DK172350B1 - Hirudin-derivat, DNA, der koder derfor, vektorer, der indeholder en sådan DNA, fremstilling af hirudin-derivatet samt lægemiddel indeholdende dette - Google Patents
Hirudin-derivat, DNA, der koder derfor, vektorer, der indeholder en sådan DNA, fremstilling af hirudin-derivatet samt lægemiddel indeholdende dette Download PDFInfo
- Publication number
- DK172350B1 DK172350B1 DK013189A DK13189A DK172350B1 DK 172350 B1 DK172350 B1 DK 172350B1 DK 013189 A DK013189 A DK 013189A DK 13189 A DK13189 A DK 13189A DK 172350 B1 DK172350 B1 DK 172350B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- gly
- glu
- dna
- thr
- cys
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Hydrogenated Pyridines (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
DK 172350 B1
Opfindelsen angår et hirudin-derivat, der er ejendommeligt ved det i krav l's kendetegnende del angivne, en DNA, der er ejendommelig ved det i krav 2's kendetegnende del angivne, vektorer, der er ejendommelige ved det i krav 5 3's kendetegnende del angivne, en fremgangsmåde til fremstil ling af et polypeptid som angivet i krav 1, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav 4's kendetegnende del angivne, samt et lægemiddel, der er ejendommeligt ved det i krav 6's kendetegnende del angivne.
10 Fra den europæiske patentansøgning med offentliggørel sesnumret (EP-A) 0.171.024 er derivater af hirudin og den gentekniske fremstilling heraf kendt.
Det har nu vist sig, at hirudin-derivatet med amino-syresekvensen 15 0 1 10
Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys- 20
Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-30 40 20 Ile-Leu-Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-Gly- 50
Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe- 60
Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln 25 har en række fordele. I denne sekvens er nummereringen fra EP-A 0.171.024 bibeholdt.
Hirudin og derivater heraf har forskellig biologisk aktivitet, hvilket kan føres tilbage til en forskellig af-30 finitet for thrombin og/eller en forskellig stabilitet. Hirudin-derivatet ifølge opfindelsen udmærker sig overraskende ved en særlig aktivitet.
Man har endvidere fundet, at hirudin-derivatet ifølge opfindelsen særlig fordelagtigt eksprimeres i gær. Som sam-35 menligningsforsøg viser, sker en ekspression i analoge hiru-din-derivater, der N-terminalt begynder med Thr-Tyr eller 2 DK 172350 B1
Ile-Tyr, kun med lave udbytter.
Ekspressionen ud fra gærceller er ikke kun fordelagtig, fordi hirudin-derivatet bliver sekreteret, men frem for alt derfor, at det foreligger praktisk taget kvantitativt 5 i rigtig foldet form og har høj aktivitet.
Figur 1 viser kloningsvektorer til udvinding af en genstruktur, der koder for gær-MFa-forløberproteinet og hirudin-derivatet ifølge opfindelsen. Figur 2 viser en gær--ekspressionsvektor med denne genstruktur.
10 Fremstillingen af hirudin-derivaterne ifølge opfin delsen kan selvfølgelig også udføres efter andre metoder, f.eks. ved ekspression i bakterier eller i højere eukaryo-tiske celler, såsom insektceller eller animalske celler. Foretrukket er dog ekspressionen fra gærsystemer, f.eks.
15 under anvendelse af de gærarter, som de, der f.eks. er anført i EP-A 0.248.227, f.eks. Pichia pastoris, Hansenula polymor-phis, Schizosaccharomyces pombe eller fortrinsvis Saccharo-myces cerevisiae.
Vektorer for ekspressionen i gær kendes i stort antal, 20 f.eks. fra EP-A 0.060.057, 0.088.632, 0.116.201, 0.121.884, 0.123.544 og 0.195.691. Fremstillingen af hirudin-derivatet ifølge opfindelsen beskrives i det efterfølgende på baggrund af gær-cr-faktorsystemet, hvilket dog kun skal forstås at være et eksempel, da også andre ekspressionssystemer på i 25 og for sig kendt måde kan anvendes.
Strukturen af gær-pheromonogenet MFa er kendt fra Kurjan og Hershkovitz, Cell 30 (1982) 933-943, hvor også muligheden for ekspression af andre gener og sekretionen af genprodukter er diskuteret. I denne forbindelse kan der 30 også henvises til Brake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 4642-4646.
