JPS63209589A - Ｎａｌ（ｎ―アシルノイラミン酸アルドラーゼ）の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ（本願明
細書ではＮＡＬ、と略称する。）を含む組換え体プラス
ミド、それにより形質転換されたプロビデンシア（Ｐｒ
ｏｖｉｄｅｎｅｉａ　）属に属する微生物及びこの微生
物をもちいてＮＡＬを製造する方法に関する。

〔従来技術〕

ＮＡＬ、すなわち、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼは、国際生化学連合酵素委員会の酵素番号Ｅ、Ｃ，４
，１，３，３，に分類され、系統名ではＮ−アシルノイ
ラミン酸：ピルビン酸すアーゼと呼称される酵素である
。本酵素はシアル酸（Ｎ−アシルノイラミン酸）をＮ−
アシルマンノサミンとピルビン酸に分解する酵素であり
、腫瘍の診断のためのシアル酸含￥変化測定に用いられ
る酵素である。

本酵素は、動物組織およびガス壊庭菌（Ｃ１ｏｓｔｒｉ
−ｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）　、コレラ菌（
Ｖｉｂｒｏ　ｃｈｌｏｌｅｒａｅ）、大腸菌（Ｂｓｃｈ
ｅｒＹｅｈｉａ　ｅｏｌｉ）等の微生物に存在すること
が知られている。また、微生物においては培地中にＮ−
アシルノイラミン酸を存在させるとその生産能が飛躍的
に上昇することが報告されている（特公昭５６−５４１
５３号）が、このＮ−アシルノイラミン酸は非常に高価
なものであり、工業的な規模で用いることは困難であっ
た。本発明者らは先に、高価なＮ−アシルノイラミン酸
を培地に添加することなくＮＡＬを著量産生せしめる方
法について鋭意検討を行ない、Ｎ−アシルノイラミン酸
が存在するとＮＡＬを産生する微生物の染色体ＤＮＡを
適当な制限酵素で処理してＤＮＡ断片を得、これを適当
なベクターに組み込んで得られたエシェリヒア属に属す
る形質転換体の中に、Ｎ−アシルノイラミン酸を含まな
い培地で培養してもＮＡＬを産生ずるものがあることを
見出した（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌ
ｏｇｙνｏｌｕｍｅ１６７、　ｐａａｅ　４０４　（１
９８６））。

しかしながら、プロビデンシア属に属する微生物でＮＡ
Ｌ生産能のあるものは知られていない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

近年、組み換えＤＮＡ技術の進歩によりエシェリヒア属
以外の微生物における遺伝子の組み換えも可能となって
きている。そして、前記ＮＡＬ生産能を有する微生物に
関しても、従来公知のエシェリヒア属に属する微生物以
外のものを遺伝子の組み換えにより開発することができ
れば、微生物によるＮＡＬの生産技術の新規な改善の手
段を提供したものとして十分なメリットがあるものと考
えられる。

本発明の目的は、かかる、技術の多様化、または、豊富
化の観点から、従来ＮＡＬ生産能のあるものが全く知ら
れていなかったプロビデンシア属に属する微生物を遺伝
子工学的手法で形質転換することにより、Ｎ　Ａ　１．
、生産能のある新規なプロビデンシア属に属する微生物
を提供するとともに、それによる新規なＮＡＬの製造方
法を提供Ｖることにある。

〔問題点を解決するための技術的手段〕本発明はＬ記目
的に基づいて鋭意研究を重ねた結果完成されたものであ
って、■ＮＡＬ遺伝子ＤＮＡをプロビデンシア属に属す
る微生物内での複製能を有するベクタープラスミドに連
結した組換え体プラスミド、■前記組換え体プラスミで
形質転換されたプロビデンシア属に属する微生物、及び
、■前記形質転換されたプロビデンシア属に属する微生
物を培地中に培養し、培養物中にＮ　Ａ　Ｔ。

を蓄積せしめ該培養物からＮ　Ａ　Ｌを採取することを
特徴とするＮＡＬの製造法の各発明からなる。

前記Ｎ　Ａ　Ｔ、遺伝子ＤＮＡとは、ＮＡＬの生産に関
与するＤＮＡ、ｔなわち、Ｎ　Ａ　Ｌをコードする構造
遺伝子プロモーター、ＳＤ配列および必要によりターミ
ネータ−からなるものである。

