JPS62224291A - ポリヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はポリヌクレオチドに間する。詳しくは酵母の分
泌シグナルをコードするポリヌクレオチドに間する。

（発明の構成） 酵母は、細胞の構造や機能が高等生物の特徴を備え、ま
た、食品、医薬品、飼料等の原料として、人間の日常生
活と深い係わり合いを持つ有用な微生物であり、遺伝子
工学に於ける宿主としての開発が朋待されている。

しかしながら、酵母の細胞表層は細胞膜の外側に強固な
細胞壁を有するため、遺伝子組換え技術によって生産さ
れた有用物質（′Ａ種蛋白質）の精製が困難な場合が多
く、精製を簡略化テるために、生産物を菌体外に分泌さ
せる系の開発が望まれている。

一方、従来酵母サラカミマイセス・セレビシェの代表的
な分泌酵素としてインベルターゼが知られているが、本
酵素は細胞膜と細胞壁との間に局在し、ごく一部が菌体
外に漏出するに過ぎず、これは、本酵素の分子量が大き
いため細胞壁を通過できないと考えられている。

本発明者等はさきに上記インへルターゼ遺伝子の特定の
領域を利用することによって、菌体内で生産された有用
物質を分泌させることに成功した（特願昭６０−２３３
３７１号）が、更に研究の結果、インベルターゼ遺伝子
の特定の領域を條飾したポリヌクレオチドが分泌シグナ
ルとして好適であり、これを含むプラスミドを導入した
サツ力口マイセス・セレビシェが有用物質を直接かつ効
率よく分泌させ得ることを見出し、本発明を達成したも
のである。

以丁に本発明の分泌シグナルをコードするポリヌクレオ
チドと該ポリヌクレオチドをシグナル配列として含む分
泌ベクターの有用性について説明する。

（１）プラスミドｐＳＭＦ２２　（５，Ｏｋｂ）の調製
サツカロマイセス・セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）のインベルターゼ遺伝子として知られている５Ｕ
Ｃ２遺伝子［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ、　１１巻、６号・１９４３〜１９５３頁、特に
その１９４８〜１９４９頁（１９８３）参照］をＥｃｏ
ＲＩ及びＡｖａ　ＩＩで切断した後、Ａｖａ　ＩＩ部位
をＢａｍ１ｌｌリンカ−を用いてＢａｎ＋８１部位に変
え、得られるプロモーター配列、分泌シグナル配列及び
成熟インベルターゼの１１アミノ酸配列までを含むＥｃ
ｏＲＩ　−Ｂａｍｆｌ　Ｉ断片（１，Ｏｋｂ）を、プラ
スミドｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ〜［ｌａｍ８１部位に
挿入してプラスミドＰＳＭＦ２２（５，Ｏｋｂ）を得る
（第１図）。

（２）プラスミドｐｓＭＦ６１（５，Ｏｋｂ）の調製上
記ｐＳＭＦ２２を　５ｉｔｅ　ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕ
ｔａｇｅｎｅｓｉｓによってインベルターゼ遺伝子の分
泌シグナル配列中１７番目のＩｌｅをＡｒｇに変換し、
同時にこの位置にＢｇｌ■切断部位を有するプラスミド
ｐｓＭＦ６１（５，０ｋｂ）を調製する。

即ち、ｐＳＭＦ２２をＰｓｔ　Ｉ及びＥｃｏＲＩ　−Ｂ
ａｍＨＩで切断した夫々の断片の一本鎖ＤＮＡと、合成
オリゴヌクレオチド５’　ＧＣＡＧＣＣＡＡＡＡＧＡＴ
ＣＴＧＣＡＴＣＡ　３’とをアニールさせ、フレノウ（
Ｋｌｅｎｏ誓）酵素で修復した後連結し、得られたＤＮ
Ａｌ１：Ｅ、ｃｏｌ　ｉ　１１Ｂ１０１株に導入し、培
養した後プラスミドを分離し、翻訳開始点から５０番目
のＴがＧに変ったプラスミドをハイブリダイゼーション
　シグナルの濃淡によって選択することにより、ＢｇＩ
ｎ切断部位が導入されたプラスミドｐｓＭＦ６１（５，
Ｏｋｂ）が得られる（第１図）。

