FI96956B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen hirudiinijohdannaisen valmistamiseksi - Google Patents

Description

96956

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen hirudiinijohdannaisen valmistamiseksi

Keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti käyttö-5 kelpoisen hirudiinijohdannaisen valmistamiseksi.

Hirudiinijohdannaiset ja niiden geenitekninen valmistus ovat tunnettuja EP-A-hakemusjulkaisusta 0 171 024.

Nyt on havaittu, että hirudiinijohdannainen, jonka aminohapposekvenssi on 10 0 1 10

Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys- 20

Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-30 40 15 Ile-Leu-Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-Gly- 50

Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe- 60

Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln 20 omaa lukuisia etuja. Edeltävässä sekvenssi on säilytetty EP-A-hakemusjulkaisun 0 171 024 mukainen numerointi.

Hirudiini ja sen johdannaiset osoittavat vaihtele-vaa biologista aktiivisuutta, jolloin mainittu vaihtelu on johdettavissa vaihtelevasta affiniteetista trombiinin suh-25 teen ja/tai toisistaan poikkeavasta stabiilisuudesta. Kek sinnön mukaisesti saatava hirudiinijohdannainen erottuu yllättävästi muista erityisen aktiivisuutensa ansiosta.

. Edelleen todettiin, että keksinnön mukaisesti saa tava hirudiinijohdannainen on erityisen edullisesti il-30 maistavissa hiivoissa. Vertailukokeet osoittivat analogisten hirudiinijohdannaisten, jotka N-päätteetään alkavat Thr-Tyr- tai Ile-Tyr-ryhmillä ilmaistuvan vain alhaisina saantoina.

Ilmaiseminen hiivasoluista ei ole edullista ainoas-35 taan siksi, että hirudiinijohdannainen erittyy, vaan erityisesti siksi, että se saadaan käytännöllisesti katsoen kvantitatiivisena saantona oikein laskostuneessa muodossa, ja siksi, että se omaa korkean aktiivisuuden.

2 96956

Keksinnön mukaiselle menetelmälle hirudiinijohdan-naisen valmistamiseksi on siten tunnusomaista, että tätä polypeptidiä koodaava DNA-sekvenssi ilmaistaan hiivassa ja hirudiinijohdannainen otetaan talteen soluviljelmän super-5 natantista.

Kuviossa 1 on esitetty kloonausvektoreita geenira-kenteen saamiseksi, joka koodaa hiivan MFÖ-esiproteiinia sekä em. hirudiinijohdannaista. Kuviossa 2 esitetään hii-vailmaisinvektori, joka käsittää tämän geenirakenteen.

10 Hirudiinijohdannaisen valmistus voidaan luonnolli sesti suorittaa myös muiden menetelmien mukaan, esimerkiksi ilmaisemalla bakteereissa tai korkeammissa eukaryootti-sissa soluissa kuten hyönteissoluissa tai eläinsoluissa. Ilmaiseminen suoritetaan kuitenkin keksinnön mukaisesti 15 edullisesti hiivajärjestelmän avulla, esimerkiksi kuten on esitetty EP-A-hakemusjulkaisussa 0 248 227, esim. hiivoissa Pichia pastoris, Hansenula polymorphis, Schizosaccharo-myces pombe tai edullisesti Saccharomyces cerevisiae.

Hiivailmaisuvektoreita tunnetaan lukuisia, esimer-20 kiksi EP-A-hakemusjulkaisuista 0 060 057, 0 088 632, 0 116 201, 0 121 884, 0 123 544 ja 0 195 691. Keksinnön mukaista hirudiinijohdannaisen valmistusta kuvataan seu-raavassa hiiva-α-tekijäjärjestelmää käyttäen, minkä tulee kuitenkin ymmärtää vain esimerkkiluonteiseksi, koska si-, 25 nänsä tunnetulla tavalla voidaan käyttää muitakin ilmaisu- järjestelmiä.

