JPH0716419B2 - 組換えｄｎａ材料から得られるレンニン，プレ−プロレンニン，またはプロレンニン遺伝子、およびこれらの遺伝子を含有する生細胞 - Google Patents

組換えｄｎａ材料から得られるレンニン，プレ−プロレンニン，またはプロレンニン遺伝子、およびこれらの遺伝子を含有する生細胞

Info

Publication number
JPH0716419B2
JPH0716419B2 JP57003556A JP355682A JPH0716419B2 JP H0716419 B2 JPH0716419 B2 JP H0716419B2 JP 57003556 A JP57003556 A JP 57003556A JP 355682 A JP355682 A JP 355682A JP H0716419 B2 JPH0716419 B2 JP H0716419B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cag
ctg
gac
atc
tac
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP57003556A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS57141287A (en
Inventor
バ−ナデツテ・ラヴツツキ−・アルフオ−ド
ジエンイ・マオ
ドナルド・テイラ−・モイア−
アリソン・タウントン・リグビ−
ジエラルド・フランシス・ヴオヴイス
Original Assignee
コラボラテイヴ・リサ−チ・インコ−ポレイテツド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26919852&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JPH0716419(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by コラボラテイヴ・リサ−チ・インコ−ポレイテツド filed Critical コラボラテイヴ・リサ−チ・インコ−ポレイテツド
Publication of JPS57141287A publication Critical patent/JPS57141287A/ja
Publication of JPH0716419B2 publication Critical patent/JPH0716419B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
    • C12N9/6481—Pepsins (3.4.23.1; 3.4.23.2; 3.4.23.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C12N1/185—Saccharomyces isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/85—Saccharomyces
    • C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は組換えDNA材料から得られる遺伝子材料を含有
し，かつレンニン，プレ−プロレンニンおよびプロレン
ニンを発現することのできる生細胞に関する。レンニ
ン，プレ−プロレンニンおよびプロレンニンは，細胞自
体または組換えDNA方法によつて培養中の生育過程で所
望の酵素蛋白の生産を行なうように処理されたそれらの
親細胞から得られる。
酵素蛋白レンニンはチーズ製造において乳汁カゼインを
凝固させるのに有用であることが長い間知られてきた。
レンニンはまたその特異な蛋白質加水分解活性のために
チーズ熟成と関連して使用される。過去において，レン
ニンは商業生産ではレンネツトから得られてきた。乳汁
で飼育した子牛を屠殺し，食物を含有していない第４胃
を除去する。ついで，それらの胃を乾燥し，塩漬けし，
冷凍するという複雑な方法を用いる。工場段階では，そ
れらの胃を洗浄し，塩を分離し，表面の脂肪を除去する
ように処理する。ついでそれらの胃を網だなの上に広げ
て乾燥する。それらの乾燥した胃をしばしば冷却して貯
蔵し，ついですりつぶし，さらにレンニンの抽出が完了
するまでその皮膚を通して循環しているブライン溶液の
入つた大きなタンクの中に置く。レンニンを製造するた
めの上記の方法は多大な費用を要し，かつ世界中の種々
の利用における商業上の使用のために要する莫大な量を
生産する際に多くの困難を伴う。
本発明の目的は大量生産のための培養中にレンニンを生
産することのできる生細胞を得ることにある。
本発明の別の目的は大量生産のための培養中にプロレン
ニンを生産することのできる生細胞を得ることにある。
本発明の他の目的は大量生産のための培養中にプレ−プ
ロレンニンの生産することのできる生細胞を得ることに
ある。
本発明のさらに別の目的は生細胞が組換えDNA材料から
得られた遺伝子材料を含有する前記目的に一致する生細
胞から得られるレンニン，プロレンニン，またはプレ−
プロレンニンを提供することにある。
本発明のさらに別の目的は特殊な機能を与えたレンニン
遺伝子，プレ−プロレンニン遺伝子およびプロレンニン
遺伝子を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は組換えDNA技術を用いるレン
ニン，プロレンニンまたはプレ−プロレンニンを生産す
る方法を提供することにある。
本発明のさらに別の目的は選択された酵素または蛋白材
料のような選択されたアミノ酸配列のペリプラスミツク
（periplasmic）スペース，他の細胞区域，または適合
した宿主と共に細胞外への移動に使用するための暗号配
列を提供することにある。
本発明のさらに他の目的はレンニンまたは乳汁凝固活性
を示すポリペプチドの生産に使用するための特別の変性
細胞を提供することにある。
本発明によれば，生細胞は組換えDNA材料から得られた
遺伝子材料を含有し，かつレンニン，プレ−プロレンニ
ン，またはプロレンニンを発現することができる。本発
明はまた生細胞から得られるレンニン，プロレンニンお
よびプレ−プロレンニン，およびそのための遺伝子から
成る。
本発明の方法によれば，宿主細胞中のプレ−プロレンニ
ンの発現はプレ−プロレンニンをコード化するDNA配列
を発生させることによつて得られる。その配列はその
５′末端のところで転写プロモーターおよびリボゾーム
結合サイトに結合し，プレ−プロレンニンをコード化す
るDNAの開始点とプロモーターおよび結合サイトを担うD
NAの断片との距離は変化する。そのDNAはついで宿主細
胞中に移入して（形質）転換される。宿主細胞はクロー
ン化され，プレ−プロレンニンの高レベルの発現を有す
る宿主細胞が選択される。
宿主細胞中のプロレンニンまたはレンニンの発現を得る
方法において，プレ−プロレンニンをコード化し，かつ
５′末端を有するDNA配列が選択される。一部分が５′
末端から除去され，その部分はプロレンニンまたはレン
ニン前駆体ポリペプチドをコード化する。プロレンニン
またはレンニンコード化配列を有する残りの部分はその
断片の３′末端に翻訳開始コドンを有するDNAの合成断
片上に結合される。ついで，前と同様にして，転写プロ
モーターおよびリボゾーム結合サイトと該DNA配列とを
結合させる操作，並びにプロレンニンまたはレンニンを
コード化する該DNAの開始点とプロモーターおよびリボ
ゾーム結合サイトを有するDNAの断片との間の距離を変
化させる操作を続行する。この材料は宿主細胞中に移入
され，クローニングが行なわれ，ついで所望の，かつ上
で選択されたプロレンニンまたはレンニンを発現する細
胞の選択が行なわれる。
ここに記載される方法によつて調製されたエシエリヒア
・コリ（大腸菌）はメリーランド20852,ロツクビレ,123
01パーク・ウオーレン・ドライブのアメリカン・タイプ
・カルチヤー・コレクシヨンの寄託された培養菌によつ
て例示され，かつ大腸菌BNN45株由来のCGE24株である受
入れ番号第31929号として同定される。
ここに記載される方法によつて調製された酵母微生物は
メリーランド20852,ロツクビレ,12301パーク・ウオーレ
ン・ドライブのアメリカン・タイプ・カルチヤー・コレ
クシヨンに寄託された培養菌によつて例示され，かつサ
ツカロミセス・セレビシエーCGY80株由来のCGY116株で
ある受入れ番号第20623号として同定される。
好ましくは，本発明の方法において，プレ−プロレンニ
ン，プロレンニンおよびレンニンはそれぞれプレ−プロ
レンニンDNA材料の単離によつて得ることができる。プ
レ−プロレンニンはプロレンニンの前駆体であり，文献
には記載されていない。プレ−プロレンニンDNAの部分
を除去することによつて，プロレンニンまたはレンニン
をコード化する遺伝子材料を得ることができる。
本発明によるプレ−プロレンニン，プロレンニンまたは
レンニン遺伝子はプレ−プロレンニン，プロレンニンま
たはレンニンの各々のアミノ酸配列をコード化する特定
のヌクレオチド配列を含有し，かつプレ−プロレンニ
ン，プロレンニンまたはレンニンの各々をコード化する
ゲノムDNA中に存在するすべての介在ヌクレオチド配列
を除外する。これらの３つの遺伝子はまた適当な宿主細
胞中で複製するベクターに結合されて与えられている。
宿主細胞は好ましくは大腸菌であり，これは所望の酵素
蛋白を生産する組換えDNA材料を発現することができ
る。酵母および他の細胞もまた使用することができる。
これらの細胞は合理的な商業規模の培養条件下で大量の
酵素蛋白を生産できるように選択される。
この明細書中に記載された酵素レンニン（EC3.4.23.4）
はまたキモシン（chymosin）として知られている。これ
は予め反芻する子牛の胃の中に見い出される主要な加水
分解性蛋白であり，凝固乳に対して反応性である。レン
ニンは商業的にはチーズの製造に用いられる。プロレン
ニンは,B.FoltmannらによつてProc.Nat.Acad.Sci.USA第
74巻2321〜2324頁（1977）に記載されているようにアミ
ノ末端に42個の付加アミノ酸を有するレンニンの前駆体
形である。この明細書中に最初に記載されたプレ−プロ
レンニンはプロレンニンの前駆体形であり，プロレンニ
ン分子のアミノ末端上に多くの付加アミノ酸（16個のア
ミノ酸）を有する。これらの付加アミノ酸は好ましくは
胃細胞から酵素の選択にとつて重要である。B.Foltmann
らは，精製されたレンニンが２つの形,AおよびＢの混合
物であることを示した〔B.Foltmann外,Proc.Nat.Acad.S
ci.USA第74巻,2321〜2324頁（1977）およびJ.Biol.Che
m.第254巻,8447〜8456頁〔1979）〕。両方の形は活性で
あり，そして配列データは，おそらく唯一の相異がレン
ニンＡ中の位置＃290におけるアスパラギン酸塩残基お
よびレンニンＢ中の上記位置におけるグリシン残基であ
ることを示している。本発明の実施例で生産されたレン
ニンはレンニンＡである。しかしながら，同一の手法お
よび（または）簡単な転化によつてレンニンＢを生産す
ることができる。同様にプレおよびプロ形はＡまたはＢ
形中に生起させることができる。
本発明の目的のために，プロレンニン遺伝子は，プロレ
ンニン分子をコード化する特定のヌクレオチド配列とし
て定義され，そのアミノ酸配列は文献に記載されている
〔B.Foltmann.V.B.Pedersen,H.Jacobsen,D.Kaufman,お
よびG.Wybrandt,Proc.Nat.Acad.Sci.USA第74巻,2321〜2
324頁（1977）〕。
プレ−プロレンニン遺伝子はプロレンニンをコード化し
ているヌクレオチドの配列を有するばかりではなく，プ
レ−プロレンニン酵素上に見い出されるアミノ末端前駆
体ポリペプチドをコード化する５′末端上の48個の付加
ヌクレオチドを含有する。
レンニン遺伝子はプロレンニンの酵素原部分をコード化
する最初の126個のヌクレオチドを排除してなるレンニ
ン分子をコード化するヌクレオチドの特定の配列として
定義される。
生細胞は，子牛の第４胃から得られる材料を用いて出発
する複数かつ公知のDNA技術を用いることによつて最初
の実施例において生産される。
得られるレンニン，プレ−プロレンニンおよびプロレン
ニンがチーズ製造において乳汁を凝固させてチーズを得
るのに使用することができ，かつおそらく他の商業上の
利用において乳汁を凝固させてチーズを得るのに使用す
ることができることは本発明の一つの特徴である。大量
生産は培養技術によつて可能である。こうして，大量の
材料が合理的な生産速度およびコストで生産されること
ができる。遺伝子組換えDNA材料は，レンニンが生産さ
れることになつているときは子牛のプレ−プロレンニン
遺伝子のレンニン部分と実質的に同一であり，プレ−プ
ロレンニンが生産されることになつているときは子牛の
プレ−プロレンニン遺伝子と実質的に同一であり，そし
てプロレンニンが生産されることになつているときは子
牛のプレ−プロレンニン遺伝子のプロレンニン部分と実
質的に同一である。組換えDNA中の相異は主として，子
牛の遺伝子中に存在するイントロン（intron）を有して
いない分子と関係がある。
組換えDNA操作に対して安全であると考えられるすべて
の種属の細菌を使用することができる。これらの細菌に
は例えばエシユリヒア・コリ（大腸菌），いろいろな種
属のバチルス，例えばバチルス。ズブチリス，種々のラ
クトバチルス種属，および種々のミクロコツカス種属，
例えばミクロコツカス・フラジリスが包含される。菌類
（fungi），酵母または哺乳動物のような他の細胞もま
た宿主細胞として使用することができる。それぞれの場
合において，もたらされる細胞の遺伝子情報は組換えDN
A材料から得られる新しい遺伝子材料を含有する。この
材料はプラスミドの形でしばしば含有され，プラスミド
は宿主細胞中で複製することができ，かつ宿主細胞中に
ある初期の段階でドナー（供与体）細胞からの遺伝子材
料が挿入される。いつたん組換えDNA分子が形成され，
宿主細胞に挿入されれば，その宿主細胞は生育し，本質
的に正常な手段によつて複製する。組換えDNA材料をコ
ード化する酵素蛋白（レンニン，プレ−プロレンニンま
たはプロレンニンであり得る）の生産は本発明に従つて
生起する。
所望の組換えDNA材料が導入される宿主細胞は好ましく
は大腸菌Ｋ−12由来株である。有用な由来株は次のとお
りである。
HB101,H.W.Boyer＆D.Roulland−Dussoix（1969）J.Mol.
Biol.第41巻,459〜472頁,C600,M.Mandel＆A.Higa J.Mo
l.Biol.第53巻,159〜162頁（1970），およびC600の由来
株，例えば MV1およびMV12,V.Hershfield,H.W.Boyer,C.Yanofsky,M.
A.Lovett＆D.R.Helinski（1974）Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA第71巻,3455〜3459頁， LE392,S.M.Tilghman,D.C.Tiemeier,F.Polsky,M.H.Edgel
l,J.G.Seidman,A.Leder,L.W.Enquist,B.Norman＆P.Lede
r（1977）Proc.Natl.Acad.Sci.USA第74巻,4406〜4410
頁， JM101,J.Messing（1979）Recombinant DNA Technical B
ulletin第２巻,43〜48頁， W3110および由来株,K.L.Korr＆C.Yarofsky（1976）J.Mo
l.Biol.第103巻,395〜409頁 これらの細胞は通常の培養技術によつて生育させること
ができる。例えば，大腸菌のための培地は次のとおりで
ある。
栄養培地 LB 当り バクト（Bacto）・トリプトン （Difcoラボラトリーズ，デトロイト） 10g バクト酵母抽出物 （Difcoラボラトリーズ，デトロイト） 5g NaCl 10g グルコース 2g TY 当り バクト・トリプトン （Difcoラボラトリーズ，デトロイト） 10g バクト酵母(Difcoラボラトリーズ，デトロイト) 1g NaCl 8g グルコース 1g 最少培地 M9 当り NaHPO4 6g KH2PO4 3g NaCl 0.5g CaCl2 11mg MgCO47H2O 0.2g Bl（チアミンHCl） 5mg 株により必要量のアミノ酸（各40mg）グルコース 2g 培養菌は懸濁液中で生育し，寒天培地上でプレート化す
ることができ，または他の標準的な技術および細胞培養
技術を使用することができる。
使用される培地は特別の細胞を生育させるためのすべて
の標準的な培地であり得る。例えば，大腸菌LE392（大
腸菌C600▲ｒ- k▼m+SupE,SupF,gal-）またはBNN45（大
腸菌hadR-,hadM+,SupE,SupF,Bl-met-）（Advanced Bact
erial Genetics,R.W.Davis,D,Botstein,J.R.Roth,コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー〔1980〕p.
7）の細胞を最初に１％〜４％のレベルで接種したTX培
地が好ましい。
標準的な技術において，該大腸菌は10〜30×1012細胞１
の密度まで生育し，所望の酵素蛋白が生産される。
細胞を生育させるために知られている種々の培地を使用
することができるが，本発明の部分を構成するものでは
ない。同様に種々の生育方法，技術および条件を用いる
ことができる。例えば，該細胞が好ましくは30℃〜40℃
の温度で生育している間に，この範囲外の温度を用いる
ことができる。
本発明の細胞を得るための出発点は所望の遺伝子材料を
得るための，かつそれを宿主細胞に挿入してその後宿主
細胞がクローン化されるための当業界公知の組換えDNA
技術を使用することである。
好ましくは，微生物におけるクローンを最終的に望むレ
ンニン遺伝子，プレ−プロレンニン遺伝子またはプロレ
ンニン遺伝子は組織源からのプレ−プロレンニン遺伝子
のメツセンジヤー（伝令）RNAを得ることによつて第１
段階で単離される。子牛の場合，これは子牛の第４胃か
らの単離によつて得られる。メツセンジヤーRNAはDeele
yらの方法によつて単離することができる（R.G.Deeley,
J.I.Gordon,A.T.H.Burns,K.P.Mullinix,M.Bina−Stein,
R.F.Goldberger J.Biol.Chem.第252巻,8310〜8319頁〔1
977〕）。また，ポリＡ−富化RNAはR.C.Desrasiers,K.
H.Friderici,＆F.M.Rottmanの方法によるオリゴ（dT）
セルローズ上のクロマトグラフイーによつて得ることが
できる（Biochemistry,第14巻,4367〜4374頁〔197
5〕）。
メツセンジヤーRNAはついで慣用の手段によつて２本鎖D
NAに転換される。まず最初に，該RNAの相補（complimen
tary）コピーがAMV逆転写酵素の使用によるなどの慣用
の組換えDNA手段によつてメツセンジヤーRNAから作られ
る。例えば,A.Efstratiadis,F.C.Kafatos,A.M.Maxamお
よびT.Maniatis,Cell,第７巻,279〜288頁（1976）,R.Hi
guchi,G.V.Paddock,R.WallおよびW.Salser,Proc.Nat.Ac
ad,Sci.USA第73巻,3146〜3150頁（1976）,D.L.Kacianお
よびJ.C.Myers,Proc.Nat.Acad.Sci.USA第73巻,2191〜21
95頁（1976）,M.P.Wickens,G.N.BuellおよびR.T.Schimk
e,J.Biol.Chem.第253巻,2483〜2495頁（1978）,G.M.Wah
l,R.A.PadgettおよびG.R.Stack,J.Biol.Chem.,第254巻,
8679〜8689頁（1979）の方法をコピーDNA（cDNA）を得
るために使用することができる。そのRNA部分は，上記
方法のいずれかを使用する当業界で公知の連鎖切断によ
つて，またはWickensらの方法（1978）による熱変性に