Som gærvektorer anvendes fordelagtigt såkaldte "shuttle"-vektorer, der har en bakteriel plasmid- og en gærplasmid-replikationsoprindelse, samt gener til selektion 35 i begge værtssystemer. Endvidere indeholder sådanne vektorer de til ekspressionen af fremmede gener nødvendige promotor- 3 DK 172350 B1 sekvenser og eventuelt til forbedring af udbytterne en ter-minatorsekvens, således at det heterologe gen, hensigtsmæssigt fusioneret til sekretoriske signaler, er anordnet mellem promotor og terminator.
5 Opfindelsen illustreres yderligere ved hjælp af de følgende eksempler. Procentangivelser er baseret på vægten.
Eksempel 1: Konstruktion af ekspressionsvektoren.
10 Først syntetiseres DNA-sekvensen I (tabel I) efter phosphitfremgangsmåden. Denne DNA-sekvens koder for amino-syrerne 4 9 til 80 i MFcx-proteinforløberen og svarer i det væsentlige til den naturlige DNA-sekvens.
DNA-sekvensen I anvendes først som sonde til isolering 15 af genet for a-faktoren og mærkes hertil med 32P. Ved hjælp af denne sonde isoleres genet fra en genomisk Xgtll-gærgen-bank (som de, der nu er handelsgængse, og som f.eks. kan fås hos Clontech Laboratories Inc., 4055 Fabian Way, Palo Alto, CA94303). Hertil identificeres Xgtll-fager, der bærer a-20 faktorgenet, ved et plaque-hybridiseringseksperiment. Fager fra plaque, der er identificeret som værende positive, isoleres, hvorefter de opformeres og DNA'et udvindes. Dette spaltes med EcoRI og analyseres på en 0,8%'s agarosegel. Efter et "Southern transfer"-eksperiment hybridiseres membra-25 nen mod den 32P-mærkede DNA-sekvens I. Fag-DNA, der har et ca. 1,75 kb-fragment, der hybridiserer mod DNA-sekvensen I, spaltes påny med enzymet, og det tilsvarende fragment isoleres. Vektoren pUC 19 åbnes med EcoRI og omsættes med 1,75 kb-fragmentet med T4-ligase. Der fås kloningsvektoren 30 1.
I tabel II er kloningsvektorerne anført, hvilke alle er konstrueret på basis af et pUC-Plasmid. Tabellerne viser herved kun disse vektorers polylinker-region i den gængse 51 _3 i-retning, idet MFar-sekvenserne er anført ved hjælp af 35 prikkede linier, og hirudin-sekvenserne er anført ved hjælp af stiplede linier. Fuldt optrukne linier betyder pUC- eller 4 DK 172350 B1 linker-sekvenser. Figur 1 viser disse kloningsvektorer skematisk og i ikke-korrekt målestoksforhold.
Stammen E. coli 79/02 transformeres med ligationsblandingen. Der isoleres hvide kolonier, hvorudfra plasmid-DNA'et 5 udvindes, og plasmider, der indeholder 1,75 kb-EcoRI-fragmentet identificeres.
Den naturlige DNA-sekvens for proteinforløberen for MFa indeholder i området for codonen for aminosyrerne 8 til 10 et Pstl-skæringssted og i området for codonen for amino-10 syrerne 48/49 et Taql-skæringssted. Fra det isolerede plas-mid-DNA isoleres nu ved omsætning med PstI og Taql fragmentet, der koder for MFa-forløbersekvensens aminosyrer 9-48. Vektoren pUC18 åbnes med PstI og Kpnl, hvorefter der omsættes med PstI-Taql-fragmentet samt med den syntetiske 15 DNA-sekvens I ved hjælp af T4-ligase. E. coli 79/02 transformeres med ligationsblandingen. Transformationsblandingen udspredes på IPTG-Xgal-Ap-plader. Hvide kolonier isoleres, og plasmid-DNA fra disse kloner karakteriseres ved hjælp af restriktionsanalyse. Man opnår på denne måde kloningsvektoren 20 2, der koder for MFa-forløbersekvensens aminosyrer 8 til 80.
