JPH0588110B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はポリヌクレオチドに関する。詳しくは
酵母の分泌シグナルをコードするポリヌクレオチ
ドに関する。

（発明の構成） 酵母は、細胞の構造や機能が高等生物の特徴を
備え、また、食品、医薬品、飼料等の原料とし
て、人間の日常生活と深い係わり合いを持つ有用
な微生物であり、遺伝子工学に於ける宿主として
の開発が期待されている。

しかしながら、酵母の細胞表層は細胞膜の外側
に強固な細胞壁を有するため、遺伝子組換え技術
によつて生産された有用物質（異種蛋白質）の精
製が困難な場合が多く、精製を簡略化するため
に、生産物を菌体外に分泌させる系の開発が望ま
れている。

一方、従来酵母サツカロマイセス・セレビシエ
の代表的な分泌酵母としてインベルターゼが知ら
れているが、本酵素は細胞膜と細胞壁との間に局
在し、ごく一部が菌体外に漏出するに過ぎず、こ
れは、本酵素の分子量が大きいため細胞壁を通過
できないと考えられている。

本発明者等はさきに上記インベルターゼ遺伝子
の特定の領域を利用することによつて、菌体内で
生産された有用物質を分泌させることに成功した
（特願昭60−233371号）が、更に研究の結果、イ
ンベルターゼ遺伝子の特定の領域を修飾したポリ
ヌクレオチドが分泌シグナルとして好適であり、
これを含むプラスミドを導入したサツカロマイセ
ス・セレビシエが有用物質を直接かつ効率よく分
泌させ得ることを見出し、本発明を達成したもの
である。

以下に本発明の分泌シグナルをコードするポリ
ヌクレオチドと該ポリヌクレオチドをシグナル配
列として含む分泌ベクターの有用性について説明
する。

(1) プラスミドpSMF22（5.0kb）の調製 サツカロマイセス・セレビシエ（S.
cerevisiae）のインベルターゼ遺伝子として知ら
れているSUC2遺伝子［Nucleic Acids
research、11巻、６号、1943〜1953頁、特にその
1948〜1949頁（1983）参照］をEcoR及びAva
で切断した後、Ava部位をBamHリンカ
ーを用いてBamH部位に変え、得られるプロ
モーター配列、分泌シグナル配列及び成熟インベ
ルターゼの11アミノ酸配列までを含むEcoR〜
BamH断片（1.0kb）を、プラスミドpBR322
のEcoR〜BamH部位に挿入してプラスミド
pSMF22（5.0kb）を得る（第１図）。

(2) プラスミドpSMF61（5.0kb）の調製 上記pSMF22をsite directed mutagenesisによ
つてインベルターゼ遺伝子の分泌シグナル配列中
17番目のleをArgに変換し、同時にこの位置に
Bgl切断部位を有するプラスミドpSMF61
（5.0kb）を調製する。

即ち、pSMF22をPst及びEcoR〜BamH
で切断した夫々の断片の一本鎖DNAと、合成オ
リゴヌクレオチド
5'GCAGCCAAAAGATCTGCATCA3'とをアニ
ールさせ、クレノウ（klenow）酵素で修復した
後連結し、得られたDNAをE.coli HB101株に導
入し、培養した後プラスミドを分離し、翻訳開始
点から50番目のＴがＧに変つたプラスミドをハイ
ブリダイゼーシヨン シグナルの濃淡によつて選
択することにより、Bgl切断部位が導入された
プラスミドpSMF61（5.0kb）が得られる（第１
図）。

(3) プラスミドpSMF62（3.7kb）の調製 (2)で得たpSMF61のEcoR〜Bgl断片
（1.0kb）、ホスフオグリセレートキナーゼ遺伝子
（PGK）［Nucleic Acids research、10巻、23号、
7791〜7808頁（1982）、特に7797頁の塩基配列参
照］をBgl及びHindで切断して得られるター
ミネーター領域を含むBgl〜Hind断片
（0.4kp）及びpBR322のPvu部位をHindリン
カーを用いてHind部位に変えたEcoR〜
Hind断片（2.3kb、Ap^r及びoriを含む）を結合
させてプラスミドpSMF62（3.7kb）を調製する
（第１図）。