よつて配列されることができる。
次に，大腸菌DNAポリメラーゼＩまたはAMV逆転写酵素の
ような酵素は，上記の文献およびJ.I.Gordon,A.T.H.Bur
ns,J.L.Christmann＆R.G.Deeley,J.Biol.Chem.第253巻,
8629〜8639頁（1978）の方法を用いてcDNAを２本鎖DNA
に変えるために使用することができる。
第３に，合成リンカーは，例えばHind IIIまたはEcoR1
合成オリゴヌクレオチドリンカーを使用することによつ
て，例えばR.H.Scheller,T.L.Thomas,A.S.Lee,W.H.Klei
n,W.D.Niles,R.J.BrittenおよびE.H.Davidson,Science
第196巻,197〜200頁（1977）,T.H.FraserおよびB.J.Bru
ce,Proc.Natl.Acad.Sci.USA第75巻,5936〜5940頁（197
8）,A.Ullrich,I.Shine,J.Chivgwin,R.Pictet,E.Tische
r,W.J.Rutter＆H.M.Goodmann,Science第196巻,1313〜13
19頁（1977）,J.Ssine,P.H.Seeburg,J.A.Martial,J.D.B
axter＆H.M.Goodmann,Natiure第270巻,494〜499頁（197
7），またはP.H.Seeburg,J.Shine,J.A.Martial,J.D.Bax
ter＆H.M.Goodmann,Nature第270巻,486〜494頁（1977）
に記載された通常の方法を用いて,2本鎖DNAの両方の末
端に結合されることができる。
第４段階では,DNA分子は染色体に結合されるか，または
プラスミド，ウイルスまたは当業界公知のコスミド（co
smid）であり得るベクターに結合される。そのようなベ
クターには以下のものがある。
pBR322（F.Bolivar,R.L.Rodriguez,P.J.Greehe,M.C.Bet
lach,H.L.Heyneker,H.W.Boyer,J.H.Grosa,S.Falkow,197
7,Gene,第２巻,95〜119頁） pMB9（R.L.Rodrigues,F.Bolivara,H.M.Goodman,H.W.Boy
er,M.C.Betlach“Molecular Mechanisms in the Contro
l of Gene Expression"〔D.P.Nierlich,W.J.Rutter,C.
F.Fox,Eds.〕471頁，アカデミツク・プレス，ニユーヨ
ーク,1976） pSC101（S.N.Coher,A.C.Y.Chang,H.W.Boyer,R.B.Hellin
g,1973,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,第70巻,3240頁） λgtWES（D.Tiemeier,L.Enquist,P.Leder,Nature第263
巻,526〜527頁）（1976） λcharoフアージ（F.R.Blattner外,Science第196巻,161
〜169頁）（1977） f1R229（J.D.Boeke,Molec.Gen.Genetics,第181巻,288〜
291頁）（1981） pJC75−58（J.Collins,Methcd in Enzymology第68巻,30
9〜326頁）（1979） この段階は最後の宿主細胞の外側で再び行なわれる。こ
の方法のための有用な技術はリンカーと関連して上記の
文献に記載され，同様に次の文献にも記載されている。
V.Hershfield,H.W.Boyer,C.Yanofasky,M.A.Lovett＆K.M
urray,Nature,第251巻,476〜482頁（1974）,F.R.Blattn
er外,Science,第196頁,161〜169頁（1977）。
第５段階では，組換えDNA分子は，例えばM.Mandel＆A.H
iga（1970）J.Mol.Biol.第53巻,159〜162頁,P.C.Wensin
k,D.J.Finnegan,J.E.Donelson＆D.S.Hogness,Cell第３
巻,315〜325頁（1974）,S.N.Cohen,A.C.Y.Changおよび
L.Hsu,Proc.Natl.Acad.Sci.USA第69巻,2110〜2114頁，
（1972）,H.M.Goodman,およびR.J.MacDonald,Methods i
n Enzymology第68巻,75〜90頁（1979）,E.M.Lederberg
およびS.N.Cohen,J.Bact.第119巻,1072〜1074頁（197
4）に記載された通常の方法を用いて，宿主細胞株の細
胞質中に導入されることができる。
正確なクローンの確認は雑種化選択（hybridization se
lection）の方法によつて，または合成オリゴヌクレオ
チドを用いるプロ−ビング（probing）によつて遂行す
ることができる（T.Taniguchi,Y.Fujii,Kuriyamaおよび
M.Muramatsu,Proc.Natl.Acad.Sci.USA第77巻,4003〜400
6頁（1980）,R.P.Ricciardi,J.S.Miller＆B.E.Roberts,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA第76巻,4927〜4931頁（1979）,
D.L.Montgomery,B.D.Hall,S.GillamおよびM.Smith,Cell
第14巻,673〜680頁〔1978〕）。
新たに改変された宿主細胞はついでクローン化され，所
望材料の発現が得られる。例えば，ラクトースオペロン
プロモーターを使用するGuarenteらの技術（1980）（L.
Guarente,G.Lauer,T.M.Roberts＆M.Ptashne,Cell第20
巻,543〜553頁〔1980〕,L.Guarente,T.M.Roberts＆M.Pt
ashne,Science第209巻,1428〜1430頁〔1980〕）によつ
て，外来性DNAの発現が得られ，かつ最適化される。他
のプロモーターは，それらのプロモーターが所望の細
菌，酵母または他の宿主細胞中で活性である間は，当業
界公知の発現を得るために使用されることができる。そ
のようなプロモーターには，大腸菌トリプトフアンオペ
ロン，またはβ−ラクタマーゼプロモーター，およびサ
ツカロミセス・セレビシエー，ウラシル３または転化酵
素プロモーターが包含される。
本発明の特定の実施例では，以下のとおり，プレ−プロ
レンニンA,プロレンニンＡまたはレンニンＡを生産する
組換え大腸菌株を得ることができる。
1. RNAの単離 乳汁で飼育した子牛からの胃組織を地方屠殺場から新た
に得た。第４胃の粘膜を胃壁から切り離し，ドライアイ
ス中で冷凍した。粘膜組織21gを50mM Tris゜HCl（pH7.
5）,8MグアニジンHCl,および1mMジチオトレイトールか
らなる冷却した緩衝液（10℃）200mlに添加して混合機
により分断した。不溶性材料はSorvall SA−600回転機
中で12分間,10,000rpmで遠心分離することによつて除去
した。スピン（spin）からの表面浮上物質200mlを冷却
した無水エタノール100mlに添加した。−20℃で1.5時間
後，沈澱を−10℃で30分間,3000rpmで遠心分離すること
によつてペレツト化した。ペレツトは,20mM EDTA（pH
7）,20mM NaOAc（pH7）,8MグアニジンHCl,および1mMジ
チオトレイトールからなる氷で冷却した緩衝液（EGAD）
40mlに溶解させた。冷却した無水エタノール20mlを添加
し，ついでその溶液を−20℃で45分間放置した。沈澱を
−10℃で20分間,3000rpmで遠心分離することによつてペ
レツト化した。ペレツトを冷却したEGAD緩衝液40ml中に
溶かし，冷却したエタノール20mlで沈澱させ，遠心分離
し，そしてEGAD緩衝液中にペレツトを再溶解させる操作
をさらに２回くり返した。最後に，ペレツトを20mM EDT
A（pH7）16mlに溶かし，クロロホルム：イソブタノール
（4:1）で３回抽出した。次に,4.5M NaOAc（pH5.2）の
２容積を水性層に添加し，その溶液を−20℃で一夜放置
した。RNAの沈澱を−10℃で25分間,10,000rpmで遠心分
離することによつて収集し，ついで水30mlに溶かした。
収量はRNA45mgであつた。RNAを2M NaOAc（pH5）1mlおよ
び無水エタノール75mlの添加によつて沈澱させ，ついで
−20℃で一夜インキユベーシヨンした。RNAを遠心分離
（10,000rpm,10分間，−10℃）によつてペレツト化し，
水20mlに再溶解し,60℃で10分間加熱し，氷上で急速に
冷却し,2×濃縮した結合緩衝液〔20mM Tris゜HCl（pH7.
5）,2mM EDTA（pH7）,0.4％SDSおよび0.24M NaCl〕で希
釈した。RNAを4mlのオリゴ−dT−セルローズカラムに付
し，カラムを１×濃縮した結合緩衝液で洗い，ついでポ
リＡ−含有RNAを，カラムをNaCl非含有の結合緩衝液で
洗うことによつて溶離した。ポリＡ−含有RNA約1mgが得
られた。ポリＡ−含有RNAの一部分をラビツト・レテイ
キユロサイト（reticulocyte）・リゼイト（lysate）・
システム（H.R.B.PelhamおよびR.J.Jackson〔1976〕Eu
r.J.Biochem.第67巻,247〜256頁）中で試験管内で翻訳
した。蛋白生成物は10％ポリアクリルアミド・ゲル上で
分析した。単一の主要蛋白の帯が観察され，これはレン
ニン抗血清と共に沈澱した。このことはレンニンmRNAが
ポリＡ−含有RNA中に存在することを示している。
2. ２本鎖コピーDNA（cDNA）の作成 50mM Tris゜HCl（pH8.3）,100mM KCl,8mM MgCl2,0.4mM
ジチオトレイトール，各1mMデオキシヌクレオシド・ト
リフオスフエート,100単位の逆転写酵素を含有する20ug
/mlオリゴ（−dT）12〜18および1Ci/mM α32P−dCTP中
で42℃,1時間インキユベーシヨンすることによつて，子
牛の胃ポリＡ−含有RNA20μｇからcDNA約8.7μｇを合成
した。反応混合物を100℃で３分間加熱した後，氷上で
３分間冷却し，沈澱した蛋白を遠心分離によつて除去
し，表面浮上材料の半分に100mM HepesKOH（pH6.9）,5m
M MgCl2,0.5mMジチオトレイトール,0.125mMデオキシヌ
クレオシド・トリフオスフエートを添加した。この混合
物を300単位の大腸菌DNAポリメラーゼＩと共に16℃で２
時間インキユベーシヨンすることによつて,2本鎖cDNA8.
6μｇが作成された。このDNAをフエノールで抽出し,Sep
hadex G−100（12mlのカラム,0.7cm×30cm,20mMTris゜H
Cl（pH7.5）,0.5mM EDTA（pH7.5）で溶離）上でクロマ
トグラフイーを行なうことによつてとり込まれなかつた
トリフオスフエートから分離し,2MNaOAc（pH5）1/10容
積，および冷却したエタノール2.5容積の添加によつて
−20℃で一夜，エタノール沈澱させた。２本鎖cDNA（4.
6μｇ）をついで1000単位のSlヌクレアーゼで37℃で１
時間,BufferS（0.3M NaCl,30mM NaOAc（pH4.6）,3mM Zn
SO4）中で処理した。反応は10mM EDTA,および200mM Tri
s゜HCl（pH8.3）の添加によつて終了させ，混合物をバ
イオゲルＡ−150mカラム（0.7cm×33cm）にかけて平衡
させ,10mM Tris゜HCl（pH7.5）,1mM EDTAおよび250mM N
aClで溶離した。高分子量DNAのピーク画分（各0.5ml）
をプールし,2M NaOAc（pH5）1/10容積および冷却した無
水エタノール2.5容積の添加によつてエタノール沈澱さ
せた。
3. Hind IIIリンカーの添加 Slで処理した２本鎖cDNA（1.7μｇ）をBufferT（25mM T
ris゜HCl（pH8）,6.6mM MgCl2,0.5mM EDTA,5mM2−メル
カプトエタノールおよび各0.5mMデオキシヌクレオシド
・トリフオスフエート）中で２単位のT4DNAポリメラー
ゼと共に室温で30分間インキユベーシヨンした。この材
料をフエノールで抽出し，ついでエーテルで抽出し，さ
らに2M NaOAc（pH5）1/10容積およびエタノール2.5容積
の添加によつてエタノール沈澱させた。この，平滑末端
を有する２本鎖cDNAをついで66mM Tris゜HCl（pH7.6）,
6.6mM MgCl2,5mM2−メルカプトエタノール,0.5mM ATP中
で,32PをラベルしたHind III合成リンカー300pモル（10
0×過剰のcDNA末端）および平滑末端が９単位のT4DNAリ
ガーゼと共に12℃で一夜インキユベーシヨンした。
反応は10mM EDTA（pH8）で調整され,Biogel Ａ−150m
カラム（0.7cm×20cm）上で分画した。高分子量DNAを含
有する画分（各0.25ml）をプールし，エタノール沈澱さ
せた。この材料を制限Hind IIIエンドヌクレアーゼ（９
単位）で,5.6mM Tris゜HCl（pH7.6）,5.6mM MgCl2で37
℃で45分間処理し，ついでフエノールで抽出し，エーテ
ルで抽出し，さらに1M NaOAc（pH5）1/10容積および無
水エタノール2.5容積の添加によつてエタノール沈澱さ
せた。この,Hind III接着末端を有する２本鎖cDNAを次
にflフアージCGF42本鎖DNAに結合させた。このflフアー
ジCGF42本鎖DNAは制限Hind IIIエンドヌクレアーゼで切
断開鎖され，かつH.GoodmanおよびR.J.MacDonaldの方法
（H.M.GoodmanおよびR.J.MacDonald〔1979〕,Methods i
n Enzymology第68巻,75〜91頁）により子牛の腸のフオ
スフアターゼで２回処理することによつて末端リン酸塩
を除去したものであつた｛注：フアージCGF4を生成させ
るために,flフアージR229（J.D.Boecke〔1981〕Mol.Ge
n.Genet.第181巻,288〜291頁）はEcoRIエンドヌクレア
ーゼで切断され,T4DNAポリメラーゼで平滑末端とされ，
ついでコラボラテイブ・リサーチ社（マサチユセツツ州
ウオルサム市）からのHind III合成オリゴヌクレオチド
・リンカーで結合された｝。この結合反応には66mM Tri
s゜HCl（pH7.6）,5mM2−メルカプト−エタノール,2本鎖
cDNA0.3μg,CGF4DNA0.2μg,0.5mM ATPおよび接着末端30
0単位のT4DNAリガーゼを含有させた。結合反応は16℃で
29時間行なわれた。
4. 組換え−CGF4DNAを用いる大腸菌BNN45のトランスフ
エクシヨン（transfection） 大腸菌CGE6株（BNN45;hsdR-,hsdM+,supE,supF,Bl-,me
t-）をトリプトン（tryptone）ビイヨン中で37℃で振と
うしながら生育させ,4℃で10分間,7000rpmで遠心分離す
ることによつてOD700＝0.5で収穫した。細胞を氷で冷却
した50mM CaCl2（最初の培養容積の1/2）中に再懸濁さ
せ，ついで０℃で30分間放置した。懸濁液をついで４℃
で10分間,7000rpmで遠心分離し，氷で冷却した50mM CaC
l2（最初の培養容積の1/20）中に懸濁した。０℃で60分
間放置した後，細胞をトランスフエクシヨンのために使
用した。20μの結合反応剤（ligation reaction）の1
/2μを滅菌した50mM Tris゜HCl（pH7.6）50μを含
有する８個の試験管の各々に添加した。CaCl2で処理し
た細胞の1/10mlを各試験管に添加し，混合物を氷上で30
分間放置した。37℃まで２分間暖めた後,CGE5（JM101:
J.Messing〔1979〕,V（lacpro）SupEthi-バツクグラウ
ンド中のＦ′tra D36 pro AB lac IZVM15）一夜培養物
0.2mlおよび0.7％ソフト・アガー（寒天）を添加し，混
合物を８個のトリプトン寒天プレート上に注いだ。37℃
で一夜インキユベーシヨンすることにより，プレート当
り約250個のプラツクが生じた。
5. レンニンのコード化配列を担う組換えCGF4の同定 これらのプラツクをニトロセルロースに移し，▲32 α▼
Ｐ−dCTPおよび逆転写酵素（T.P.S.T.JohnおよびR.W.Da
vis〔1979〕Cell第16巻,443〜452頁）を用いて子牛の胃
のポリＡ−含有PNAから作られる32PをラベルしたcDNAを
使用するBenton＆Davisの方法（W.D.BentonおよびR.W.D
avis〔1977〕Soience第196巻,180〜182頁）によつてプ
ローブした。ラベルしたcDNAに対して高度に交配する組
換えフアージ約80個がプレートからつまみ取られ,TY媒
体中に４℃で貯蔵された。無傷の（完全な）フアージ試
料をCGE5細胞上で一夜生育させることによつて拡大さ
せ，遠心分離によつて収穫し，ついで0.37M Tris゜ｇグ
リシン（pH9.5）を含有する２％アガロース・ゲル中で
電気泳動に付し,0.2N NaOH中の１時間処理および0.5M T
ris゜HCl（pH7.4）中の中和後に臭化エチジウム（ethid
ium）で染色した。その移動はフアージDNAの大きさのロ
グ（log）に反比例しており，大きさが1000〜2000ベー
ス・ペアー（base pairs）の挿入DNAを有する８個のフ
アージを選択した。２本鎖RFIDNAを,Mosesらの方法（P.
B.Moses,J.D.Boeke,K.Horiuchi＆N.D.Zinker〔1980〕Vi
rology第104巻,267頁）によつて，これらの８個のフア
ージから作成した。このDNAはHind IIIで切断され，つ
いで生じた断片を，該挿入物（insert）がHind IIIサイ
ト中に在り，かつ予測された大きさであることを立証す
るために，アガロース・ゲル上で分析した。最後に,4個
の組換えフアージからのDNA（各々から約５〜10μｇ）
およびベクターCGF4からのDNAをHind IIIで切断し，そ
れらの断片を,45分間煮沸することによる変性および乾
燥した氷／エタノール中での冷凍後に，水中の該DNAを,
20×SSCで予め処理して乾燥したニトロセルローズの小
片上にスポツトすることによつてニトロセルローズに結
合させた。真空下で75℃で1.5時間ベーキングした後，
ニトロセルローズに結合したDNAをMillerらによつて記
載された雑種選択（hybrid selection）手法（J.S.Mill
er,R.P.Ricciardi,B.E.Roberts,B.M.Paterson＆M.B.Mat
hews〔1980〕J.Mol,Biol.第142巻,455〜488頁）に付
し，各雑種化のためにポリＡを富化した子牛の胃のRNA2
μｇを用いた。溶離されたRNAをPelhamおよびJacksonの
方法（H.R.B.PelhamR.J.Jackson〔1976〕Eur.J.Bioche
m.第67巻,247〜256頁）によつて35S−メチオニンでラベ
ルしているレテイキユロサイト溶解物（reticulocytely
sate）システム中で翻訳し，生じた蛋白生成物をLaemml
iの方法（U.Laemmli〔1970〕Nature第227巻,680〜685
頁）によつて0.1％のSDSを含有する10％のポリアクリル
アミド・ゲル上で分析した。ゲル分析の結果は，試験さ
れた４個のフアージDNAのすべてが，ラビツト・レテイ
キユロサイト・溶解物中で翻訳後に大きさおよび免疫学
的な規準においてプレ−プロレンニンと同一の蛋白生成
物を生じるRNA種を選択したので，該フアージDNAがレン
ニンmRNAに雑種化したことを示した。４個のうちの２
個，すなわち約1400ベース・ペアー（bp）の挿入物を有
する293−207および約1250bpの挿入物を有する293−118
/37をさらに調査するために選択した。DNA挿入物をMaxa
mおよびGilbert（A.M.MaxamおよびW.Gilbert〔1980〕Me
thods in Enzymology第68巻,499〜560頁）の方法によつ