Fra kloningsvektoren 2 udskæres ved omsætning med PstI og Kpnl den nævnte kodende sekvens, og anbringes i den i det efterfølgende beskrevne ligering. Hertil omsættes kloningsvektoren 1 med EcoRI og delvis med PstI, og det 25 fragment, der indeholder kodningssekvensen for de første 8 aminosyrer i MFa-forløbersekvensen, isoleres. Endvidere åbnes vektoren pUC19 med EcoRi og Kpnl, og den ligeres med de to beskrevne fragmenter, hvorved kloningsvektoren 3 opstår. Denne koder for MFa's samlede forløbersekvens op til 30 aminosyre 80.
Som udgangsmateriale for den største del af hirudin-sekvensen tjener det syntetiske gen, der er anført i EP-A 0.171.024 som "DNA-sekvens I", hvilket syntetiske gen i den foreliggende tabel I er anført som DNA-sekvens IV. I 35 denne sekvens er restriktionsenzymskæringsstederne fremtruk-ket ved understregning: I området af aminosyrerne 1 til 3 5 DK 172350 B1 skærer Accl, i området ved aminosyrerne 30/31 skærer BamHI og begyndende med det sidste stop-codon, Sad. I genets 5'--ende befinder sig den overhængende sekvens for Xbal og i 3'-enden den overhængende sekvens for Sall.
5 Dette syntetiske gen subklones i to dele (figurerne 1 og 2 i EP-A 0.171.024) . Disse subkloningsvektorer er anført i tabel II under nr. 4 (svarende til figur 2 i EP-A 0.171.024) eller 6 (svarende til figur 1 i EP-A 0.171.024).
Kloningsvektoren 4 åbnes med Hindi og Hindlll, og 10 det lineariserede DNA ligeres med DNA-sekvensen II (tabel I) . I den således opnåede kloningsvektor 5 er der blevet dannet et Ncol-skæringssted på det stumpendede ligerede sted.
Fra kloningsvektoren 6 udskæres det for hirudin-del-sekvensen kodende fragment ved totalfordøjelse med BamHI og 15 Accl. Dette fragment ligeres herefter med kloningsvektoren 3, hvilken er blevet åbnet med BamHI og Kpnl, samt med DNA--sekvensen III (tabel I). I DNA-sekvensen III er de sidste tre codoner nummereret på samme måde som i DNA-sekvensen IV (tabel I) . Der fås således kloningsvektoren 7, der koder 20 for de første 80 aminosyrer fra MFa's forløbersekvens og de første 30 aminosyrer fra hirudin-derivatet ifølge opfindelsen, hvilket bekræftes ved DNA-sekvensanalyse.
Ud fra kloningsvektoren 5 udskæres fragmentet fra BamHI og HindiII, hvilken sekvens koder for hirudins amino-25 syrer 31 til 64. Denne fragment ligeres i den med de samme enzymer åbnede kloningsvektor 7, hvorved kloningsvektoren 8 fås, hvilken koder for de første 80 aminosyrerser i MGa--forløbersekvensen og den samlede sekvens for hirudin-derivatet ifølge opfindelsen. Dette plasmids struktur bekræftes 30 ved hjælp af restriktionsanalyse.
Plasmidet Yepl3 (Broach et al., Gene 8. (1979) 121) åbnes med BamHI, og de overstående ender udfyldes med Klenow--polymerase. DNA fældes med ethanol og behandles med alkalisk oksephosphatase.
35 Fra kloningsvektoren 8 (tabel II) udskæres med Ncol og EcoRI det for hirudin-derivatet og for MFa's forløberse- 6 DK 172350 B1 kvens kodende fragment, og de overstående ender udfyldes som beskrevet.
De to stumpendede DNA-sekvenser ligeres med hinanden, hvorved fås plasmiderne pafHirl7 og pafHirl8 (fig. 2) . Disse 5 to plasmider adskiller sig kun i de indsatte fragmenters orientering.
Som det er beskrevet i EP-A 0.171.024, kan der bagved den indsatte sekvens indsættes en terminator (figurerne 4 til 6 i EP-A 0.171.024). Hertil er Ncol- og/eller BamHI--10 skæringsstederne egnede.