(4) プラスミドpSMF63（6.4kb）の調製 プラスミド2μmDNAのEcoR〜Pst断片
（ARSを含む）と、プラスミドYRp7［Nature、
282巻、39〜43頁（1979）］のTRP1を含むEcoR
〜Pst断片を結合させることにより、2μm
DNAの複製起点とTRP1とを含むEcoR〜
EcoR断片（2.7kb）を得て、これを前記で得た
pSMF62のEcoR切断部位に挿入してプラスミ
ドpSMF63（6.4kb）を得る（第１図）。

上記pSMF63は、SUC2遺伝子の19アミノ酸残
基からなる分泌シグナル配列中のＣ末端側の３個
のアミノ酸残基lle Ser AlaがArgで置換されて
いる下記の17アミノ酸残基からなる分泌シグナル
配列を有する。

Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe
LeuLeu ATG CTT TTG CAA GCT TTC
CTT TTC CTT TTG Ala Gly Phe Ala Ala Lys Arg GCT GGT TTT GCA GCC AAA AGA ↑ （Bgl切断部位） (5) プラスミドpSMF101（6.4kb）及びpSMF101
−４（6.4kb）の調製 上記pSMF63をXba及びBglで切断して得
られるXba〜Bgl断片［1.7kb、2μm DNAの
一部とSUC2のプロモーター及び前記(4)に示した
分泌シグナル配列を含む］をSlヌクレアーゼ又は
緑豆のヌクレアーゼで処理して突出末端を除去し
た後、次の塩基配列からなる合成リンカー 5'CGGAAGGGGTATCTTTGGATAAAA 3' 3'GCCTTCCCCATAGAAACCTATTTTCTA
Ｇ 5' を結合し次いでEcoR及びBglで切断する。

得られたEcoR〜Bgl断片（1kb）を、
pSMF63のEcoR〜Bglの代りに挿入すること
により、プラスミドpSMF101（6.4kb）が得られ
る。

pSMF101は、塩基配列測定の結果、次の25ア
ミノ酸残基からなるシグナル配列を有することが
判明した。

Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu
Leu ATG CTT TTG CAA GCT TTC
CTT TTC CTT TTG Ala Gly Phe Ala Ala Lys Thr Glu Gly
Val GCT GGT TTT GCA GCC AAA
ACG GAA GGG GTA Ser Leu Asp Lys Arg TCT TTG GAT AAA AGA ↑ （Bgl切断部位） この際、Slヌクレアーゼが過剰に作用すると、
上記アミノ酸残基中Ｃ末端から11〜９番目の３個
（9bo）が欠損した次の22アミノ酸残基からなる
シグナルペプチド配列を有するプラスミド
pSMF101−４（6.4kb）も同時に得られる。

Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu
Leu ATG CTT TTG CAA GCT TTC
CTT TTC CTT TTG Ala Gly Phe Ala Glu Gly Val Ser Leu
Asp GCT GGT TTT GCA GAA GGG
GTA TCT TTG GAT Lys Arg AAA AGA ↑ （Bgl切断部位） （発明の効果） 本発明に係る分泌シグナルをコードするポリヌ
クレオチドを含有するプラスミドpSMF101及び
pSMF101−４に、適当な外来遺伝子を挿入して
宿主中で発現させた場合、後記実施例に示すよう
に、目的とする蛋白質を直接かつ効率よく分泌さ
せることができる。