て配列解析した。ヌクレオチド205〜1350がプレ−プロ
レンニンＡ遺伝子用のDNA配列である（表１参照）。ヌ
クレオチド配列１〜204および1351〜1460はプレ−プロ
レンニンに結合しているが，しかし所望ならば除去する
ことができ，発現における遺伝子の使用にとつて必須の
ものではない。表１のDNA材料の有用な部分は分離する
ことができ，かつ公知技術によつて使用することができ
る。
この表は293−207および293−118/37の両方からの情報
を組み合わせたものである。すなわち、組換えフアージ
293−207は、削除されているヌクレオチド848〜961のほ
かはヌクレオチド＃１から少なくともヌクレオチド＃13
60まで表１に示された配列を有する挿入物を有し、他方
フアージ293−118/37はヌクレオチド＃229からヌクレオ
チド＃1460までの配列を有する挿入物を有する。配列結
果によつて明らかにされたように、レンニン合成の開始
はメチオニンコドン（ヌクレオチド205〜207）のところ
で起こり、精製プロレンニンと比較して16個の付加アミ
ノ酸を有するプレ−プロレンニン分子をもたらす。（プ
ロレンニンＢアミノ酸配列はB.Foltmann外、Proc.Nat.A
cad.Scl.USA第74巻、2321〜2324頁（1977）およびB.Fol
tmann外J.Biol.Chem.第254巻、8447〜8456頁（1979）に
記載されている。表１のヌクレオチド配列データはプレ
−プロレンニンの存在を最初に指摘したものである。）
２つの組換えflフアージ293−207および293−118/37は
一緒に組み合わせると全体のプレ−プロレンニンＡ分子
に対するDNA配列を有している。プレ−プロレンニンＡ
のプロレンニン部分はアミノ酸＃290のところでプロレ
ンニンＢと異なる（Foltmannらによつて記載された（上
記参照）レンニンＡ中のアスパラギン酸塩およびレンニ
ンＢ中のグリシン；アミノ酸部分の番号付与はFoltmann
のそれによる）。アスパラギンのコドンはアミノ酸位置
＃204で示され、一方Foltmannはその位置でアスパラギ
ン酸塩を報告した。しかしながら、アスパラギン酸塩お
よびグルタミン酸塩のアミドはそれらの酸の形と区別す
るのが困難であり、一方ヌクレオチド配列は該コドンを
容易に区別することができるので、上記の報告はアミノ
酸配列を誤つたものと思われる。
フアージ293−118/37で示されるクローン化レンニン遺
伝子は、牛のゲノムコピーまたはレンニン遺伝子のコピ
ーの特性を研究するために使用した。これらの実験は、
刻み目（nick）−翻訳の方法（P.W.J.Rigby,M.Diekman
n,C.Rhodes,およびP.Berg〔1977〕J.Mol.Biol.第113巻2
37〜251頁）により、32Pでラベルしたクローン化レンニ
ンDNAを雑種化させることによつて、種々の制限酵素で
切断され、アガロース・ゲルで分離され、Southernの方
法（E.M.Southern〔1975〕J.Mol.Biol.第98巻、503〜51
7頁）によりニトロセルローズ膜に移された牛のDNAに対
して行なわれた。それらの結果は、Sac IおよびBg/Iの
ような酵素による牛のDNAの制限エンドヌクレアーゼ切
断（クローン化プレ−プロレンニンcDNA配列は切断しな
い）が、それにもかかわらずしばしば、レンニン配列に
雑種化するDNAの１つ以上の帯（band）を生じさせるこ
とを示している。このことは、（ａ） レンニン情報の
ゲノムコピーが、レンニンcDNA中には見い出されない制
限酵素サイトを含む付加的なDNA（おそらくは介在配
列）を含有すること、または（ｂ） １つ以上のレンニ
ン遺伝子がゲノム中に存在し、かついくつかの制限酵素
がコピー間を切断することを示唆している。この後者の
可能性はクローン化レンニンcDNAの５′および３′末端
から得られた、32Pでラベルしたプローブ（probes）を
有する制限切断牛ゲノムDNAを雑種化させることによつ
て排除された。これらの結果は、例えば制限エンドヌク
レアーゼEcoR IおよびBamH Iを使用すると、レンニンコ
ード化情報の単一のゲノムコピーと一致する。このこと
は、B.Foltmannら（J.Biol.Chem.第254巻,8447〜8456頁
〔1979〕）によつて観察されたレンニンのＡおよびＢ形
がレンニン遺伝子の２つの異なる対立遺伝子の生成物と
非常によく似ていることを意味している。さらに、レン
ニン遺伝子の牛ゲノムコピーは介在配列を含有し、そし
てその点で該ゲノムコピーは、プレ−プロレンニン用の
メツセンジヤー（伝令）RNAと同一である我々のクロー
ン化cDNAと相違する。
6. 大腸菌中のプレ−プロレンニンの発現 大腸菌中のプレ−プロレンニンの発現を獲得するのを促
進するようにデザインされたプラスミド、pCGE5は、ア
ガロース・ゲルで精製したDNAの３つの断片（segment）
によつて構成された。プラスミドpBR322（4.5μｇ）は
制限エンドヌクレアーゼ、Hind III（N.E.Biolabs,6単
位）およびPst I（N.E.Biolabs,3単位）を37℃で１時
間、50mM NaCl、7mM Tris゜HCl（pH7.5）、7mM MgCl2お
よび6mM 2−メルカプトエタノールを含有する50μの
反応剤（reaction）中で切断された。組換えフアージ29
3−207からの２本鎖RFIDNA（４μｇ）は制限エンドヌク
レアーゼKpn I（N.E.Biolabs,10単位）で、37℃で１時
間、Buffer K（6mM NaCl、6mM Tris゜HCl（pH7.5）、6m
M MgCl2、および6mM 2−メルカプトエタノール）を含有
する50μの反応剤中で切断された。プラスミドpLG400
（L.Guarente,G.Lauer,T.Roberts,M.Ptasne,Cell第20
巻、543〜553頁,1980）からのDNA約4.5μｇはHind III
（N.E.Biolabs,6単位）で、37℃で１時間、Buffer H（6
0mM NaCl、7mM Tris゜HCl（pH7.5）、7mM MgCl）を含有
する50μｇの反応剤中で切断された。フエノールで抽出
し、エーテルで抽出し、そしてエタノール沈殿を行なつ
た後、293−207およびpLG400からの切断DNAは、制限切
断のところで平滑末端を創製するために、T4DNAポリメ
ラーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミカルズ、10単位）で、37℃で
30分間、Buffer T（25mM Tris゜HCl（pH8）、6.6mM MgC
l2、5mM 2−メルカプトエタノール、0.5mM EDTA、各0.5
mMデオキシヌクレオチド・トリフオスフエート）を含有
する50μの反応剤中で別々に処理された。フエノール
抽出、エーテル抽出およびエタノール沈殿を行なつた
後、pLG400DNAはさらにPst I（N.E.Biolabs,3単位）
で、37℃で２時間、Buffer p（50mM NaCl、7mM Tris゜H
Cl（pH7.5）、7mM MgCl2 6mMおよび２−メルカプトエタ
ノール）50μ中で切断され、一方293−207DNAはHind
III（N.E.Biolabs,6単位）で、37℃で２時間、BufferH5
0μ中で切断された。制限切断DNAの３つの調製品の各
々をフエノールで抽出し、エーテルで抽出し、エタノー
ル沈殿させ、水30μに再溶解し、予備の、かつ水平の
１％アガロース・ゲルに注入した。40mM Tris゜アセテ
ート（pH7.2）中で、70〜80ボルトで３〜４時間電気泳
動を行なつた後、そのゲルを臭化エチジウム（ethidiu
m）で染色し、長波長の紫外線下で試験した。293−207
からの500ベース・ペアー（pb）帯、pLG400からの6000b
p帯、およびpBR322からの800bp帯を切り取り、該ゲル・
ピース（pieces）を凍らせ、かつ解かすことによりDNA
を抽出した（Thuring外、Anal.Biochem.第66巻、213頁
〔1975〕）。３つのDNA断片（segment）のすべてをエタ
ノール沈殿させ、水に再溶解させた。各ピースの約0.15
pモルを、14℃で一夜、BufferL（66mM Tris゜HCl（pH7.
5）、6.7mM MgCl2、10mMジチオトレイトール、0.75mM A
TP）およびT4DNAリガーゼ（N.E.Biolabs,600単位）を含
有する20μの反応剤中で互いに結合させた。転換能を
有する大腸菌CGE6株の細胞を前項４で述べた方法と全く
同じようにして作り、50mM Tris・HCl（pH7.6）50μ
中の結合DNA5μを該細胞100μと０℃で１時間混合
し、37℃で２時間加熱処理し、ついで新たなトリプトン
・ブイヨンで10倍に希釈した。37℃で１時間、振とうし
ながらインキユベーシヨンした後、細胞をアンピリシン
（ampicillin）20μg/mlを含有するトリプトン平板上で
平板にした。アンピリシン耐性コロニーを選択し、プラ
スミドDNAを作成し、制限酵素の消化力によつて分析し
た。これらのいくつかの標準株によつて、図１に示され
る所望のプラスミドpCGE5が得られた。DNA配列の分析
は、293−207DNAとpLG400 DNAとの間の結合が予期され
たものであることを明らかにした。それ故、プレ−プロ
レンニンの５′末端はGuarenteらのＩ″Ｚ融合の３′末
端フレームに融合される。プラスミドDNAは標準方法
（D.B.ClewellおよびD.R.Helinski,Proc.Nat.Acad.Sci.
USA.第62巻、1159〜1166頁〔1969〕）によつてpCGE5を
有する株から作成された。
ラクトース・オペロン・プロモーターおよびリボゾーム
結合サイトを担うDNA断片は、DNA10μｇをPvu II（N.E.
Biolabs,7.5単位）およびPst I（N.E.Biolabs,4単位）
で、37℃で２時間、BufferPを含有する反応剤100μ中
で切断することによつて、プラスミドpGL101（L.Guaren
te,G.Lauer,T.RobertsおよびM.Ptashne,Cell第20巻、54
3〜553〔1981〕）から単離された。850bp断片は上述し
たような帯の除去および冷凍／解凍の技術によつて予備
のアガロース・ゲルから単離された。
プラスミドpCGE5DNA（40μｇ）は、Hind III（CRI、70
単位）で37℃で１時間、BufferH（上記参照）を含有す
る反応剤150μ中で切断された。このDNAは次にエクソ
ヌクレアーゼBal31（N.E.Biolabs,5単位）で、30℃で10
分間、Buffer B（0.6M NaCl、12mM CaCl2、12mM MgC
l2、20mM Tris゜HCl（pH8）、1mMおよびEDTA）を含有す
る反応剤200μ中で消化された（図２参照）。ゲル電
気泳動による分析は、Bal31処理が十分な数のヌクレオ
チドを除去してプレ−プロレンニンのためのATG開始コ
ドン付近の５′末端を有する一群の断片をもたらしたこ
とを示した。DNAはT4DNAポリメラーゼを用いる上記の方
法によつて平滑末端とし、ついでDNA（１μｇ）はPst I
（N.E.Biolabs,0.06単位）で37℃で５分間、Buffer Pを
含有する反応剤20μ中で部分的に消化された。次のこ
のDNAは、Buffer L中にT4DNAリガーゼ（CRI,300単位）
を含有する反応剤20μ中で、ラクトースオペロンプロ
モーターおよびリボゾーム結合サイト（0.2μｇ）を有
するDNA断片850bpと結合せしめられた。大腸菌CGE7株の
転換能を有する細胞（NK5031,su III+,lacVM5265、nal
r,F-,Bl-）は株CGE6に対する上記方法と全く同じ方法で
作られ、懸濁液中の細胞100μは該反応剤５μで転
換せしめられ、インキユベーシヨンされ、熱シヨツクを
受け、pCGE5によるCGE6の転換に対する上記方法と全く
同じ方法でアンピシリン耐性の表現型の発現のために生
育せしめられた。細胞は、MacConkeyラクトースおよび
アンピシリン（20μg/ml）培地上で平板にした。β−ガ
ラクトシダーゼを示す、暗い赤色のコロニーを選択し、
β−ガラクトシダーゼ活性を評価分析した（J.Miller,E
xperiments in Molecular Genetics,ニユーヨーク，コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー,197
2）。プラスミドDNAを12個のこれらの転換細胞（transf
ormant）から単離し、制限酵素の消化力およびアガロー
スまたはポリアクリルアミド・ゲルの電気泳動によつて
分析した。１個の株、CGE20はプラスミドpCGE17（図３
参照）上のプレ−プロレンニン−Ｉ″Ｚ融合のATG開始
コドンからの約40個のヌクレオチド、ラクトースオペロ
ンプロモーターを有し、β−ガラクトシダーゼの中間レ
ベル（CGE6のようなラクトース＋株の完全に誘起された
レベルの約1/3）を生じさせる。
ラクトースプロモーターおよびリボゾーム結合サイトに
融合した全プレ−プロレンニン遺伝子を有するプラスミ
ドを創製するために、pCGE17DNA（４μｇ）をBgl II
（N.E.Biolabs,6単位）で、37℃で１時間、Buffer Pを
含有する反応剤90μ中で切断した。ついで、100mM Tr
is゜HCl（pH7.5）を添加し、該DNAをさらにEcoR I（Boe
hringer/Mannheim,40単位）で、37℃で１時間切断し
た。次に、pBR322DNA（５μｇ）をPvu II（N.E.Biolab
s,5単位）で、37℃で１時間、Buffer Pを含有する反応
剤45μ中で切断し、ついで100mM Tris゜HCl（pH7.5）
およびEcoR I（Boehringer/Mannheim,単位）を添加して
37℃で１時間さらにインキユベーシヨンした。最後に、
組換えflフアージ293−118/37RFI DNA（６μｇ）をHind
III（N.E.Biolabs,6単位）で、37℃で１時間、Buffer
Hを含有する反応剤50μ中で切断した。フエノール抽
出およびエタノール沈殿を行なつた後、切断されたDNA
をT4DNAポリメラーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミカルズ,10単
位）で、室温で30分間、Buffer Tを含有する反応剤50μ
中で処理してHind IIIサイトを平滑にした。ついで、
再溶解した、フエノール抽出しかつエタノール沈殿した
DNAをBgl II（N.E.Biolabs,4単位）で、37℃で１時間、
Buffer Pを含有する反応剤30μ中で切断した。３つの
制限酵素切断DNA種を予備の水平アガロース・ゲルに塗
抹し、ついでpCGE17断片370bp、pBR322断片2300bpおよ
び293−118/37断片1000bpを切り取り、アガロースの塊
りを冷凍し、かつ解凍することにより溶離した。エタノ
ール沈殿を行なつた後、DNAを水に再溶解し、各断片の
約0.2pモルを14℃で６時間、Buffer LおよびT4DNAリガ
ーゼ（N.E.Biolabs,300単位）を含有する反応剤20μ
中で互いに結合させた。大腸菌CGE6株を上記した方法に
よつて結合DNAで転換し、アンピシリン耐性コロニーを
選択した。制限酵素切断によるプラスミドDNAの分析に
よつて、CGE24株がラクトース・オペロン・プロモータ
ーおよびリボゾーム結合サイトに融合した全プレ−プロ
レンニン配列を有するプラスミドpCGE21（図４参照）を
担持していることが明らかになつた。
２種類の分析は、この株が真正の合成牛プレ−プロレン
ニンであることを示している。まず最初に、該細胞の粗
抽出物がPeakらの方法（G.J.Peak,J.MorrisおよびM.J.B
uckman〔1979〕“Growth Hormones"in Methods of Horm
one Radioimmunoassay,223〜244頁〔B.M.Jaffe＆H.R.Be
hrman編〕アカデミツク・プレス，ニユーヨーク）によ
つて行なわれた放射線免疫測定法において、抗レンニン
血清に対するヨード化レンニンの結合を阻害する。ただ
し、上記の方法には次の修正が施される。すなわち、ヨ
ード化レンニンは50mMリン酸ナトリウム（pH6）0.15M N
aCl、１％BSA中に貯蔵され、RIA緩衝液は0.05M Tris゜H
Cl（pH8）、0.5％ヒト血清アルブミンおよび0.1％亜硝
酸ナトリウムから成り、インキユベーシヨンは４℃で18
時間行なわれる。阻害量は、プレ−プロレンニン約0.8
μｇが各mlの抽出物中に存在していること（または細胞
培養物の当りプレ−プロレンニン約４μｇ）を示して
いる。第２に、細胞は、中間典型相（mid−exponential
phase）中で30分間、35S−メチオニンでパルス（puls
e）ラベルし、溶解し、抗レンニン血清で免疫沈殿させ
た。（J.S.EmtageらNature第283巻、171〜175頁〔198
0〕に記載されている。）免疫沈殿物をSDS（U.K.Laemml
i＆M.Faver,J.Mol.Biol.第80巻、575〜599頁〔1973〕）
を含有する10％ポリアクリルアミド・ゲル上で分析し、
オートラジオグラフイーを行なうと、プレ−プロレンニ
ンとほぼ同じ大きさの帯が観察された。加えて、レンニ
ンと同じ大きさの帯もまた観察され、このことは細菌が
プレ−プロレンニンをレンニンに転化させているか、ま
たは翻訳の第２の開始がプレ−プロレンニン配列中で起
こつていることを示唆するものである。プラスミドを含
有しない親株CGE6の免疫沈殿中にはいかなる帯も存在し
なかつた。これらの結果は、プレ−プロレンニンがプラ
スミドpCGE21を有する大腸菌細胞中で生産され、かつ生
産のレベルが細胞当り約600分子であることを示すもの
である。高レベルの生産は、同様のスキーム（体系）を
使用して、プレ−プロレンニンの開始コドンに近似した
ラクトース・オペロンプロモーターの融合を得ることに
よつて達成することができる。
CGE24株の抽出物もまた、B.Foltmannの標準乳汁−凝固
分析（Methods in Enzymology〔1970〕第19巻、421〜43
6頁）における活性を試験された。それらの結果は、こ
の大腸菌株が細胞当り約100分子の活性レンニンまたは
乳汁を凝固させることのできるレンニンの活性断片を生
産し、一方レンニンDNA配列を含有しないCGE6株からの
抽出物が乳汁を凝固することができないことを示してい
る。プラスミドpCGE21を有するCGE24株はアメリカン・
タイプ・カルチヤー・コレクシヨン（ATCC）に受入番号
第31929号として寄託されている。
CGE24株は、第５図によつて定義されるプラスミドpCGE2
1を有する大腸菌BNN45株（hsdR−hsdM＋supE 44 supF B
l-met-）（アドバンスト・バクテリアル・ジエネテイツ
クス、R.W.Davis,D.Botstein,J.R.Roth,コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリン
グ・ハーバー，ニユーヨーク,1980、７頁）である。こ
のプラスミドは、プラスミドpBR322（ヌクレオチド2067
〜4360,J.G.Sutcliffe〔1979〕コールド・スプリング・
ハーバー・シンポジウム、第43巻、77〜90頁参照）の一
部分並びに、EcoRIおよびプラスミドpGL101（L.Guarent
e,G.Lauer,T.M.RobertsおよびM.Ptashne〔1980〕Cell第
20巻、543〜553頁）からのPvu IIサイトによつて、プレ
−プロレンニン分子（組換えflフアージ293−207および
293−118/37からの）をコード化する約1300個のヌクレ
オチドに融合した95ベース・ペアーの断片を含有してい
る。その配置は、ラクトースオペロンプロモーターが大
腸菌中でプレ−プロレンニン蛋白の発現を進行させるよ
うな具合になつている（図５参照）。
7. 大腸菌中のメチオニンプロレンニンの発現 プレ−プロレンニン遺伝子は、制限エンドヌクレアーゼ
Hha Iのための３つの容認サイト（GCGC〔表１参照〕を
認める）を含有し、それらの１つは“プレ”暗号配列を
除去し、プロレンニンのための配列からアラニンコドン