Efter amplifikation af plasmid-DNA i E. coli MM294 transformeres plasmidet pafHirl7 i de leucin-krævende gærstammer Y79 (a,trpl-l, leu2-l) (Cantrell et al., Proc. Acad. Natl. Sci. USA 82 (1985) 6250) og DM6-6 (θ'/ar leu2-3,112:: 15 ura3+/ Ieu2::lys2+, trpl~/trpl“, his3-ll, 15/his3-ll, 15, ura3"/ura3“, Iys2~/lys2-, arg4-17/arg4+, adel“/adel+) (Maya Hanna, Dept. Mol. Biol. Massachusetts General Hospital, Boston, USA) , efter den lithiummetode, der beskrevet af Ito, H. et al., J. Bacteriol., 153 (1983) 163. Kolonier, 20 der kan vokse på selektivt medium uden tilsat leucin, isoleres og spredes. Gær-minimalmedium podes med de enkelte kolonier, og der inkuberes i 24 timer ved 28°C. Cellerne fracentrifugeres, og den overstående væske undersøges ved en thrombin- hæmningsanalyse for hirudinaktivitet. Fra gærkloner, 25 hvis ovenstående væske viser hirudinaktivitet, reisoleres plasmid-DNA'et, og det karakteriseres ved hjælp af en restriktionsanalyse. De transformerede gærstammer anvendes til de følgende ekspressionsforsøg.
30 Eksempel 2: Ekspression.
10 ml gærfuldmedium podes med celler, der er fjernet fra en frisk én nat gammel kultur af en ifølge eksempel 1 opnået stamme fra et selektivt medium, således, at der opnås 35 en optisk tæthed ODg0o - 0/1· Kulturen rystes i 8 timer ved 28°C, hvorefter 90 ml frisk medium tilsættes. Derefter omry- 7 DK 172350 B1 stes kulturen i yderligere 20 timer. Cellerne fracentrifugeres, og hirudinaktiviteten i den ovenstående væske bestemmes .
5 Eksempel 3: Oparbejdning.
Den efter eksempel 2 opnåede ovenstående væske gøres sur til en pH værdi på 3-5, og blandingen sættes på en 0,1 M eddikesyreækvilibreret adsorptionsharpikssøjle med en 10 porøs adsorbar harpiks bestående af en copolymer af styren og divinylbenzen ("DIAION® HP 20") . Efter vask med tris · HCl (pH 8,5) og 50 mM eddikesyre sker elueringen med 60% isopro-panol. De fraktioner, der indeholder hirudin-derivatet, samles og oprenses over en Q-"SEPHAROSE®"-søjle, der er ækvi-15 libreret med 20 mM piperazin · HCl (pH 6). Elueringen sker herved over en 0-0,25 M NaCl-gradient. De fraktioner, der indeholder hirudin-derivatet, samles påny, og der oprenses ved hjælp af HPLC over en C18-"Reversed Phase" - c hr omat ograf i-søjle. Det således opnåede rene produkt underkastes herefter 20 en automatisk proteinsekvensanalyse.
Eksempel 4: Sammenligningseksempel.
Der gås frem ifølge eksempel 1, men anvender i stedet 25 for DNA-sekvensen II (tabel I) de følgende sekvenser, og man kan i gærkulturens ovenstående væske kun påvise en minimal hirudinaktivitet.
8 DK 172350 B1 1 2 (Pro) Leu Asp Lys Arg Thr (Tyr)
5 ' CT TTG GAT AAA AGA ACG T
11 la 3' CAT GGA AAC CTA TTT TCT TGC ATA
5 (Kpnl) (Accl) 1 2 (Pro) Leu Asp Lys Arg Ile (Tyr)
5 ' CT TTG GAT AAA AGA ΑΤΑ T
11 Ib 3' CAT GGA AAC CTA TTT TCT TAT ATA
10 (Kpnl)
Ved at anvende sekvensen Hib indeholder de til kloningsvektorerne 7 og 8 (tabel II) svarende vektorer ikke Accl-skæringsstedet.