（３）プラスミドｐＳＭＦ６２（３，７ｋｂ）の調製（
２）で得たｐｓＭＦ６１のＥｃｏＲＩ　−Ｂｇｌ　ＩＩ
断片（１，Ｏｋｂ）、ホスフォグリセレートキナーゼ遺
伝子（ＰＧに）［Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ、　１０巻、２３号、７７９１〜７８０８
頁（１９８２）、特に７７９７頁の塩基配列参照コをＢ
ｇｌ■及びＨｉｎｄｍで切断して得られるターミネータ
−領域を含むＢｇｌＩＩ　〜Ｈｉｎｄｍ断片（０，４ｋ
ｐ）及びｐＢＲ３２２のＰｖｕ　Ｉｆ部位を）Ｉｉｎｄ
ｍリンカ−を用いてＨｉｎｄＩＩＩ部位に変えたＥｃｏ
ＲＩ　〜Ｈｉｎｄｍ断片（２，３ｋｂ、Ａ　Ｉ）　ｒ及
びｏｒｉを含む）を結合させてプラスミドｐｓＭＦ６２
（３，７ｋｂ）を調製する（第１図）。

（４）プラスミドｐＳＭＦ６３（６，４ｋｂ）の調製プ
ラスミド２．ｕｍＤＮＡのＥｃｏＲＩ　〜Ｐｓｔ　Ｉ断
片（ＡＲ５を含む）と、プラスミドＹＲｐ７［Ｎａｔｕ
ｒｅ、　２８２巻、３９〜４３頁（＋９７９）コのＴＲ
ＰＩを含むＥｃｏＲＩ　〜Ｐｓｔ　Ｉ断片を結合させる
ことにより、２μｓ　ＤＮＡの複製起点とＴＲＰＩとを
含むＥｃｏＲＩ　〜ＥｃｏＲＩ断片（２，７ｋｂ）を得
て、これを前記で得たｐＳＭＦ６２のＥｃｏＲＩ切断部
位に挿入してプラスミドｐＳＭＦ６３（６，４ｋｂ）を
得る（第１図）。

上記ｐｓＭＦ６３は、５ＵＣ２遺伝子の１９アミノ酸残
基からなる分泌シグナル配列中のＣ末端側の３個のアミ
ノ酸残基　ｌｌｅ　Ｓｅｒ　ＡｌａがＡｒｇで置換され
ている下記の１７アミノ酸残基からなる分泌シグナル配
列を有する。

Ｍｅｔ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｇｉｎ　　Ａｌａ　　
Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　ＬｅｕＡＴ
Ｇ　　ＣＴＴ　　ＴＴＧ　　ＣＡＡ　　ＧＣＴ　　ＴＴ
ＣＣＴＴ　　ＴＴＣＣＴＴ　　ＴＴＧＡｌａ　　Ｇｌｙ
　　Ｐｈｅ　　Ａｌａ　　Ａｌａ　　Ｌｙｓ　　Ａｒｇ
ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＴＴＴ　ＧＣＡ　ＧＣＣＡＡＡ　Ａ、
ＧＡ（Ｂｇｌｌｌ切断部位） （５）プラスミドｐｓＭＦ＋０１（６，４ｋｂ）及びｐ
ＳＭＦｌｏｌ−４（６，４ｋｂ）の＊Ｕ 上記ｐＳＭＦ６３をＸｂａ　Ｉ及びＢｇｌＩＩで切断し
て得られるＸｂａ　Ｉ　−ＢｇＩ　ｎ断片［１，７ｋｂ
、２μｎ＋ＤＮＡの一部とトυＣ２のプロモーター及び
前記（４）に示した分泌シグナル配列を含む］を５１ヌ
クレアーゼ又は緑豆のヌクレアーゼで処理して突出末端
を除去した後、次の塩基配列からなる合成リンカ− ５’ＣＧＧＡＡＧＧＧＧＴＡＴＣＴＴＴＧＧＡＴＡＡＡ
Ａ　　　３’３’　ＧＣＣＴＴＣＣＣＣＡＴＡＧＡＡＡ
ＣＣＴＡＴＴＴＴＣＴＡＧ　５’を結合し次いでＥｃｏ
ＲＩ及びＢｇｌＩＩで切断する。

