FI96956B - Process for the preparation of a therapeutically useful hirudin derivative - Google Patents
Process for the preparation of a therapeutically useful hirudin derivative Download PDFInfo
- Publication number
- FI96956B FI96956B FI890127A FI890127A FI96956B FI 96956 B FI96956 B FI 96956B FI 890127 A FI890127 A FI 890127A FI 890127 A FI890127 A FI 890127A FI 96956 B FI96956 B FI 96956B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- gly
- glu
- thr
- cys
- leu
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Hydrogenated Pyridines (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
9695696956
Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen hirudiinijohdannaisen valmistamiseksiA process for preparing a therapeutically useful hirudin derivative
Keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti käyttö-5 kelpoisen hirudiinijohdannaisen valmistamiseksi.The invention relates to a process for the preparation of a therapeutically useful hirudin derivative.
Hirudiinijohdannaiset ja niiden geenitekninen valmistus ovat tunnettuja EP-A-hakemusjulkaisusta 0 171 024.Hirudin derivatives and their genetic engineering are known from EP-A application 0 171 024.
Nyt on havaittu, että hirudiinijohdannainen, jonka aminohapposekvenssi on 10 0 1 10It has now been found that a hirudin derivative having the amino acid sequence of 10 0 1 10
Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys- 20Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys- 20
Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-30 40 15 Ile-Leu-Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-Gly- 50Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-30 40 15 Ile-Leu-Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln -Cys-Val-Thr-Gly- 50
Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe- 60Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe- 60
Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln 20 omaa lukuisia etuja. Edeltävässä sekvenssi on säilytetty EP-A-hakemusjulkaisun 0 171 024 mukainen numerointi.Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln 20 has numerous advantages. The above sequence retains the numbering according to EP-A application 0 171 024.
Hirudiini ja sen johdannaiset osoittavat vaihtele-vaa biologista aktiivisuutta, jolloin mainittu vaihtelu on johdettavissa vaihtelevasta affiniteetista trombiinin suh-25 teen ja/tai toisistaan poikkeavasta stabiilisuudesta. Kek sinnön mukaisesti saatava hirudiinijohdannainen erottuu yllättävästi muista erityisen aktiivisuutensa ansiosta.Hirudin and its derivatives show varying biological activity, said variation being due to varying affinity for thrombin and / or different stability. The hirudin derivative obtained according to the invention is surprisingly distinguished from others by its particular activity.
. Edelleen todettiin, että keksinnön mukaisesti saa tava hirudiinijohdannainen on erityisen edullisesti il-30 maistavissa hiivoissa. Vertailukokeet osoittivat analogisten hirudiinijohdannaisten, jotka N-päätteetään alkavat Thr-Tyr- tai Ile-Tyr-ryhmillä ilmaistuvan vain alhaisina saantoina.. It was further found that the hirudin derivative obtainable according to the invention is particularly advantageously present in yeast. Comparative experiments showed that analogous hirudin derivatives, which start at their N-terminus with Thr-Tyr or Ile-Tyr groups, are expressed only in low yields.
Ilmaiseminen hiivasoluista ei ole edullista ainoas-35 taan siksi, että hirudiinijohdannainen erittyy, vaan erityisesti siksi, että se saadaan käytännöllisesti katsoen kvantitatiivisena saantona oikein laskostuneessa muodossa, ja siksi, että se omaa korkean aktiivisuuden.Expression from yeast cells is advantageous not only because the hirudin derivative is secreted, but especially because it is obtained in a practically quantitative yield in a correctly folded form, and because it has a high activity.
2 969562 96956
Keksinnön mukaiselle menetelmälle hirudiinijohdan-naisen valmistamiseksi on siten tunnusomaista, että tätä polypeptidiä koodaava DNA-sekvenssi ilmaistaan hiivassa ja hirudiinijohdannainen otetaan talteen soluviljelmän super-5 natantista.The method for preparing a hirudin derivative according to the invention is thus characterized in that the DNA sequence encoding this polypeptide is expressed in yeast and the hirudin derivative is recovered from the cell culture super-5 natant.
Kuviossa 1 on esitetty kloonausvektoreita geenira-kenteen saamiseksi, joka koodaa hiivan MFÖ-esiproteiinia sekä em. hirudiinijohdannaista. Kuviossa 2 esitetään hii-vailmaisinvektori, joka käsittää tämän geenirakenteen.Figure 1 shows cloning vectors for obtaining a gene structure encoding a yeast MFÖ preprotein and the above-mentioned hirudin derivative. Figure 2 shows a carbon detector vector comprising this gene construct.