15 9 DK 172350 B1 o
Tabel I: DNA-sekvenser 50 55
5 1.5' C GAT GTT GCT GTT TTG CCA TTC TCC
3' TA CAA CGA CAA AAC GGT AAG AGG
(Taql) 60 65
AAC AGT ACT AAT AAC GGT TTA TTG TTC 10 TTG TCA TGA TTA TTG CCA AAT AAC AAG
70
ATT AAT ACT ACT ATT GCT AGC ATT GCT
TAA TTA TGA TGA TAA CGA TCG TAA CGA
15 75 80 GCT AAA GAA GAA GGG GTA C 3' CGA TTT CTT CTT CCC 5' (Kpnl) 20 II. 5' CATGGA 3' 3' GTACCTTCGA 5' (HindiII) 25 (Pro) Leu Asp Lys Arg Leu Thr (Tyr) III. 5' CT TTG GAT AAA AGA CTT ACG T 3' 3' CAT GGA AAC CTA TTT TCT GAA TGC ATA 5' 30 (Kpnl) (Accl) 35 10 DK 172350 B1 0
DN#-sekvens IV
Triplet nr. 012345'
Aminosyre Met Thr Tyr Thr As c
Nucleotid nr. 1 ^0 20
5 Kod. Streng 5' cT AGA ATG ACG TAT ACT GAC TGC
Ikke-kod. streng - 3' T TAC TGC ATA TGA CTG ACG
6 7 Θ 9 10 11 12 13 14 15
Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu ‘Cys 30 40 50
ACT G AA TCT GGT CAG AAC CTG TGC CTG TGC
TGA CTT AGA CCA GTC TTG GAC ACG GAC ACG
10 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gin Gly Asn 60 70 80
GAA · GGA TCT AAC GTT TGC GGC CAG GGT AAC
CTT CCT AGA TTG CAA ACG CCG GTC CCA TTG
26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 6 Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys 90 100 110
AAA TGC ATC CTT GGA TCC GAC GGT GAA AA G
TTT ACG TAG GAA CCT AGG CTG CCA CTT TTC
36 37 38 39 40 41 42 43 44 45
Asn Gin Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro 20 120 130 1 40
AAC CAG TGC GTT ACT GGC GAA GGT ACC CCG
TTG GTC ACG CAA TGA CCG CTT CCA TGG GGC
46 47 48 49 50 51 52 53 54 55
Lys Pro Gin Ser His Asn Asp Gly Asp Phe 150 160 170
AAA CCG CAG TCT CAT AAC GAC GGC GAC TTC
25 TTT ' GGC GTC AGA GTA TTG CTG CCG CTG AAG
56 57 58 59 60 61 62 63 64
Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gin Stp 180 190 200
GAA GAG ATC CCT GAG GAA TAC CTT CAG TAA
CTT CT C TAG GGA CTC CTT ATG GAA GTC ATT
30
Stp 210 TAG AGC TCG 31 ATC TCG AGC AGC T 5 ’ 35 U DK 172350 B1 0
Tabel II: Kloningsvektor Nr. pUC
5 1 19 -E· · · (1,75 kb α-fragment)··-E- 2 18 -K· · · (a-80-49) · · ·Τ· · · (α-48-8) · · ·Ρ- 3 19 -Β-Κ· ·· (α-80-49) ·· ·Τ· ·· (α-48-8) · ·Ρ· · ·Ε- 4 8 -Β---(Hir31-64) -S-Hc-Hd- 5 8 -Β---(Hir31-64) - S-N-Hd- 10 6 12 -Β---(Hir30-3)---A---X-A- 7 19 -Hd-B---(Hir30- 3)---A---Κ· · · (α- 80- 8) · · ·Ρ· · ·Ε- 8 19 -Hd-N-S---(Hir64- 3 )---A---K · · · ( α- 80-8) · · ·Ρ · · · Ε- 15 ... MFa-sekvenser --- Hirudin-sekvenser
Forkortelser for restriktionsenzymer 20 A = Accl B = BamHI E = EcoRI He = Hindi 25 Hd = Hindi 11 K = Kpnl N = Ncol P = PstI S = Sall 30 T = Taql X = Xbal 35
Claims (6)
1. Hirudin-derivat, kendetegnet ved, at det har aminosyresekvensen 5 0 1 10 Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys- 20 Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-30 40
10 Ile-Leu-Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-Gly- 50 Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe- 60 Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln 15