得られたＥｃｏＲＩ　〜Ｂｇｌ　ｎ断片（１ｋｂ）を、
ｐｓＭＦ６３のＥｃｏＲ１〜８ｇ１ＩＩの代りに挿入す
ることにより、プラスミドＩ）ＳＭＦＩＯＩ（６，４ｋ
ｂ）が得られる。

ｐｓＭＦＩｏｌは、塩基配列測定の結果、次の２５アミ
ノ酸残基からなるシグナル配列を有すること力１判明し
た。

Ｍｅｔ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｎ　　Ａｌａ　　
Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　ＬｅｕＡＴ
Ｇ　ＣＴＴ　ＴＴＧ　ＣＡＡ　ＧＣＴ　ＴＴＣＣＴＴ　
ＴＴＣＣＴＴ　ＴＴＧＡｌａ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ａｌａ
　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　ＶａｔＧ
ＣＴ　ＧＧＴ　ＴＴＴ　ＧＣＡ　ＧＣＣＡＡＡ　ＡＣＧ
　ＧＡＡ　ＧＧＧ　ＧＴＡＳｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｐ
　　Ｌｙｓ　　ＡｒｇＴＣＴ　ＴＴＧ　ＧＡＴ　ＡＡＡ
　ＡＧＡ↑ （ＢｇＩ　ｎ切断部位） この際、Ｓｔヌクレアーゼが過剰に作用すると、上記ア
ミノ酸残基中Ｃ末端から１１〜９番目の３個（９叶）が
欠損した次の２２アミノ酸残基からなるジグ用ルベブチ
ド配列を有するプラスミド　ｐＳＭＦＩｏｌ−１（ａ、
４ｂｂ）も同時に得られる。

Ｍｅｔ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｎ　　Ａｌａ　　
Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　ＬｅｕＡＴ
Ｇ　ＣＴＴ　ＴＴＧ　ＣＡＡ　ＧＣＴ　ＴＴＣＣＴＴ　
ＴＴＣＣＴＴ　ＴＴＧＡｌａ　　Ｇｔｙ　　Ｐｈｅ　　
Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｙ　　Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　　
Ｌｅｕ　　ＡｓｐＧＣＴ　ＧＧＴ　ＴＴＴ　ＧＣＡ　Ｇ
ＡＡ　ＧＧＧ　ＧＴＡ　ＴＣＴ　ＴＴＧ　ＧＡＴしｙｓ
　　Ａｒｇ ＡＡＡ　　ＡＧＡ （ＢｇｌＩＩ切断部位） （発明の効果） 本発明に係る分泌シグナルをコードするポリヌクレオチ
ドを含有するプラスミド　ｐｓＭＦｌｏｌ及びｐＳＭＦ
ｌｏｌ−４に、適当な外来遺伝子を挿入して宿主中で発
現させた場合、後記実施例に示すように、目的とする蛋
白質を直接かつ効率よく分泌させることができる。

（実施例） 以下実施例において、マウス　アミラーゼ遺伝子をマー
カーとして使用した場合につき、より具体的に説明する
。

なお、以下の実施例における操作は、特に記載する場合
を除き、次のＩ〜■の方法によった。

ｌ［制限酵素によるＤＮＡの切断と回収コ制限酵素によ
る切断用緩衝液は、下記３種類を用い（１）〜（３）の
使い分けは、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＢａｃｔｅｒｉａｌＧ
ｅｎｅｔｉｃｓ（１９８１）　（Ｃｏｌｄ　ｓｐｒｉｎ
ｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）に従・った。ま
た切断条件は２単位／７．（ｇＤＮＡの制限酵素を用い
、３７℃で３０分園外理する。