のための最初のヌクレオチドＧを取り去ったものを残
す。したがつて、我々はほとんど無傷の（完全な）プロ
レンニン遺伝子を表わす、この部分的なHha I消化生成
物を単離した。組換えフアージ293−118/37からのRFI2
本鎖DNA18μｇを制限Hind III（N.E.Biolabs）12単位
で、Buffer H 50μ中で、37℃で１時間切断した。レ
ンニンDNAを有する挿入物約1230bpを、冷凍／解凍法に
よる１％アガロース・ゲル上の適当な帯から該DNAを抽
出することにより精製した。このDNA約1.5μｇを、Buff
er P 30μ中でHha I（N.E.Biolabs）0.25単位と共に3
7℃で５分間インキユベーシヨンすることによつて、部
分的なHah I切断に付した。切断されていない断片プラ
ス293−118/37の開始点から約25個のヌクレオチドを欠
いている１個所切断された断片に相当するDNAを２％ア
ガロース・ゲル上の帯から単離した。プラスミドpBR322
DNA（10μｇ）を制限エンドヌクレアーゼHind II（N.E.
Biolabs、９単位）で、Buffer H 100μ中で、37℃で
１時間切断した。このDNAをフエノール抽出し、ついで
エタノール沈殿させた。DNA（すなわち部分的なHha I切
断293−118/37およびHind III切断pBR322）の各約0.5p
モルを結合させ、水28μに再溶解させ、ついでDNAポ
リメラーゼＩ（Boehringer/Mannheim,9単位）で、Buffe
r D（60mM Tris゜HCl（pH7.5）、80mM MgCl2、10mMジチ
オトレイトール、1mM ATPおよび各0.2mMデオキシヌクレ
オチド・トリフオスフエート）を含有する反応剤40μ
中で、10℃で10分間処理することによつて平滑末端とし
た。Xba I制限エンドヌクレアーゼ配列プラスATGGを有
する合成オリゴヌクレオチド（すなわち、CCATCTAGATG
G）を、コラボラテイブ・リサーチ社によるトリエステ
ル方法（K.Itakuraら、J.Biol.Chem.第250巻、4592頁
〔1975〕）によつて合成し、その５μｇをT4ポリヌクレ
オチドキナーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミカルズ）６単位を用
いて、Buffer Y（70mM Tris゜HCl（pH7.6）、10mM MgCl
2 10mM 2−メルカプトエタノールおよび2mM ATP）を含
有する反応剤25μ中で、α32−Ｐ−ATPでキナーゼ化
した。この５′−ラベル化オリゴヌクレオチドを、その
濃度を一定に保つための追加の緩衝液成分およびT4DNA
リガーゼ（N.E.Biolabs）600単位と一緒に平滑末端反応
剤40μに添加した。反応剤を14℃で一夜インキユベー
シヨンし、ついで180mM NaCl、7mM MgCl2および5mM Tri
s゜HCl（pH8）からなる溶液５容積で希釈した。65℃で
５分間加熱した後、そのDNAをXba I制限エンドヌクレア
ーゼ45単位で処理した（３時間の全消化時間に対して１
時間当り15単位を添加した）。最後に、オリゴヌクレオ
チド単量体を、バイオ・ゲルＡ−5mカラム（0.68×36c
m、上記参照）上でゲル過することによつて大きなDNA
から分離した。除外されたDNAをプールし、エタノール
沈殿させ、水12μに再溶解させ、Buffer LおよびT4DN
Aリガーゼ（N.E.Biolabs）300単位を含有する結合反応
剤中で、14℃で一夜インキユベーシヨンした。この結合
反応剤５μを、上記したようにCGE6株の細胞に転換能
を付与するために使用した。転換した細胞は、アンピシ
リン20μg/mlを含有するトリプトン平板上で平板にし、
コロニーを選択し、エトラサイクリン感受性をスクリー
ニングした。制限酵素消化（Xba IプラスKpn I）および
ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によるプラスミドDN
Aの分析は、所望のプラスミドpCGE181（すなわち、Xba
I−Kpn I断片を生ずる）を有する１個の株を示してい
た。
pCGE181DNA約５μｇをXba I（N.E.Biolabs,4単位）で37
℃で１時間、Buffer X（150mM NaCl、6mM Tris゜HCl（p
H7.9）、6mM MgCl2）を含有する反応剤50μ中で切断
する。フエノール抽出およびエタノール沈殿を行なつた
後、該DNAをT4DNAポリメラーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミカル
ズ、10単位）で、37℃で30分間、BufferTを含有する反
応剤50μ中で処理することによつて、その平滑末端と
する。再び、該DNAをフエノール抽出し、ついでエタノ
ール沈殿させる。ベクターDNAはプラスミドpGL101DNA
（L.GuarenteらCell第20巻543〜553頁〔1980〕）５μｇ
をPvu II（N.E.Biolabs,5単位）で、Buffer Pを含有す
る反応剤50μ中で切断することによつて作成される。
ついで、フエノール抽出およびエタノール沈殿を行なつ
た後、再溶解したDNAを、子牛の腸のアルカリ性フオス
フアターゼ（Boehringer/Mannheim）0.06単位で、37℃
で30分間、Buffer Cを含有する反応剤50μ中で処理す
ることによつてフオスフアターゼ化する。Pvu IIで切断
したベクター（0.2pモル）およびXba Iで切断したプロ
レンニンDNA断片（0.2pモル）を14℃で一夜Buffer Lを
含有する反応剤20μ中で互いに結合させる。CGE6株の
転換能を有する細胞は上記のようにして調製され、結合
反応剤５μで転換される。生成する細胞は、アンピシ
リン20μg/mlを含有するトリプトン寒天平板上で平板に
される。アンピシリン耐性コロニーを選択し、プラスミ
ドDNAを単離し、制限酵素消化およびアガロース・ゲル
電気泳動によつて分析する。ラクトースオペロンプロモ
ーターおよびプロレンニン蛋白が生体内で作られるよう
なリボゾーム結合サイトに結合したプロレンニンDNAを
有する株が見い出される（すなわち、プロレンニン配列
に添加されたATG開始コドンはラクトースオペロンリボ
ゾーム結合サイトからの９個のヌクレオチドである）。
我々は、プラスミドを担う細胞の溶解物（lysate）を、
ヨード化した真正の精製レンニンおよび抗レンニン血清
を用いる放射線免疫測定法に付すことによつて、合成さ
れたプロレンニンの量を決定する。プロレンニン生成物
の大きさはSDSを含有するポリアクリルアミド・ゲル上
の35S−メチオニンをラベルした細胞抽出物の免疫沈殿
の電気泳動によつて決定される。
8a. 大腸菌中のメチオニン−バリン−レンニンの発現 レンニンコード化配列のみを有するDNAを得るために、
組換えフアージ293−207からのRFIDNAをヌクレアーゼBa
l31で切除し、flフアージベクター中に結合させた。こ
の結合生成物をクローン化し、そして切除したレンニン
DNAのライブラリーを作成した。詳細には、293−207フ
アージRFIDNA8μｇをHind III（N.E.Biolabs）６単位
で、Buffer Hを含有する反応剤20μ中で、37℃で１時
間切断した。フエノールおよびエーテル抽出、およびエ
タノール沈殿を行なつた後、該DNAを水20μに再溶解
し、Bal31（N.E.Biolabs）1.25単位で、BufferBを含有
する反応剤50μ中で、30℃で30分間処理した。反応を
フエノール抽出およびエタノール沈殿によつて停止させ
た。大きさが500〜1000bpの範囲の、Bal31で切除したDN
A断片を、上記した冷凍／解凍技術によつて1.5％アガロ
ース・ゲルから単離した。切除したDNAは、DNAポリメラ
ーゼＩ（Boehringer/Mannheim,9単位）で、Buffer Dを
含有する反応剤40μ中で、10℃で10分間処理すること
によつて、その平滑末端とした。合成オリゴヌクレアー
ゼリンカー（詳細には、Hind III 8−mer CAAGCTTG;コ
ラボラテイブ・リサーチ社製、5.0μｇ）は、T4ポリヌ
クレオチドキナーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミカルズ）６単位
を用いて、Buffer Yを含有する反応剤25μ中で、32P
−ATPでキナーゼ化した。このラベルしたオリゴヌクレ
オチドを、その濃度を一定に保つための追加の緩衝液成
分およびT4DNAリガーゼ（N.E.Biolabs）600単位と一緒
に平滑末端反応剤40μに添加した。反応剤を14℃で一
夜インキユベーシヨンした。次に、反応剤を60mM NaCl
および7mM MgCl2の250μで５倍に希釈し、65℃で５分
間加熱した。反応混合物を冷却した後、Hind III制限エ
ンドヌクレアーゼ（N.E.Biolabs）45単位全部を、１時
間当り15単位づつ３回に分けて添加し、37℃で３時間イ
ンキユベーシヨンした。オリゴヌクレオチドリンカー単
量体を、バイオゲルＡ−5mカラム（0.68×36cm、BioRa
d）上でカラム緩衝液（10mM Tris゜HCl（pH7.5）、100m
M NaCl、1mM EDTA）中で溶離することによつて、該混合
物から除去した。除外されたピークをエタノール沈殿さ
せ、該DNA（約0.5pモル）を、Buffer L、T4DNAリガーゼ
（N.E.Biolabs）600単位および、Hind IIIで切断されか
つ上記方法によつてフオスフアターゼ化されていたフア
ージCGF4 RFI DNA（コラボラテイブ・ジエネテイツクス
社）約0.5pモルを含有する結合反応剤20μに添加し
た。14℃で18時間結合させた後、50mM Tris゜HCl（pH7.
6）中で４倍に希釈した反応混合物４μをCGE6株の細
胞に転換能を付与するために使用した。転換能付与およ
びプラークの平板化は前項４記載の方法と全く同じ方法
で行なつた。平板当り約500個のプラークが得られた。B
entonおよびDavisの方法（Science第196巻、180〜182頁
〔1977〕）による。プラスミドpBR322上に含有される刻
み目翻訳された（nick−translaed）プレ−プロレンニ
ンDNA（P.W.J.Rigbyらの方法〔1977〕J.Mol.Biol.第113
巻237〜251頁）を使用するプロービング（probing）は
レンニンDNAを含有するプラーク約15％を示していた。
これらの約250個を取り、トリプトンブイヨン中に４℃
で貯蔵した。制限酵素による消化およびアガロースゲル
の電気泳動によるこれらのいくつかの組換えフアージか
らのDNAの分析は、挿入された配列の５′末端がレンニ
ンコード化配列の開始点（すなわち、表１に示された配
列中のヌクレオチド379）に近づくようにプレ−プロレ
ンニンDNAからBal31で切除したDNAを有するいくつかの
フアージを示している。１本鎖組換えflフアージDNAを
これらのフアージから次のようにして単離した。最初
に、フアージの平板ストツクを、CGE5の一夜培養物0.4m
lをプラークから採取したフアージ50μで感染させる
ことによつて調製する。これを0.7％ソフト寒天7ml中の
トリプトン寒天平板上に移す。フアージを、一夜生育後
にトリプトンブイヨン12mlを該平板に添加しかつ２時間
インキユベーシヨンすることによつて溶離する。ついで
そのブイヨン3mlをポリエチレングリコール/NaCl溶液
（25％PEGおよび2.5M NaCl）0.6mlで沈殿させ、４℃で
１時間貯蔵する（K.R.Yamamotoら、Virology第40巻734
〜744頁〔1970〕）。遠心分離した後、そのフアージをB
uffer TEN（10mM Tris゜HCl（pH8）、10mM NaCl、0.5mM
EDTA）0.3ml中に再懸濁する。ついでフアージをPEG/Na
Cl溶液30μで沈殿させ、４℃で１時間インキユベーシ
ヨンし、遠心分離する。フアージをBuffer TEN50μに
再懸濁させ、１％SDS5.5μを各試験管に添加する。55
℃で10分間インキユベーシヨンした後、TEN200μを添
加し、溶液をフエノール抽出し、エーテル抽出し、エタ
ノール沈殿を行なう。組換えflフアージ中の挿入dnaの
配列は、Sahgerの方法（F.Sangerら、Mol.Biol.第143
巻、161〜178頁〔1980〕）により、合成オリゴヌクレオ
チドプライマー（TTGACGGGGAAAG配列を有する“ユニバ
ーサルプライマー”、コラボラテイブリサーチ社、マサ
チユセツツ州ウオルサム市）を用いて決定される。fl中
でクローン化された、Bal31で切除した挿入物のコレク
シヨンから、少なくとも１個のフアージが見い出され、
（293−207−101）と呼ばれるが、これはヌクレオチド3
79のところで（すなわち、成熟したレンニンのＮ末端ア
ミノ酸であるグリシンのためのコドンのところで）レン
ニンの５′末端に融合したHind IIIリンカーを有する。
フアージ293−207−101のRFI DNA（５μｇ）をHind III
（４単位、N.E.Biolabs）で、37℃で１時間、BufferHを
含有する反応剤50μ中で消化させる。フエノール抽出
およびエタノール沈殿を行なつた後、そのDNAを水20μ
に再溶解させ、ヌクレアーゼSl（Boehringer/Mannhei
m）10単位で、37℃で10分間、Buffers S（前項２参照）
を含有する反応剤50μ中で処理する。このDNAを再び
フエノール抽出し、ついでエタノール沈殿させる。次
に、合成オリゴヌクレオチドリンカー（CCATCTAGATGG配
列を有する、５μｇ、コラボラテイブ・リサーチ社）
を、Buffer Yを含有する反応剤25μ中でT4ポリヌクレ
オチドキナーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミカルズ）６単位を用
いてα−32P−ATPでキナーゼ化する。このキナーゼ化し
たオリゴヌクレオチドを、Slで処理し（上記参照）かつ
冷凍／解凍法によりアガロース・ゲルから精製しておい
たHind III結合挿入物上に結合させる。結合混合物はHi
nd III結合Sl処理レンニンDNA0.8pモル、キナーゼ化合
成リンカー100pモルおよびT4DNAリガーゼ（N.E.Biolab
s）600単位をBuffer L 20μ中に含有する。14℃で18
時間インキユベーシヨンする。反応剤を180mM NaCl、7m
M MgCl2および5mM Tris゜HCl（pH8）の溶液100μで６
倍に希釈する。65℃で５分間加熱した後、制限エンドヌ
クレアーゼXba I（N.E.Biolabs）45単位を、37℃で３時
間インキユベーシヨンする間に各15単位づつ３回に分け
て添加する。オリゴヌクレオチド単量体を、バイオゲル
Ａ−5mカラム（0.68×36cm）上でカラム緩衝液（上記参
照）中で過することによつて大きなDNAから分離す
る。除去されたDNAをエタノール沈殿させ、Buffer T 50
μ中のT4DNAポリメラーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミカル
ズ、10単位）処理に付してそのXba−切断末端を平滑に
する。フエノール抽出およびエタノール沈澱を行なつた
後、そのDNAを、Buffer R（100mM Tris゜HCl（pH7.
5）、50mM NaCl、5mM MgCl2）を含有する反応剤50μ
中で、37℃で１時間、EcoRI（N.E.Biolabs、４単位）消
化処理に付す。レンニン断片（約350bp）が２％アガロ
ース・ゲルから単離される。フアージ293−118/37RFI D
NA（５μ）をHind III（N.E.Biolabs,4単位）で、37
℃で１時間、Buffer Hを含有する反応剤50μ中で切断
する。フエノール抽出およびエタノール沈殿を行なつた
後、そのDNAを37℃で30分間、T4DNAポリメラーゼ（Ｐ−
Ｌバイオケミカルズ、10単位）を用いて、Buffer T50μ
中で平滑末端にする。次に、さらにもう１回フエノー
ル抽出およびエタノール沈澱を行なつた後、そのDNAをE
coRI（N.E.Biolabs、４単位）で、37℃で１時間、Buffe
r Rを含有する反応剤50μ中で切断する。フアージ293
−118/37からのEcoRIからHind III（平滑）DNA断片（約
660bp）は、２％アガロース・ゲルから単離される。プ
ラスミドpGL101からのプラスミドDNA（５μｇ）をPvu I
I（N.E.Biolabs、４単位）で、37℃で１時間、Buffer P
50μ中で切断し、ついでそのDNAをフエノール抽出
し、エタノール沈殿させる。牛の腸のアルカリ性フオス
フアターゼ（0.1単位、Boehringer/Mannheim）を用いて
Buffer C 50μ中で処理した後、そのDNAを再びフエノ
ール抽出し、エタノール沈殿させる。結合反応は、14℃
で18時間、リンカード（linkered）−レンニンDNA（ヌ
クレオチド379〜731）0.2pモル、フアージ293−118/37
からのレンニンDNA（ヌクレオチド732〜1456）0.2pモル
およびPvu IIで切断したpGL101 0.2pモルを使用して、T
4DNAリガーゼ（N.E.Biolabs）300単位を用いるBuffer20
μ中で行なわれる。Ca++で処理したCGE4細胞（上記参
照）100μを変形するために、反応剤５μを使用す
る。アンピシリン20μg/mlを含有するトリプトン平板か
ら採取したいくつかのアンピシリン耐性コロニーからの
プラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼによる分析
は、ラクトースオペロンプロモーターを発現するように
適当に配置されたレンニン配列を担うプラスミドpCGE18
8を含有する１つのコロニーを示している。
我々は、プラスミドを有する細胞の溶解物（lysate）
を、ヨード化された真正の精製レンニンおよび抗レンニ
ン血清を用いる放射線免疫測定法に付すことによつて、
合成されたレンニンの量を決定する。レンニン生成物の
大きさは、35S−メチオニンでラベルした細胞抽出物の
免疫沈殿をSDS含有ポリアクリルアミドゲル上で電気泳
動することによつて決定される。
加えて、大腸菌細胞中に存在する活性レンニンの量は、
標準乳汁凝固分析（B.Foltmann,Methods in Enzymology
第19巻、421〜436頁〔1970〕）の修正ミクロスケール版
を用いて測定される。
8b. 大腸菌中のメチオニン−レンニンＡの発現 開始コドンATGによつて直前に先行され、かつラクトー
ス オペロン プロモーターの制御下にあるレンニンＡ
遺伝子のヌクレオチド配列を含有するプラスミドは以下
のとおり作成される。この作成は、最終生成物を生成さ
せるための順次的な組換えにおいて用いられる３個の別
々のプラスイミドの創製を必要とする。
作成すべき最初のプラスミドはレンニン遺伝子の最初の
約350個のヌクレオチドにすぐ接して先行する開始コド
ンATGを含有するものである。２本鎖組換えflフアージ2
93−118/37DNA（200μｇ）を制限エンドヌクレアーゼPs
t I（N.E.Biolabs、20単位）で、37℃で150分間、Buffe
r Pを含有する反応剤100μ中で消化させた。Tris゜HC
l（pH7.5）11μおよびEcoRI（Boehringer/Mannheim、
80単位／μ）を添加し、該消化を37℃でさらに60分間
続けた。制限反応を200mM EDTAの1/10容積を添加するこ
とによつて終了させ、DNA制限断片を、Tris゜アセテー
ト（pH8.3）40mMを含有する0.6％アガロースゲル中でア
ガロースゲル電気泳動を行なうことによつて分離した。
ゲルを臭化エチジウム（0.5μg/ml）で染色し、所望の4
00bp帯を含有する部分を長波長紫外線下で可視化し、切
り取つた。DNAを冷凍−解凍法によつてゲルから分離
し、エタノール沈殿させた。DNAを水に再溶解させ、制
限エンドヌクレアーゼMspI（N.E.Biolabs、30単位）
で、37℃で１時間、10mM Tris゜HCl（pH7.4）、10mM Mg
Cl2、6mM KClおよび1mMジチオトレイトールを含有する
反応剤50μ中で消化させた。この反応によつて、レン