（実施例） 以下実施例において、マウス アミラーゼ遺伝
子をマーカーとして使用した場合につき、より具
体的に説明する。

なお、以下の実施例における操作は、特に記載
する場合を除き、次の〜の方法によつた。

［制限酵素によるDNAの切断と回収］ 制限酵素による切断用緩衡液は、下記３種類を
用い(1)〜(3)の使い分けは、Advanced Bacterial
Genetics（1981）（Cold spring Harbor，New
York）に従つた。また切断条件は２単位／μg
DNAの制限酵素を用い、37℃で30分間処理する。

次いで、TE緩衡液［10mMのトリス塩酸（PH
8.0）及び1mMのEDTAからなる］で飽和したフ
エノールで１回抽出し、エーテルでフエノールを
除き２培容のエタノールを加えて−20℃で30分間
放置した後、遠心分離してDMAを回収する。

(1) 低塩濃度緩衡液 10mMのトリス塩酸（PH7.4）、10mMのMgSO₄
及び1mMのジチオスレイトールからなる。

(2) 中塩濃度緩衡液 50mMのNaCl、10mMのトリス塩酸（PH7.4）、
10mMのMgSO₄び1mMのジチオスレイトールか
らなる。

(3) 高塩濃度緩衡液 100mMのNaCl、50mMのトリス塩酸（PH7.4）
及び10mMのMgSO₄からなる。

［大腸菌（E.coli）からのプラスミドDMA
の調製］ (1) ミニ調製法（mini prep法）［Nucleic Acids
Re−search、７巻、1513〜1523頁（1979）］ プラスミドDNAを含む大腸菌を、500μlのＬ−
ブロス［10ｇのペプトン、５ｇの酵母エキス、１
ｇのグルコース、５ｇのNaCl／１からなる（PH
7.2）］を用いて一夜間培養し、遠心分離して集菌
した菌体を、100μlの溶液Ａ［50mMのグルコー
ス、10mMのEDTA、25mMのトリス塩酸（PH
8.0）及びリゾチーム２mg／mlからなる］に懸濁
し、氷水中で30分間放置する。

次いで氷水中で200μlの溶液Ｂ［１％のSDS（ド
デシル硫酸ナトリウム）を含む0.2NのNaOH］
を加え振盪して同時にDNAの変性を行う。

150μlの3M酢酸ソーダ溶液（PH4.8）を加え氷
冷後遠心分離し、上清に冷エタノールを加え−70
℃に冷却して遠心分離し沈澱を集める。沈澱物を
400μlの溶液Ｃ［50mMのトリス塩酸（PH8.0）及
び0.1Mの酢酸ソーダからなる］に溶解し、不溶
物を除去後、冷エタノールを加え、沈澱する
DNAを洗浄し、減圧下乾燥し−20℃で存する。

(2) 大量調製法 プラスミドDNAを含む大腸菌を、100mlのＬ−
ブロス（薬剤耐性プラスミドの場合は薬剤を含
む）を用いて培養し、集菌洗浄した後、３mlの溶
液Ａ［50mMのグルコース、10mMのEDTA、
25mMのトリス塩酸（PH8.0）及びリゾチーム
mg／mlからなる］に懸濁し、氷水中で30分間放置
する。

次いで、氷水中で４mlの溶液Ｂ［１％のSDSを
含む0.2NのNaOH］を加え振盪して、同時に
DNAの変性を行う。

３mlの3M酢酸ソーダ溶液（PH4.8）を加え氷冷
後、遠心分離し、上清に0.6容のイソプロパノー
ルを加え−20℃で20分間放置する。

遠心分離して沈澱を集め、エタノールで洗浄後
２mlのTE（PH7.5）緩衡液に懸濁する。次いで、
10μlのRNase Ａ（10mg／ml）を加え、37℃で30
分間放置後フエノール抽出を行う。水層に0.2容
の5M NaClと1/3容の30％ポリエチレングリコー
ル6000を加えて−20℃で40分間、次いで４℃で40
分間放置する。遠心分離して沈澱を集め400mlの
水に溶解し、DNAをエタノールで沈澱させ、洗
浄後100μlのTE緩衡液に溶解する。

