JPH02109984A - 複合プラスミド及びそれを含有する微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、複合プラスミド及びそれを含有する仔牛プロ
レンニン生産性宿主微生物に関する。

更に詳しくは、本発明は、作中第四胃より分泌され＊チ
ーズの製造に不可欠な凝乳酵素レンニン（キモシン］の
前駆体である仔牛プロレンニン（プロキモシン）のｃＤ
ＮＡ（相補的ＤＮＡ）を含有して成る複合プラスミド及
び該複合プラスミド金持った作中グロレンニン生産性宿
主微生物に関する。

作中第四胃粘膜より分泌されるレンニンは、アミノ酸残
基数３２３個の酸性プロテアーゼの一種であり、その前
駆体であるプロレンニンは、アミノ酸残基数３６５個の
レンニン前駆体蛋白質であって、酸性条件下で、自己触
媒的に凝乳酵素レンニンに転化する分子量約３７，００
０の酵素蛋白質である。

宿主微生物のベクター・プラスミドに有用物質生産情報
を持りｆｔ−ｃＤＮＡｆ：組み込んだ複合プラスミドを
持つ宿主微生物を用いて、該微生物に上記有用物質を生
産さ擾る遺伝子組み換え技術金利用した技術分野に、近
年、急速に進歩し５たとえば生長ホルモンやインターフ
ェロンなどの有用物質を、大腸菌を宿主微生物として利
用して生産する技術が開発されつつある。

本発明者等は、チーズ製造に不可欠な凝乳酵素レンニン
の前駆本蛋白であるプロレンニンの構造遺伝子の全鎖長
のクローン化を目指して研究を続けてきた。そして、そ
の研究経過について、日本農芸化学会昭和５５年大会講
演要旨集、４０８頁（昭和５５年３月５日発行）　；　
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆｔｈｅ　　ｌｌ／　　ｔ
ｈ　　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｆｅｒｍｅｎｔ
ａｔｉｏｎＳｙｍｐｏｓｉｕｍ　、　１７９頁、Ｆ−２
ｘ−ｓ（Ｌ）。

１９８０年；日本農芸化学会昭和５６年大会講演要旨集
、２５９頁及び５６９頁（昭和５６年３月１０日発行）
などに経過報告を行ってきた。

しかしながら、ハイブリッド・アレステッド・トランス
レーション法（ｈｙｂｒｉｄ　−ａｒｒｅｓｔｅｄｔｒ
αｎｓｌαｔ　ｉｏｎαＳＳαｙ］で確認されたプロレ
ンニン構造遺伝子の実質的に全鎖長を持つクローン、す
なわち、仔牛プロレンニン生産能が確実に期待できるク
ローンの形成Ｙｃは到達できなかった。上記経過報文で
のクローンハ、んｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（＋）の菌
株が取得されたが、それらが含有するのは約０、２　Ｍ
　ｄ程度の部分的鎖長のプロレンニン構造遺伝子を持つ
プロレンニンｃＤＮＡの部分片であって、プロレンニン
ｃＤＮＡｆ含有するものではなかった。

更に研究を進めた結果、今回、本発明者等は、後に実施
例において詳しく述べるように、ハイブリッド・アレス
テッド・トランスレーション法で確認され友プロレンニ
ン構造遺伝子の実質的に全鎖長を含有する複合プラスミ
ドを持つ友作中プロレンニン生産性クローンの形成に成
功した。

本発明者等は、後に詳しく述べる手法を利用して、作中
グロレンニンのｃＤＮＡｋ含有して成る複合プラスミド
の合成に成功し、この複合プラスミドを持つ定宿主微生
物を取得し友。この新規複合プラスミド金持った新規な
宿主微生物は、徹工研（Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ。

Ａｇｅｎｃｙ　　ｏｆ　　Ｉｎｒｈｂｓｔｒｉａｌ　　
５ｃｉｅｎｃｅ　　ａｎｄ　　ＴｅＣん−ｎｏｔｏｇｙ
　、　Ｊａｐａｎ　）が寄託を受理しないＰ２レベルに
属する微生物例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
Ｃ６００ｒ　Ｅｍｋ−（ｐ　Ｔ　４　ＣＲ１）　テロ　
っテ、本発明者等の属する東京大学農学部農芸化学科醗
酵学研究室に保存されている。

仔牛プロレンニンは、生後約数週間以内の仔牛の第Ｖｆ
ｊ胃より分泌される酵素蛋白質であって、チーズ製造に
必須であるが、近年その生産は需要に応じきれず、微生
物レンネットによる代用も行われており、本発明者等に
よって遺伝子組み換え技術金利用し友作中プロレンニン
生産性宿主微生物の提供に成功したことの工業酌量４Ｈ
極めて大きい。

従って、本発明の目的は、仔牛プロレンニンのｃＤＮＡ
ケ含有して成る複合プラスミド、更ＶＣＵ、該複合プラ
スミドを持つ友宿主微生物全提供するにある。

本発明の上記目的及び更に多くの他の目的ならびに利点
は、以下の記載から一層明らかとなるであろう。

本発明の複合プラスミド及びそれ全含有する宿主微生物
を形成する一態様によれば、生後数週間以内の仔牛の第
４胃粘膜層からプロレンニン、、ＲＮＡ（メツセンジャ
ーＲＮＡ）を抽出し、逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔ
ｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　）を用いる手法を利用して
、該ｍＲＮＡ全鋳型として、その相補的−本備ＤＮＡを
合成したのち、アルカリ処理して鋳型ｒｒＬＲＮＡｆ除
去し、斯くて得られた−杢調ＤＮＡｆ用いて、例えばＤ
ＮＡポリメラーゼＩや逆転写酵素を用いる手法を利用し
て相補的二本鎖ｃＤＮＡｔ合成し、ヌークレアーゼ５１
（ｎｕｃｌｅα５ｅｓ１１）ｆ用いる手法を利用して、
形成された相補的二本鎖ｃＤＮＡのヘアピン構造部分の
みを選択的に除去して、完全なプロレンニン特異的二本
鎖ｃＤＮＡを合成し友のち、ターミナル・デオキシヌー
クレオチジル・トランスフェラーゼ（ＴｄＴ　；　ｔｅ
ｒｍｉｎａｌ　ｄｅａｒ；ｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔ
ｒαｎ５ｆｅτα５ｅ）ｖｉ−用いる手法を利用して、
得られたプロレンニン特異的二本鎖ｃ　Ｄ　Ｎ　ＡＯ両
３′末端に、次とえはポリｄＧ（デオキシグアニン）ホ
モポリマーを付加する。