ニン遺伝子の開始点付近の配列 ５′CGCG TTC ▲▼GAG…… CG AAG CCC CTC……５′ を含有する断片が生成した（レンニン遺伝子配列の最初
のコドンに印を付けるが、これは表１中のヌクレオチド
379〜381を示すものである）。フエノール抽出、エーテ
ル抽出およびエタノール沈殿を行なつた後、この断片お
よびMspI消化によつて生成した２個の小さな断片を大腸
菌DNAポリメラーゼＩ（Boehringer/Mannheim、３単位）
のKlenow断片で、37℃で15分間、0.05mMデオキシアデノ
シントリフオスフエート、6.6mM Tris゜HCl（pH7.5）6.
6mM NaCl、6.6mM MgCl2および6.6mMジチオトレイトール
を含有する反応剤42μ中で処理した。この反応は上記
の配列からの２個のヌクレオチドの形を整えて ５′CGGC TTC ▲▼ GAG…… AAG CCC CTC……５′ を生成させた。フエノール抽出およびエーテル抽出を行
なつた後、デオキシアデノシントリフオスフエートを、
200mMスペルミン0.5μを添加することによつて高分子
量の種類から分離し、氷上で15分間インキユベーシヨン
し、４℃のミクロ遠心分離機中で10分間遠心分離し、生
成したペレツトを75％エタノールの存在下に４℃で２回
（各５分間）遠心分離した。スペルミンを75％エタノー
ル1ml、0.3M酢酸ナトリウムおよび10mM酢酸マグネシウ
ムの添加によつて除去し、氷上で１時間インキユベーシ
ヨンし、上記と同様に遠心分離した。
大腸菌DNAポリメラーゼのKlenow断片によるDNAの第２の
処理は、0.05mMデオキシシチジントリフオスフエートを
前の反応の0.05mMデオキシアデノシントリフオスフエー
トの代りに用いることを除いて、上記と同様に行なわれ
た。この方法によつて、レンニン遺伝子の開始点付近の
の配列 ５′C GGC TTC ▲▼ GAG…… CCC CTC……５′ を有する断片が生成した。フエノール抽出、エーテル沈
殿、およびエタノール沈殿を行なつた後、DNAを水に再
溶解させ、slヌクレアーゼ（Boehninger/Mannheim、100
単位）で、室温で30分間、Buffer Sを含有する反応剤50
μ中で処理した。この酵素は配列 ５′ ▲▼ GAG…… CCC CTC……５′ を残すため前記断片から、５′１本鎖DNAを除去した。
それ故、レンニン配列の開始点はDNA断片の５′末端の
ところである。Cla I制限サイト、およびヌクレオチドA
TGを有する末端を含有する合成オリゴヌクレオチド（す
なわち、CATCGATG、コラボラテイブ・リサーチ社、５μ
ｇ）をT4ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミ
カルズ、３単位）を用いて、37℃で30分間、Buffer Yを
含有する反応剤25μ中で、α32P−ATPでキナーゼ化し
た。このキナーゼ化リンカー（約200pモル）を、T4DNA
リガーゼ（N.E.Biolabs、900単位）で15℃で一夜Buffel
L中でインキユベーシヨンすることによつて、処理済み
DNA断片に結合させた。反応は65℃で５分間加熱するこ
とによつて終了させた。10×Cla I緩衝液（１×＝10mM
Tris゜HCl（pH8）10mM MgCl2）４μ、および制限エン
ドヌクレアーゼCla I（Boehringer/Mannheim、27単位）
を添加した。生成した混合物を37℃で１時間インキユベ
ーシヨンした。ポリアクリルアミドゲル上で分析するた
めに４μを除去し、10×Cla I緩衝液１μ、Cla I酵
素10μ、および水３μを添加した。この混合物をさ
らに１時間インキユベーシヨンした。所望のレンニン配
列を含有する処理済みDNAを、40mM Tris゜アセテート緩
衝液（pH8.3）を含有する２％アガロース・ゲル中で分
離することによつて精製した。DNAを長波長紫外線によ
つて可視化し、上記の冷凍−解凍法によつてゲルから除
去した。ついで、この断片を適当なベクターへの挿入に
供した。
ベクターDNAの作成は、Cla I緩衝液を含有する反応剤30
μ中で37℃で１時間Cla Iエンドヌクレアーゼ（Boehr
inger/Mannheim）5.4単位でpBR322DNA3.3μｇを消化す
ることによつて開始された。フエノール抽出、エーテル
抽出、およびエタノール沈殿を行なつた後、ベクターDN
Aを子牛の腸のフオスフアターゼ（Boehringer/Mannhei
m）0.06単位で、37℃で15分間、Buffer C中で処理し
た。フェノール抽出、エーテル抽出、およびエタノール
沈殿を行なつた後、ベクターDNA約1pモルを上記のよう
にレンニン断片DNA2pモルと混合した。これら２個のDNA
断片をBuffer Lを含有する反応剤29μおよびT4DNAリ
ガーゼ（N.E.Biolabs、450単位）中で互いに結合させ
た。大腸菌CGE43株（Ｆ−Ｖ）（lac−pro）XIII、またL
G90株として公知）の転換能を有する細胞を前項４記載
の方法により調製し、結合したDNAで転換した。平板上
で選択されたアンピシリン耐性コロニーを採取し、プラ
スミドDNAを制限酵素の消化によつて分析した。これら
のプラスミドの配列部分にとつて、レンニン遺伝子配列 ▲▼ GAG…… の開始点に隣接したリンカー配列、CATCGATGを含有する
正しい構造を得ることを保証することが必要である。pC
GE301と呼ばれる、所望の正しい配列を有するプラスミ
ドを次に、大腸菌中でメチオニン−レンニンの発現を指
令する最後のプラスミドを作成するために、以下に記載
された他の２個のプラスミドと組み合せて使用する。
この構造に必要とされる３個のプラスミドの第２番目の
ものを生じさせるには、組換えフアージ293−118/37
２本鎖DNAのレンニン含有Hind III断片のサブクローニ
ングが必要である。２本鎖flフアージ293−118/37DNA3
μｇを制限エンドヌクレアーゼHind III（N.E.Biolab
s、３単位）で、37℃で１時間、BufferHおよび7mM2−メ
ルカプトエタノールを含有する反応剤10μ中で消化し
た。Hinc II（N.E.Biolabs、３単位）４μを添加し、
混合物を37℃でさらに１時間インキユベーシヨンした。
フエノール抽出、エーテル抽出、およびエタノール沈殿
を行なつた後、このDNA約1.5μｇをpBR322DNA（Hind II
Iおよび上記の牛の腸のアルカリ性フオスフアターゼで
予め処理されたもの）約１μｇとし混合した。２個のDN
A断片を、16℃で一夜、Buffer LおよびT4DNAリガーゼ
（N.E.Biolabs、600単位）を含有する反応剤20μ中で
互いに結合させた。この混合物５μを、大腸菌CGE6株
の細胞を転換させるために使用し、ついでアンピシリン
耐性コロニーを上記の方法で単離した。制限酵素による
切断およびアガロース・ゲルの電気泳動によつて、生成
プラスミドpCGE302はpBR322のHind IIIサイトに挿入さ
れたフアージ293−118/37からのプロレンニン遺伝子配
列から成ることが明らかになつた。
レンニンを生産するプラスミドの構造に必要な型の第３
成分、pGL101（L.Guarente,G.Lauer,T.M.Robertsおよび
M.Ptashne〔1980〕、上記参照）DNAを制限エンドヌクレ
アーゼPvu II（N.E.Biolabs、５単位）で、37℃で１時
間、Buffer Hおよび10mM2−メルカプトエタノールを含
有する反応剤20μ中で消化することを必要とした。フ
エノール抽出、エーテル抽出、およびエタノール沈殿を
行なつた後、DNAをキナーゼ化合成オリゴヌクレオチド
（CATCGATC,コラボラテイブ・リサーチ社、約200pモ
ル）と混合し、T4DNAリガーゼ（N.E.Biolabs、900単
位）で、16℃で一夜、Buffel Lを含有する反応剤30μ
中で結合させた。反応は65℃で５分間処理することによ
つて終了させた。大腸菌CGE43株のCaCl2処理細胞を転換
させるために、この混合物５μを使用した。プラスミ
ドDNAをいくつかの転換株から作成し、ついでPvu IIサ
イトがCla Iサイトに転化されることを除いてプラスミ
ドpGL101と同一である所望のプラスミドpCGE303を同定
するために、制限酵素による消化およびアガロース・ゲ
ルの電気泳動に付した。
ラクトース・オペロン・プロモーターの翻訳制御下にあ
るATG−レンニン配列を含有する最後のプラスミドの作
成は、上記した３個のプラスミドの試験管内の組換えを
包含し、理論的には以下のように要約される。プラスミ
ドpCGE301を制限エンドヌクレアーゼKpl IおよびHind I
IIで消化し、生成する断片を子牛の腸のアルカリ性フオ
スフアターゼで処理する。プラスミドpCGE302を制限エ
ンド・ヌクレアーゼKpn I,Hind IIIおよびBgl IIで消化
する。ついで、これら２つの処理から生じた断片を混合
し、結合させる。このDNAを、大腸菌CGE43を転換させる
ために使用する。主要なアンピシリン耐性プラスミド生
成物は、全レンニンコード化配列に結合したATGを含有
するpCGE304である。
ついで、プラスミドpCGE303を制限エンドヌクレアーゼP
st IおよびCla Iで消化させ、子牛の腸のアルカリ性フ
オスフアターゼで処理する。プラスミドpCGE304はまたP
st IおよびCla Iで消化させる。これら２つの処理から
生成したDNA断片を互いに混合し、結合させ、CGE43株を
転換させるために使用する。転換細胞から得られるアン
ピシリン耐性プラスミドを大きさ、制限酵素による消
化、およびDNA配列によつて分析し、ラクトースオペロ
ンプロモーターの翻訳制御下でATGレンニン配列を有す
る、所望のプラスミドpCGE305を見い出す。このプラス
ミドは、大腸菌中に存在するとき、メチオニン−レンニ
ンの合成を指令する。
9. サツカロミセス・セレビシエー中でプレ−プロレン
ニン、プロレンニン、およびレンニンの発現を得る方法 これら３つの種類、プレ−プロレンニン、メチオニン−
プロレンニンおよびメチオニン−バリン−レンニンは、
S.セレビシエーウラシル３遺伝子からのプロモーターお
よび他の転写および翻訳制御領域を用いてS.セレビシエ
ー中で発現される。酵母ウラシル３遺伝子を、β−ガラ
クトシダーゼまたはlacZ遺伝子の一部削除翻訳文（その
５′末端から22bpを抜かしている）がura3遺伝子（その
３′末端から約900bpを抜かしている）の断片の３′末
端に結合しているような形で、プラスミド（選択され、
かつ酵母または大腸菌中に保持されることができるシヤ
トル（shuttle）ベクター）上に置いた。これは、M.Ros
e,M.J.Casadaban,およびD.B.BotsteinによつてProc.Na
t.Acad.Sci.USA,第78巻、2460〜2464頁（1981）に報告
されたクラスIII削除部分＃35である。このプラスミド
に関しては、酵母中のβ−ガラクトシダーゼ活性の発現
はウラシル３遺伝子制御領域の制御下にある。我々は、
S.セレビシエー中のプレ−プロレンニン、メチオニン−
プロレンニン、およびメチオニン−バリン−レンニンの
発現を得るために、この削除部分＃35を以下のとおり使
用する。
最初に、ウラシル３コード化配列のより完全な削除部分
は、削除部分＃35からの閉鎖したDNAをura3−lacZ連結
点で切断する制限エンドヌクレアーゼBamH Iで切断する
ことによつて得られる。このDNAを、平均200bpが除去さ
れるようなヌクレアーゼBal31で切除する。次に、BamH
I合成オリゴヌクレオチドリンカー（CRI）をその末端に
結合させ、該DNAを互いに結合させ、その結果、プラス
ミドの集団はBamH Iサイトと共にウラシル制御領域から
種々の距離で存在する。制限酵素で切断された精製プラ
スミドDNAのゲル電気泳動は、非常に小さいura3コード
化配列を含有するプラスミドpCGS210を示している。Max
amおよびGilbertの方法によるBamH Iサイトからの配列
化はこのことを立証している。そのように好適な、Bal
で切除したクローン化プラスミドからのDNAを精製す
る。このDNAは大腸菌（アンピシリン耐性）および酵母
〔Leu2基本栄養（Prototrophy）〕を選択し得る標識
（マーカー）、大腸菌および酵母の複製開始点であり、
これらのすべてはプラスミドpRB45（M.Rose,M.J.Casada
ban,D.Botstein,上記参照）、およびura3コード化材料
の50個未満のヌクレオチドを有するura3制御領域であ
る。特に、pCGS210と呼ばれる、これらのプラスミドの
一つは、MaxamおよびGlbertの方法によるDNA配列化によ
つて決定されるように、ura3コード化材料のヌクレオチ
ドをわずか10〜20個有するだけである。
プレ−プロレンニン、プロレンニンおよびレンニンの
５′末端に対するDNAコード化は次のようにして得られ
る。ATG翻訳開始コドン、およびATGの５′へ20個未満の
ヌクレオチドを含有するプレ−プロレンニン遺伝子のた
めのDNAコード化は、前項８記載のBal31で切除して調製
されるレンニンDNAを得るためのflフアージバンク（ban
k）から、それらのフアージを制限酵素とゲル電気泳動
を併用してスクリーニングすること並びにSanger法（F.
SangerらJ.Mol.Biol.第143巻、161〜178頁〔1981〕）に
より配列化することによつて得られる。ATG翻訳開始コ
ドンを有するプロレンニンのためのDNAコード化は、前
項７記載のプラスミドpCGE181から得られる。翻訳開始
のためのATGコドンおよびGTGバリンコドン（フアージ29
3−207−101）を有するレンニンのためのDNAコード化は
前項8a記載のレンニンDNA−flフアージバンク（bank）
から得られ、またはメチオニン−レンニンのためのDNA
コード化は前項8b記載のプラスミドpCGE304から得られ
る。
これらの各DNA断片の酵母中の発現を獲得するために、
次の実験が行なわれる。プレ−プロレンニン、メチオニ
ン−プロレンニン、メチオニン−バリン・レンニンまた
はメチオニン−レンニンのためのDNAコーデイングを上
記した適当なフアージまたはプラスミドのうちから切断
する。その断片をさらにSma Iで切断し、レンニンの形
に対する所望のコーデイング断片をゲル電気泳動によつ
て精製する。同様に、大腸菌からの′ZYA断片のためのD
NAコーデイングのBamH I（平滑）−Sal I断片（その
５′末端から22bpを抜かしているβ−ガラクトシダーゼ
のための遺伝子およびラクトース・パーミアーゼ（perm
ease）およびラクトーストランスアセチラーゼのための
遺伝子）をpRB45（M.Rose,M.J.Casadaban,およびD.Bots
tein〔1981〕、上記参照）から単離する。次に、上記の
プラスミドpCGS210を唯一のBamH Iサイトのところで切
断し、Bal31ヌクレアーゼで短かい距離だけ切除し（す
なわち、L.Guarente,G.Lauer,M.Ptashen〔1980〕上記参
照、の条件を使用する）、それによつて全ての残留ura3
コード化配列を除去するが制御配列を除去しないだけの
DNAを失つた断片を生成させる。このDNAをまたSal Iで
切断し、ついで最大の断片をゲル精製する。３分子結合
反応を、このベクター断片（fragment）プラスpRB45か
らのSal I−BamH I（平滑）断片プラスSma Iで切断さ
れ、ゲル精製されたプレ−プロレンニン、メチオニン−
プロレンニン、メチオニン−バリン−レンニンDNAのい
ずれかを用いて行なう。この結合反応物の一部分を、大
腸菌CGE4株を転換させるために使用し、Macconkeyラク
トース上の赤色のコロニーおよびアンピシリン平板を採
取する。プラスミドDNAの単離および制限酵素による分
析は所望のプラスミドの構造を確認する。酵母CGY80株
（下記参照）中への転換、ロイシン原栄養系（prototro
phy）の選択、および最少培地にウラシル（過剰量、ま
たは限定量）とロイシンとＸ−gal（５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド、Bach
em,カリフオルニア州）とを加えた培地上の青色のスク
リーニングは、該プラスミドがウラシル制御下に適当な
レンニン−β−ガラクトシダーゼ融合蛋白の翻訳を指令
することを示している。最後に、所望のプラスミドのβ
−ガラクトシダーゼコード化部分を、該プラスミドをBa
l IIおよびSal Iで切断し、ついで最大の断片をゲル精
製することによつて除去する。この断片をフアージ293
−118/37からのBgl II−Hind III（これは合成オリゴヌ
クレオチドリンカー.CRIでSal Iサイトに転化されてい
る。）断片に結合させ、それによつて完全なプレ−プロ
レンニン、プロレンニンまたはレンニン遺伝子を再生す
る。これらのプラスミドは酵母S.セレビシエー中でプレ
−プロレンニン、メチオニン−プロレンニン、メチオニ
ン−バリン−レンニンまたはメチオニン−レンニンの翻
訳を指令する。
10. 酵母中のプロレンニン融合蛋白の発現 ura3コード化材料のわずか11個のヌクレオチドだけが、
BamH Iサイトの前に残留していることを除いて上記（お
よびM.Rose,M.J.CasadabanおよびD.Botstein,1981、Pro
c.Nat.Acad.Sci.USA第78巻、2460〜2464頁に記載）の削
除部分＃35およびラクトースオペロンZYA遺伝子材料に
類似しているプラスミドpRB71（M.RoseおよびD.Botstei
n,公表するために提出された。）の調製された有用性の
ために、我々は、融合蛋白がS.セレビシエー中で合成さ
れるようなura3−コード化材料の11個のヌクレオチドに
融合したプロレンニンのための遺伝子を有するプラスミ
ドpCGS28を作成した。この融合蛋白は、プロレンニンの
最初の４個のアミノ酸がメチオニン−セリン−リジン−
アラニンによつて置き替えられていることを除いて、真
正のプロレンニン分子から成る。レンニンを生成させる
ための活性化はプロレンニンの最初の42個のアミノ酸の
損失をもたらし、その結果これらの最初の４個のアミノ
酸は最終のレンニン生成物に何ら影響を及ぼさない。こ
のプラスミドの構造の詳細は以下に記載されている。
酵母中のプロレンニンの発現を効率よく得るために、ur
a3遺伝子プロモーター領域を使用した。このDNA配列は
クローン化されており、プラスミドに関して有効である
（M.Rose,M.J.CasadabanおよびD.Botstejn,1981,Proc.N
at.Acad.Sci.USA第78巻、2460〜2464頁）。M.Roseから
得られるプラスミドpRB71は、ura3プロモーター領域、
および最初の22個のヌクレオチドを抜かしているlacZ遺
伝子の断片に結合したウラシル３遺伝子の11個のヌクレ
オチドを有する。２個の不完全な遺伝子の間の結合点は
BamH I制限エンドヌクレアーゼサイトである。このプラ
スミドはまた、M.Roseら（上記参照）によつて記載され
たように、酵母のプラスミド２μｍ、酵母からのleu2遺
伝子、および複製開始点プラスpBR322からのアンピシリ
ン耐性遺伝子を含有する。こうして、該プラスミドを生
育させることができ、その存在は大腸菌またはＳセレビ
シエーのいずれかの中で選択することができる。
酵母中のプロレンニン結合蛋白（すなわち、ura3遺伝子
の最初の11個のヌクレオチドに融合され、かつura3プロ
モーターによつて制御されている。）の発現を得るため
に、２つの基本的なプラスミド構造を発生させた。最初
の構造は、酵母中に配置されたとき活性なβ−ガラクト
シダーゼ融合蛋白を生ずるura3−プロレンニン−lacZ融
合であり、これはura3プロモーターが所望の融合遺伝子
の転写を指令していることを示している。第２の構造
は、lacZ部分をプロレンニンの残りで置換したものであ
り、ura3遺伝子によつて特徴づけられた４個のアミノ酸
を有するプロレンニン分子を生成させる酵母細胞中に生
じる。
最初の構造において、プロレンニン遺伝子の５′部分
は、ura3、プロレンニン、およびlacZがすべて同一の翻
訳解読フレーム中にあるようなBamH Iサイト中に挿入さ
れる。これは次のように行なわれる。完全なプロレンニ