Hiiva-feromonigeenin MFa rakenne tunnetaan lähteestä Kurjan ja Hershkovitz, Gell 30 (1982) 933 - 943, jossa käsitellään myös muiden geenien ilmaisumahdollisuutta sekä 30 geenituotteiden eritystä. Tältä osin voidaan viitata niin ikään lähteeseen Brake et. ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 (1984) 4642 - 4646.

Hiivavektoreina käytetään edullisesti niinsanottuja sukkulavektoreita, joissa on bakteeriplasmidin ja hiiva-35 plasmidireplikaation aloituskohdan että seulontageenin 3 96956 seulontaa varten kummassakin isäntäjärjestelmässä. Lisäksi nämä vektorit sisältävät vierasgeenien ilmaisemiseksi välttämättömät promoottorisekvenssit ja valinnaisesti saannon nostamiseksi lopetussekvenssin, siten, että hete-5 rologinen geeni - joka on tarkoituksenmukaisesti fuusioitu erityssignaaleihin - on järjestäytynyt promoottori- ja lopetussekvenssien väliin.

Keksinnön mukaisesti saatava Leu-Thr-hirudiini on aktiivisuusomainisuuksiltaan parempi kuin tunnetut hiru-10 diinit.

Tämän keksinnön puitteissa on eri yhdistelmähiru-diineja testattu niiden trombiinia inhiboivan aktiivisuus-tensa suhteen kromogeenista substraattia käsittävässä analyysissä.

15 Kineettiset mittaukset suoritettiin Stonen ja

Hofsteengen kuvaamissa olosuhteissa (J. Biochemistry, 1986, 25, 4622 - 4628) 0,05 molaarisessa Tris-HCl:ssä, joka sisälsi 0,1 % polyetyleeniglykolia 6000 ja 0,1 M NaCl pH-arvossa 7,8 ja lämpötilassa 37 °C. Hirudiiniliuokset 20 titrattiin 2 nMrisella trombiinilla (hirudiinipitoisuudet noin 2 nM - 0,5 nM) ja 0,2 mM:isella S-2266, joka on Kabi Vitrumin markkinoima kromogeeninen substraatti. Kineettiset mittaukset suoritettiin käyttäen 20 pM trombiinia ja 0, 8, 16, 24, 32 ja 40 pM hirudiinia ja substraattina 25 0,094 mM S-2238, joka on Kabi Vitrumin markkinoima kromo geeninen substraatti, HP 8452 - diodiarrayspektrofotomet-rillä. Reaktio aloitettiin lisäämällä trombiini esilämmi-tettyyn puskurin, substraatin ja hirudiinin seokseen ja sitä seurattiin aallonpituudella 405 nm 30 minuuttia.

30 Reaktioiden kulku on rekisteröity mikrotietokoneella ja analysoitu sovittamalla ne löysä/kiinteä -sitomisyhtälöön Dr. Stuart Stonen kehittämillä ohjelmilla epäsuoraa regressioanalyysiä varten. Ohjelma antaa näennäisen disso-siaatiovakion, Kx, assosiaationopeusvakion, Kon, sekä näen-35 näisen assosiaationopeusvakion, Koff. Arvot on korjattu sub- 4 96956 straatin vaikutuksen osalta inhibiittorin sitomiseen käyttäen Κ,,-arvoa 3,6 μΜ S-2238:n osalta.

Kokeessa saatiin seuraavat tulokset: 5 ____

Val-Val-Hir. Leu-Thr-Hir. Ile-Thr-Hir.