一方、適当なベクタープラスミドたとえば大腸菌（Ｅｓ
ｃｈｔｔｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ベクターｐＢＲ３２
２に、Ｓα１１制限酵素゛を作用させる手法を利用して
得ることのできる線状ｐＢＲ３２２ＤＮＡＶＣ１ＤＮＡ
ポリメラーゼ夏（ＤＮ　Ａ　７ｙｏｌｙｍｅｒａｓｅ　
ｌ　）を用いる手法を適用して、その両３′末端−本鎖
部分を修復したのち、ＴｄＴｆ用いる手法を利用して該
修復された両３′末端に、たとえばポリｄＣ（デオキシ
シチジル］ホモポリマーを付加する。

このようにして得るこのできる３′末端にポリｄＣホモ
ポリマーを付加した線状ｐ　ＢＲ３２２ＤＮＡと、前述
のニゲにして得ることのできる３′末端にポリｄＧホモ
ポリマーを付加したプロレンニン特異的二本鎖ｃＤＮＡ
ｆ混合、アニーリング（ａｎｎｅａｌ　ｉｎｇ　）　し
て、仔牛プロレンニンのｃＤＮＡを含有して成る複合プ
ラスミドを形成することができる。

次いで、大腸菌をカルシウム処理し、上述のようにして
得られた複合プラスミドと混合して形質転換株を形成す
る。ベクタープラスミドの薬剤耐性全利用する手法によ
ってｐＢＲ３２２（ＤＳｃｒｔ　　１部位上に何等かの
挿入ＤＮＡ２有するクローンを選択し、この選択された
株の中から、プロレンニンｃＤＮＡｆ持つクローンを選
択するためにコロニーＨ／％イブリダイゼーション（ｃ
ｏｌｏｎｙ　ｈｙｂｒｉ−ｄｉｚａｔｉｏｎ　）　ｆ行
う。この手法によるグロレンニンｃＤＮＡｆ持つクロー
ンの選択は、先に取得したプロレンニン特異的　ＲＮＡ
ｆ放射線標識した　ＲＮｍ、　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　ｍＡたとえば１２５１−
−ＲＮＡや”Ｐ−、ＲＮＡｆプローブ（ｐｒｏｖｅ　）
としたコロニー・ハイブリダイゼーションにより行うこ
とができる。

このようにして得られる仔牛プロレンニンのｃＤＮＡｆ
含有して成る複合プラスミドを持つと考えられる宿主微
生物候補株はノ・イブリッド・アレステッド・トランス
レーション法によす、挿入され友プロレンニン構造遺伝
子の存在を確認する。

後に、実施例に於て示すとおり、本発明によって。

ハイブリッド・アレステッド・トランスレーション法で
確認されたプロレンニン構造遺伝子の実質的に全鎖長を
持つクローンが提供された。更に、Ｍａｔａｍ−Ｇｉｌ
ｂａｒｔ法によッテプロレンニンのＮ末端アミノ酸配列
に対応する塩基配列の存在が確認された。

本発明の複合プラスミド及びそれ全含有する宿主微生物
の取得の一轢様について説明したが、宿主微生物、該複
合プラスミドの合成、ベクター・プラスミドなどには種
々の変更態様を採用することができる。宿主微生物の他
の例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅの如き酵母、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔ
ｉｌｉｓ　（枯草菌）の如きグラム陽性細菌、Ｐｓｔｔ
ｕｄｏｍｏｎα８属細菌の如きダラム陰性細菌などを例
示することができる。たとえば、制限エンドヌクレアー
ゼ−リガーゼ法を利用して複合プラスミドを合成する手
法も利用可能である。

父、ベクター・プラスミドの他の例としては、大腸菌を
宿主微生物とする場合ＶＣは、例えば、ｐＭＢ９その他
の公知ベクター・プラスミド、酵母菌を宿主微生物とす
る場合には、例えば２μＤＮＡ又は酵母染色体由来の各
棟の公知ベクター・プラスミド、枯草菌を宿主微生物と
する場合ＶＣは、例えばｐＵＢｌｌＯの如き公知ベクタ
ープラスミド、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎα８属細歯全宿主微
生物とする場合には各種の薬剤耐性プラスミドなど全例
示することができる。

以下、本発明の複合プラスミド及びそれを含有する宿主
微生物の形成の一例について、更に詳しく具体例を示す
。

■、プロレンニンｍ　ＲＮ　Ａ　（メツセンジャーＲＮ
Ａ）の分離 生後数週間以内の作中の第４胃粘膜層から、プロレンニ
ンｒｎＲＮＡｆ抽出採取する。抽出は、内山らの方法（
Ａｇｒ、　Ｂｉａｌ、　Ｃｈｅｍ、、　　４４．１３７
３〜１３８１．１９８０）の改良法で行うことができる
。例えば、作中第４胃粘膜層を採取し、低温で粉末化し
たのち、フェノール法好ましくはベントナイトの存在下
でフェノール法を利用して全ＲＮＡｆ抽出する。得られ
た高分子ＲＮＡ含有水性抽出相を沈殿剤処理たとえばリ
チウムクロライドで処理し、形成される高分子ＲＮＡ含
有沈殿物を採取することができる。