ン遺伝子を有する２本鎖組換えflフアージ293−118/37D
NA（12μｇ）を、Sma I制限エンドヌクレアーゼ（N.E.B
iolabs）７単位で、37℃で２時間、20mM KCl 6mM Tris
゜HCl（pH8）6mM MgCl2および6mM 2−メルカプトエタノ
ールを含有する反応剤50μ中で切断した。そのDNAを
フエノール抽出し、エーテル抽出し、ついでエタノール
沈殿させた。次に、前項７記載のT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いてその５′末端のところでリン酸化してお
いた、BamH I合成オリゴヌクレオチドリンカー（CRI、C
CGGATCCGG）250pモルを14℃で一夜、Buffer DおよびT4D
NAリガーゼ（N.E.Biolabs）を含有する反応剤40μ中
で、BamH Iで切断したフアージDNAに結合させた。結合
に続いて、反応剤を180mM NaCl、7mM MgCl2および5mM T
ris゜HCl（pH8）を含有する緩衝液５容積で希釈し、65
℃で５分間加熱し、氷上で冷却し、１時間当りBamH Iエ
ンドヌクレアーゼ15単位づつを添加して３時間の消化に
付した。フエノール抽出、エーテル抽出、およびエタノ
ール沈殿を行なつた後、DNAを水に再溶解させ、２％ア
ガロース・ゲル中で電気泳動に付した。DNAを、凍つた
ゲル断片をふやかし残留した液を集めること（冷凍−解
凍法）によつてBamH I−SmaI（BamH I−linkered）断片
約440bpに相当する帯から溶離した。DNA断片をエタノー
ル沈殿させ、水６μに再溶解させた。プラスミドpRB7
1DNA約５μｇをBamH Iエンドヌクレアーゼ（N.E.Biolab
s）20単位で、37℃で２時間Buffer Xおよび6mM2−メル
カプトエタノールを含有する反応剤50μ中で消化させ
た。フエノール抽出、エーテル抽出、およびエタノール
沈殿を行なつた後、DNAを水20μに再溶解させ、子牛
の腸のアルカリ性フオスフアターゼ（Boehringer/Mannh
eim）0.1単位で、37℃で30分間Buffer Cを含有する反応
剤50μ中で処理した。フエノール抽出し、エタノール
沈殿させた後、DNAを水６μに再溶解させ、BamH I−S
amI（BamH I−linkered）断片６μを含有する結合反
応剤に添加した。結合反応はT4DNAリガーゼ（N.E.Biola
bs）600単位で、14℃で一夜bufferL20μ中で行なわれ
た。大腸菌CGE6株の細胞を結合DNAで転換させ、アンピ
シリン耐性転換株を上記のようにして得た。約200個の
転換株を、M.GrunsteinおよびD.S.Hognessのコロニー雑
種化法（1975,Proc.Nat.Acad.sci.USA第72巻,3961〜396
5頁）によつて、プローブ（probe）としてα−32Pをラ
ベルした。刻み目（nick）翻訳された組換えフアージ29
3−207DNAを用いて試験した。ほとんど20％の転換株が
この規準によるレンニン配列を含有していた。プラスミ
ドDNAを10個の転換株から作成し、挿入物の配置をPst I
エンドヌクレアーゼによる消化によつて生成した断片の
パターンから決定した。正しい配置中にプロレンニン断
片を含有していたプラスミドpCGS16の１つを、A.Hinne
n,J.B.HicksおよびG.Finkの報告書（1978,Proc.Nat.Aca
d,Sci.USA第75巻1929〜1933頁）に従つて、S.セレビシ
エーCGY80株（NATa,leu2−3,leu2−112,his3,trpl−28
9,ura3−52）を転換させるために使用した。プラスミド
上のleu2遺伝子の存在によりロイシンを添加せずに生育
することのできる酵母転換株を、発色性の基質Ｘ−gal
（正確にはM.Roseらにより上記のとおり記載されたも
の）を含有し、かつウラシル、トリプトフアンおよびヒ
スチジンで補足された最少培地の平板上にストリーキン
グした。試験されたすべての転換はＸ−gal最少培地上
に青色のコロニーを生じさせ、β−ガラクトシダーゼが
生産されることを示していた。このことは、ura3−プロ
レンニン−lacZ融合蛋白が生産され、かつ各３つの蛋白
断片のための翻訳解読フレームが同一であることを意味
するものである。
この結果は、同一のプラスミドがもしβ−ガラクトシダ
ーゼ配列がプロレンニン遺伝子の残りで置換されるなら
ば、ura3−プロレンニン融合蛋白の発現を指令すること
を示唆していた。それ故、プラスミドpCGS16 8μｇをBg
l II制限エンドヌクレアーゼ（N.E.Biolabs）で、37℃
で１時間、Buller P80μ中で消化させた。次に、1M N
aCl10μおよび水６μを反応剤に添加し、DNAをさら
にSal Iエンドヌクレアーゼ16単位で、37℃で１時間消
化させた。フエノール抽出、エーテル抽出、およびエタ
ノール沈殿を行なつた後、DNAを子牛の腸のアルカリ性
フオスフアターゼ（Boehringer/Mannheim）0.06単位
で、37℃で15分間、BufferCを含有する反応剤50μ中
で処理した。反応はDNAのフエノール抽出およびエタノ
ール沈澱によつて終了させた。
一方、組換えflフアージ293−118/372本鎖DNA約15μｇ
をHind III（N.E.Biolabs）12単位で、37℃で２時間、B
uffer H 100μ中で切断した。フエノールおよびエー
テル抽出、およびエタノール沈澱を行なつた後、DNA
（６μｇ）を大腸菌DNAポリメラーゼ（Boehringer/Mann
heim）10単位で、10℃で10分間、Buffer D 40μ中で
処理することによつて平滑未端とした。次に、上記のよ
うにT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化して
おいたSal I合成オリゴヌクレオチドリンカー（CRI,GGT
CGACC）250pモルを、全ての成分の濃度を一定に保つの
に十分な緩衝液成分と一緒に添加した。リンカーを、T4
DNAリガーゼ（N.E.Biolabs）900単位で14℃で一夜イン
キュベーシヨンすることによつて該DNA上に結合させ
た。次に、10mM Tris゜HCl（pH8）、10mM MgCl2および
180mM NaClから成る緩衝液５容積を添加し、溶液を65
℃で５分間加熱し、氷上で冷却し、ついでSal I制限エ
ンドヌクレアーゼ（N.E.Biolabs）を１時間当り20単位
づつ添加して、37℃で５時間インキュベーシヨンした。
DNAをフエノール抽出し、エーテル抽出し、エタノール
沈澱させた後、それを水20μに再溶解させ、Bgl II
（N.E.Biolabs）５単位で、37℃で１時間、Buffer Pを
含有する反応剤30μ中で消化させた。ついで反応を20
0mM EDTA 1/10容積で終了させ、２％アガロースゲルに
かけた。Bal II−Hind III（SalI−linkered）断片約10
00bpに相当する帯を切り取り、DNAを上記の冷凍−解凍
法によつて回収した。
Bgl IIおよびSalIエンドヌクレアーゼで切断しておい
た、エタノール沈澱させたpCGS16DNAを、ゲル精製した2
93−118/37Bgl II−Hind III（SalI−linkered）DNA断
片と一緒に水13μ中に再溶解させ、２つの断片を、Bu
fferLおよびT4DNAリガーゼ（N.E.Biolabs）600単位を含
有する反応剤20μ中で互いに結合させた。CGE6株の細
胞をCaCl2で処理し、上記のように結合DNAで転換させ
た。プラスミドDNAを５つの異なるアンピシリン耐性転
換株から精製し、BamH IまたはPst IプラスSal Iによる
消化に付した。２％アガロース・ゲル中の帯の部分は、
完全なプロレンニン配列がプラスミドpCGS28中に存在し
ていることを示していた。
それ故、酵母CGY 80株をA.Hinnen,J.B.Hicks,およびG.F
ink（1979、上記参照）によつて、プラスミドDNAで転換
させ、ロイシン原栄養株（prototrophs）を選択した。
１つのこのような転換株CGY116を、1/2世代に対して35S
−Ｌ−メチオニン100μciでラベルした適当なアミノ酸
補足剤を含有する最少培地中で、30℃で典型相に生育さ
せ、ガラス溶球（250〜300μｍ）で３分間うず巻を起こ
させることによつて溶解させた。抽出物を遠心分離によ
つて清澄化し、レンニン抗血清で免疫沈澱させた。免疫
沈澱物をSDS試料緩衝液に溶かし、0.1％SDSを含有する1
0％ポリアクリルアミドゲル中で、U.K.LaemmliおよびM.
Farreの方法（上記参照）に従つて電気詠動に付した。
オートラジオグラフイーは、プラスミドpCGS28を有する
CGY116株がレンニン抗血清と反応する蛋白の合成を指令
し、かつプロレンニンに対して予期された大きさである
ことを示していた。さらに、免疫沈澱操作の間過剰のラ
ベルされていないレンニンを存在させるとプロレンニン
の放射性の帯が消失する。したがつて、Ｓセレビシエー
CGY116株は、プロレンニンの最初の４個のアミノ酸の代
りに、酵母ura3遺伝子からの４個のアミノ酸に融合した
子牛のプロレンニンを生産する。B.Foltmanによつて記
載された標準方法（Methods in Enzymology 第19巻、42
1〜436頁、1970）によるura3−プロレンニン融合蛋白の
活性化は、“プロ”チモーゲン（酵素原）ペプチド（こ
の場合には４個の“外来性”アミノ酸を含有する）が活
性化の間に切断されるので、真正の子牛のレンニＡと全
く同一の活性レンニンを生じさせる。プラスミドpCGS28
を有するCGY116株はアメリカン・タイプ・カルチヤー・
コレクシヨン（ATCC）に寄託されており、その受入番号
は20623である。
CGY116株は、ＳセレビシエーCGY80株（MATa.leu2−3,le
u2−112,ura3−52,his3V,trp1−289,プラスミドpCGS28
を有する）である。プラスミドpCGS28は次のように定義
される（図６参照）。即ち該プラスミドは、大部分のプ
ラスミドpBR322（J.G.Sutcliffe〔1979〕Cold Spring H
arbor Symposium第43巻、77〜90頁）、EccRI、酵母２μ
ｍプラスミド（J.L.HartleyおよびJ.E.Donelson〔198
0〕、Nature286巻、860〜865頁）の断片、LEU2遺伝子
（A.Hinnen,J.HicksおよびG.R.Fink〔1978〕Proc.Nat.A
caD.Sci.USA、第75巻、1929〜1933頁）を有する酵母の
染色体DNAのSalI−XhoI断片、ura3遺伝子（pRB71中と同
様にBamH Iから翻訳開始の11ヌクレオチド３′サイ
ト）、プラスヌクレオチド＃267のところのBamH Iサイ
トから該遺伝子の末端までのプロレンニンＡを含有す
る。
再び表１を参照すると、プレープロレンニンＡのヌクレ
オチドおよびアミノ酸配列は本発明のいくつかの材料の
ためにヌクレオチド配列を例示するものである。これら
の材料は慣用の方法によつて示されるヌクレオチド配列
から切断することができる。同様に、プレープロレンニ
ンＡ形は、前記Foltmannらによる位置番号290（表１に
おける塩基配列の1108〜110に対応し、プロレンアミノ
酸配列ではAlaから286番目に対応）のところでアスパラ
ギン酸塩残基の代りにこの位置でグリシンを用いること
によつてプロレンニンＢ形に変えることができる。表１
に示される、本発明の方法によつて誘導されるプレープ
ロレンニンから得た有用な生成物は組換えDNA材料の部
分を形成している次のヌクレオチド配列に対応するアミ
ノ酸配列を含有する。
1. 表１中に番号379〜1350で示され、かつ下記にくり
返されるようなヌクレオチド配列を有するプレ−プロレ
ンニン活性を示すポリペプチドのための遺伝子コーデイ
ング。
2. 表１中に番号205〜1350で示され、かつ下記にくり
返されるようなヌクレオチド配列を有するレンニン活性
を示すポリペプチドのための遺伝子コーデイング。
3. 表１中に番号253〜1350で示され、かつ下記にくり
返されるようなヌクレオチド配列を有するレンニン活性
を示すポリペプチドのための遺伝子コーデイング。
4. 表１のヌクレオチド205〜252から成る開始（initia
tor）ATGコドンを含有する16個のアミノ酸に対するプレ
ープロレンニン暗号配列コーデイング。この配列はプレ
ープロレンニンを合成する胃細胞からのプレープロレン
ニンの分泌を指令し、したがつて、この配列は、宿主細
胞からペリプラスミツク（periplasmlc）スペースまた
は培地へのそれらの蛋白生成物の分泌を指令するための
他のクローン化遺伝子に結合されたときに有用であると
思われる。加えて、レンニン活性のためには不必要な、
これらの余分のヌクレオチドは、アミノ酸に翻訳された
とき、それが細胞内にある間に蛋白加水分解に抵抗する
酵素の安定化にある役割を演ずる。これは、種々の宿主
細胞およびシエルフ・アイテム（shelf item）中のクロ
ーン化遺伝子生成物の安定化に対して一般的な有用性を
もつことができる。
5. プロレンニン分子の酵素原を形成する42個のアミノ
酸のための126個のヌクレオチドコーデイングの配列で
ある表１中のヌクレオチド番号253〜378のところの“プ
ロ”または酵素原配列。この配列はレンニンの不活性酵
素原を形成し、活性レンニンを発生させるために除去さ
れる。不活性酵素原は長い貯蔵寿命（shelf life）を有
することができる。それはまたレンニン分子を安定化さ
せ、それ故、他のクローン化遺伝子の遺伝子生成物を安
定化させることに対して一般的な有用性をもつことがで
きる。
ここで使用されたように、用語“組換えDNA材料から得
られる遺伝子材料”は、組換えDNAで転換され、かつ所
望の生成物に対する遺伝子情報を担う細胞を得るために
クローン化された宿主細胞の遺伝子材料を意味する。組
換えDNA材料は、その通常の意味において、単一の分子
を形成するために互いに結合または接合された２または
それ以上の異なるソース（源）から得たDNAを表わすた
めに使用されるが、また例えば化学合成によつて得た合
成DNAを包含する。明らかに、新規な組換えDNA材料を単
離し、かつ得るために使用される組換え方法は、次にク
ローン化され、かつ遺伝子組換え方法を再使用する必要
なしに生育される宿主細胞を作成することができる。そ
のような場合、クローン化細胞は、組換えDNA方法によ
つて最初に処理された細胞から得られると考えられ、か
つ組換えDNA材料から得られる遺伝子材料を含有すると
考えられる。
上記したように、組換えDNA分子は、乳汁凝固活性を示
す少なくとも１つのポリペプチドのための遺伝子コーデ
イングを含有するように形成されるか、またはそのよう
なポリペプチドを作成するのに有用である。
特定のプロレンニン、プレープロレンニンおよびレンニ
ン遺伝子は表１中で詳細に説明されているが、ここで使
用された用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列、ま
たは最終のレンニン生成物の乳汁凝固性または触媒活性
に著しい影響を及ぼさない修正配列における全ての変化
を有するそれらの機能的均等物（functional equivalen
ts）を包含することを理解すべきである。それ故、レン
ニン、プレープロレンニンおよびプロレンニンにおいて
使用された広義の用語“レンニン”は、牛または山羊の
乳汁のような哺乳類の乳汁を凝固させるアミノ酸の全て
の配列を包含すること意味し、したがつて、先行技術に
おいて以前に配列されたようなレンニンの選択された断
片を包含することができる。レンニン、プレープロレン
ニンおよびプロレンニンは、ポリペプチドの所望の活性
を高めるための慣用方法によつて除去されることのでき
る非機能性アミノ酸配列を有することがきる。
上記したように、子牛のレンニンは、前記Foltmannらに
よる位置番号において、配列位置290のところで、また
ひよつとすると位置204のところで相違する２つの対立
遺伝子型ＡおよびＢ中に存在する。レンニンＡのクロー
ニングおよび発現はここに記載されているが、レンニン
Ｂのための遺伝子は下記に要約した簡単な技術によつて
Ａ型から容易に発生させることができる。レンニンＢの
発現は、Ａ型に対してここで記載された方法と同一の方
法で得ることができる。レンニンＢのための遺伝子を発
生させるために、変化せしめられることになつておりか
つその所望の変化を包含している領域に及ぶオリゴヌク
レオチドを化学的に合成することができる。例えば、２
つの20−merオリゴヌクレオチド（ヌクレオチド856を除
いてヌクレオチド847〜866（表１）と同一の配列の１つ
はＡからＧに変えられ、かつヌクレオチド1109を除いて
ヌクレオチド1099〜1118（表１）と同一の配列の１つは
ＡからＧに変えられる。）が合成され、そして任意に刻
み目をつけ、かつR.B.Wallaceら（Science〔1980〕第20
9巻,1396〜1400頁）の方法によつてエンドヌクレアーゼ
IIIで１本鎖に転化させておいたflフアージ293−118/37
２本鎖DNAの第２のDNA鎖合成を容易するために用いら
れる。生成する２本鎖環状DNAはT4DNAポリメラーゼで結
合され、適当な大腸菌株を転換させるために使用され
る。フアージの混合物は、レンニンＡのための遺伝子を
担ういくつかのフアージ、および２つの特徴づけられた
変化の一方または他方を有する修正レンニンＡ遺伝子を
有するいくつかのフアージをもたらす。適切な制限断片
のDNA配列は、それぞれ所望の変化を担うフアージの選
択を許容し、かつ、レンニンＢ遺伝子は２つの遺伝子を
適当な制限サイトのところで一緒に接合させることによ
つて発生させることができる。もしレンニンＢに転化さ
れるべきレンニンＡが位置290のところでのみレンニン
Ｂと相違するならば、領域1099〜1118に及ぶ合成オリゴ
ヌクレオチドのみを使用することが必要であり、847〜8
66のための配列は使用されない。
本発明の方法はRNA材料で出発することを記載している
が、またゲノムDNAから得られる遺伝子を単離すること
によつて出発することもできる。その場合、介在配列が
まず最初に接合されるか、またはRNAを処理して介在配
列を除去することのできる適当な宿主生物が使用され
る。適当なRNAまたはDNA、またはそれらの部分を化学的
に合成し、ついでレンニン、プレープロレンニンおよび
（または）プロレンニンのいずれかの発現を最終的に得
るためにここに記載された手法を使用することによつて
出発することもできる。さらに、羊、山羊、豚、または
水牛のような他の生物の乳汁を凝固させる蛋白のための
クローン化遺伝子（これはレンニン様の酵素を生産す
る。）はここに記載された手法を用いて発生させること
ができる。
【図面の簡単な説明】
第１図はプラスミドpCGE5を示し、第２図はHind IVで切
断され、かつエクソヌクレアーゼBal31で消化されたプ
ラスミドpCGE5を示し、第３図はプラスミドpCGE17を示
し、第４図はプラスミドpCGE21を示し、第５図はプラス
ミドpCGE21中のpBR322およびpGL101からのヌクレオチド
の配置を示し、第６図はプラスミドpCGS28を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 ドナルド・テイラ−・モイア− アメリカ合衆国マサチユ−セツツ02154ウ オルサム・バ−ジニア・ロ−ド39 (72)発明者 アリソン・タウントン・リグビ− アメリカ合衆国マサチユ−セツツ01773リ ンコルン・フアラ−・ロ−ド（番地なし) (72)発明者 ジエラルド・フランシス・ヴオヴイス アメリカ合衆国マサチユ−セツツ02154ウ オルサム・バコン・ストリ−ト350 (56)参考文献 特開 昭58−9687（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−109499（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ．，1977〔74〕Ｐ．2321−2324 Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．, 1980〔44〕Ｐ．1373−1381

