさらに欠いて
    いる、請求項５に記載の酵母株。 ７、前記ハイブリドベクターがＭＦα１プロモーター、
    ＧＡＬ１プロモーター、解糖系酵素をコードする遺伝子
    のプロモーター、ＴＲＰＩプロモーター、及び上流活性
    化部位を欠いている場合がある￥ＰＨＯ５￥プロモータ
    ーから成る群から選択された酵母プロモーターを含んで
    成る、請求項１に記載の酵母株。 ８、前記ハイブリドベクターが、ヒルジンシグナル配列
    ；酵母インベルターゼ、α−ファクター、フェロモンペ
    プチダーゼ（ＫＥＸ１）、「キラー・トキシン」及び抑
    制性酸性ホスファターゼ（￥ＰＨＯ５￥）の各遺伝子の
    シグナル配列及びプレプロ配列；並びにアスペルギルス
    ・アワモリ（￥Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ￥￥ａｗａｍｏ
    ｒｉ￥）からのグルコアミラーゼシグナル配列から選択
    された第一ＤＮＡ配列を含んで成る、請求項２に記載の
    酵母株。 ９、前記ハイブリドベクターが、デスルファトヒルジン
    変形体ＨＶ１、ＨＶ１（修飾型ａ、ｂ）、ＨＶ２、ＨＶ
    ２（修飾型ａ、ｂ、ｃ）、ＰＡ、ＰＡの変形体、及びｄ
    ｅｓ（Ｖａｌ＿２）−デスルファトヒルジンから成る群
    から選択されたデスルファトヒルジン化合物をコードす
    る第二ＤＮＡ配列を含んで成る、請求項２に記載の酵母
    株。 １０、サッカロミセス・セレビシエーの株である請求項
    １に記載の酵母株。 １１、カルボキシペプチダーゼｙｓｃα活性を欠く酵母
    株を前記ハイブリドベクターにより形質転換することを
    特徴とする、請求項１の形質転換された酵母株の製造方
    法。 １２、酵母にとって異種性の蛋白質の製造方法であって
    、カルボキシペプチダーゼｙｓｃα活性を欠き、そして
    該異種蛋白質をコードするＤＮＡ配列に作用可能に連結
    されている酵母プロモーターを含んで成るハイブリドベ
    クターにより形質転換されている酵母株を培養し、そし
    て該異種蛋白質を単離する、ことを特徴とする方法。 １３、前記ハイブリドベクターが、酵母プロモーター、
    該酵母プロモーターに作用可能に連結されているシグナ
    ルペプチドをコードする第一ＤＮＡ配列、該第一ＤＮＡ
    配列と適切なリーディングフレーム内に連結されている
    異種蛋白質をコードする第二ＤＮＡ配列及び酵母転写終
    止シグナルを含有するＤＮＡ配列を含んで成る、請求項
    １２に記載の酵母にとって異種性の蛋白質の製造方法。 １４、前記異種蛋白質がカルボキシペプチダーゼｙｓｃ
    αによる翻訳後Ｃ−末端分解に対して感受性である、請
    求項１２に記載の方法。 １５、前記異質蛋白質の２個のＣ−末端アミノ酸がＬｙ
    ｓ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ
    、Ａｓｐ、Ａｓｎ及びＳｅｒから成る群から選択された
    ものである、請求項１２に記載の方法。 １６、前記異種蛋白質がデスルファトヒルジンである、
    請求項１３に記載の酵母にとって異種性である蛋白質の
    製造方法。 １７、デスルファトヒルジン変形体ＨＶ１、ＨＶ１（修
    飾型ａ、ｂ）、ＨＶ２、ＨＶ２（修飾型ａ、ｂ、ｃ）、
    ＰＡ、ＰＡの変形体及びｄｅｓ（Ｖａｌ＿２）−デスル
    ファトヒルジンから成る群から選択されたデスルファト
    ヒルジン化合物の製造のための、請求項１６に記載の方
    法。 １８、デスルファトヒルジン変形体ＨＶ１の製造のため
    の、請求項１６に記載の方法。 １９、次の式（IV）： 【遺伝子配列があります】（IV） （式中、Ｘ＿１はジペプチド残基Ｖａｌ−Ｖａｌを表わ
    し；Ｘ＿２、Ｘ＿３及びＸ＿４はＬｙｓであり；Ｘ＿５
    はＨｉｓであり；そしてＸ＿６はＧｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙ
    ｓ−Ａｒｇ、Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ及びＴｒ
    ｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇから成る群から選択された
    ものである）で表わされるデスルファトヒルジン。
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