例えば上述のようにして得ることのできる高分子ＲＮＡ
含有沈殿物の水溶液を形成し、たとえばポリＣＵ）セフ
７０−ｘ　（ｐｏｌｙ　Ｕ−８ｅｐんａｒｏｓｅ　）や
オリゴ（ｄＴ）セファロースなどの如き吸着剤全利用し
たアフイニテイ・クロ脅トゲラフイーによって、グロレ
ンニン、ｎＲＮＡ含有成分を分離採取することができる
。上記高分子ＲＮＡ含有沈殿物水溶液を、上記例示の如
き吸着剤カラム中を流下させると、グロレンニン、、Ｒ
ＮＡｆ含むｍＲＮＡ分画が選択的に吸着され、リボゾー
ムＥＮＡその他の夾雑成分が流出除去される。ホルムア
ミド水溶液で溶離させることによりプロレンニンｍＲＮ
Ａ宮有ホルムアミド水＠液が得られる。この操作は複数
回ぐりかえして行うのが好ましい。

上述のようにし、で得ることのできるプロレンニン□Ｒ
ＮＡ含有分画金、それ自体公知の手法に従って蔗糖密度
勾配遠心分画法を利用して分子量分画し、ｌ　５８ｆ中
心とする分子量金持つ分画（プロレン＃ン、ＬＲＮＡ分
画）全採取できる。プロレンニンｒｒＬＲＮＡ分画は試
験管内蛋白質合成系によって確認することができる。こ
の分画操作も、所望により複数回くりかえして行うこと
ができる。

■、グロレンニン。ｃＤＮＡの調製。

上述のようにして得ることのできるプロレンニン　ＲＮ
Ａｆ鋳型として、逆転写酵素音用いる手法を適用し、該
ｍＲＮＡの相補的−本領ＤＮＡｆ合成したのち、アルカ
リ処理して鋳型、、、ＲＮＡ”ｚ除去し、−本鎖のプロ
レンニン　ｃＤＮＡｆｃ得ることができる。

Ｆｌｔは、該プロレンニンｍＲＮＡＶＣｌ４種のデオキ
ヌクレオチド三リンｎ（ｄＸＴＰ’ｓ）の存在下、オリ
ゴＣｄＴ）ｋブライマーとして、逆転写酵素を作用させ
ることにより、該プロレンニンｒｒＬＲＮＡｆ鋳型とし
て、その相補的−本鎖ＤＮＡを合成することができる。

合成された該相補的−本領ＤＮＡｆアルカリ存在下、約
７０℃程度に加温する処理により該鋳型、ｒＬＲＮＡｆ
分解的に除去分解−本鎖のプロレンニンｃＤＮＡｆｔ形
成することができる。

上述のようにして得られた一本鎖のプロレンニンｃＤＮ
ＡＶＣＤＮＡポリメラーゼ■ポリ転写酵素を、ｄＸＴＰ
’ｓの存在下で作用させることにより、相補的二本鎖ｃ
ＤＮＡｆｊ（合成できる。合成され之相補的二本鎖ｃＤ
ＮＡＩｒ１ヘヤピン構造部分を有するので、該構造部分
を選択的に切除する酵素ネタレアーゼＳＩｔ作用させる
ことにより該ヘアピン構造部分を除去して、完全なプロ
レンニン特異的二本鎖ｃＤＮＡを合成することができる
。

■、グロレンニンｃＤＮＡとベクタープラスミドの連結
。

上述のようにして合成される完全なプロレンニン特異性
二本鎖ｃＤＮＡの両３′末端と、適当な宿主のベクター
・プラスミド全所望の部位で切断することによって導か
れる線状ＤＮＡの両３′末端に、夫々相補性を有するデ
オキシヌクレオチジルホモボリマーを付加する。

例えば、該プロレンニン二本鎖ｃＤＮＡの両３′末、４
に、ｄＧＴＰ（デオキシグアノシントリホスエート）の
存在下、ＴｄＴｆ作用させることにより、該３′末端に
ボＩＪ　ｄ　Ｇホモポリマーを付加することかできる。

一方、適当なベクター・プラスミド、たとえばＥ、ｃｏ
ｌｉのベクター・プラスミド、ＢＨ３２２に、制限酵素
Ｓａｌ　ｌヌクレアーゼを作用させることにより、線状
、ＢＨ３２２’ＤＮＡｆ形成する。この線状ＤＮＡの両
３′末端−本鎖部分に、４種のデオキシヌクレオチド三
リン酸（ｄＸＴＰｈ）の存在下ｃＤＮＡポリポリーゼ！
全作用させることにより、該両３′末端−本鎖部分を修
復した後、デオキシシトシントリホスフェ−）　（ｄｃ
ＴＰ）の存在下、ＴｄＴを作用させることにより、該修
復部末端にポリｄＣホモポリマーｔ−付加することがで
きる。

本発明の仔牛プロレンニンのｃＤＮＡｆ含有して成る複
合プラスミドは、例えば上述のようにして得ることので
きる３′末端にポリｄＧホモポリマーの付加されたプロ
レンニン特異性二本鎖ｃＤＮＡと例えば上述のようにし
て得ることのできる修復された３′末端にポリｄＣホモ
ポリマーの付加された線状ｐＢＲ３２２ＤＮＡとを混合
し、アニーリングすることにより、ポリｄＣホモポリマ
一部とこれ金相補性のあるポリｄＧホモポリマ一部の部
分で結合させて、プロレンニン構造遺伝子の実質的に全
鎖長全含有する複合プラスミドを合成することができる
。

■、宿主微生物の形質転換と仔牛プロレンニンのｃＤＮ
Ａｆ（含有して成る複合プラスミドを持つクローンの選
択。

宿主微生物たとえば大腸菌（ｇ、ｃ、ｏｌｉ　　ｃ６０
０（ｍ”　）　ｔカルシウム処理した後、前述のように
して得うれた仔牛のプロレンニンのｃＤＮＡｆ含有して
成る複合プラスミドと混合して、該複合プラスミドを大
腸菌内に取り込ませて、形質転換株を形成する。このよ
うにして形成された形質転換株ノ中カラ、プロレンニン
ＣＤＮＡｆ含有して成る複合プラスミドを有するクロー
ンを選択する。