次いで、ＴＥ緩衝液［１０ｍＭのトリス塩酸（ｐ）Ｉ　
８．０）及び１　ｍＭのＥＤＴＡからなる］で飽和した
フェノールで１回抽出し、エーテルでフェノールを除き
２倍容のエタノールを加えて一２０℃で３０分間放置し
た後、遠心分離してＤＮＡを回収する。

（１）低塩濃度緩衝液 ｌＯ糟門のトリス塩酸（ｐＨ７，４）、１０　ｍＭのＭ
ｇ５Ｏ，及び１　ｍＭのジチオスレイトールからなる。

（２）中塊濃度緩衝液 ５０　ｍＭのＮａＣｌ、１０　ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ
７，４）、１０ｗＭのＭｇ５Ｏｚ及びｌ　ｍＭのジチオ
スレイトールからなる。

（３）高塩濃度緩衝液 １００　ｍＭの、　ＮａＣＩ、５０　ｍＭのトリス塩酸
（ｐＨ７，４）及び１０　ａ＋ＭのＭｇＳＯ４からなる
。

■［大腸菌（ε、ｃｏｌｉ）からのプラスミド［ｌＮＡ
の調製］（１）ミニｒｉｇ法（ｍｉｎｉ　ｐｒｅｐ法）
［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ−５ｅａｒｃｈ、
７巻、１５１３〜１５２３頁（１９７９）］プラスミド
［ｌＮＡを含む大腸菌を、５００μＩのし一ブロス［１
０ｇのペプトン、５ｇの酵母エキス、１ｇのグルコース
、５ｇのＮａＣｌ／１からなる（ｐＨ７，２）］を用い
て一夜間培養し、遠心分離して集菌した菌体を、１００
μｍの溶液Ａ［５０ｍＭのグルコース、ｔ　ｏ　ｍ　ｔ
＋のＥＤＴＡ、２５ｍＭのトリス塩酸（ｐｉｔ　８．０
）及びリゾチーム２１ｇ／ｍｌからなる］に懸濁し、氷
水中で３０分間放置する。

次いで氷水中で２００μｍの溶液１？［Ｉ　Ｘの５ＤＳ
Ｃドデシル硫酸ナトリウム）を含む０．２ＮのＮａＯＨ
］を加え振盪して同時にＤＮＡの変性を行う。

１５０μｍの３Ｍ酢酸ソーダ溶液（ｐＨ４，８）を加え
水冷後遠心分離し、上清に冷エタノールを加え一７０℃
に冷却して遠心分離し沈澱を集める。沈；澱物を４００
μｍの溶液Ｃ［５０ｌＩＩＭのトリス塩酸（ｐ）Ｉ　８
．０）及び０．１Ｍの酢酸ソーダからなる］に溶解し、
不溶物を除去後、冷エタノールを加え、沈澱するＤＮＡ
を洗浄し、減圧下乾燥し一２０℃で保存する。

（２）大量調製法 プラスミＦＤＮＡを含む大腸菌を、１００　ｍｌのし−
ブロス（薬剤耐性プラスミドの場合は薬剤を含む）を用
いて培養し、集菌洗浄した後、３１の溶液Ａ［５０ｍＭ
のグルコース、１０　ｍＭのＥＤＴＡ、２５信門のトリ
ス塩酸（ｐＨ８，０）及びリゾチーム２　ｍｇ／ｍｌか
らなる］）乍懸濁し、氷水中で３０分間放置する。

次いで、氷水中で４１の溶液Ｂ［Ｉ　＄の５Ｏ５を含む
−べ、２　ＮのＮａＯＨ］を加えｔｒｉ盪して、同時に
ＤＮＡの変性を行う。

３ｍｌの３Ｍ酢酸ソーダ溶液（ｐＨ４，８）を加え水冷
後、遠心分離し、上清に０．６容のイソプロパツールを
加え一２０℃で２０分間放置する。

遠心分離して沈澱を集め、エタノールで洗浄後２１のＴ
Ｅ（ＰＨ７，５）＆ｌｌ液液懸濁する０次いで、１０μ
ｍのＲＮａｓｅ　Ａ（１０ｍｇ　／ｍｌ）を加え、３７
℃で３０分間放置後フェノール抽出を行う。水層に０．
２容の針ＮａＣＩと１／３容の３０χポリエチレングリ
コール６０００を加えて一２０℃で４０分間、次いで４
°Ｃで４０分間放置する。遠心分離して沈澱を集め４０
０１の水に溶解し、ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、洗
浄後１００μｍのＴＥ緩衝液に溶解する。