なお、本発明において、前記組換え体プラスミドとして
、Ｎ　Ａ　Ｌ遺伝子ＤＮＡ以外に、エンドヌクレアーゼ
Ｐｓｔｌ遺伝子１）　Ｎ　Ａも共に連結したものを使用
するか、または、宿主のプロビデンシア属に属する微生
物としてエンドヌクレアーゼＰｓｔ■生産能を有するも
のを選択することにより１、前記形質転換されたプロビ
デンシア属に属する微生物としてＮＡＬ及びエンドヌク
レアーゼＰｓ口生産能を有する微生物が得られ、該微生
物を栄養培地に培養して、培養物中にＮ　Ａ　Ｌ及びエ
ンドヌクレアーゼＰｑｔＩを同時に腎積せしめるように
することができる。

前記エンドヌクレアーゼＰｓｔｌはＣＴＧＣＡＧの塩基
配列のＤＮＡを認識し、これを切断する酵素であり、遺
伝子工学の研究において頻繁に利用される有用な酵素で
ある。

以下本発明を実施のための各ステップにわけて詳細に説
明する。

（ａ）　　ｍみ換え体プラスミド及びその調製本発明に
用いられるＮＡＬ遺伝子ＤＮＡを含む組換え体プラスミ
ドは、プロビデンシア（Ｐｒ−ｏｖｉｄｅｎｃｉａ　）
属に属する微生物の培養された細胞内での複製能を有す
るベクタープラスミドにＮ　Ａ　Ｌ生産能を有する微生
物から調製されたＮＡＬ遺伝子ＤＮＡを組み込んでなる
プラスミドである。

前記ベクタープラスミドとしては、例えばＪｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｕｙ
、Ｖｏｌｕｍｅ２５９゜ｐａｇｅ８０１５　（１９８４
）記載のｐＰＳＴ　１０１が挙げられる。

なお、このｐＰＳＴ　１０１にはエンドヌクレアーゼＰ
ｓｔＩ遺伝子ＤＮＡも含まれており　（第１図参照）、
このベクタープラスミドを使用した場合にはエンドヌク
レアーゼＰｓｔＩの生産性も向上する。なお１、前記Ｐ
ｓｔＩ遺伝子ＤＮＡとは、ＰｓｔＩのの生産に関与する
ＤＮＡ、すなわち、ＰｓｔＩをコードする構造遺伝子、
プロモーター、ＳＤ配列および必要によりターミネータ
−からなるものである。

さらに、ベクタープラスミドとして前記ｐｐｓ’ｒ１０
１以外に、ｐＰＳＴ　１０３．　ｐＰＳＴ　１０４．　
ｐＰＳＴ　２０１゜ｐＢＲ３２２等をあげることができ
る。

ＮＡＬ遺伝子ＤＮＡとしては、前記の動物組織、ガス壊
痕菌、コレラ菌及び大腸菌から調製することができるが
、大腸菌から調製したものとして、例えばＪｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ−ｕｍｅ
　１６７、　ｐａｇｅ　４０４（１９８６）に記載のプ
ラスミドＰＮＬＩ（第２図参照）より調製した約１．３
　ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片が挙げられる。

また、前記ベクターＤＮＡに前記ＤＮＡ断片を組み込む
方法は、既知のいずれの方法も適用できる。

ベクタープラスミドとして、ｐＰＳＴ　１０１を用い、
これにＮＡＬ遺伝子ＤＮＡとして、ｐＮＬ　１より調製
した約１．３ｋｂのＨｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片を組み
込むことにより新規なプラスミドｐＮＬ　５　Ｐが得ら
れる。ｐＮＬ　５　Ｐの調製工程及その制限酵素地図を
第３図に示す。

０））形質転換微生物の調製 このようにして得られたＮＡＬｉ伝子ＤＮＡを含むベク
ターを既知の形質転換法によりプロ　（ビデンシア属に
属する微生物に導入することにより、所望の遺伝形質と
ベクターＤＮＡの形質を併せもつ形質転換株が得られる
。

形質転換法としてはＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｅｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ＋Ｖｏｌｕｍｅｌ１９．　ｐａｇｅ１０
７２に記載のカルシウムイオン処理法が挙げられる。

前記プロビデンシア属に属する微生物としては、プロビ
デンシア・スチュアーティー（Ｐｒｏ−ｖｉｄｅｎｃｉ
ａ　５ｔｕａｒｔｉｉ　＞　、プロビデンシア・アルカ
リファシェンス（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｅｔａ　Ａｌｃａｌ
ｉｆａｅｉｅｎｓ）。