例えば、上に例示しｆｃｐＢ　Ｒ３２２の互Ａユ１部位
にプロレンニンｃＤＮＡを挿入した場合には、この選択
は、アンピシリン耐性で且りテトラサイノリン感受性で
ある仔牛のプロレンニンのｃＤＮＡを含有して成る複合
プラスミドを持つと期待される形質転換株と、アンピシ
リン耐性で且つテトラサイクリン耐性である他の形質転
換株とを、アンピシリン及びテトラサイクリンに対する
薬剤耐性の差異を利用してまず予備的に行うことができ
る。

このようにして予備的に選択された仔牛のプロレンニン
のｃＤＮＡｆ含有して成る複合プラスミドを持つと期待
される形質転換株から、真に該複合プラスミドを持つ形
質転換株を選択分離するたメニ、コロニー・ハイブリダ
イゼーション及びＩ・イブリッド・アレステッド・トラ
ンスレーション法を行う。コロニー・ノ・イブリダイゼ
ーションは、先に述べ九手法で得ることのできるプロレ
ンニン特異的ｍＲＮＡを放射線標識したｍＲＮＡたとえ
Ｉｄ”Ｉ−ＲＮＡや”Ｐ−ｍＲＮＡｆプローフとした、
それ自体公知の手法により行うことができる。このコロ
ニー・ハイブリダイゼーションで得られた、ハイブリダ
イゼーション（十）の株について、更にそれ自体公知の
ハイブリッド・アレステッド・トランスレーション法に
より、挿入されたプロレンニン構造遺伝子の存在を確認
する。

以下、実施例により本発明複合プラスミドの合成、それ
を含有する宿主微生物の形成の一例について、更に詳し
く述べる。

実施例 （１）　　プロレンニンメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮ
Ａ）の抽出精製 生後２週間の作中第四胃（２頭分）の粘膜層約１４０２
全剥離し、０．０２５Ｍ　ＥＤＴＡ、０．１ＭＮａＣ１
，１％５ＤＳｆ含む冷１ｎ、−友ｏ、ＩＭトリスー塩酸
緩衝液（ｐ　Ｈ９，Ｏ）で洗浄し、アセトン−ドライア
イス中で脱水、凍結し、更にホモヂナイザーで粉末化し
た。得られた粉末はベントナイト０．７２を含む上記緩
衝液１４に懸濁し、フェノール、クロロフォルム、イソ
アミルアルコ−Ａ４合溶媒（５０：５０：１）５００ａ
ｊを加えて攪拌した後遠心して上層水相をとり出した。

同様の操作を更ＶＣ６回くり返した後に最後に得られた
水相に終！Ｉ度２ＭとなるようにＬｉＣ１を加え、４℃
で一夜放置後遠心によって沈殿を集め、これを０．１×
Ｓ　Ｓ　Ｃ（１５０ｍｕ（ＤＮａＣｌ及び１５ｙｙｃＭ
のクエン酸三ナトリウム塩）６０−に溶解した。同様の
操作を更ＶＣ１回くり返した後、得られた溶液１７ｃ２
倍量のエタノールを加えて高分子ＲＮＡｆ沈殿させる操
作を３回くり返した。最後に得られた沈殿を水に溶解し
、４倍量の０．０１ＭＥＤＴＡ、０．７ＭＮαＣ１，２
５％フォルムアミドを含むトリス塩酸０．２％ＳＤＳ、
９ｏ％フォルムアミドｏ、ｏｔＭりんばカリを含む溶液
（ｐ　Ｈ７，５）によってカラムに吸収されｆ（ｍＲＮ
Ａを溶出させ友。溶出液は蒸溜水に対し透析後、エタノ
ールを加えてｒｒＬＲＮＡを含むＲＮＡを沈殿させ友。

沈＆２は溶解後５−２０％蔗糖密度蔗糖中でｓｏ、ｏｏ
ｏｘｒ、１３時間遠心しｔ後、プロレンニンｒｒＬＲＮ
Ａｆ有し約１５ｆを中心とする分子Ｉｌを有するＲ１／
１１５Ａ’、とじて１２０μｒ２含む分画を得次。この
分画はウサギ網状赤血球リゼートを用いる試験管内蛋白
合成系による検定で、はん訳生成物の７０％以上に達す
るプロレンニンを生成する活性を有することが確認され
た。

（２）　　プロレンニンｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの調製０）で得
たプロレンニンｍ　ＲＮ　Ａを鋳型として一本領ｃＤＮ
Ａを合成するために、ｍ　ＲＮ’　Ａ　３０８ｇ、ＡＭ
Ｖ逆転写酵素１４０単位、オリゴ（ｄＴ）　ｕ−ｔｓｌ
、６μｍ１四種のデオキシヌクレオチド三りん酸各０．
５　ｍＷ、　７りｆ、／−ｒイシンＤ　４０　ｔｔ　１
ＳＮａＣ１６０ｍＭ、　　ＭｇＣｌ２　６　ｍｕ、　　
ＤＴＴ　　２　ｍＭ　１　　ト　リ、ｒ、　Ｊｉ酸塩ｓ
　ＯｍＭ（ｐＨ８，３）を４００ｔｔｌ中に含む反応液
を４２℃１時間インキュベートした。

反応生成物をフェノール抽出、エタノール沈澱によって
分離した後０．３１ソ　ＮｃＬＯＨに溶解し・６８℃１
５分加熱することによって鋳型ｍ　ＲＮ　Ａを分解し、
次いでセファデックスＧ−５０ゲル濾過によシー本領ｃ
ＤＮＡ２４ｏｎ＆を取得した。

得られた一本領ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを鋳型として二本鎖ＤＮ
Ａを合成するだめに、上記−重鎖ｃＤＮＡ２００ｎｌｌ
。