2. DNA, kendetegnet ved, at det koder for polypeptidet med aminosyresekvensen ifølge krav 1.
3. Vektorer, kendetegnet ved, at de indeholder en DNA-sekvens ifølge krav 2.
4. Fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at et DNA ifølge krav 2 eksprimeres i en værtscelle.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at værtscellen er en gærcelle. 25
6. Lægemiddel, kendetegnet ved, at det har et indhold af polypeptidet ifølge krav 1.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU851341A HU198085B (en) | 1984-04-18 | 1985-04-11 | Process for producing new hirudine derivatives with anticoagulant effect and pharmaceutical compositions comprising same as active ingredient |
| HU134185 | 1985-04-11 | ||
| DE3805540 | 1988-02-23 | ||
| DE3805540 | 1988-02-23 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK13189D0 DK13189D0 (da) | 1989-01-12 |
| DK13189A DK13189A (da) | 1989-07-14 |
| DK172350B1 true DK172350B1 (da) | 1998-04-06 |
Family
ID=25865106
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK013189A DK172350B1 (da) | 1985-04-11 | 1989-01-12 | Hirudin-derivat, DNA, der koder derfor, vektorer, der indeholder en sådan DNA, fremstilling af hirudin-derivatet samt lægemiddel indeholdende dette |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0324712B1 (da) |
| AT (1) | ATE87938T1 (da) |
| DE (2) | DE19775033I2 (da) |
| DK (1) | DK172350B1 (da) |
| ES (1) | ES2055149T3 (da) |
| FI (1) | FI96956C (da) |
| IL (1) | IL88925A (da) |
| LU (1) | LU90127I2 (da) |
| NL (1) | NL970027I2 (da) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3835815A1 (de) * | 1988-10-21 | 1990-04-26 | Hoechst Ag | Neue isohirudine |
| EP0502962B1 (de) * | 1989-12-01 | 1996-03-13 | BASF Aktiengesellschaft | Hirudin-Muteine und deren Polyalkylenglykolkonjugate |
| DE4140381A1 (de) * | 1991-12-07 | 1993-06-09 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt, De | Neue synthetische isohirudine mit verbesserter stabilitaet |
| DE4404168A1 (de) * | 1994-02-10 | 1995-08-17 | Hoechst Ag | Hirudinderivate und Verfahren zu deren Herstellung |
| DE19529997C1 (de) | 1995-08-16 | 1997-04-10 | Hoechst Ag | Verfahren zur Inaktivierung von Carboxypeptidase Y in hirudinhaltigen Kulturbrühen |
| DE19543737A1 (de) * | 1995-11-24 | 1997-05-28 | Hoechst Ag | Verfahren zur Ultrafiltration von Peptide oder Proteine enthaltender biologischer Matrices |
| DE19544233A1 (de) | 1995-11-28 | 1997-06-05 | Hoechst Ag | Verfahren zur Nutzung des Hefe-ADH II-Promotorsystems zur biotechnologischen Produktion heterologer Proteine in hohen Ausbeuten |
| DE69625623T2 (de) | 1996-01-31 | 2003-11-06 | Sumitomo Bakelite Co. Ltd., Tokio/Tokyo | Verfahren zur Herstellung von in Epoxyharz eingekapselter Halbleitervorrichtung |
| DE19607239A1 (de) | 1996-02-27 | 1997-08-28 | Behringwerke Ag | Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend Hirudin und Verfahren zu deren Herstellung |
| DE19944870A1 (de) | 1999-09-18 | 2001-03-29 | Aventis Pharma Gmbh | Signalsequenzen zur Herstellung von Leu-Hirudin über Sekretion durch E. coli in das Kulturmedium |
| DE10033195A1 (de) * | 2000-07-07 | 2002-03-21 | Aventis Pharma Gmbh | Bifunktionale Fusionsproteine aus Hirudin und TAP |
| US7638618B2 (en) | 2001-02-20 | 2009-12-29 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Nucleic acids encoding a hirudin and pro-insulin as superscretable peptides and for parallel improvement of the exported forms of one or more polypeptides of interest |
| US7202059B2 (en) | 2001-02-20 | 2007-04-10 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Fusion proteins capable of being secreted into a fermentation medium |
| JP2006096668A (ja) * | 2002-11-08 | 2006-04-13 | Ono Pharmaceut Co Ltd | エラスターゼ阻害剤と血液凝固系および／または線溶系酵素阻害剤との組み合わせからなる医薬 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3438296A1 (de) * | 1984-04-18 | 1985-11-07 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Neue polypeptide mit blutgerinnungshemmender wirkung, verfahren zu deren herstellung bzw. gewinnung, deren verwendung und diese enthaltende mittel |