10 Hirudiinijohdannaisen valmistus voidaan luonnolli sesti suorittaa myös muiden menetelmien mukaan, esimerkiksi ilmaisemalla bakteereissa tai korkeammissa eukaryootti-sissa soluissa kuten hyönteissoluissa tai eläinsoluissa. Ilmaiseminen suoritetaan kuitenkin keksinnön mukaisesti 15 edullisesti hiivajärjestelmän avulla, esimerkiksi kuten on esitetty EP-A-hakemusjulkaisussa 0 248 227, esim. hiivoissa Pichia pastoris, Hansenula polymorphis, Schizosaccharo-myces pombe tai edullisesti Saccharomyces cerevisiae.The preparation of a hirudin derivative can, of course, also be carried out according to other methods, for example by expression in bacteria or higher eukaryotic cells such as insect cells or animal cells. However, according to the invention, the detection is preferably carried out by means of a yeast system, for example as disclosed in EP-A application 0 248 227, e.g. in yeasts Pichia pastoris, Hansenula polymorphis, Schizosaccharomyces pombe or preferably Saccharomyces cerevisiae.
Hiivailmaisuvektoreita tunnetaan lukuisia, esimer-20 kiksi EP-A-hakemusjulkaisuista 0 060 057, 0 088 632, 0 116 201, 0 121 884, 0 123 544 ja 0 195 691. Keksinnön mukaista hirudiinijohdannaisen valmistusta kuvataan seu-raavassa hiiva-α-tekijäjärjestelmää käyttäen, minkä tulee kuitenkin ymmärtää vain esimerkkiluonteiseksi, koska si-, 25 nänsä tunnetulla tavalla voidaan käyttää muitakin ilmaisu- järjestelmiä.Numerous yeast expression vectors are known, for example from EP-A application 0 060 057, 0 088 632, 0 116 201, 0 121 884, 0 123 544 and 0 195 691. The preparation of a hirudin derivative according to the invention is described below by a yeast α-factor system. however, which should be understood as exemplary only, as other detection systems may be used in a manner known per se.
Hiiva-feromonigeenin MFa rakenne tunnetaan lähteestä Kurjan ja Hershkovitz, Gell 30 (1982) 933 - 943, jossa käsitellään myös muiden geenien ilmaisumahdollisuutta sekä 30 geenituotteiden eritystä. Tältä osin voidaan viitata niin ikään lähteeseen Brake et. ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 (1984) 4642 - 4646.The structure of the yeast pheromone gene MFa is known from Kurjan and Hershkovitz, Gell 30 (1982) 933-943, which also deals with the possibility of expressing other genes and the secretion of 30 gene products. In this regard, reference may also be made to Brake et. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 4642-4646.
Hiivavektoreina käytetään edullisesti niinsanottuja sukkulavektoreita, joissa on bakteeriplasmidin ja hiiva-35 plasmidireplikaation aloituskohdan että seulontageenin 3 96956 seulontaa varten kummassakin isäntäjärjestelmässä. Lisäksi nämä vektorit sisältävät vierasgeenien ilmaisemiseksi välttämättömät promoottorisekvenssit ja valinnaisesti saannon nostamiseksi lopetussekvenssin, siten, että hete-5 rologinen geeni - joka on tarkoituksenmukaisesti fuusioitu erityssignaaleihin - on järjestäytynyt promoottori- ja lopetussekvenssien väliin.As yeast vectors, so-called shuttle vectors are preferably used, which have a bacterial plasmid and a yeast 35 plasmid origin of replication and a screening gene 3 96956 for screening in both host systems. In addition, these vectors contain promoter sequences necessary for the expression of foreign genes and, optionally, a stop sequence to increase yield, so that the heterologous gene - suitably fused to secretion signals - is arranged between the promoter and stop sequences.
Keksinnön mukaisesti saatava Leu-Thr-hirudiini on aktiivisuusomainisuuksiltaan parempi kuin tunnetut hiru-10 diinit.The Leu-Thr hirudin obtained according to the invention has better activity properties than the known hiru-10 dyes.
Tämän keksinnön puitteissa on eri yhdistelmähiru-diineja testattu niiden trombiinia inhiboivan aktiivisuus-tensa suhteen kromogeenista substraattia käsittävässä analyysissä.Within the scope of this invention, various recombinant hirudins have been tested for their thrombin inhibitory activity in an analysis of a chromogenic substrate.