ＤＮＡポリメラーゼ（フラグメントＡ）１８単位、四種
のデオキシヌクレオチド三りん酸各１ｍＭ’。

Ｍ’ｇＣ１，４倶Ｍ、β−メルカプトエタノール０．５
ｍＭ’、　　）リス塩酸塩（ｐＨ７，５）　３０ｔｎＭ
を２４０μｌ中に含む反応液を２５℃４時間インキュベ
ートした。反応生成物をフェノール抽出、エタノール沈
誠によって分離した後、酢酸ナトリウム３０ｍＭ、Ｎａ
Ｃｌ３０ｍｕＳＺｎＳ０．１ｍＭ（ｐＨ４，６）を含む
２００μｌの反応液中でヌクレアーゼＳｌ　８０単位と
４０℃、９０分処理することによシヘアピン構造を分解
除去した。これを５−３０％蔗糖密度勾配中で９５．０
００　ｚ　ｌ、１２時間遠心して平均０．７メガダルト
ンの分子量を有するヘアピン構造のないプロレンニン二
本鎖ｃ　Ｄ　ＮＡＬｏｏｍＩＩを取得した。

（３）　　プロレンニンｃＤＮＡとベクタープラスミド
の連結 （２）で得られたプロレンニンｃ　Ｌ）ＮＡ　０．０５
　ｐｍｏｌｅｔをターミナルデオキシヌクレオデジルト
ランスフェラーゼ８０単位、ｄＧＴＰｏ、０６ｔｔｔｎ
ｏｌｓ。

Ｍ’ｇＣ１，５ｍＭ、Ｉｉ’ＥＰＥＳ−ＮａＯＨ１０ｍ
Ｍ（ｐＨ７，１）を含む１２０μｌの反応液（Ａ）中で
３７℃、６分インキュベートし、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの３′
末端に（ｄＧ）ホモポリマーを付加した。一方、ベクタ
ープラスミドｐＢＲ３２２をＳａｇ　　１エンドヌクレ
アーゼで切断して得た線状ＤＮＡを四種のデオキシヌク
レオチド三シん酸存在下ＤＮＡポリメラーゼ（フラグメ
ントＡ）とインキュベートしてその末端−本鎖部分を修
復して得られた０、５ｐｍ６１　ＨのＤＮＡをターミナ
ルデオキシヌクレオチラルトランスフェラーゼ２４単位
ｄｃＴＰ０．０４ｐｍｔｚＬｇ、ＣｏＣ１，１ｍＭ、カ
コジル酸カリウム塩１００　ｍＷ、　　）リス塩酸塩３
０ｍＡ／（ｐＨ７，６）を含む１２０μＥの反応液ＣＢ
＞中で２５℃１０分インキユベートシ、その３′末端に
（ｄＣ）ホモポリマーを付加した。反応液Ａｌ２Ｏμｊ
と反応液Ｅ２４μｌとをそれぞれＥＤＴＡ添加により反
応停止後θ℃で混合し、フェノール抽出およびエタノー
ル沈澱によって反応生成物を分１催する。

これを１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、１００ｍＭ　　ＮａＣ１を
含む１００ｍＡｆ）リス塩酸塩（ｐＨ７，６）に０．３
μｉ　／　ｍｅの割で溶解して６８℃２時間加温後３０
分間に５℃の降温速度で室温まで冷却して（ｄＧ）ホモ
ポリマーを付加したプロレンニンｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ト（
ｄＣ）ホモポリマーを付加したｐＢＡ！３２２ＤＮＡと
をアニーリングによシ連結させた。

（４）連結ＤＮＡによる大腸菌の形質転換とプロレンニ
ンｃＤＮＡを有するクローンの取得（３）で得た連結Ｄ
ＮＡを用いて大腸菌を形質転換するにはカルシウム処理
による常法を用いた。Ｅ、。

ｃｏｌｉ　Ｃ６０Ｏｒ７ｃｍｐを形質転換処理後、アン
ピシリン３０μｌ／／ｖｒｌを含むＬ−プロス寒天平板
培地上で形質転換株８０４株を選択し、次いでテトラサ
イクリン１０μｆＩ／Ｉｌｌを含む同培地上でアンピシ
リン耐性、テトラサイクリン感受性を示す株を選択した
。得られた総計６２２株をアンピシリン３０μ／ｌ　／
　ｍｌを含有するＬ−グロス寒天上にはりつけたミリポ
アフィルタ−上に格子状に植苗してコロニーを形成させ
、次いでこのフィルターを洗浄、プロテアーゼ処理、９
５％エタノールおよびクロロフォルム処理した後真空中
８０℃２時間加熱して各棟のＤＮＡをフィルター上に焼
付けた。同時に作成した相同な三枚のフィルターの中−
枚は＋１）で得られたプロレンニンｍ　ＲＮ　Ａ　ヲ”
’　１で標識したものをグローブとし、−枚は過剰のデ
ＲＮＡで処理した後同じ１２ｓＩ−ｍＲＮＡをプローブ
とし、更に一枚は１ｔｓＩ−ｒＲＮＡをプローブとして
常法によるコロニーハイブリダイゼーションを行った。

得られたハイブリダイゼーションの結果を上記の相同な
三枚ごとに比較することにより、τＤＮＡを含むクロー
ンを除外し、プロレンニンｃＤＮ’Ａを有すると考えら
れるクローン３０株を取得した。更にこうして得られた
３０株から、セシウムクロライド−エチジウムブロマイ
ド平衡密度遠心でプラスミドＤＮＡを取得し、その各々
ヲ（１）で得られたプロレンニンｍ　ＲＮ　Ａとハイブ
リダイズさせた後、ウサギ網状赤血球リゼートを用いる
試験管内蛋白合成系で検定することにより、プロレンニ
ン合成を阻止するかどうかを調べた。

このハイブリッド・アレステッド・トランスレーション
法により明らかにプロレンニンｃＤＮＡを含有すると確
定されたクローン１０株が取得された。

（５）　　クローン化されたプロレンニンｃＤＮＡｒ７
）％性 （４）で得られたプロレンニンｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを含むと
確定されたクローンの中の一つ１ｏ２−Ｂ株が含むｐＴ
ＡｃＲ１プラスミドＤＮＡを抽出し、炙り１エンドヌク
レアーゼで処理した後アガロースケル電気泳動にかけた
藉果、プロレンニンｃＤＮＡの全長にはぼ匹敵する挿入
ＤＮＡフラグメントが検出された。この挿入ＤＮＡフラ
グメントの塩基配列をＭａｚａｍ−Ｇｉｔｂｓｒｔ法に
よって決定した結果下に示すように、明らかにプロレン
ニンのＮ末端アミノ酸配列に対応する塩基配列の存在が
証明された。