プロビデンシア・レフ１−ゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉ
ａ　ｒｅｔｔ−ｇｅｒｉ）等があげられる。そして、こ
の内、Ｐｓｔ　Ｉ生産能を有するプロビデンシア属に属
する微生物としては、前記プロビデンシア・スチュアー
テ４−（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ　Ｖｏｌｕｍｅ３．ｐａｇｅ３４３　（１９７６）　
）が挙げられる。かくして得られた微生物の例としては
、例えばプロビデンシア・スチュアーテイ−（Ｐｒｑｖ
ｉｄｅｎｃｉａ　５ｔｕａｒｔｉｉ）ｐＮＬ　５　Ｐ（
微工研菌寄第９０７７号）がある。

ＣＡＮＡＬの生産 工程（ｂ）で得られた形質転換株を培養するには、ＮＡ
Ｌの生産に適した培地であって且つ宿主微生物の生育に
適した培地を用い得るが、培地中でＮＡＬの生産と同時
にＰｓｔＩの生産をも行わせる場合には、前記培地はＰ
ｓｔＩの生産にも適したものを用いる。

そして、本発明方法では、通常エシェリヒア・コリの生
育培地として用いられるＬＢ培地（トリプトン、酵母エ
キス、食塩）　、ＢＰＢ培地（Ｄｉｆｃｏ　　；ポリペ
プトン、酵母エキス、リン酸カリウム）、栄養・寒天培
地（Ｄｉｒｃｏ　０００１）、トリプトン・食塩培地等
を基本培地として調製したものを用いればよい。

その他、必要に応じて炭素原、窒素源の他にアミノ酸、
ビタミン等の栄養素を添加してもよい。

培養方法は、ｐＨ１温度、酸素供給量等の条件として通
常のエシェリヒア属の微生物の生育に適した条件を採り
得るが、前記微生物を培地に接種した後、前記微生物が
生育してその菌体量が最大に達したとき、即ち対数増殖
後期まで生育させるのが好ましい。培養温度は通常３０
〜３７℃、ｐＨ条件は、ｐＨ５〜８の範囲、特に中性付
近が適当である。

得られた菌体を集画後、遠心分離、超音波破砕工程等に
より抽出し、次いで硫安分画、凍結乾燥等、通常この種
の高分子生理活性物質の分離精製方法にしたがって処理
することによりＮＡＬ、あるいは、これと共にエンドヌ
クレアーゼＰｓｔｌを得ることができる。

以下、本発明を実施例により、更に詳しく説明するが、
本発明は何らこれらに限定されるものではない。

実施例 （１）ベクタープラスミドｐＰＳＴ　１０１の精製別紙
第１図の通り調製されたベクタープラスミドｐＰＳＴ　
１０１のＤＮＡを保有するプロビデンシア・スチュアー
ティーをアイオワ大学のＲ，Ｙ、ワルダー博士から得た
。このプロビデンシア・スチュアーティーを以下の通り
精製してベクタープラスミドｐＰＳＴ　１０１を得た。

ずなわちｐＰＳＴｌｏｌのＤＮＡをプラスミドとして保
有するプロビデンシア・スチェアーティーをＬ　Ｂ培地
〔純水１ｅあたりトリプトン（Ｄｉｒｅｏ）　１０　ｇ
　、酵母エキス５ｇＸＮａ（Ｊ！ＬｏｇをＰＨ７，０に
調製したもの〕１１に接種し、３０℃で振盪培養を行な
った。１８時間後に菌体を集める。次に集めた菌体を５
ｍｇ／−のりゾチーム（太陽化学９１製）　、５０ｍＭ
グルコース、１０ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａを含む２５ｍＭ　
）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）２０ｍＺに懸濁し、室
温で５分間静置する。次に１％ＳＤＳを含む０．２　Ｎ
　ＮａＯＨ溶液４〇−を加え、氷上で１０分間静置する
。更に３Ｍの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４，８）を３０
ｍ／加え、氷上で１０分間静置後、２０，０００ｒｐｍ
　２０分間の遠心分離を行なう。上清にイソプロパツー
ルを加え、室温で１５分間放置する。１２．ＯＯＯｒｐ
ｍ　３０分間の遠心分離を行ない、得られた沈澱物につ
いて、７０％エタノール洗浄後、１６ｍｆの１ｍＭＥＤ
ＴＡ含む１０ｍＭ）リス塩酸緩　衝液に溶解させる。次
に、１６ｇの塩化セシウム０．８　ｍ／のエチジウムブ
ロマイド溶液と混合し、３８．０００ｒｐｍ　４０時間
の遠心分離を行なった。プラスミドＤＮＡ層を注射器で
ぬきとり、ｎ−ブタノール抽出によってエチジウムブロ
マイドを除去し、ｉｎ＋ＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭ）リ
ス塩緩衝液（ｐＨ８，０）に透析することにより約７０
０μｇのｐＰｓＴｌｏｌ　ＤＮＡを取得した。