ｍ［Ｔ４　ＤＮＡリガーゼによる連結］連結する２個の
ＤＮＡ断片は、１Ｍｇ／１０μｍになるように連結用緩
衝液［６６ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７，５）、６．６　
ｍＭのＭ、ｇＣ＋　２．１０　ｗ＋Ｈのジチオスレイト
ールからなる］に溶解し６５℃で１０分間処理した後、
４℃で６６μ門のＡＴＰ（アデノシントリフオスフェー
ト）を加え、更にＴ４リガーゼを粘着末端の場合は０．
１単位／μｇ　ＤＮＡ、また平滑末端の場合は１単位／
μｇＤＮＡ１乏へなるように加えて４℃で１８時間反応
させた後６５℃１で１０分間処理する。

ＴＶｌ［大腸菌の形質転換］［Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂａ
ｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅ−ｎｅｔｉｃｓ（１９８１）（Ｃ
ｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｖ　Ｖｏｒ
ｋ）］５１のし一ブロスに大ｌｌ！菌を植菌し、−夜間
培養する。この０．２１を２０１のし一ブロスに植え、
３７℃でクレットユニットが６０に達するまで振盪培養
する。菌体を集め氷冷した５０　ｍＭの（ａＣＩ　２と
１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８，０）とからなるｗｉ衝
液液１０１！ｊ濁し３０分間氷冷す°る。遠心分離した
菌体を１ｍｌのＣａＣｌ　２溶液に懸濁し、この０．１
　ｍｌを１０μ＋（１）ＤＮＡｍｔ（１（と混合し０℃
で３０分間、４２℃で２分間インキュベートした後、１
．５１のし一ブロスを加え３７℃で３０分間培養し、こ
の０．１　ｍｌを寒天培地に植える。

Ｖ　［５１ヌクレアーゼによるＤＮＡ粘着末端の除去］
粘着末端を持つＤＮＡを、２００μｍの高塩濃度緩衝液
［３０ｍＭの酢酸ソーダ（ｐＨ４，２５）、０．３Ｍの
ＮａＣｌ及び４　ｍＭのＺｎＳＯ４からなる］に溶解し
、Ｓｌヌクレアーゼを２０単位／μｇ　ＤＮＡ加え、２
２℃で４０分間処理し、ＴＥ緩衝液で飽和したフェノー
ルで抽出処理した後、エーテルでフェノールを除き、冷
エタノールを加え一２０°Ｃに冷却し、遠心分離により
沈澱した［）ＮＡモモ−収する。

■［緑豆ヌクレアーゼによるＤＮＡ粘着末端の除去コ１
〜１０μｇのＤＮＡを含む゛「Ｅ緩衝液ｉｏ　μｍに、
２μｍ（１）ＩＯＸ　ＭＢＮ緩衝液（ｐ）Ｉ　５．２）
［１，５Ｍ（１）酢酸ソーダ、１１ＭｍＭのＺｎＣＩ　
２．１０　ｍＭのシスティン、１０　ｍＭのｔＬｇｃ　
Ｉ　２．０．０１　＄のトリトンＸ１００からなるコと
８μｍの水を加え、更に１〜５単位１μｍの緑豆ヌクレ
アーゼを２μｍ加え２０℃で３０分間保温する。次いで
２μｍの２０χＳＯ５溶液を加えて反応を停止させ、３
０μｍのＴＥ緩衝液を加えた後フェノール抽出を行い、
ＤＮＡをエタノール沈澱により回収する。