”−ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＡＴＣＡＣＴ　ＡＧＧ　ＡＴＣＣ
ＣＴ　ＣＴＧＡｌａ　　Ｇｌｕ　　Ｉｒｅ　　Ｔんｒ　
　Ａｒｇ　　Ｉｒｅ　　Ｐｒｏ　　Ｌｅｗ二基込ＧＧＣ
−” Ｔｙｒ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｙ 上記の方法で得られたプロレンニンｃＤＮ’Ａを含むと
確定されたクローンより得られたプラスミドＤＮＡにつ
いて、Ｍａｚａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法により塩基配列を
決定した結果は、その中の一つｐＴＡＣＲ１０２Ｂ６は
、プロレンニンｃＤＮＡ全長１０９５塩基の中、プロレ
ンニンＮ末端に対応する１番より８９０番までの塩基を
、７）ＴＡＣＲ１０３Ｃ２は、７７１番よりプロレンニ
ンＣ末端に対応する１０９５番までの塩基を含有してい
た。プロレンニンｃＤＮＡ全長を含有するプラスミドｐ
ＣＲ１００１を次のように造成した。

即ち、ｐ７’ＡｃＲ１０２Ｂ　６　オｊ　ヒフ）ＴＡＣ
ＲＩ　Ｏ３Ｃ２を５ａｌＩで処理することによって得ら
れた各挿入ＤＮＡ断片を、ｅｔｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ｍ
　　テ消化して両３′末端から約１５０塩基を切り縮め
、次いで、ｐＴＡＣＲ１０２ＢＧ由来の断片はＫｐｎｌ
で１．ＴＡＣＲ１０３Ｃ２由来の断片はＢαｍＨ＋で、
夫々、切断した後、両者を混合アニーリングした（ａ）
。これとは別に、ｐＴＡｃＲ１０２ＢＧプラスミドＤＮ
ＡをＥｃ　ｏＲｔ　＋　ＫｇｆＬ［で処理して得られる
小ＤＮＡ断片（ｂ）、及びｐＴＡｃＲＬ０３Ｃ２プラス
ミドＤＮＡをＥｃｏＲＥ＋Ｅα常ｆｉｔで処理して得ら
れる大ＤＮＡ断片（Ｃ）をそれぞれ調製し、（α）（ｂ
）（Ｃ）の王者を混合アニーリング後ｃＤＮＡ−リガー
ゼ（ｊｉｇαｓｅ）で連結した。かくして得られたｐｃ
Ｒｔｏｏｔはプロレンニン全アミノ酸配列に対応する完
全なｃＤＮＡを含有し、その停止コドンを含む塩基配列
は下に示す通りであった。

ＧＣ７’　　ＧＡＧ　　ＡＴＣ，４ＣＣＡＧＧ　　ＡＴ
ｃ　　ＣＣＴ　　ＣＴＧ　　７’ＡＣ，４，４，４ＧＧ
ＣＡｌａ　Ｇｉｎ　　Ｉｒｅ　　ｉ’ｈｒ　Ａｒｇ　　
Ｊｉｇ　　Ｐｒｏ　　Ｌｅｇ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ
　Ｌｙｓ　　Ｓａｒ　Ｌａｗ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　ＡＬａ
　Ｌａｗ　Ｌｙｓｌ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１０６０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　８０　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　１　Ｇ。

ＧＡＧ　　ＣＡＴ　　ＧＧＧ　　Ｃ７”７’　　ＣＴＧ
　　ＧＡＧ　　ＧＡＣＴＴＣＣＴＧ　　ＣＡＧ　ＡＡＡ
　　ＣＡＧ　　ＣＡＧ　　ＴＡＴ　ＧＧＣＡＴＣＡＧＧ
　　ＡＧＣＡＡＧＧｌｕ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｌｇｕ　Ｌ
ａｗ　Ｇ１１ＬＡｓｐ　Ｐｈｅ　　Ｌｅａ　Ｇｉｎ　Ｌ
ｙｓ　Ｇｌｎ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｉｌｇ　Ｓｅ
ｒ　Ｓｇｒ　ＬｙｓＣＴＧ　　ＡＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴ
Ｇ　　ＧＡＴ　　ＡＧＴ　　ＣＡＧＬｅｓｔ　　Ｔｈｒ
　　Ａｓｎ　　Ｔｙｒ　　Ｌａｗ　　Ａｓｐ　　Ｓｅｒ
　　Ｇ１ｎＴＡＣＴＴＴ　ＧＧＧ　　ＡＡＧ　　ＡＴＣ
ＴＡＣＣＴＣＧＧＧ　　ＡＣＣＣＣＧ　　ＣＣＣＣＡＧ
　　ＧＡＧ　　ＴＴＣＡＣＣＧＴＧ　　ＣＴＧ　　ＴＴ
Ｔ　　ＧＡＣＴｙｒ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｙ　　Ｌｙｓ　
　ＩＩｓ　　Ｔｙｒ　　Ｌｇｕ　　Ｇｌｙ　　Ｔｈｒ　
　Ｐｒｏ　　Ｐｒｏ　　Ｇｉｎ　　ＧＬｗ　　Ｐｈｅ　
　Ｔｈｒ　　Ｖａｌ　　Ｌｇｕ　　Ｐｈｔ　　ＡｓｐＡ
（：’７’　　ＧＧＣＴＣＣＴＣＴ　　ＧＡＣＴＴＣＴ
ＧＧ　　ＧＴＡ　　ＣＣＣＴＣＴ　　ＡＴＣＴＡＣＴＧ
ＣＡＡＧ　　ＡＧＣＡＡ７’　ＧＣＣＴＧＣＡＡＡ７’
ｈｒ　　Ｇｌｙ　　Ｓｅｒ　　Ｓｉｒ　　Ａｓｐ　　Ｐ
ｈｒ　　Ｔｒｐ　　Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　　Ｓｓｒ　　Ｊ
ｉｇ　　Ｔｙｒ　　Ｃｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ｓａｒ　Ａｓ
ｎ　　Ａｌａ　　Ｃｙｓ　　ＬｙｓＡＡＣＣＡＣＣＡＧ
　　ＣＧＣＴＴＣＧＡＣＣＣＧ　　ＡＧＡ　　ＡＡＧ　
　’ｌ’ｃＧ　　ＴＣＣＡＣＣＴＴＣＣＡＧ　　ＡＡＣ
ＣＴＧ　　ＧＧＣＡＡＧ　　ＣＣＣＡｓｎ　　Ｈｉｓ　
　Ｇｉｎ　　Ａｒｇ　　Ｐｈｇ　　Ａｓｐ　　Ｐｒｏ　
　Ａｒｇ　　Ｌｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｂａｒ　　Ｔｈｒ　
　Ｐｈｇ　　Ｇｌｎ　　Ａｓｎ　　Ｌａｗ　　Ｇｌｙ　
　Ｌｙｓ　　Ｐｒ。