［T4 DNAリガーゼによる連結］ 連結する２個のDNA断片は、1μg／10μlになる
ように連結用緩衡液［66mMのトリス塩酸（PH
7.5）、6.6mMのMgCl₂、10mMのジチオスレイト
ールからなる］に溶解し65℃で10分間処理した
後、４℃で66μMのATP（アデノシントリフオス
フエート）を加え、更にT4リガーゼを粘着末端
の場合は0.1単位／1μg DNA、また平滑末端の場
合は１単位／μg DNAになるように加えて４℃
で18時間反応させた後65℃で10分間処理する。

［大腸菌の形質転換］［Advanced Bacterial
Ge−netics（1981）（Cold Spring Harbor，
New york）］ ５mlのＬ−ブロスに大腸菌を植菌し、一夜間培
養する。この0.2mlを20mlのＬ−ブロスに植え、
37℃でクレツトユニツトが60に達するまで振盪培
養する。菌体を集め氷冷した50mMのCaCl₂と
10mMのトリス塩酸（PH8.0）とからなる緩衡液
10mlに懸濁し30分間氷冷する。遠心分離した菌体
を１mlのCaCl₂溶液に懸濁し、この0.1mlを10μlの
DNA溶液を混合し０℃で30分間、42℃で２分間
インキユベートした後、1.5mlのＬ−ブロスを加
え37℃で30分間培養し、この0.1mlを寒天培地に
植える。

［S1ヌクレアーゼによるDNA粘着末端の除
去］ 粘着末端を持つDNAを、200μlの高塩濃度緩衡
液［30mMの酢酸ソーダ（PH4.25）、0.3MのNaCl
及び4mMのZnSO₄からなる］に溶解し、S1ヌク
レアーゼを20単位／μgDNA加え、22℃で40分間
処理し、TE緩衡液で飽和したフエノールで抽出
処理した後、エーテルでフエノールを除き、冷エ
タノールを加え−20℃に冷却し、遠心分離により
沈澱したDNAを回収する。

［緑豆ヌクレアーゼによるDNA粘着末端の
除去］ １〜10μgのDNAを含むTE緩衡液10μlに、2μl
の10×MBN緩衡液（PH5.2）［1.5Mの酢酸ソー
ダ、1mMのZnCl₂、10mMのシステイン、10mM
のMgCl₂、0.01％のトリトン×100からなる］と
8μlの水を加え、更に１〜５単位／μlの緑豆ヌク
レアーゼを2μl加え、20℃で30分間保温する。次
いで2μlの20％SDS溶液を加えて反応を停止させ、
30μlのTE緩衡液を加えた後フエノール抽出を行
い、DNAをエタノール沈澱により回収する。

［リンカーDNAの平滑末端への連結］ 平滑末端のDNA断片（1.2p mol末端）とリン
カーDNA（100p mol末端）を連結用緩衡液
［66mMのトリス塩酸（PH7.5）、6.6mMのMgCl₂、
10mMのジチオスレイトールからなる］に溶解
し、１単位のT4リガーゼを加え４℃で18時間反
応後、TE緩衡液で飽和したフエノールでDNAを
抽出し、エーテルでフエノールを除去した後エタ
ノール沈澱でDNAを回収する。

［DNA断片の仔牛小腸アルカリンフオスフ
アターゼ（ClAP）による処理］ リガーゼ反応によるプラスミドDNAの自己連
結を阻止するために、リガーゼ反応に先だつて、
プラスミドDNAの制限酵素による切断断片を
ClAPで処理する。