■［リンカ−ＤＮＡの平滑末端への連結コ平滑末端のＤ
ＮＡ断片（１，２ｐ　ｎ＋ｏｌ末端）とリンカ−ＤＮＡ
（１００ｐ　ｎ＋ｏｌ末端）を連結用緩衝液［６６ｍＭ
のトリス塩酸（ｐ　Ｉｔ　７　、５　）、６．６　ｍＭ
のＭｇＣｌ２．１０　ｍＭのジチオスレイトールからな
る］に溶解し、１単位のＴ４リガーゼを加え４℃で１８
時間反応後、ＴＥ緩衝液で飽和したフェノールでＤＮＡ
を抽出し、エーテルでフェノールを除去した後エタノー
ル沈殿でＤＮＡを回収する。

■［ＤＮＡ断片の修生小腸アルカリンフォスファターゼ
（ＣＩＡＰ）による処理］ リガーゼ反応によるプラスミドＤＮＡの自己連結を阻止
するために、リガーゼ反応に先だって、プラスミドＤＮ
Ａの制限酵素による切断断片をＣＩＡＰで処理する。

制限酵素で切断したプラスミドＤＮＡ（１０ｐ　ｍｏ１
５’床端）を５０μｍのＣＩＡＰ緩衝液［５０１のトリ
ス塩酸Ｌ’ｐＨ９，０）、夏　ｌのＭｇＣＩ　２．０．
１　ｍＭのＺｎＣｌ　２及びＩ　ｍＭρスペルミジンか
らなるコに溶解し、１　ｐ　ｍｏｌ末端当り０．０１単
位のＣＩＡＰを加え３７℃で３０分間反応後、１０μｍ
の０．１　Ｍ）リス塩酸（ｐＨ８，０）、ＩＨのＮａＣ
ｌ、１０　ｍＭのＥＤＴＡ、　５μｍの１０χＳＤＳ、
　４０μｍの水を加え、６５℃で１５分間保持する。冷
却後ＴＥＩＩ衝液で飽和したフェノールで抽出処理し、
エーテルでフェノールを除去し、エタノール沈澱により
ＤＮＡを回収する。

■［酵母の形質転換（ＫＵ法） 酵母サツカロマイセス・セレビシェを１０１のＹＥＰＤ
培地中で３０℃で一夜間培養し、集菌して一回ＴＩＪＩ
衝液で洗浄した後、同緩衝液に懸濁し、細胞数が２Ｘ　
１０　ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにする。

この懸濁液５００μｍに同量の０．２Ｍ酢酸リチウム（
ｐＨ７，５）を加え、３０℃で１時間保持した後、１０
０μｍ宛試験管に分注し、０℃でこれにＤＮＡを添加し
、同温度で３０分間混合する。１００μｍの７０χポリ
エチレングリコール４０００を含むＴＥ緩衝液を加え、
よく混合した後３０℃で１時間、次いて４２℃で５分間
保持し、遠心分離して集菌し、滅菌水で洗浄する。

これを５００μｍの滅菌水に懸濁し、１００μｍ宛を選
択培地上に植菌し、３０℃で３〜４日間培養して形Ｉ鐸
転換株を得る。

貴族例 （りプラスミドｐＳＭＦ２２（５，Ｏｋｂ）の調製サツ
カロマイセス・セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）の５ＵＣ２をＥｃｏＲＩ及びＡｖａｆｆで切断し、次
いでＡｖａ１１部位をＢａｍＨＩリンカ−を用いてＢａ
ｍ８１部位に変換して、プロモーター配列、分泌シグナ
ル配列及び成熟インベルターゼの１１アミノ酸配列まで
を含むＥｃｏＲＩ　〜ＢａｍＨＩ断片（１，Ｏｋｂ）を
得た。一方、ｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ
で切断し、得られたＥｃｏＲ１〜８ａａ＋ＨＩ部位に、
上記ＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩ断片を挿入してプラスミ
ドｐｓＭＦ２２（５，０ｋｂ）を得た。