Ｃ’ｌ’Ｇ　ＴＣＴ　ＡＴＣＣＡＣＴＡＣＧＧＧ　ＡＣ
Ａ　ＧＧＣＡＧＣＡＴＧ　ＣＡＧ　ＧＧＣＡＴＣＣ７’
Ｇ　ＧＧＣＴＡＴ　ＧＡＣＡＣＣＧＴＣＬｇｕ　　Ｓｅ
ｒ　　ｌｉｅ　　Ｈｉｓ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｙ　　Ｔｈ
１−　Ｇｌｙ　　Ｓａｒ　Ｍｅｔ　　Ｇｉｎ　　Ｇｌｙ
　　Ｊｉｇ　　Ｌｇｕ　　Ｇｌｙ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｐ
　　Ｔ五ｒＶａ１１２０　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１３゜
ＡＣＴ　ＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＴＴ　ＧＴＧ　ＧＡＣＡ
ＴＣＣＡＧ　ＣＡＧ　ＡＣＡ　ＧＴＡ　ＧＧＣＣＴＧ　
ＡＧＣＡＣＣＣＡＧ　ＧＡＧ　ＣＣＣＴｈｒ　Ｖａｌ　
　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　　ｌｉｅ　Ｖａｌ　　Ａｓｐ　ｌｉ
ｅ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ
　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｐｒ。

寥 ＧＧＧ　　ＧＡＣＧＴＣ’ｌ’Ｔｃ　　ＡＣＣＴＡＴ　
　ＧＣＣＧＡＡ　　ＴＴＣＧＡＣＧＧＧＧｌｙ　Ａｓｐ
　Ｙａｌ　　Ｐｈｅ　　Ｔｈｅ　Ｔｙｒ　Ａメｔｘ　Ｇ
ｌｕ　Ｐｋ、ｇ　　Ａｓｐ　ＧＬｙＡＡＣＡ７’Ｇ　　
ＡＴＧ　　ＡＡＣＡＧＧ　　ＣＡＣＣＴＧ　　ＧＴＧＡ
ｓｎ　Ｍｅｔ　Ｍｅｔ　　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　　
Ｌｔｔｙ　Ｖａ１ＧＣＣＣ，４，４ＧＡＣＣＴＧ　　Ｔ
ＴＣＴＣＧ　ＧＴＴ　７’、４ＣＡＴＧ　ＧＡＣＡＧＧ
Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　　Ｓ６ｒ　
Ｖａｌ　　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　ＡｒｇＣＴＧ　　
ＧＧＧ　　ＧＣＣＡＴＣＧＡＣＣＣＧ　　ＴＣＣＴＡＣ
ＴＡＣＡＣＡ　ＧＧＧＬｅａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　　Ｉｊ
ｇ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　５ａｒＴｙｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　
ＧｌｙＶａｌ　　Ｔｈｒ　　Ｉｒｅ　　Ｓｅｔ　　Ｇｌ
ｙ　Ｖａｌ　　ＶａＬ　　Ｖａ１ＡＣＧ　　ＧＧＣＡＣ
ＣＴＣＣ，４ＡＧ　　ＣＴＧ　　ＧＴＣＧＧＧＴｈｒ　
　Ｇｌｙ　　Ｔｈｅ　　Ｓｅｗ　　ｒ、ｙｓ　　Ｌａｗ
　　Ｖａｌ　　ＧＬｙＡＴＴ　　ＧＧＡ　　ＧＣＣＡＣ
Ａ　　ＣＡＧ　　ＡＡＣＣＡＧ　　ＴＡＣＩｒｅ　　（
Ｅｌｙ　　Ａｌａ　　Ｔｈｒ　　Ｇｉｎ　　Ａｓｎ　　
Ｇｉｎ　　ＴｙｒＧＣＣＴＡＴ　　ＡＣＣＡＧＣＣＡＡ
　　ＧＡＣＣＡＧ　　ＧＧＣＡｌａ　　Ｔｙｒ　　Ｔｈ
ｒ　　Ｓｕｒ　　Ｇｉｎ　　Ａｓｐ　　Ｇｉｎ　　Ｇｌ
ｙＴＣＣＣＡＧ　　ＡＡＡ　　ＴＧＧ　　Ａ’ｌ’ＣＣ
ＴＧ　　ＧＧＧ　　ＧＡＴＳｇｒ　　Ｇｉｎ　　Ｌｙｓ
　　Ｔｒｐ　　Ｉｒｅ　　Ｌａｗ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｐ
かくして得られたプラスミド９ＣＲ１００１が含有する
完全なゾロレンニンｃＤＮＡを、大腸菌ラクトースオ（
ロンの世プロモーター領域よりβ−ガラクトシダーゼ構
造遺伝子中同酵素のＮ末端より７番目のアミノ酸ロイシ
ンに対応するコドンまでを含有するｐＢＲ３２２由来の
プラスミドに読み取りフレームを合せて連結することＫ
より１．ＣＲるプロレンニン蛋白が生成していることが
検出された。なお、前記菌株Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＣＲＩは
アメリカン・タイプΦカルチュア・コレクションにＡＴ
ＣＣ３９１７０として寄託されている。