| DE3689525D1 (de) * | 1985-07-17 | 1994-02-24 | Hoechst Ag | Neue Polypeptide mit blutgerinnungshemmender Wirkung, Verfahren zu deren Herstellung bzw. Gewinnung, deren Verwendung und diese enthaltende Mittel. |
-
1989
- 1989-01-11 EP EP89710003A patent/EP0324712B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-11 DE DE19775033C patent/DE19775033I2/de active Active
- 1989-01-11 FI FI890127A patent/FI96956C/fi not_active IP Right Cessation
- 1989-01-11 AT AT89710003T patent/ATE87938T1/de active
- 1989-01-11 DE DE8989710003T patent/DE58903988D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-11 IL IL8892589A patent/IL88925A/en active IP Right Grant
- 1989-01-11 ES ES89710003T patent/ES2055149T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-12 DK DK013189A patent/DK172350B1/da not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-07-23 NL NL970027C patent/NL970027I2/nl unknown
- 1997-08-20 LU LU90127C patent/LU90127I2/fr unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NL970027I2 (nl) | 1998-04-01 |
| FI890127A (fi) | 1989-07-14 |
| DK13189A (da) | 1989-07-14 |
| ES2055149T3 (es) | 1994-08-16 |
| DE19775033I2 (de) | 2011-01-20 |
| DE58903988D1 (de) | 1993-05-13 |
| DK13189D0 (da) | 1989-01-12 |
| ATE87938T1 (de) | 1993-04-15 |
| EP0324712A2 (de) | 1989-07-19 |
| EP0324712B1 (de) | 1993-04-07 |
| IL88925A (en) | 1995-11-27 |
| LU90127I2 (fr) | 1997-10-06 |
| FI96956B (fi) | 1996-06-14 |
| FI890127A0 (fi) | 1989-01-11 |
| NL970027I1 (nl) | 1997-10-01 |
| EP0324712A3 (en) | 1990-07-04 |
| FI96956C (fi) | 1996-09-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI84080C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av rennin och daeri anvaendbara hybridplasmider. | |
| DK172350B1 (da) | Hirudin-derivat, DNA, der koder derfor, vektorer, der indeholder en sådan DNA, fremstilling af hirudin-derivatet samt lægemiddel indeholdende dette | |
| Kataoka et al. | DNA sequence and characterization of the S. cerevisiae gene encoding adenylate cyclase | |
| US5139936A (en) | Use of the GAL1 yeast promoter | |
| US4661454A (en) | GAL1 yeast promoter linked to non galactokinase gene | |
| US4732973A (en) | Active site modified protease α-1-antitrypsin inhibitors | |
| DK175195B1 (da) | Hirudinekspression | |
| JPH1045799A (ja) | 形質転換酵母を用いて製造した蛋白質 | |
| JPS63313587A (ja) | 微生物宿主細胞による第８因子活性を有するタンパク質の製造法、発現ベクタ−、宿主細胞、抗体 | |
| NO178035B (no) | Ekspressjonsvektor, gjærcelle som er i stand til å utskille desulfatohirudin samt fremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt desulfatohirudin | |
| US5010010A (en) | Production of human parathyroid hormone from microorganisms | |
| US4752576A (en) | Expression of α-1 antitrypsin in yeast | |
| CA1341165C (en) | Active site modified protease alpha-1-antitrypsin inhibitors and their production | |
| US5180668A (en) | Hirudin derivative | |
| WO1992001048A1 (en) | Production of aprotinin in methylotrophic yeast cells | |
| AU660172B2 (en) | BAR1 secretion signal | |
| AU701136B2 (en) | Novel inhibitor | |
| US5407822A (en) | Artificial promoter for the expression of proteins in yeast | |
| PT592358E (pt) | Processo para a producao de inibidores de proteases | |
| PT716705E (pt) | Processo para a preparacao por recombinacao de proteinas na levedura hansenula | |
| Cook et al. | Expression and Purification of Recombinant Tick Anticoagulant Peptide (Y1W/D10R) Double Mutant Secreted bySaccharomyces cerevisiae | |
| PT725822E (pt) | Processo para preparacao de proteinas por recombinacao em leveduras | |
| CN1029988C (zh) | 水蛭素衍生物 | |
| DE3900626A1 (de) | Hirudin-derivat |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| CTFF | Application for supplementary protection certificate (spc) filed |
Free format text: CA 1998 00017, 19980520, EXPIRES: 20120313 |
|
| CTFG | Supplementary protection certificate (spc) issued |
Spc suppl protection certif: CA 1998 00017 |
|
| PUP | Patent expired |