Kx (fM) 237 47 206 10 Kon (M'1S’1) 1,37 x 10® 2,28 x 10® 1,25 x 10®

Kon (S-1) 3,2 x 10*5 1,05'x ΙΟ-5 2,6 x 10'5

Yhdistelmähirudiinin Leu-Thr-variantti näyttä siis 15 olevan 4 - 5-kertaisesti tehokkaampi ihmisen trombiinin inhibiittori kuin HV1-variantit, joilla on Val-Val tai Ile-Thr N-päätesekvenssinä. Tämä johtuu lähinnä alhaisesta dissosiaationopeusvakiosta Koff, (muodostunut kompleksi on stabiili). Tulos on sopusoinnussa yleisesti hyväksytyn 20 hirudiinin sitomismallin kanssa, jonka mukaan tiivis N-päätealue antaa suuremman osan trombiinin ja hirudiinin välisestä sitomisenergiasta (Stone, S.R. ja Hofsteenge, J. Biochemistry 1986, 25, 4622-4628, Wallace A., Dennis, S., Hofsteenge, J. ja Stone, S.R., Biochemistry 1989 1989, 28, 25 10079-10084, Rydel, T.J. ja Tulinsky, A., J. Mol. Biol.

1991, 221, 583-601).

Uusi hirudiini on siis aktiivisempi kuin tunnetut ja eroaa siten edukseen näistä. Keksinnön mukaisesti saatava hirudiini on näin ollen selvästi keksinnöllinen ja 30 myös teollisen käyttökelpoisuutensa osalta parempi kuin tunnetut hirudiinit.

Keksintöä havainnollistetaan edelleen seuraavien esimerkkien avulla. Prosenttiosuudet on laskettu painosta.

5 96956

Esimerkki 1

Ilmaisuvektorien rakentaminen

Ensin syntetisoidaan DNA-sekvenssi I (taulukko 1) fosfiittimenetelmän mukaan. Tämä DNA-sekvenssi koodaa MFa-5 esiproteiinin aminohappoja 49 - 80, ja vastaa oleellisesti luonnollista DNA-sekvenssiä.

Sitten DNA-sekvenssiä I käytetään koettimena a-teki jägeenin eristämiseksi, missä tarkoituksessa se leimataan 32P:llä. Geeni eristetään tämän koettimen avulla λ-10 gtll-hiivagenomigeenipankista (joita on kaupallisesti saatavana, esimerkiksi valmistajalta Clontech Laboratories Inc., 4055 Fabian Way, Palo Alto, CA94303). Tätä silmälläpitäen tunnistetaan a-tekijägeenin käsittäviä λ-gtll-faa-geja plakkihybridisaatiomenettelyn avulla. Positiivisiksi 15 tunnistetuista plakeista eristetään faageja, joita monistetaan ja joista eristetään DNA. Tätä pilkotaan EcoRI:llä ja analysoidaan 0,8-%:isessa agaroosigeelissä. Southern transfer-siirron jälkeen siirtokalvo hybridisoidaan 32P-leimattuun DNA-sekvenssiin I. Faagi-DNA:ta, jossa on DNA-20 sekvenssiin I hybridisoituva noin 1,75 kb:n fragmentti, pilkotaan toistamiseen samalla entsyymillä ja eristetään vastaava fragmentti. Vektori pUC19 avataan EcoRI:llä ja tuote ligatoidaan 1,75 kb:n fragmenttiin T4-ligaasin avulla. Saadaan kloonausvektori 1.

25 Taulukossa 2 on esitetty kloonausvektoreita, jotka kaikki rakennettiin pUC-plasmidista lähtien. Taulukossa esitetään tosin vain näiden vektorien polyliittäjäalueet tavanomaisessa 5' -+3' -suunnassa, jolloin MFa-sekvenssit on merkitty pilkkuviivoin ja hirudiinisekvenssit katkovii-30 voin. Yhtenäiset viivat merkitsevät pUC- tai liittäjäsek-venssejä. Kuviossa 1 kloonausvektorit on esitetty kaavio-kuvina eikä oikeassa mittakaavassa.

Ligatointiseoksella transformoidaan E. coli -kantaa 79/02. Valkeat pesäkkeet eristetään, ja niistä otetaan 35 talteen plasmidi-DNA, josta tunnistetaan 1,75 kb:n EcoRI-fragmentin sisältävät plasmidit.