15 Kineettiset mittaukset suoritettiin Stonen ja15 Kinetic measurements were performed on Stone and
Hofsteengen kuvaamissa olosuhteissa (J. Biochemistry, 1986, 25, 4622 - 4628) 0,05 molaarisessa Tris-HCl:ssä, joka sisälsi 0,1 % polyetyleeniglykolia 6000 ja 0,1 M NaCl pH-arvossa 7,8 ja lämpötilassa 37 °C. Hirudiiniliuokset 20 titrattiin 2 nMrisella trombiinilla (hirudiinipitoisuudet noin 2 nM - 0,5 nM) ja 0,2 mM:isella S-2266, joka on Kabi Vitrumin markkinoima kromogeeninen substraatti. Kineettiset mittaukset suoritettiin käyttäen 20 pM trombiinia ja 0, 8, 16, 24, 32 ja 40 pM hirudiinia ja substraattina 25 0,094 mM S-2238, joka on Kabi Vitrumin markkinoima kromo geeninen substraatti, HP 8452 - diodiarrayspektrofotomet-rillä. Reaktio aloitettiin lisäämällä trombiini esilämmi-tettyyn puskurin, substraatin ja hirudiinin seokseen ja sitä seurattiin aallonpituudella 405 nm 30 minuuttia.Under the conditions described by Hofsteenge (J. Biochemistry, 1986, 25, 4622-4628) in 0.05 molar Tris-HCl containing 0.1% polyethylene glycol 6000 and 0.1 M NaCl at pH 7.8 and 37 ° C. Hirudin solutions were titrated with 2 nM thrombin (hirudin concentrations of about 2 nM to 0.5 nM) and 0.2 mM S-2266, a chromogenic substrate marketed by Kabi Vitrum. Kinetic measurements were performed using 20 pM thrombin and 0, 8, 16, 24, 32 and 40 pM hirudin and as substrate 0.094 mM S-2238, a chromogenic substrate marketed by Kabi Vitrum, with an HP 8452 diode array spectrophotometer. The reaction was initiated by the addition of thrombin to a preheated mixture of buffer, substrate and hirudin and monitored at 405 nm for 30 minutes.
30 Reaktioiden kulku on rekisteröity mikrotietokoneella ja analysoitu sovittamalla ne löysä/kiinteä -sitomisyhtälöön Dr. Stuart Stonen kehittämillä ohjelmilla epäsuoraa regressioanalyysiä varten. Ohjelma antaa näennäisen disso-siaatiovakion, Kx, assosiaationopeusvakion, Kon, sekä näen-35 näisen assosiaationopeusvakion, Koff. Arvot on korjattu sub- 4 96956 straatin vaikutuksen osalta inhibiittorin sitomiseen käyttäen Κ,,-arvoa 3,6 μΜ S-2238:n osalta.30 The progress of the reactions was recorded on a microcomputer and analyzed by fitting them to the loose / solid binding equation using software developed by Dr. Stuart Stone for indirect regression analysis. The program gives the apparent dissociation constant, Kx, the association rate constant, Kon, and the I-35 such association rate constant, Koff. Values are corrected for the effect of sub-4 96956 strata on inhibitor binding using a Κ ,, value of 3.6 μΜ for S-2238.
Kokeessa saatiin seuraavat tulokset: 5 ____The experiment yielded the following results: 5 ____
Val-Val-Hir. Leu-Thr-Hir. Ile-Thr-Hir.Val-Val-Hir. Leu-Thr-Hir. Ile-Thr-Hir.
Kx (fM) 237 47 206 10 Kon (M'1S’1) 1,37 x 10® 2,28 x 10® 1,25 x 10®Hx (fM) 237 47 206 10 Con (M'1S'1) 1.37 x 10® 2.28 x 10® 1.25 x 10®
Kon (S-1) 3,2 x 10*5 1,05'x ΙΟ-5 2,6 x 10'5Kon (S-1) 3.2 x 10 * 5 1.05'x ΙΟ-5 2.6 x 10'5
Yhdistelmähirudiinin Leu-Thr-variantti näyttä siis 15 olevan 4 - 5-kertaisesti tehokkaampi ihmisen trombiinin inhibiittori kuin HV1-variantit, joilla on Val-Val tai Ile-Thr N-päätesekvenssinä. Tämä johtuu lähinnä alhaisesta dissosiaationopeusvakiosta Koff, (muodostunut kompleksi on stabiili). Tulos on sopusoinnussa yleisesti hyväksytyn 20 hirudiinin sitomismallin kanssa, jonka mukaan tiivis N-päätealue antaa suuremman osan trombiinin ja hirudiinin välisestä sitomisenergiasta (Stone, S.R. ja Hofsteenge, J. Biochemistry 1986, 25, 4622-4628, Wallace A., Dennis, S., Hofsteenge, J. ja Stone, S.R., Biochemistry 1989 1989, 28, 25 10079-10084, Rydel, T.J. ja Tulinsky, A., J. Mol. Biol.Thus, the Leu-Thr variant of recombinant hirudin appears to be a 4- to 5-fold more potent inhibitor of human thrombin than HV1 variants with Val-Val or Ile-Thr as the N-terminal sequence. This is mainly due to the low dissociation rate constant Koff, (the complex formed is stable). The result is consistent with the generally accepted hirudin binding model, in which the dense N-terminal region provides most of the binding energy between thrombin and hirudin (Stone, SR and Hofsteenge, J. Biochemistry 1986, 25, 4622-4628, Wallace A., Dennis, S. , Hofsteenge, J. and Stone, SR, Biochemistry 1989 1989, 28, 10079-10084, Rydel, TJ and Tulinsky, A., J. Mol. Biol.