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記プロレンニンヌクレオチド配列、即
    ち、 GCT GAG ATC ACC AGG ATC CCT CTG TAC AAA GGC AAG TC
    T CTG AGG AAG GCG CTG AAG GAG CAT GGG CTT CTG GAG
    GAC TTC CTG CAG AAA CAG CAG TAT GGC ATC AGC AGC AA
    G TAC TCC GGC TTC GGG GAG GTG GCC AGC GTG CCC CTG ACC AAC TAC CTG GA
    T AGT CAG TAC TTT GGG AAG ATC TAC CTC GGG ACC CCG
    CCC CAG CAG TTC ACC GTG CTG TTT GAC ACT GGC TCC TC
    T GAC TTC TGG GTA CCC TCT ATC TAC TGC AAG AGC AAT
    GCC TGC AAA AAC CAC CAG CGC TTC GAC CCG AGA AAG TC
    G TCC ACC TTC CAG AAC CTG GGC AAG CCC CTG TCT ATC
    CAC TAC GGG ACA GGC AGC ATG CAG GGC ATC CTG GGC TA
    T GAC ACC GTC ACT GTC TCC AAC ATT GTG GAC ATC CAG
    CAG ACA GTA GGC CTG AGC ACC CAG GAG CCC GGG GAC GT
    C TTC ACC TAT GCC GAA TTC GAC GGG ATC CTG GGG ATG
    GCC TAC CCC TCG CTC GCC TCA GAG TAC TCG ATA CCC GT
    G TTT GAC AAC ATG ATG AAC AGG CAC CTG GTG GCC CAA
    GAC CTG TTC TCG GTT TAC ATG GAC AGG AAT GGC CAG GA
    G AGC ATG CTC ACG CTG GGG GCC ATC GAC CCG TCC TAC
    TAC ACA GGG TCC CTG CAC TGG GTG CCC GTG ACA GTG CA
    G CAG TAC TGG CAG TTC ACT GTG GAC AGT GTC ACC ATC
    AGC GGT GTG GTT GTG GCC TGT GAG GGT GGC TGT CAG GC
    C ATC CTG GAC ACG GGC ACC TCC AAG CTG GTC GGG CCC
    AGC AGC GAC ATC CTC AAC ATC CAG CAG GCC ATT GGA GC
    C ACA CAG AAC CAG TAC GAT GAG TTT GAC ATC GAC TGC
    GAC AAC CTG AGC TAC ATG CCC ACT GTG GTC TTT GAG AT
    C AAT GGC AAA ATG TAC CCA CTG ACC CCC TCC GCC TAT
    ACC AGC CAG GAC CAG GGC TTC TGT ACC AGT GGC TTC CA
    G AGT GAA AAT CAT TCC CAG AAA TGG ATC CTG GGG GAT
    GTT TTC ATC CGA GAG TAT TAC AGC GTC TTT GAC AGG GC
    C AAC AAC CTC GTG GGG CTG GCC AAA GCC ATC TGA、 下記プレ−プロレンニンヌクレオチド配列、即ち ATG AGG TGT CTC GTG GTG CTA CTT GCT GTC TTC GCT CT
    C TCC CAG GGC GCT GAG ATC ACC AGG ATC CCT CTG TAC AAA GGC AAG TC
    T CTG AGG AAG GCG CTG AAG GAG CAT GGG CTT CTG GAG
    GAC TTC CTG CAG AAA CAG CAG TAT GGC ATC AGC AGC AA
    G TAC TCC GGC TTC GGG GAG GTG GCC AGC GTG CCC CTG ACC AAC TAC CTG GA
    T AGT CAG TAC TTT GGG AAG ATC TAC CTC GGG ACC CCG
    CCC CAG GAG TTC ACC GTG CTG TTT GAC ACT GGC TCC TC
    T GAC TTC TGG GTA CCC TCT ATC TAC TGC AAG AGC AAT
    GCC TGC AAA AAC CAC CAG CGC TTC GAC CCG AGA AAG TC
    G ACC TTC CAG AAC CTG GGC AAG CCC CTG TCT ATC CAC
    TAC GGG ACA GGC AGC ATG CAG GGC ATC CTG GGC TAT GA
    C ACC GTC ACT GTC TCC AAC ATT GTG GAC ATC CAG CAG
    ACA GTA GGC CTG AGC ACC CAG GAG CCC GGG GAC GTC TT
    C ACC TAT GCC GAA TTC GAC GGG ATC CTG GGG ATG GCC
    TAC CCC TCG CTC GCC TCA GAG TAC TCG ATA CCC GTG TT
    T GAC AAC ATG ATG AAC AGG CAC CTG GTG GCC CAA GAC
    CTG TTC TCG GTT TAC ATG GAC AGG AAT GGC CAG GAG AG
    C ATG CTC ACG CTG GGG GCC ATC GAC CCG TCC TAC TAC
    ACA GGG TCC CTG CAC TGG GTG CCC GTG ACA GTG CAG CA
    G TAC TGG CAG TTC ACT GTG GAC AGT GTC ACC ATC AGC
    GGT GTG GTT GTG GCC TGT GAG GGT GGC TGT CAG GCC AT
    C CTG GAC ACG GGC ACC TCC AAG CTG GTC GGG CCC AGC
    AGC GAC ATC CTC AAC ATC CAG CAG GCC ATT GGA GCC AC
    A CAG AAC CAG TAC GAT GAG TTT GAC ATC GAC TGC GAC
    AAC CTG AGC TAC ATG CCC ACT GTG GTC TTT GAG ATC AA
    T GGC AAA ATG TAC CCA CTG ACC CCC TCC GCC TAT ACC
    AGC CAG GAC CAG GGC TTC TGT ACC AGT GGC TTC CAG AG
    T GAA AAT CAT TCC CAG AAA TGG ATC CTG GGG GAT GTT
    TTC ATC CGA GAG TAT TAC AGC GTC TTT GAC AGG GCC AA
    C AAC CTC GTG GGG CTG GCC AAA GCC ATC TGA、および レンニンヌクレオチド配列、即ち、 GGG GAG GTG GCC AGC GTG CCC CTG ACC AAC TAC CTG GA
    T AGT CAG TAC TTT GGG AAG ATC TAC CTC GGG ACC CCG
    CCC CAG GAG TTC ACC GTG CTG TTT GAC ACT GGC TCC TC
    T GAC TTC TGG GTA CCC TCT ATC TAC TGC AAG AGC AAT
    GCC TGC AAA AAC CAC CAG CGC TTC GAC CCG AGA AAG TC
    G TCC ACC TTC CAG AAC CTG GGC AAG CCC CTG TCT ATC
    CAC TAC GGG ACA GGC AGC ATG CAG GGC ATC CTG GGC TA
    T GAC ACC GTC ACT GTC TCC AAC ATT GTG GAC ATC CAG
    CAG ACA GTA GGC CTG AGC ACC CAG GAG CCC GGG GAC GT
    C TTC ACC TAT GCC GAA TTC GAC GGG ATC CTG GGG ATG
    GCC TAC CCC TCG CTC GCC TCA GAG TAC TCG ATA CCC GT
    G TTT GAC AAC ATG ATG AAC AGG CAC CTG GTG GCC CAA
    GAC CTG TTC TCG GTT TAC ATG GAC AGG AAT GGC CAG GA
    G AGC ATG CTC ACG CTG GGG GCC ATC GAC CCG TCC TAC
    TAC ACA GGG TCC CTG CAC TGG GTG CCC GTG ACA GTG CA
    G CAG TAC TGG CAG TTC ACT GTG GAC AGT GTC ACC ATC
    AGC GGT GTG GTT GTG GCC TGT GAG GGT GGC TGT CAG GC
    C ATC CTG GAC ACG GGC ACC TCC AAG CTG GTC GGG CCC
    AGC AGC GAC ATC CTC AAC ATC CAG CAG GCC ATT GGA GC
    C ACA CAG AAC CAG TAC GAT GAG TTT GAC ATC GAC TGC
    GAC AAC CTG AGC TAC ATG CCC ACT GTG GTC TTT GAG AT
    C AAT GGC AAA ATG TAC CCA CTG ACC CCC TCC GCC TAT
    ACC AGC CAG GAC CAG GGC TTC TGT ACC AGT GGC TTC CA
    G AGT GAA AAT CAT TCC CAG AAA TGG ATC CTG GGG GAT
    GTT TTC ATC CGA GAG TAT TAC AGC GTC TTT GAC AGG GC
    C AAC AAC CTC GTG GGG CTG GCC AAA GCC ATC TGA からなる群から選択されることを特徴とするDNA。
  2. 【請求項２】下記プロレンニンヌクレオチド配列、即
    ち、 GCT GAG ATC ACC AGG ATC CCT CTG TAC AAA GGC AAG TC
    T CTG AGG AAG GCG CTG AAG GAG CAT GGG CTT CTG GAG
    GAC TTC CTG CAG AAA CAG CAG TAT GGC ATC AGC AGC AA
    G TAC TCC GGC TTC GGG GAG GTG GCC AGC GTG CCC CTG ACC AAC TAC CTG GA
    T AGT CAG TAC TTT GGG AAG ATC TAC CTC GGG ACC CCG
    CCC CAG GAG TTC ACC GTG CTG TTT GAC ACT GGC TCC TC
    T GAC TTC TGG GTA CCC TCT ATC TAC TGC AAG AGC AAT
    GCC TGC AAA AAC CAC CAG CGC TTC GAC CCG AGA AAG TC
    G TCC ACC TTC CAG AAC CTG GGC AAG CCC CTG TCT ATC
    CAC TAC GGG ACA GGC AGC ATG CAG GGC ATC CTG GGC TA
    T GAC ACC GTC ACT GTC TCC AAC ATT GTG GAC ATC CAG
    CAG ACA GTA GGC CTG AGC ACC CAG GAG CCC GGG GAC GT
    C TTC ACC TAT GCC GAA TTC GAC GGG ATC CTG GGG ATG
    GCC TAC CCC TCG CTC GCC TCA GAG TAC TCG ATA CCC GT
    G TTT GAC AAC ATG ATG AAC AGG CAC CTG GTG GCC CAA
    GAC CTG TTC TCG GTT TAC ATG GAC AGG AAT GGC CAG GA
    G AGC ATG CTC ACG CTG GGG GCC ATC GAC CCG TCC TAC
    TAC ACA GGG TCC CTG CAG TGG GTG CCC GTG ACA GTG CA
    G CAG TAC TGG CAG TTC ACT GTG GAC AGT GTC ACC ATC
    AGC GGT GTG GTT GTG GCC TGT GAG GGT GGC TGT CAG GC
    C ATC CTG GAC ACG GGC ACC TCC AAG CTG GTC GGG CCC
    AGC AGC GAC ATC CTC AAC ATC CAG CAG GCC ATT GGA GC
    C ACA CAG AAC CAG TAC GAT GAG TTT GAC ATC GAC TGC
    GAC AAC CTG AGC TAC ATG CCC ACT GTG GTC TTT GAG AT
    C AAT GGC AAA ATG TAC CCA CTG ACC CCC TCC GCC TAT
    ACC AGC CAG GAC CAG GGC TTC TGT ACC AGT GGC TTC CA
    G AGT GAA AAT CAT TCC CAG AAA TGG ATC CTG GGG GAT
    GTT TTC ATC CGA GAG TAT TAC AGC GTC TTT GAC AGG GC
    C AAC AAC CTC GTG GGG CTG GCC AAA GCC ATC TGA、 下記プレ−プロレンニンヌクレオチド配列、即ち ATG AGG TGT CTC GTG GTG CTA CTT GCT GTC TTC GCT CT
    C TCC CAG GGC GCT GAG ATC ACC AGG ATC CCT CTG TAC AAA GGC AAG TC
    T CTG AGG AAG GCG CTG AAG GAG CAT GGG CTT CTG GAG
    GAC TTC CTG CAG AAA CAG CAG TAT GGC ATC AGC AGC AA
    G TAC TCC GGC TTC GGG GAG GTG GCC AGC GTG CCC CTG ACC AAC TAC CTG GA
    T AGT CAG TAC TTT GGG AAG ATC TAC CTC GGG ACC CCG
    CCC CAG GAG TTC ACC GTG CTG TTT GAC ACT GGC TCC TC
    T GAC TTC TGG GTA CCC TCT ATC TAC TGC AAG AGC AAT
    GCC TGC AAA AAC CAC CAG CGC TTC GAC CCG AGA AAG TC
    G TCC ACC TTC CAG AAC CTG GGC AAG CCC CTG TCT ATC
    CAC TAC GGG ACA GGC AGC ATG CAG GGC ATC CTG GGC TA
    T GAC ACC GTC ACT GTC TCC AAC ATT GTG GAC ATC CAG
    CAG ACA GTA GGC CTG AGC ACC CAG GAG CCC GGG GAC GT
    C TTC ACC TAT GCC GAA TTC GAC GGG ATC CTG GGG ATG
    GCC TAC CCC TCG CTC GCC TCA GAG TAC TCG ATA CCC GT
    G TTT GAC AAC ATG ATG AAC AGG CAC CTG GTG GCC CAA
    GAC CTG TTC TCG GTT TAC ATG GAC AGG AAT GGC CAG GA
    G AGC ATG CTC ACG CTG GGG GCC ATC GAC CCG TCC TAC
    TAC ACA GGG TCC CTG CAC TGG GTG CCC GTG ACA GTG CA
    G CAG TAC TGG CAG TTC ACT GTG GAC AGT GTC ACC ATC
    AGC GGT GTG GTT GTG GCC TGT GAG GGT GGC TGT CAG GC
    C ATC CTG GAC ACG GGC ACC TCC AAG CTG GTC GGG CCC
    AGC AGC GAC ATC CTC AAC ATC CAG CAG GCC ATT GGA GC
    C ACA CAG AAC CAG TAC GAT GAG TTT GAC ATC GAC TGC
    GAC AAC CTG AGC TAC ATG CCC ACT GTG GTC TTT GAG AT
    C AAT GGC AAA ATG TAC CCA CTG ACC CCC TCC GCC TAT
    ACC AGC CAG GAC CAG GGC TTC TGT ACC AGT GGC TTC CA
    G AGT GAA AAT CAT TCC CAG AAA TGG ATC CTG GGG GAT
    GTT TTC ATC CGA GAG TAT TAC AGC GTC TTT GAC AGG GC
    C AAC AAC CTC GTG GGG CTG GCC AAA GCC ATC TGA、お
    よび レンニンヌクレオチド配列、即ち、 GGG GAG GTG GCC AGC GTG CCC CTG ACC AAC TAC CTG GA
    T AGT CAG TAC TTT GGG AAG ATC TAC CTC GGG ACC CCG
    CCC CAG GAG TTC ACC GTG CTG TTT GAC ACT GGC TCC TC
    T GAC TTC TGG GTA CCC TCT ATC TAC TGC AAG AGC AAT
    GCC TGC AAA AAC CAC CAG CGC TTC GAC CCG AGA AAG TC
    G TCC ACC TTC CAG AAC CTG GGC AAG CCC CTG TCT ATC
    CAC TAC GGG ACA GGC AGC ATG CAG GGC ATC CTG GGC TA
    T GAC ACC GTC ACT GTC TCC AAC ATT GTG GAC ATC CAG
    CAG ACA GTA GGC CTG AGC ACC CAG GAG CCC GGG GAC GT
    C TTC ACC TAT GCC GAA TTC GAC GGG ATC CTG GGG ATG
    GCC TAC CCC TCG CTC GCC TCA GAG TAC TCG ATA CCC GT
    G TTT GAC AAC ATG ATG AAC AGG CAC CTG GTG GCC CAA
    GAC CTG TTC TCG GTT TAC ATG GAC AGG AAT GGC CAG GA
    G AGC ATG CTC ACG CTG GGG GCC ATC GAC CCG TCC TAC
    TAC ACA GGG TCC CTG CAC TGG GTG CCC GTG ACA GTG CA
    G CAG TAC TGG CAG TTC ACT GTG GAC AGT GTC ACC ATC
    AGC GGT GTG GTT GTG GCC TGT GAG GGT GGC TGT CAG GC
    C ATC CTG GAC ACG GGC ACC TCC AAG CTG GTC GGG CCC
    AGC AGC GAC ATC CTC AAC ATC CAG CAG GCC ATT GGA GC
    C ACA CAG AAC CAG TAC GAT GAG TTT GAC ATC GAC TGC
    GAC AAC CTG AGC TAC ATG CCC ACT GTG GTC TTT GAG AT
    C AAT GGC AAA ATG TAC CCA CTG ACC CCC TCC GCC TAT
    ACC AGC CAG GAC CAG GGC TTC TGT ACC AGT GGC TTC CA
    G AGT GAA AAT CAT TCC CAG AAA TGG ATC CTG GGG GAT
    GTT TTC ATC CGA GAG TAT TAC AGC GTC TTT GAC AGG GC
    C AAC AAC CTC GTG GGG CTG GCC AAA GCC ATC TGA からなる群から選択されるDNAから得られる遺伝子を含
    有し、かつ該遺伝子を発現することのできる細菌または
    酵母。
  3. 【請求項３】下記プロレンニンヌクレオチド配列、即
    ち、 GCT GAG ATC ACC AGG ATC CCT CTG TAC AAA GGC AAG TC
    T CTG AGG AAG GCG CTG AAG GAG CAT GGG CTT CTG GAG
    GAC TTC CTG CAG AAA CAG CAG TAT GGC ATC AGC AGC AA
    G TAC TCC GGC TTC GGG GAG GTG GCC AGC GTG CCC CTG ACC AAC TAC CTG GA
    T AGT CAG TAC TTT GGG AAG ATC TAC CTC GGG ACC CCG
    CCC CAG GAG TTC ACC GTG CTG TTT GAC ACT GGC TCC TC
    T GAC TTC TGG GTA CCC TCT ATC TAC TGC AAG AGC AAT
    GCC TGC AAA AAC CAC CAG CGC TTC GAC CCG AGA AAG TC
    G TCC ACC TTC CAG AAC CTG GGC AAG CCC CTG TCT ATC
    CAC TAC GGG ACA GGC AGC ATG CAG GGC ATC CTG GGC TA
    T GAC ACC GTC ACT GTC TCC AAC ATT GTG GAC ATC CAG
    CAG ACA GTA GGC CTG AGC ACC CAG GAG CCC GGG GAC GT
    C TTC ACC TAT GCC GAA TTC GAC GGG ATC CTG GGG ATG
    GCC TAC CCC TCG CTC GCC TCA GAG TAC TCG ATA CCC GT
    G TTT GAC AAC ATG ATG AAC AGG CAC CTG GTG GCC CAA
    GAC CTG TTC TCG GTT TAC ATG GAC AGG AAT GGC CAG GA
    G AGC ATG CTC ACG CTG GGG GCC ATC GAC CCG TCC TAC
    TAC ACA GGG TCC CTG CAC TGG GTG CCC GTG ACA GTG CA
    G CAG TAC TGG CAG TTC ACT GTG GAC AGT GTC ACC ATC
    AGC GGT GTG GTT GTG GCC TGT GAG GGT GGC TGT CAG GC
    C ATC CTG GAC ACG GGC ACC TCC AAG CTG GTC GGG CCC
    AGC AGC GAC ATC CTC AAC ATC CAG CAG GCC ATT GGA GC
    C ACA CAG AAC CAG TAC GAT GAG TTT GAC ATC GAC TGC
    GAC AAC CTG AGC TAC ATG CCC ACT GTG GTC TTT GAG AT
    C AAT GGC AAA ATG TAC CCA CTG ACC CCC TCC GCC TAT
    ACC AGC CAG GAC CAG GGC TTC TGT ACC AGT GGC TTC CA
    G AGT GAA AAT CAT TCC CAG AAA TGG ATC CTG GGG GAT
    GTT TTC ATC CGA GAG TAT TAC AGC GTC TTT GAC AGG GC
    C AAC 、AAC CTC GTG GGG CTG GCC AAA GCC ATC TGA、 下記プレ−プロレンニンヌクレオチド配列、即ち ATG AGG TGT CTC GTG CTA CTT GCT GTC TTC GCT CTC TC
    C CAG GGC GCT GAG ATC ACC AGG ATC CCT CTG TAC AAA GGC AAG TC
    T CTG AGG AAG GCG CTG AAG GAG CAT GGG CTT CTG GAG
    GAC TTC CTG CAG AAA CAG CAG TAT GGC ATC AGC AGC AA
    G TAC TCC GGC TTC GGG GAG GTG GCC AGC GTG CCC CTG ACC AAC TAC CTG GA
    T AGT CAG TAC TTT GGG AAG ATC TAC CTC GGG ACC CCG
    CCC CAG GAG TTC ACC GTG CTG TTT GAC ACT GGC TCC TC
    T GAC TTC TGG GTA CCC TCT ATC TAC TGC AAG AGC AAT
    GCC TGC AAA AAC CAC CAG CGC TTC GAC CCG AGA AAG TC
    G TCC ACC TTC CAG AAC CTG GGC AAG CCC CTG TCT ATC
    CAC TAC GGG ACA GGC AGC ATG CAG GGC ATC CTG GGC TA
    T GAC ACC GTC ACT GTC TCC AAC ATT GTG GAC ATC CAG
    CAG ACA GTA GGC CTG AGC ACC CAG GAG CCC GGG GAC GT
    C TTC ACC TAT GCC GAA TTC GAC GGG ATC CTG GGG ATG
    GCC TAC CCC TCG CTC GCC TCA GAG TAC TCG ATA CCC GT
    G TTT GAC AAC ATG ATG AAC AGG CAC CTG GTG GCC CAA
    GAC CTG TTC TCG GTT TAC ATG GAC AGG AAT GGC CAG GA
    G AGC ATG CTC ACG CTG GGG GCC ATC GAC CCG TCC TAC
    TAC ACA GGG TCC CTG CAC TGG GTG CCC GTG ACA GTG CA
    G CAG TAC TGG CAG TTC ACT GTG GAC AGT GTC ACC ATC
    AGC GGT GTG GTT GTG GCC TGT GAG GGT GGC TGT CAG GC
    C ATC CTG GAC ACG GGC ACC TCC AAG CTG GTC GGG CCC
    AGC AGC GAC ATC CTC AAC ATC CAG CAG GCC ATT GGA GC
    C ACA CAG AAC CAG TAC GAT GAG TTT GAC ATC GAC TGC
    GAC AAC CTG AGC TAC ATG CCC ACT GTG GTC TTT GAG AT
    C AAT GGC AAA ATG TAC CCA CTG ACC CCC TCC TAT ACC
    AGC CAG GAC CAG GGC TTC TGT ACC AGT GGC TTC CAG AG
    T GAA AAT CAT TCC CAG AAA TGG ATC CTG GGG GAT GTT
    TTC ATC CGA GAG TAT TAC AGC GTC TTT GAC AGG GCC AA
    C AAC CTC GTG GGG CTG GCC AAA GCC ATC TGA、および レンニンヌクレオチド配列、即ち、 GGG GAG GTG GCC AGC GTG CCC CTG ACC AAC TAC CTG GA
    T AGT CAG TAC TTT GGG AAG ATC TAC CTC GGG ACC CCG
    CCC CAG GAG TTC ACC GTG CTG TTT GAC ACT GGC TCC TC
    T GAC TTC TGG GTA CCC TCT ATC TAC TGC AAG AGC AAT
    GCC TGC AAA AAC CAC CAG CGC TTC GAC CCG AGA AAG TC
    G TCC ACC TTC CAG AAC CTG GGC AAG CCC CTG TCT ATC
    CAC TAC GGG ACA GGC AGC ATG CAG GGC ATC CTG GGC TA
    T GAC ACC GTC ACT GTC TCC AAC ATT GTG GAC ATC CAG
    CAG ACA GTA GGC CTG AGC ACC CAG GAG CCC GGG GAC GT
    C TTC ACC TAT GCC GAA TTC GAC GGG ATC CTG GGG ATG
    GCC TAC CCC TCG CTC GCC TCA GAG TAC TCG ATA CCC GT
    G TTT GAC AAC ATG ATG AAC AGG CAC CTG GTG GCC CAA
    GAC CTG TTC TCG GTT TAC ATG GAC AGG AAT GGC CAG GA
    G AGC ATG CTC ACG CTG GGG GCC ATC GAC CCG TCC TAC
    TAC ACA GGG TCC CTG CAC TGG GTG CCC GTG ACA GTG CA
    G CAG TAC TGG CAG TTC ACT GTG GAC AGT GTC ACC ATC
    AGC GGT GTG GTT GTG GCC TGT GAG GGT GGC TGT CAG GC
    C ATC CTG GAC ACG GGC ACC TCC AAG CTG GTC GGG CCC
    AGC AGC GAC ATC CTC AAC ATC CAG CAG GCC ATT GGA GC
    C ACA CAG AAC CAG TAC GAT GAG TTT GAC ATC GAC TGC
    GAC AAC CTG AGC TAC ATG CCC ACT GTG GTC TTT GAG AT
    C AAT GGC AAA ATG TAC CCA CTG ACC CCC TCC GCC TAT
    ACC AGC CAG GAC CAG GGC TTC TGT ACC AGT GGC TTC CA
    G AGT GAA AAT CAT TCC CAG AAA TGG ATC CTG GGG GAT
    GTT TTC ATC CGA GAG TAT TAC AGC GTC TTT GAC AGG GC
    C AAC AAC CTC GTG GGG CTG GCC AAA GCC ATC TGA からなる群から選択されるDNAからなる遺伝子を適当な
    宿主細胞中で複製するベクターに有効に結合したベクタ
    ー。
JP57003556A 1981-01-16 1982-01-14 組換えｄｎａ材料から得られるレンニン，プレ−プロレンニン，またはプロレンニン遺伝子、およびこれらの遺伝子を含有する生細胞 Expired - Lifetime JPH0716419B2 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US22571781A 1981-01-16 1981-01-16
US225717 1981-01-16
US325481 1981-12-01
US06/325,481 US4666847A (en) 1981-01-16 1981-12-01 Recombinant DNA means and method