6 96956 MFa-esiproteiinin luonnollinen DNA-sekvenssi sisältää aminohapporyhmien 8-10 kodonialueella Pstl-pilkko-miskohdan sekä aminohappojen 48/49 kodonialueella Taql-pilkkomiskohdan. Eristetystä plasmidi-DNA:sta eristetään 5 sitten Pstl:llä ja Taql:llä pilkkomalla fragmentti, joka koodaa MFa-esisekvenssin aminohappoja 9-48. Vektori pUC18 avataan Pstl:llä ja Kpnl:llä ja tuote ligatoidaan Pstl-TaqI-fragmenttiin sekä synteettiseen DNA-sekvenssiin 1 T4-ligaasin avulla. Ligatointiseoksella transformoidaan 10 E. coli -kantaa 79/02. Transformointiseos maljataan IPTG-Xgal-Ap-maljoihin. Valkeat pesäkkeet eristetään ja klooneista saatua plasmidi-DNA:ta karakterisoidaan restriktio-analyysin avulla. Näin saadaan kloonausvektori 2, joka koodaa MFa-esisekvenssiin aminohappoja 8-80.

15 Kloonausvektorista 2 leikataan mainittu koodaava sekvenssi irti Pstl:llä ja Kpnl:llä, minkä jälkeen saatua sekvenssiä käytetään seuraavaksi kuvatussa ligatoinnissa. Tähän tarkoitukseen kloonausvektori 1 pilkotaan EcoRI:llä sekä osittain Pstl:llä ja eristetään MFa-esisekvenssin 8 20 ensimmäistä aminohappoa koodittavan sekvenssin käsittävä fragmentti. Edelleen vektori pUC19 avataan EcoRI:llä ja KpNl:llä ja tuote ligatoidaan kahteen edellä kuvattuun fragmenttiin, jolloin saadaan kloonausvektori 3. Tämä koodaa MFa:n esisekvenssiä kokonaissuudessaan aina aminohap-25 poon 80 asti.

Lähtömateriaalina suurimmalle osalle hirudiinisek-venssiä käytetään EP-A-hakemusjullkaisussa 0 171 024 'DNA-sekvenssinä 1’ esitettyä synteettistä geeniä, joka on esitetty oheisessa taulukossa 1 nimellä DNA-sekvenssi IV.

30 Tässä sekvenssissä restriktioentsyymien pilkkomiskohdat on merkitty alleviivauksella: aminohappoalueella 1-3 pilk-koo Accl, aminohappoalueella 30/31 BamHI ja viimeisestä lopetuskodonista eteenpäin Sacl. Geenin 5'-päätteessä on Xbal-ylijäämäsekvenssi ja 3*-päätteessä Sall-ylijäämäsek- 35 venssi.

7 96956 Tämä synteettinen geeni alakloonattiin kahtena palana (kuviot 1 ja 2 EP-A-hakemusjulkaissa 0 171 024). Nämä alakloonausvektorit on esitetty taulukossa 2 numeroilla 4 (joka vastaa EP-A 0 171 024 kuviota 2) ja 6 (joka vastaa 5 EP-A 0 171 024 kuviota 1).

Kloonausvektori 4 avataan Hindi:11a ja HindIII:lla, minkä jälkeen linearisoitu DNA ligatoidaan DNA-sekvenssiin II (taulukko 1). Näin saatuun kloonausvek-toriin 5 on muodostunut Ncol-pilkkomiskohta tylppäpäät-10 teisesti ligatoituun kohtaan.

Kloonausvektorista 6 leikataan irti hirudiiniosa-sekvenssiä koodaava fragmentti pilkkomalla vektori täysin BamHI:llä ja Accl:llä. Sitten fragmentti ligatoidaan BamHI:llä ja Kpnl:llä avattuun kloonausvektoriin 3 sekä 15 DNA-sekvenssiin III (taulukko 1). DNA-sekvenssissä III

viimeiset kolme kodonia on numeroitu samalla tavalla kuin DNA-sekvenssissä IV (taulukko 1). Näin saadaan kloonausvektori 7, joka koodaa MFa-esisekvenssin 80 ensimmäistä aminohappoa sekä halutun hirudiinijohdannaisen 30 ensim-20 mäistä aminohappoa, mikä varmistetaan DNA-sekvenssoinnin avulla.