（２）　　Ｎ　Ａ　Ｌ遺伝子ＤＮＡの調製（第３図参照
）まず特願昭６０−１３９８０７号（特開昭６２−２７
７号）に記載のプラスミドｐＮＬ１（第２図参照）を保
有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ
を１１のＬＢ培地に接種し、上記（１）と同様の方法に
より最終１　、０００μｇのｐＮＬ　１を取得した。次
に得られたｐＮＬｌの１０．ｃｏｇについて、５０Ｕの
エンドヌクレアーゼＨｃｏＲＩを加え、３７℃、１時間
の反応を行なうことにより、これを完全に切断した。更
に１５０Ｖ、１時間の１％アガロース電気泳動を行ない
、１Ｍｇ／ｒｄ、のエチジウムブロマイド溶液にて染色
後１．３ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｅｏＲＩ断片を含むゲル
を切り出し、核酸回収器（和科盛製）にてゲルより回収
した。ｎ−ブタノール抽出によってエチジウムブロマイ
ドを除去し、１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭ　）リス塩
酸緩衝液にて透析することにより、ＮＡＬ遺伝子ＤＮＡ
が約１μｇのＤＮＡ断片として得られた。

（３）ＮＡＬ遺伝子ＤＮＡのベクタープラスミドｐＰＳ
Ｔ　１０１への挿入（第３図参照）上記（１）で得られ
たベクタープラスミドｐＰＳＴｔｏｉ　ｉｏμｇについ
て５０ＵのエンドヌクレアーゼＢｃｏＲＩを加え、３７
℃、１時間の反応を行なうことによりこれを完全に切断
後、ＩＵのアルカリフォスファターゼを加え、３７℃、
１時間の反応を行ない５′末端のリン酸を除去した。次
に上記（２）で得られたＤＮＡ断片０．５μｇとｐＰＳ
Ｔ　１０１のＤＮＡ断片１μｇを混合し、１ｍＭＡＴＰ
及び５ｍＭジチオスレイトールの存在下に、５ＵのＴ４
ファージ由来のＤＮＡリガーゼを用いて１５’Ｃ１６時
間のＤＮＡ鎖の連結反応を行って、ＮＡＬｌ伝子ＤＮＡ
を含んだ組換え体プラスミドｐＮＬ　５　Ｐを得た。

＋４）　　Ｎ　Ａ　Ｌ　ｌ転子ＤＮＡを含む組換え体プ
ラスミドｐＮＬ　５　Ｐによる形質転換 エンドヌクレアーゼＰｓｔｌ生産能を有するプロビデン
シア・スチェアーテイ−１６４（コールドスプリングハ
ーバ−研究所のＲ，Ｊ、ロバーツ博士から入手した）を
前記Ｌ　Ｂ培地１０−に接種し、３０℃で振盪培養を行
ない対数増殖期まで生育させた後に集菌した。これを水
冷下、最終濃度０．０３ＭＣａＣ１１！２の溶液に懸濁
させてコンピテントな細胞とした。この細胞懸濁液に（
３）で得た組換え体プラスミドｐＮＬ　５　Ｐの溶解液
を加えて、水冷下で６０分反応させ、４２℃、１〜２分
間ヒートショックを与えて、前記組換え体プラスミドｐ
ＮＬ　５　Ｐを細胞内に取りこませた。次いでこの細胞
懸濁液を別途前記ＬＢ培地に接種し、３７℃、３へ・５
時間振盪培養して形質転換反応を行なった後、アンピシ
リン耐性を有し、且つＮＡＩ、生産能を有する株、プロ
ビデンシア・スチ工アーティー（ｐＮＬ　５　Ｐ）　（
微工研菌寄第９０７７号）を分離した。

（５）　　プロビデンシア・スチュアーティー（ｐＮＬ
　５　Ｐ）によるＮＡＬ及びエンドヌクレアーゼＰｓｔ
ｌの生産 （４）で得られた形質転換株、プロビデンシア・スチュ
アーティー（ｐＮＬ　５　Ｐ）　（微工研菌寄第９０７
７号）を前記ＬＢ培地１００ｍ１を含む５０〇−容のフ
ラスコで３０℃にて１６時間振盪培養を行なった。