制限酵素で切断したプラスミドDNA（10p
mol5'未端）を50μlのClAP緩衡液［50mMのトリ
ス塩酸（PH9.0）、1mMのMgCl₂、0.1mMのZnCl₂
及び1mMのスペルミジンからなる］に溶解し、
1p mol末端当り0.01単位のClAPを加え37℃で30
分間反応後、10μlの0.1Mトリス塩酸（PH8.0）、
1MのNaCl、10mMのEDTA、5μlの10％SDS、
40μlの水を加え、65℃で15分間保持する。冷却後
TE緩衡液で飽和したフエノールで抽出処理し、
エーテルでフエノールを除去し、エタノール沈澱
によりDNAを回収する。

［酵母の形質転換（KU法） 酵母サツカロマスセス・セレビシエを10mlの
YEPD培地中で30℃で一夜間培養し、集菌して一
回TE緩衡液で洗浄した後、同緩衡液に懸濁し、
細胞数が２×10cells／mlとなるようにする。

この懸濁液500μlに同量の0.2M酢酸リチウム
（PH7.5）を加え、30℃で１時間保持した後、
100μl宛試験管に分注し、０℃でこれにDNAを添
加し、同温度で30分間混合する。100μlの70％ポ
リエチレングリコール4000を含むTE緩衡液を加
え、よく混合した後30℃で１時間、次いで42℃で
５分間保持し、遠心分離して集菌し、滅菌水で洗
浄する。

これを500μlの滅菌水に懸濁し、100μl宛を選択
培地上に植菌し、30℃で３〜４日間培養して形質
転換株を得る。

実施例 (1) プラスミドpSMF22（5.0kb）の調製 サツカロマスセス・セレビシエ（S.
cerevisiae）のSUC2をEcoR及びAvaで切断
し、次いでAva部位をBamHリンカーを用
いてBamH部位に変換して、プロモーター配
列、分泌シグナル配列及び成熟インベルターゼの
11アミノ酸配列までを含むEcoR〜BamH断
片（1.0kb）を得た。一方、pBR322をEcoR及
びBamHで切断し、得られたEcoR〜BamH
部位に、上記EcoR〜BamH断片を挿入し
てプラスミドpSMF22（5.0kb）を得た。

(2) プラスミドpSMF61（5.0kb）の調製 (1)で得たpSMF22を、Pst及びEcoR〜
BamHで切断し、得られた夫々の断片の一本
鎖DNAと、合成オリゴヌクレオチド 5'GCAGCCAAAAGATCTGCATCA 3' とをアニールさせ、クレノウ（Klenow）酵素で
修復した後T4DNAリガーゼで結合した。こうし
て得られたDNAをE.coli HB101株に導入し、培
養した後プラスミドを分離し、翻訳開始点から50
番目のＴがＧに変つたプラスミドをハイブリダイ
ゼーシヨン シグナルの濃淡によつて選択するこ
とにより、Bgl切断部位が形成されたプラスミ
ドpSMF61（5.0kb）を得た。

(3) プラスミドpSMF62（3.7kb）の調製 (2)で得たpSMF61をEcoR及びBglで切断し
てEcoR〜Bgl断片（1.0kb）を得た。また、
PGKをBgl及びHindで切断してターミネー
ター領域を含むBgl〜Hind断片（0.4kb）を
得た。更にpBR322をPvuで切断し、Hindリ
ンカーを用いてHind部位を導入し、EcoRで
切断してEcoR〜Hind断片（2.3kb、Ap^r及び
oriを含む）を得た。

ここに得た３種のDNA断片をT4DNAリガー
ゼで結合させてプラスミドpSMF62（3.7kb）を調
製した。

(4) プラスミドpSMF63（6.4kb）の調製 2μm DNAをEcoR及びPstで切断して
EcoR〜Pst断片（ARSを含む）を得た。ま
たYRp7をEcoR及びPstで切断してTRP1を
含むEcoR〜Pst断片を得た。この両断片を結
合させることにより、2μm DNAの複製起点と
TRP1とを含むEcoR〜EcoR断片（2.7kb）
を得た。これを、前記(3)で得たpSMF62のEcoR
切断部位に挿入してプラスミドpSMF63
（6.4kb）を得た。