Kloonausvektorista 5 leikataan BamHI:n ja HindIII:n avulla irti fragmentti, joka koodaa hirudiinin aminohappoja 31 - 64. Tämä fragmentti ligatoidaan samoilla entsyy-25 meillä avattuun kloonausvektoriin 7, jolloin saadaan kloo-‘ nausvektori 8, joka koodaa MFa-esisekvenssin 80 ensimmäis tä aminohappoa sekä halutun hirudiinijohdannaisen sekvenssiä kokonaisuudessaan. Tämän plasmidin rakenne varmistetaan restriktioanalyysin avulla.

30 Plasmidi Yepl3 (Broach et. ai., Gene 8 (1979) 121) . - avataan BamHI:llä ja ylijäämäpäätteet täytetään Klenow- ' polymeraasin avulla. DNA seostetaan etanolilla, minkä jäl keen sitä käsitellään emäksisellä naudan fosfataasilla.

Kloonausvektorista 8 (taulukko 2) leikataan 35 NcoI:llä ja EcoRI:llä hirudiinijohdannaista ja MFa-esisek- 8 96956 venssiä koodaava fragmentti irti, ja ylijäämäpäätteet täytetään kuten edellä kuvattiin.

Kyseiset kaksi tylppäpäätteistä DNA-sekvenssiä li-gatoidaan toisiinsa, jolloin saadaan plasmidit pafHirl7 ja 5 pafHirl8 (kuvio 2). Nämä kaksi plasmidia poikkeavat toisistaan vain insertoidun fragmentin suuntauksen osalta.

Kuten on kuvattu EP-A-hakemusjulkaisussa 0 171 024, insertoidun sekvenssin perään voidaan lisätä lopetussek-venssi (kuviot 4-6, EP-A 0 171 024). Tähän tarkoitukseen 10 soveltuvat Ncol- ja/tai BamHl-pilkkomiskohdat.

Plasmidi-DNA:ta monistetaan E. coli -kannassa MM294, minkä jälkeen plasmidi pafHirl7 transformoidaan leusiiniriippuvaisiin hiivakantoihin Y79 (a, trpl-1, leu2-l) (Cantrell et. ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82 15 (1985) 6250) ja DM6-6 (α/α leu2-3,112: :ura37leu2: :lys2*, trpl'/trpl", his3-ll, 15/his3-ll, 15, ura3‘/ura3', lys2'/ lys2*, arg4-17/arg4+, adel‘/adel+) (Maya Hanna., Dept. Mol. Biol. Massachusetts General Hospital, Boston, USA) Iton, H. et ai., J. Bacteriol. 153 (1983) 163, litiummenetelmän 20 mukaan. Eristetään ja erotetaan toisistaan pesäkkeet, jotka kykenevät kasvamaan selektiivisessä, leusiinia sisältämättömässä kasvualaustassa. Yksittäiset pesäkkeet siirros-tetaan hiivaminimivaatimuskasvualustaan, minkä jälkeen in-kuboidaan 24 tunnin ajan 28 °C:ssa. Solut erotetaan sen-25 trifugoimalla ja viljelmäsupernatantista määritetään hiru-diiniaktiivisuus trombiiniestokokeen avulla. Supernatan-tissa hirudiiniaktiivisuutta sisältävistä hiivaklooneista eristetään uudelleen plasmidi-DNA, jota karakterisoidaan restriktioentsyymianalyysin avulla. Transformoiduilla hii-30 vakannoilla suoritetaan seuraavat ilmaisukokeet.