（ほか１名） ＣＲ１をアンピシリン３０μｆ／ａｔｊ、テトラサイク
リンｌＯμｍ／＋−及びＩＰＴＧ　　１ｍＭを含有する
肉汁培地中で３７Ｃ振−培養し、増殖が最大に達した時
に％菌し、音波処理によって菌体を破壊し無細胞抽出液
を得た。本抽出液について１２５Ｉでラベルした抗プロ
レンニン抗体を用いるラジオイムノアッセイ法によりプ
ロレンニン蛋白の測定を行つた結果、宿主ｌ細胞当り約
１．　ＯＯ０分子に相当す手続補正書（自発） 昭和６３年１２月２６日 特許庁長官　吉　１）文　毅　　殿 １、事件の表示 昭和６３年特許願第３０２１７６９ ２、発明の名称 複合プラスミド及びそれを含有する微生物３、補正をす
る者 事件との関係　　　　特許出願人 住所　東京都杉並区堀ノ内１−５−２１氏名別府輝彦 ４、代理人　〒１０７ ５、補正命令の日付　　　なし ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 ８、補正の内容 別紙のと８す （１）　　本願特許請求の範囲の記載（明細書第１頁第
５〜１３行）を別紙のとおり訂正する。

（２）明細書第６頁第６行と第７行の間に以下の文を加
入する。

ｒ本発明の別の目的は、仔牛プロレンニンのｃＤ　Ｎ　
Ａを組換宿主微生物細胞において発現させることを特徴
とする仔牛プロレンニンの製造方法を提供するにある。

より具体的には、仔牛プロレンニンｃＤＮＡを組換宿主
微生物細胞において発現させ得る発現ベクター・プラス
ミドを調製し、宿主微生物細胞を形質転換して、組換宿
主微生物を得、該組換宿主微生物細胞を培養して仔牛プ
ロレンニンを産生させ、且つこれを回収する一連の工程
からなる方法を提供するにある。」（３）同第３５頁第
１〜９行に［かくして得られた・・菌株Ｅ、ｃｏｌｉＪ
とあるを以下のとおり訂正する。

「かくして得られたプラスミドｐｃＲ１００１が含有す
る完全なプロレンニンｃＤＮＡを、大腸菌ラクトースオ
ペロンのｌａｃ　７’ロモーター領域に読み取り７レー
ムを合せて連結することニヨリ、ｐｃＲ２００１を造Ｊ
ｆｆｉＬ、Ｅ。

入した。

上記ｐｃＲ２００１の造成は次の通りに行った。

（１）大腸菌ラクトースオペロンのＩａｃ７’Ｃ７モー
ター　リボゾーム結合部位およびβ−ガラクトシダーゼ
のＮ末の一部を含有するｐＢＲ３２２由米のプラスミド
ｐＢ　Ｈ２０をＥｃ。

ＲＩＪａ理して線状ＤＮＡとし、次いでＤＮＡポリポリ
ーゼ■によって末端−本＃ＡＤＮＡ部分を二本鎖とした
後、ＢａｍＨＩ部位を含むデカヌクレオチドをリンカ−
として両端にＴ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、更
にＢａ＋ｍＨＩ＋５ａｌＩ処理する。（２）ｐＴＡｃＲ
１０２Ｂ６またハｐｃＲＩ　Ｏ０１ヲＢａｔｎ　　ＨＩ
＋ＫｐｎＩＩＩ＆理してプロレンニンｃＤＮＡ塩基配列
中Ｎｏ、１５の゛Ｂａ５ｚＨ１部位よりＮ０９２５３の
ＫｐｎＩ部位までの挿入ＤＮＡ断片を得る。（３）ｐｃ
Ｒｌｏｏｌを堕Ｉ十江Ｉ処理してプロレンニンｃＤＮＡ
塩基配列中Ｎｏ、２５４の４凹１部位より末端Σａｌ　
　１部位までの挿入ＤＮＡ断片を得る。上記（１）（２
Ｘ３）で得られた各ＤＮＡを連結後、更にＴ４−ＤＮＡ
リガーゼ処理することによって環状ＤＮＡ　　ｐｃＲ２
００１を得ることができる。

得られた菌株　Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｊ （４）同第３６頁第４行の後に改行して以下の文を加入
する。

「生成物の分子量がプロレンニンと同程度であることは
、同抽出液を抗プロレンニン抗体をセファロース４Ｂ上
に固定化した同相抗体カラムを通過させ、吸着された蛋
白を溶出後５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よって検定することによって確認された。」以上 （別紙） ［特許請求の範囲〕 ｒｌ、作中ズａレンニンのｃＤ　Ｎ　Ａを含有して成る
ことを特徴とする組換プラスミド。

２、該プラスミドのベクター・プラスミドがｐＢＲ３２
２である特許請求の範囲第１項記載の組送プラスミド。

項記載の組換プラスミド。

旦、作中プロレンニンのｃＤ　Ｎ　Ａを含有して成る艶
濃プラスミドを持った宿主微生物。

ヱ、該宿主微生物が大腸菌（Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）である特許請求の範囲第１項記載の微生物。

ドがＣＲ１００Ｉ＋ある　許請求の範囲第１細胞を形質
転換して組換宿主微生物を得、該組換宿主微生物細胞を
培養して作中プロレンニンを産載の製造方法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、仔牛プロレンニンの＿ｃＤＮＡを含有して成る複合
   プラスミド。 ２、該プラスミドのベクター・プラスミドが＿ｐＢＲ３
   ２２である特許請求の範囲第１項記載の複合プラスミド
   。 ３、仔牛プロレンニンの＿ｃＤＮＡを含有して成る複合
   プラスミドを持つた宿主微生物。 ４、該宿主微生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃ
   ｏｌｉ）である特許請求の範囲第３項記載の微生物。