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP6264642A Division JPH07108221B2 (ja) 1981-01-16 1994-10-04 レンニンの製造方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS57141287A JPS57141287A (en) 1982-09-01
JPH0716419B2 true JPH0716419B2 (ja) 1995-03-01

Family

ID=26919852

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP57003556A Expired - Lifetime JPH0716419B2 (ja) 1981-01-16 1982-01-14 組換えｄｎａ材料から得られるレンニン，プレ−プロレンニン，またはプロレンニン遺伝子、およびこれらの遺伝子を含有する生細胞
JP6264642A Expired - Lifetime JPH07108221B2 (ja) 1981-01-16 1994-10-04 レンニンの製造方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP6264642A Expired - Lifetime JPH07108221B2 (ja) 1981-01-16 1994-10-04 レンニンの製造方法

Country Status (15)

Country Link
US (1) US4666847A (ja)
EP (1) EP0057350B1 (ja)
JP (2) JPH0716419B2 (ja)
AT (1) ATE172493T1 (ja)
AU (1) AU560340B2 (ja)
BR (1) BR8200191A (ja)
CA (1) CA1341300C (ja)
DE (1) DE3280479T2 (ja)
DK (1) DK15182A (ja)
ES (2) ES508813A0 (ja)
FI (1) FI84080C (ja)
GB (1) GB2091271B (ja)
IE (1) IE52760B1 (ja)
NO (1) NO820090L (ja)
NZ (1) NZ199445A (ja)

Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5525484A (en) * 1981-01-16 1996-06-11 Genome Therapeutics Corp. Recombinant DNA means and method for producing rennin, prorenin and pre-prorennin
NZ199722A (en) * 1981-02-25 1985-12-13 Genentech Inc Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain
IE53517B1 (en) * 1981-06-17 1988-12-07 Celltech Ltd Process for the production of a polypeptide
JPS5832896A (ja) * 1981-08-24 1983-02-25 Teruhiko Beppu 複合プラスミド及びそれを含有する微生物
IE54046B1 (en) * 1981-08-25 1989-05-24 Celltech Ltd Expression vectors
BR8205954A (pt) * 1981-10-14 1983-09-13 Unilever Nv Sequencia de dna,plasmidio recombinante,cultura bacteriana e microorganismos
US4775622A (en) * 1982-03-08 1988-10-04 Genentech, Inc. Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast
JP2608540B2 (ja) * 1982-05-19 1997-05-07 ギスト ブロカデス ナ−ムロ−ゼ フエンノ−トチヤツプ クルイベロミセス種のためのクローニング系
IL68797A0 (en) * 1982-07-01 1983-09-30 Genex Corp Cloned bovine calf chymosin and calf prochymosin genes,their preparation,plasmids containing them and microorganisms transformed by those plasmids
US4961938A (en) * 1982-12-22 1990-10-09 Genentech, Inc. Preparation of cheese with rennin from recombinant microbial cells
US4935369A (en) * 1982-12-22 1990-06-19 Genentech, Inc. Isolation of active microbially produced bovine rennin
IE56372B1 (en) * 1982-12-22 1991-07-03 Genentech Inc Microbially produced rennet methods for its production and plasmids used for its production
US4661454A (en) * 1983-02-28 1987-04-28 Collaborative Research, Inc. GAL1 yeast promoter linked to non galactokinase gene
JPS59166086A (ja) * 1983-03-09 1984-09-19 Teruhiko Beppu 新規な発現型プラスミドとそれらを用いて仔牛プロキモシン遺伝子を大腸菌内で発現させる方法
EP0129268B1 (en) * 1983-05-19 1989-10-04 Unilever N.V. Improvements in the expression of newly introduced genes in yeast cells
EP0128743A3 (en) * 1983-06-07 1985-12-27 Genex Corporation Expression of foreign genes in yeast
AU3036684A (en) * 1983-07-07 1985-01-10 Genex Corp. Production of bovine calf chymosin
US4935354A (en) * 1983-07-14 1990-06-19 Genentech, Inc. Rennin from recombinant microbial cells for preparation of cheese
US4721673A (en) * 1983-09-01 1988-01-26 Genex Corporation Recovery and activation process for microbially produced calf prochymosin
US5639639A (en) * 1983-11-02 1997-06-17 Genzyme Corporation Recombinant heterodimeric human fertility hormones, and methods, cells, vectors and DNA for the production thereof
US4935370A (en) * 1983-12-23 1990-06-19 Pfizer Inc. Expression plasmids for improved production of heterologous protein in bacteria
NL8400687A (nl) * 1984-03-02 1985-10-01 Unilever Nv Recombinant plasmiden; recombinant plasmiden bevattende bacterien; werkwijze voor het bereiden of vervaardigen van een zuivelproduct; werkwijze voor het bereiden van een eiwit.
JPS60188077A (ja) * 1984-03-09 1985-09-25 Teruhiko Beppu 仔牛プロキモシンｃＤΝＡの全配列を有する新規な発現プラスミド
JPS60188093A (ja) * 1984-03-09 1985-09-25 Teruhiko Beppu 枯草菌に於ける形質発現プラスミド
DE3585081D1 (de) * 1984-05-11 1992-02-13 Berlex Lab Verfahren zur herstellung eines im wesentlichen nichtloeslichen polypetids unter verwendung nichtionischer detergentien.
US5082775A (en) * 1984-05-11 1992-01-21 Berlex Laboratories, Inc. Efficient process for isolating insoluble heterologous protein using non-ionic detergents
GB2178431B (en) * 1985-07-15 1989-11-22 Bioteknika International Genetically engineered yeast strains
US5364770A (en) * 1985-08-29 1994-11-15 Genencor International Inc. Heterologous polypeptides expressed in aspergillus
US6004785A (en) * 1985-08-29 1999-12-21 Genencor International Inc. Heterologous polypeptides expressed in filamentous fungi, processes for making same, and vectors for making same
US4937189A (en) * 1985-10-18 1990-06-26 Pfizer Inc. Expression and secretion of heterologous proteins by Yarrowia lipolytica transformants
US5536661A (en) * 1987-03-10 1996-07-16 Novo Nordisk A/S Process for the production of protein products in aspergillus
US5766912A (en) * 1986-03-17 1998-06-16 Novo Nordisk A/S Humicola lipase produced in aspergillus
JPH0673456B2 (ja) * 1986-04-26 1994-09-21 三共株式会社 ヒト・膵臓エラスタ−ゼ▲ｉ▼
PT85364B (pt) * 1986-07-22 1990-04-30 Ciba Geigy Ag Metodo para a producao de polipeptideos relacionados com factores de ligacao
GB2200118A (en) * 1987-01-23 1988-07-27 Allelix Inc Synthetic chymosin-and prochymosin-encoding DNA segments
US4977089A (en) * 1987-01-30 1990-12-11 Eli Lilly And Company Vector comprising signal peptide-encoding DNA for use in Bacillus and other microorganisms
US5162226A (en) 1987-08-24 1992-11-10 University Of Tennessee Research Corp. (U.T.R.C.) Therapeutic compositions against streptococcal infections, transformed hosts, methods of immunization and genetically engineered products
JPH02109984A (ja) * 1988-12-01 1990-04-23 Teruhiko Beppu 複合プラスミド及びそれを含有する微生物
US5139943A (en) * 1989-06-13 1992-08-18 Genencor International, Inc. Processes for the recovery of microbially produced chymosin
US5151358A (en) * 1989-06-13 1992-09-29 Genencor International, Inc. Processes for the recovery of naturally produced chymosin
WO1991013971A1 (en) * 1990-03-13 1991-09-19 Hawaii Biotechnology Group, Inc. Neurospora expression system
IE914007A1 (en) * 1990-11-19 1992-05-20 Univ Illinois A protein being genetically engineered to provide¹orientability and a substrate having an oriented layer of¹proteins
DK0700445T3 (da) * 1993-06-04 2002-05-13 Whitehead Biomedical Inst Stressproteiner og anvendelser deraf
US7157089B1 (en) * 1996-11-26 2007-01-02 Stressgen Biotechnologies Corporation Immune responses using compositions containing stress proteins
AU5926700A (en) * 1999-07-08 2001-01-30 Stressgen Biotechnologies Corporation Induction of a th1-like response in vitro
US7390936B1 (en) 1999-08-23 2008-06-24 Sembiosys Genetics Inc. Commercial production of chymosin in plants
US6964851B2 (en) * 1999-12-07 2005-11-15 Stressgen Biotechnologies Corp. Compositions and methods for detecting stress-inducible proteins
AU1814101A (en) * 2000-01-14 2001-07-24 Massachusetts Institute Of Technology In vivo CTL elicitation by heat shock protein fusion proteins maps to a discrete ATP binding domain and is CD4+ cell-independent
IL153474A0 (en) * 2000-06-26 2003-07-06 Stressgen Biotechnologies Corp Human papilloma virus treatment
MXPA03006971A (es) * 2001-02-05 2004-05-05 Stressgen Biotechnologies Corp Tratamiento del virus de hepatitis b.
WO2005094185A2 (en) * 2004-03-30 2005-10-13 Sudershan Biotech Limited Recombinant calf-chymosin and a process for producing the same

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4136201A (en) * 1967-12-06 1979-01-23 Gb Fermentation Industries, Inc. Microbial rennin
FR2441659A1 (fr) * 1978-11-14 1980-06-13 Anvar Nouveaux plasmides hybrides et microorganismes les contenant
US4332892A (en) * 1979-01-15 1982-06-01 President And Fellows Of Harvard College Protein synthesis
GB2052516B (en) * 1979-06-01 1983-06-29 Searle & Co Plasmid vectors production and use thereof
US4338397A (en) * 1980-04-11 1982-07-06 President And Fellows Of Harvard College Mature protein synthesis
IE53517B1 (en) * 1981-06-17 1988-12-07 Celltech Ltd Process for the production of a polypeptide

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８０〔４４〕Ｐ．１３７３−１３８１
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９７７〔７４〕Ｐ．２３２１−２３２４

Also Published As

Publication number Publication date
US4666847A (en) 1987-05-19
JPH07108221B2 (ja) 1995-11-22
EP0057350B1 (en) 1998-10-21
GB2091271A (en) 1982-07-28
JPH07170978A (ja) 1995-07-11
IE52760B1 (en) 1988-02-17
ES8401132A1 (es) 1983-12-01
GB2091271B (en) 1984-08-30
ES524986A0 (es) 1986-10-01
EP0057350A2 (en) 1982-08-11
NZ199445A (en) 1985-07-12
ES508813A0 (es) 1983-12-01
DE3280479T2 (de) 1999-03-11
BR8200191A (pt) 1982-11-09
FI820075L (fi) 1982-07-17
JPS57141287A (en) 1982-09-01
EP0057350A3 (en) 1982-12-01
DE3280479D1 (de) 1998-11-26
AU7945682A (en) 1982-07-22
AU560340B2 (en) 1987-04-02
ES8700320A1 (es) 1986-10-01
FI84080C (fi) 1991-10-10
ATE172493T1 (de) 1998-11-15
NO820090L (no) 1982-07-19
CA1341300C (en) 2001-10-09
DK15182A (da) 1982-07-17
IE820069L (en) 1983-06-01
FI84080B (fi) 1991-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH0716419B2 (ja) 組換えｄｎａ材料から得られるレンニン，プレ−プロレンニン，またはプロレンニン遺伝子、およびこれらの遺伝子を含有する生細胞
CA1283373C (en) Use of the gal 1 yeast promoter
JP2763024B2 (ja) 牛のプレ成長および成長ホルモンの製造方法
US5139936A (en) Use of the GAL1 yeast promoter
SU1764515A3 (ru) Способ получени лейкоцитарного интерферона
JP2539775B2 (ja) Ｄｎａ配列を微生物によつて発現する方法及びその生産物
KR930001117B1 (ko) Dna 재조합 기술에 의한 폴리펩티드 제조방법
Roberts et al. Molecular analysis of a Neurospora crassa gene expressed during conidiation
JP2645681B2 (ja) 形質転換細菌
GB2100737A (en) A process for the production of a polypeptide
US5591640A (en) Functional DNA block and plasmid coding for hirudin, transformed yeast, method for preparing hirudin, hirudin obtained and its pharmaceutical use
JPH0838176A (ja) 改良組換ｄｎａ分子
JP2006068019A (ja) ｏｓｍＢプロモータで制御される発現プラスミド
JP2574142B2 (ja) 組換えリシン毒素フラグメント
JPH02501976A (ja) ピキア・パストリスからの分泌による動物リゾチームｃの生産とその結果生ずる組成物
JPH08507218A (ja) 一重鎖分子の過剰発現
US5496711A (en) Processes for producing pre-prorennin, prorennin and rennin
US4845031A (en) Recombinant DNA process for producing useful polypeptides
JPS63102684A (ja) 遺伝子およびその利用方法
JP2500312B2 (ja) ヒト成長ホルモンの生産法
JPH0691833B2 (ja) 利尿作用を有するポリペプチドの製造方法
JPH066060B2 (ja) 新規なプロモ−タ−
JPS62224291A (ja) ポリヌクレオチド
JPH09191885A (ja) Ｎｓｐ７５２４ＩＩＩ制限・修飾系酵素及びその遺伝子