1991, 221, 583-601).1991, 221, 583-601).
Uusi hirudiini on siis aktiivisempi kuin tunnetut ja eroaa siten edukseen näistä. Keksinnön mukaisesti saatava hirudiini on näin ollen selvästi keksinnöllinen ja 30 myös teollisen käyttökelpoisuutensa osalta parempi kuin tunnetut hirudiinit.The new hirudin is thus more active than the known ones and thus differs in favor of these. The hirudin obtainable according to the invention is thus clearly inventive and also superior to known hirudins in terms of its industrial applicability.
Keksintöä havainnollistetaan edelleen seuraavien esimerkkien avulla. Prosenttiosuudet on laskettu painosta.The invention is further illustrated by the following examples. Percentages are calculated by weight.
5 969565 96956
Esimerkki 1Example 1
Ilmaisuvektorien rakentaminenConstruction of expression vectors
Ensin syntetisoidaan DNA-sekvenssi I (taulukko 1) fosfiittimenetelmän mukaan. Tämä DNA-sekvenssi koodaa MFa-5 esiproteiinin aminohappoja 49 - 80, ja vastaa oleellisesti luonnollista DNA-sekvenssiä.First, DNA sequence I (Table 1) is synthesized according to the phosphite method. This DNA sequence encodes amino acids 49 to 80 of the MFa-5 preprotein, and substantially corresponds to the native DNA sequence.
Sitten DNA-sekvenssiä I käytetään koettimena a-teki jägeenin eristämiseksi, missä tarkoituksessa se leimataan 32P:llä. Geeni eristetään tämän koettimen avulla λ-10 gtll-hiivagenomigeenipankista (joita on kaupallisesti saatavana, esimerkiksi valmistajalta Clontech Laboratories Inc., 4055 Fabian Way, Palo Alto, CA94303). Tätä silmälläpitäen tunnistetaan a-tekijägeenin käsittäviä λ-gtll-faa-geja plakkihybridisaatiomenettelyn avulla. Positiivisiksi 15 tunnistetuista plakeista eristetään faageja, joita monistetaan ja joista eristetään DNA. Tätä pilkotaan EcoRI:llä ja analysoidaan 0,8-%:isessa agaroosigeelissä. Southern transfer-siirron jälkeen siirtokalvo hybridisoidaan 32P-leimattuun DNA-sekvenssiin I. Faagi-DNA:ta, jossa on DNA-20 sekvenssiin I hybridisoituva noin 1,75 kb:n fragmentti, pilkotaan toistamiseen samalla entsyymillä ja eristetään vastaava fragmentti. Vektori pUC19 avataan EcoRI:llä ja tuote ligatoidaan 1,75 kb:n fragmenttiin T4-ligaasin avulla. Saadaan kloonausvektori 1.The DNA sequence I is then used as a probe to isolate the α-did gene, for which purpose it is labeled with 32 P. The gene is isolated using this probe from a λ-10 gt11 yeast genomic gene bank (commercially available, e.g., from Clontech Laboratories Inc., 4055 Fabian Way, Palo Alto, CA94303). With this in mind, λ-gt11 phages comprising the α-factor gene are identified by a plaque hybridization procedure. From the 15 plaques identified as positive, phages are isolated, which are amplified and from which DNA is isolated. This is digested with EcoRI and analyzed on a 0.8% agarose gel. After Southern transfer, the transfer membrane is hybridized to 32 P-labeled DNA sequence I. Phage DNA with an approximately 1.75 kb fragment that hybridizes to DNA-20 sequence I is digested repeatedly with the same enzyme and the corresponding fragment is isolated. The vector pUC19 is opened with EcoRI and the product is ligated to a 1.75 kb fragment with T4 ligase. Cloning vector 1 is obtained.