（２）プラスミドｐｓＭＦ６１（５，Ｏｋｂ）の調製（
１）で得たｐｓＭＦ２２を、Ｐｓｔ　Ｉ及びＥｃｏＲＩ
　〜ＢａｍＨＩて切断し、得られた夫々の断片の一本鎖
ＤＮＡと、合成オリゴヌクレオチド ５’　ＧＣＡＧＣＣＡＡＡＡＧＡＴＣＴＧＣＡＴＣＡ　
３’とをアニールさせ、フレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）酵素
で修復した後Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合した。こうして
得られたＤＮＡをＥ、ｃｏｉｉ　［１０１株に導入し、
培養した後プラスミドを分離し、翻訳開始点から５０８
目のＴが６に変ったプラスミドをハイブリダイゼーショ
ン　シグナルの濃淡によって選択することにより、Ｂｇ
Ｉｎ切断部位が形成されたプラスミドｐｓＭＦ６１（５
，０ｋｂ）を得た。

（３）プラスミドｐＳＭＦ６２（３，７ｋｂ）の＊ａ（
２）で得たｔ）ＳＭＦ６１１ｉ：ＥｃｏＲＩ及び８ｇ１
ＩＩで切断してＥｃｏＲＩ　−Ｂｇｌ　ＩＩ断片（１，
Ｏｋｂ）を得た。また、ＰＧＫをＢｇｌ■及びＨｉｎｄ
ｍで切断してターミネータ−領域を含むＢｇｌ　ＩＩ　
〜１ＩｉｎｄｌＩＩ断片（０，４ｋｂ）を得た。更にｐ
ＢＲ３２２をＰｖｕ　ＩＩて切断し、）Ｉｉｎｄｍリン
カ−を用いてｌｌｌｎｄＨｌ部位を導入し、ＥｃｏＲＩ
で切断してＥｃｏＲＩ〜）ＩｉｎｄＩＩＩ断片（２，３
ｋｂ、　Ａｐ「及びｏｒｉを含む）を得た。

ここに得た３種のＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで結
合させてプラスミドｐＳＭＦ６２（３，７ｋｂ）を調製
した。

（４）プラスミドｐｓＭＦ６３（６，４ｋｂ）の調製２
μｍＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＰｓｔ　Ｉで切断してＥｃ
ｏＲＩ〜ＰＳｔＩ断片（ＡＲ５を含む）を得た。またＹ
Ｒｐ７をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔ　Ｉで切断してＴＲＰＩ
を含むＥｃｏＲＩ　〜Ｐｓｔ　Ｉ断片を得た。この両断
片を結合させることにより、２μ＋ｗＤＮＡの複製起点
とＴＲＰＩとを含むＥｃｏＲＩ　〜ＥｃｏＲ１断片（２
，７ｋｂ）を得た。これを、前記（３）で得たｐＳＭＦ
６２のＥｃｏＲＩ切断部位に挿入してプラスミドｐＳＭ
Ｆ６３（６，４ｋｂ）を得た。

（５）プラスミドｐｓＭＦ１０１（６，４ｋｂ）及びｐ
ＳＭＦ］０１−４（６，４ｋｂ）（１）ｒＡｉｌ 上記ｐｓＭＦ６３をＸｂａ　Ｉ及びＥｌ、ｇｌＩ［で切
断して、ＸｂａＩ　−８８１■断片（１，７ｋｂ、２μ
ｍ　ＤＮＡの一部とＳ　ＩＪ　Ｃ２のプロモーター及び
分泌シグナル配列を含む）を得た。このＤＮＡ断片をＳ
ｌヌクレアーゼ又は緑豆のヌクレアーゼで処理して突出
末端を除去した後、次の塩基配列からなる合成リンカー ５’ＣＧＧＡＡＧＧＧＧＴＡＴＣＴＴＴＧＧＡＴＡＡＡ
Ａ　　　　　３’３’　　ＧＣＣＴＴＣＣＣＣＡＴＡＧ
ＡＡＡＣＣＴＡＴＴＴＴＣＴＡＧ　　５’を結合した後
、ＥｃｏＲＩ及びＢｇＩｎで切断してＥｃｏＲＩ−Ｂｇ
Ｉ■断片（１ｋｂ）を得た。一方ｐｓＭＦ６３をＥｃｏ
ＲＩ及びＢｇｌＩＩで切断したＥｃｏＲＩ　〜Ｂｇｌ　
ＩＩの代りに、上記で得たＥｃｏＲＩ〜ＢｇｌＩＩ断片
を挿入してプラスミドＩＩＳＭＦＩＯＩ（（ｉ、４　ｋ
ｂ）を得た。