Esimerkki 2 »

Ilmaisu 10 ml:aan täydellistä hiivakasvualustaa siirroste-taan soluja yön yli selektiivisessä kasvualaustassa kas-35 vaneesta esimerkin 1 mukaan saadusta kannasta siten, että 9 96956 optisesti tiheydeksi tulee OD600 = 0, 1. Viljelmää ravistelu-kasvatetaan 8 tunnin ajan 28 °C:ssa, minkä jälkeen lisätään 90 ml tuoretta kasvualustaa. Sitten viljelmää ravis-telukasvatetaan edelleen 20 tunnin ajan. Solut erotetaan 5 sentrifugoimalla ja supernatant!sta määritetään hirudiini-aktiivisuus.

Esimerkki 3

Jatkokäsittely

Esimerkin 2 mukaan saatua supernatanttia tehdään 10 happamaksi pH-arvoon 3 - 5, minkä jälkeen se panostetaan 0,1 M etikkahapolla tasapaino!tettuun adsorptiokolonniin, joka on pakattu huokoisella, styroli-divinyylibentseeni -kopolymeeristä koostuvalla adsorptiohartsilla (DiaionRHP 20). Kolonnia pestään Tris/HCl:llä (pH 8,5) ja 50 mM etik-15 kahapolla, minkä jälkeen sitä eluoidaan 30-%:isella iso-propanolilla. Hirudiinijohdannaista sisältävät fraktiot yhdistetään, minkä jälkeen niitä puhdistetaan Q-SepharoseR-kolonnissa, joka on etukäteen tasapainoitettu piperatsii-ni/HCl:llä (pH 6). Tässä tapauksessa eluointi tapahtuu 20 käyttäen 0 ->0,25 M NaCl-gradienttia. Hirudiinijohdannais ta sisältävät fraktiot yhdistetään jälleen, minkä jälkeen niitä puhdistetaan HPLC-ajon avulla C18-käänteisfaasi-kro-matografiakolonnissa. Näin saadulla puhtaalla tuotteella suoritetaan sitten proteiinisekvenssianalyysi automaatti-25 sen analysaattorin avulla.

Esimerkki 4

Vertailuesimerkki

Jos menetellään muutoin kuten esimerkissä 1 paitsi, että DNA-sekvenssin III (taulukko 1) asemesta käytetään 30 seuraavaa sekvenssiä, hiivaviljelmäsupernatantista kyetään osoittamaan vain erittäin vähäistä hirudiiniaktiivisuutta.

10 96956 1 2 (Pro) Leu Asp Lys Arg Thr (Tyr)

5 ’ CT TTG GAT AAA AGA ACG T

Ilia 3' CAT GGA AAC CTA TTT TCT TGC ATA

5 (Kpnl) (AccI) 1 2 (Pro) Leu Asp Lys Arg lie (Tyr)

10 5' CT TTG GAT AAA AGA ΑΤΑ T

Illb 3' CAT GGA AAC CTA TTT TCT TAT ATA

(Kpnl) Käytettäessä DNA-sekvenssiä IIIb kloonausvektoreita 7 ja 8 15 (taulukko 2) vastaavat vektorit eivät sisällä Accl-pilk-komiskohtaa.

< 11 96956 TAULUKKO 1 DNA-SEKVENSSIT 50 55

I. 5' C GAT GTT GCT GTT TTG CCA TTC TCC

5 3' TA CAA CGA CAA AAC GGT AAG AGG

(Taql) 60 65

AAC AGT ACT AAT AAC GGT TTA TTG TTC

TTG TCA TGA TTA TTG CCA AAT AAC AAG

10 70

ATT AAT ACT ACT ATT GCT AGC ATT GCT

TAA TTA TGA TGA TAA CGA TCG TAA CGA

15 75 80 GCT AAA GAA GAA GGG GTA C 3' CGA TTT CTT CTT CCC 5' (Kpnl) 20 II. 5' CATGGA 3' 3' GTACCTTCGA 5' (Hindlll) 25 (Pro) Leu Asp Lys Arg Leu Thr (Tyr) III. 5' CT TTG GAT AAA AGA CTT ACG T 3 ' 3' CAT GGA AAC CTA TTT TCT GAA TGC ATA 5' (Kpnl) (Accl) 12 96956