これを遠心分離にて集菌、洗浄後、ｐＨ７，５に調製し
たＯ、Ｌ？ｌリン酸緩衝液２０−に懸濁し、０℃で１０
分間の超音波破砕し、酵素抽出液を得た。

次いで、ここに得られた抽出液を硫安で塩析し、３０〜
８０％飽和区分（飽和度は０ｓｂｏｒｎｅ法で表示）を
凍結乾燥して粗粉末５０■を得た。ここに得られた粗粉
末１■あたりのＮＡＬ活性は０．１単位、エンドヌクレ
アーゼＰｓｔＩ活性は４００単位であった。上記におい
て比較のため、前記ＬＢ培地にて宿主微生物であるプロ
ビデンシア・スチュアーティーを同様に培養し、上記と
同様に・処理した結果１．得られたＮＡＬの粗粉末は５
０ｍｇで、粉末１■あたりのＮＡＬ活性は０．００３単
位、エンドヌクレアーゼＰｓｔＩ活性は４０単位であっ
た。

このことからＮＡＬ遺伝子ＤＮＡ及びエンドヌクレアー
ゼＰｓｔＩ遺伝子ＤＮＡを含む前記組み換え体プラスミ
ドで形質転換されたプロビデンシア・スチュアーティー
（ｐＮＬ　５　Ｐ）はシアル酸を含まない栄養培地にお
いて、宿主微生物であるプロビデンシア・スチュアーテ
ィーの約３０倍のＮ　Ａ　Ｌ生産能及び約１０倍のエン
ドヌクレアーゼＰｓｔｌ生産能を有することがわかる。

なお、ＮＡＬの活性の測定は、ｐＨ７，５の１００ｍＭ
リン酸緩衝液中で２４＋＋＋ＭのＮ−アシルノイラミン
酸を含む混合液を調製し、その混合液に適当量の粗酵素
抽出液を加えて最終液量を０．３　ｄとし、３７℃で反
応を行ない生成するピルビン酸をＤＮＰ法〔日本分析化
学会、分析化学ライブラリー、ユ、１８２、（１９７０
）　）で定量することによって行なった。酵素活性にお
ける１単位は反応温度３７℃において１分間に１μモル
のピルビン酸を生成する活性をいう。また、エンドヌク
レアーゼＰｓｔ■の活性の測定は（１μｇのλ−ＤＮＡ
を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液、１０ｍＭ塩化マグネシウ
ム溶液、５０ｍＭ硫酸アンモニウム、７　ｍＭ　２−メ
ルカプトエタノールからなる反応液４５μｒに溶解し、
その混合液に５μβの酵素液を加えて、３７℃で１時間
の反応を行なった後、アガロース電気泳動を行なうこと
により測定する。酵素活性における１単位は、３７℃ｐ
Ｈ７，５において１時間に１μｇのλ−ＤＮＡを完全に
分解する酵素活性をいう。

〔発明の効果〕

本発明によれば、新規なＮＡＬ生産能のあるプロビデン
シア属に属する微生物が得られ、かつ、それの培養によ
りＮＡＬの工業的生産が可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図はρＰＳＴ　１０１の調製法及び制限酵素地図を
示す図、第２図はｐＮＬｌの調製法及び制限酵素地図を
示す図、及び、第３図はｐＮＬ　５　Ｐの調製工程及び
制限酵素地図を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＮＡＬ（Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ）遺
   伝子ＤＮＡをプロビデンシア属に属する微生物内での複
   製能を有するベクタープラスミドに連結した組換え体プ
   ラスミド。 ２、ＮＡＬ遺伝子ＤＮＡがエシェリヒア属に属する微生
   物由来の遺伝子であることを特徴とする特許請求の範囲
   第１項記載の組換え体プラスミド。 ３、ベクタープラスミドがｐＰＳＴ１０１であることを
   特徴とする特許請求の範囲第１項記載の組換え体プラス
   ミド。 ４、組換え体プラスミドがｐＮＬ５Ｐであることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の組換え体プラスミド
   。 ５、ＮＡＬ遺伝子ＤＮＡをプロビデンシア属に属する微
   生物中で複製するベクタープラスミドに連結した組換え
   体プラスミドで形質転換されたプロビデンシア属に属す
   る微生物。 ６、プロビデンシア属に属する微生物がプロビデンシア
   ・ステュアーティー（ｐＮＬ５Ｐ）であることを特徴と
   する特許請求の範囲第５項記載の微生物。 ７、ＮＡＬ遺伝子ＤＮＡをプロビデンシア属に属する微
   生物中で複製するベクタープラスミドに連結した組換え
   体プラスミドで形質転換されたプロビデンシア属に属す
   る微生物を培地中に培養し、培養物中にＮＡＬを蓄積せ
   しめ該培養物からＮＡＬを採取することを特徴とするＮ
   ＡＬの製造法。