(5) プラスミドpSMF101（6.4kb）及びpSMF101
−４（6.4kb）の調製 上記pSMF63をXba及びBglで切断して、
Xba〜Bgl断片（1.7kb、2μm DNAの一部と
SUC2のプロモーター及び分泌シグナル配列を含
む）を得た。このDNA断片をS1ヌクレアーゼ又
は緑豆のヌクレアーゼで処理して突出末端を除去
した後、次の塩基配列からなる合成リンカー 5'CGGAAGGGGTATCTTTGGATAAAA 3' 3'GCCTTCCCCATAGAAACCTATTTTCTA
Ｇ 5' を結合した後、EcoR及びBglで切断して
EcoR〜Bgl断片（1kb）を得た。一方
pSMF63をEcoR及びBglで切断したEcoR
〜Bglの代りに、上記で得たEcoR〜Bgl断
片を挿入してプラスミドpSMF101（6.4kb）を得
た。

また過剰のS1ヌクレアーゼの作用により、同
時にプラスミドpSMF101−４（6.4kb）が得られ
た。

(6) マウスアミラーゼ遺伝子のpSMF101（6.4kb）
及びpSMF101−４（6.4kb）への導入 マウスすい臓由来のアミラーゼのcDNAを含む
プラスミドpMSa104をPstで切断し、得られた
Pst〜Pst断片を、プラスミドpUC13のPst
部位に挿入してプラスミドpRE1075（4.3kb）を作
製した。

pREl075をApaで切断し、S1ヌクレアーゼ処
理により平滑末端とした後Draで切断して、成
熟アミラーゼ遺伝子のＮ末端から５番目のHisか
らＣ末端までの全てと3'非翻訳領域の5bpを含む
断片（1.4kb）の両端にBamHリンカー
（12bp）を結合した後BamHで切断し、得られ
たBamH断片を前記pSMF101及びpSMF101−
４のBgl部位に夫々挿入してマウスアミラーゼ
遺伝子を含むpSMF101MA及びpSMF101−4MA
を調製した。

(7) アミラーゼ活性（分泌）の確認 上記方法により構築したpSMF101MA及び
pSMF101−4MAを用いてサツカロマイセス・セ
レビシエ20B−12株をKU法により形質転換した。

得られた形質転換株を１％澱粉を炭素源とする
YEP寒天培地上に接種し、30℃で３日間培養し
た結果、アミラーゼの分泌生産による顕著なハロ
ー（halo）の形成が観察された。

なお、プラスミドをpSMF63を前記(6)と全く同
様にマウスアミラーゼ遺伝子を導入した
pSMF63MA、及びアミラーゼ遺伝子を含まない
前記pSMF101及び101−４を用いて、上記と同様
に20B−12株を形質転換し、形質転換株を１％澱
粉を炭素源とするYEP寒天培地上に接種し、30
℃で３日間培養しした。この場合、pSMF63MA
ではハローの形成は微小であり、またpSMF101
及び101−４ではハローの形成は全く観察されな
かつた。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、本発明におけるプラスミ
ドの構成ルートを示す模式図であつて、図中の記
号Ａ，Ap，Ｂ，Dr，Ｅ，Ｈ，Ｐ，Ｘ，等は夫々
下記の制限酵素を示す。 Ap：Apa、Ｂ：BamH、Bg：Bgl、
Dr：Dra、Ｅ：EcoR、Ｈ：Hind、Ｐ：
Pst。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 次のアミノ酸配列からなる分泌シグナルをコ
   ードするポリヌクレオチド。Met Leu Leu Gln
   Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe
   Ala（Ala Lys Thr）ｎ Glu Gly Val Ser
   Leu Asp Lys Arg 上記アミノ酸配列中ｎは１又は０を示す）