また過剰のＳｌヌクレアーゼの作用により、同時にプラ
スミドｐｓＭＦ１０１−４（６，４ｋｂ）が得られた。

Ｃ６）マウス７　；　−７−セ遺伝子（１）　ｐｓＭｊ
ｌｏｌ（６，４ｋｂ）及びｐｓＭＦｌｏｌ−４（６，４
ｋｂ）への導入マウスすい臓由来のアミラーゼのｃＤＮ
Ａを含むプラスミドｐＭｓａ１０４をＰｓｔ　Ｉで切断
し、得られたＰｓｔＩ　〜Ｐｓｔｌ断片を、プラスミド
ｐＵｃ１３のＰｓｔ１部位に挿入してプラスミドｐＲＥ
１０７５（４，３ｋｂ）を作製した。

ρＲＥＩ０７５をＡｐａＩで切断し、ＳＩヌクレアーゼ
処理により平滑末端とした後Ｄｒａｌで切断して、成熟
アミラーゼ遺伝子のＮ末端から５番目の１ｌｉｓからＣ
末端まての全てと３′非訓訳領域の５ｂρを含む断片（
１，４ｋｂ）の両端にＢａｍ１ｌＩリンカ−（＋２　ｂ
ｐ）を結合した後Ｂａｍ１ｌｌで切断し、得られた８ｇ
ｍｌｌｌ断片を前記ｐｓＭＦ１０＋及びｐｓＭＦＩｏｌ
　−４ノＪＩ　１１部位に夫々挿入してマウスアミラー
ゼ遺伝子を含むｐｓＭＦｌｏ団Ａ及びｐＳＭＦ＋０１−
４ＭＡを調製した。

（１）アミラーゼ活性（分泌）の確認 上記方法により構築したｐｓＭＦｌｏｌＭＡ及びｐｓＭ
Ｆｌｏｌ−４ＭＡを用いてサツカロマイセス・セレビシ
ェ２０Ｂ−１２株をＫｔＪ法により形質転換した。

得られた形質転換株を１ｚ澱粉を炭素源とするＹＥＰ寒
天培地上に接種し、３０℃で３日間培養した結果、アミ
ラーゼの分泌生産による顕著なハロー（ｈａｌｏ）の形
成が観察された。

なお、プラスミドｐＳＭＦ６３を前記（６）と全く同様
にマウスアミラーゼ遺伝子を導入したｐｓＭＦＯ３ＭＡ
、及びアミラーゼ遺伝子を含まない前記ρ５ＩＩＦＩＯ
Ｉ及び１０１−４を用いて、上記と同様に２０８−１２
株を形質転換し、形質転換株をｌχ澱粉を炭素源とする
ＹＥＰ寒天培地上に接種し、３０℃で３日間培養しした
。

この場合、ｐＳＭＦ６３ＭＡではハローの形成は微小て
あり、またｐｓＭＦｌｏｌ及び＋０１−４ではハローの
形成は全く観察されなかった。

４図面の簡単な説明 第１図及び第２図は、本発明におけるプラスミドの構成
ルートを示す模式図であって、図中の記号Ａ、　Ａｐ、
　８．　Ｏｒ、Ｅ、　Ｈｌｐ、　ｘ、等は夫々下記の制
限酵素を示す。

Ａｐ　：　Ａｐａｌ　ＳＢ　：　Ｂａｍ）ＩＩ　、　８
ｇ　：　８ｇ１■、Ｄｒ　：　ＤｒａＩ　、　　Ｅ　：
　ＥｃｏＲＩ、ｆｌ　：　Ｈｉｎｄｍ、Ｐ　：　Ｐｓｔ
ｌ 出願人　工業技術院長　　等　々　力　　達第１図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）次のアミノ酸配列からなる分泌シグナルをコード
   するポリヌクレオチド。 【アミノ酸配列があります】 （上記アミノ酸配列中ｎは１又は０を示す）