DNA-sekvenssi IV

Triplettinro 0 1 2 3 4 5

Aminohappo j äännös Met Thr Tyr Thr Asp Cys

Nukleotidinro 1 10 20

Koodaava säie 5' CT AGA ATG ACG TAT ACT GAC TGC

5 Ei-koodaava säie 3' T TAC TGC ATA TGA CTG ACG

6 7 8 9 1C 11 12 13 14 15

Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys 30 40 50

ACT GAA TCT GGT CAG AAC CTG TGC CTG TGC

-GA CTT AGA CCA GTC TT G GAC ACG GAC ACC

10 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Gin Gly Asn 60 70 80

GAA GGA TCT AAC GTT TGC GGC CAG GGT AAC

CTT CCT AGA TT G CAA ACG CCG GTC CCA TTG

26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys 90 100 110

15 AAA TGC ATC CTT GGA TCC GAC GGT GAA AAG

TTT ACG TAG GAA CCT AGG CTG CCA CTT TTC

36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

Asn Gin Cys Vai Thr Gly Glu Gly Thr Pro 120 130 140

AAC CAG TGC GTT ACT GGC GAA GGT ACC CCG

TTG GTC ACG CAA TGA CCG CTT CCA TGG GGC

46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 20 Lys Pro Gin Ser His Asn Asp Gly Asp Phe 150 160 170

AAA CCG CAG TCT CAT AAC GAC GGC GAC TTC

TTT GGC GTC AGA GTA TTG CTG CCG CTG AAG

56 57 58 59 60 61 62 63 64

Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gin Stp 180 190 200

GAA GAG ATC CCT GAG GAA TAC CTT CAG TAA

25 CTT CTC TAG GGA CTC CTT ATG GAA GTC ATT

Stp 210 TAG AGC TCG 3' ATC TCG AGC AGC T 5' 13 96956

TAULUKKO 2 KLOONAUSVEKTORIT

5 Nro pUC

1 19 -E··*(1,75 kb α-fragmentti)···Ε- 2 18 -Κ···(α-80-49)···Τ···(a-48-8)···P- 3 19 —B-K**·(a-80-49)···T···(a-48-8)···Ρ···E- 4 8 -B---(Hir31-64)-S-Hc-Hd- 10 5 8 -B---(Hir31-64)-S-N-Hd- 6 12 -B (Hir30-3) A---X-A- 7 19 -Hd-B (Hir30-3)---A---K···(a-80-8)···Ρ···Ε- 8 19 -Hd-N-S (Hir64-3) A---K···(a-80-8)···Ρ···E- 15 ··· MFa-sekvenssit --- hirudiinisekvenssit

Restriktioentsyymeistä käytetyt lyhenteet

A = Accl 20 B = BamHI E = EcoRI He = Hindi Hd = Hindlll K = Kpnl 25 N = Ncol P = PstI

5 = Sali T = Taql X = Xbal

Claims (3)

1. 96956 Patenttivaatimus Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen hirudii-nijohdannaisen valmistamiseksi, jonka aminohapposekvenssi 5 on 0 1 10 Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys- 20 Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-10 30 40 Ile-Leu-Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-Gly- 50 Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe- 60
2. 15 Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln,' tunnettu siitä, että tätä polypeptidiä koodaava DNA-sekvenssi ilmaistaan hiivassa ja hirudiinijohdannainen otetaan talteen soluviljelmän supernatantista. « ♦ 96956 Förfarande för framställnlng av ett terapeutiskt användbart hirudinderivat med aminosyrasekvensen 5 0 1 10 Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys- 20 Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-30 40
3. 10 Ile-Leu-Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-Gly- 50 Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe- 60 Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln, känneteck-15 n a t därav, att en DNA-sekvens som· kodar denna polypep-tid uttrycks i jäst och hirudinderivatet tas tillvara frän cellodllngens supernatant. • I