25 Taulukossa 2 on esitetty kloonausvektoreita, jotka kaikki rakennettiin pUC-plasmidista lähtien. Taulukossa esitetään tosin vain näiden vektorien polyliittäjäalueet tavanomaisessa 5' -+3' -suunnassa, jolloin MFa-sekvenssit on merkitty pilkkuviivoin ja hirudiinisekvenssit katkovii-30 voin. Yhtenäiset viivat merkitsevät pUC- tai liittäjäsek-venssejä. Kuviossa 1 kloonausvektorit on esitetty kaavio-kuvina eikä oikeassa mittakaavassa.Table 2 shows the cloning vectors, all constructed from plasmid pUC. However, the table shows only the polyether regions of these vectors in the conventional 5 'to + 3' direction, with the MFa sequences indicated by dotted lines and the hirudin sequences by dashed lines. Solid lines indicate pUC or linker sequences. In Figure 1, the cloning vectors are shown in schematic diagrams and not on a proper scale.
Ligatointiseoksella transformoidaan E. coli -kantaa 79/02. Valkeat pesäkkeet eristetään, ja niistä otetaan 35 talteen plasmidi-DNA, josta tunnistetaan 1,75 kb:n EcoRI-fragmentin sisältävät plasmidit.The ligation mixture is used to transform E. coli strain 79/02. White colonies are isolated and plasmid DNA is recovered to identify plasmids containing the 1.75 kb EcoRI fragment.
6 96956 MFa-esiproteiinin luonnollinen DNA-sekvenssi sisältää aminohapporyhmien 8-10 kodonialueella Pstl-pilkko-miskohdan sekä aminohappojen 48/49 kodonialueella Taql-pilkkomiskohdan. Eristetystä plasmidi-DNA:sta eristetään 5 sitten Pstl:llä ja Taql:llä pilkkomalla fragmentti, joka koodaa MFa-esisekvenssin aminohappoja 9-48. Vektori pUC18 avataan Pstl:llä ja Kpnl:llä ja tuote ligatoidaan Pstl-TaqI-fragmenttiin sekä synteettiseen DNA-sekvenssiin 1 T4-ligaasin avulla. Ligatointiseoksella transformoidaan 10 E. coli -kantaa 79/02. Transformointiseos maljataan IPTG-Xgal-Ap-maljoihin. Valkeat pesäkkeet eristetään ja klooneista saatua plasmidi-DNA:ta karakterisoidaan restriktio-analyysin avulla. Näin saadaan kloonausvektori 2, joka koodaa MFa-esisekvenssiin aminohappoja 8-80.6 96956 The native DNA sequence of the MFa preprotein contains a PstI cleavage site in codon region 8-10 of amino acid residues and a Taql cleavage site in codon region 48/49 of amino acids. The fragment encoding amino acids 9-48 of the MFα presequence is then isolated from the isolated plasmid DNA by PstI and TaqI. The vector pUC18 is opened with PstI and KpnI and the product is ligated to the PstI-TaqI fragment as well as to the synthetic DNA sequence with 1 T4 ligase. 10 E. coli strains 79/02 are transformed with the ligation mixture. The transformation mixture is plated in IPTG-Xgal-Ap plates. White colonies are isolated and plasmid DNA from the clones is characterized by restriction analysis. This gives cloning vector 2, which encodes amino acids 8-80 in the MFa presequence.
15 Kloonausvektorista 2 leikataan mainittu koodaava sekvenssi irti Pstl:llä ja Kpnl:llä, minkä jälkeen saatua sekvenssiä käytetään seuraavaksi kuvatussa ligatoinnissa. Tähän tarkoitukseen kloonausvektori 1 pilkotaan EcoRI:llä sekä osittain Pstl:llä ja eristetään MFa-esisekvenssin 8 20 ensimmäistä aminohappoa koodittavan sekvenssin käsittävä fragmentti. Edelleen vektori pUC19 avataan EcoRI:llä ja KpNl:llä ja tuote ligatoidaan kahteen edellä kuvattuun fragmenttiin, jolloin saadaan kloonausvektori 3. Tämä koodaa MFa:n esisekvenssiä kokonaissuudessaan aina aminohap-25 poon 80 asti.From said cloning vector 2, said coding sequence is excised with PstI and KpnI, after which the resulting sequence is used in the ligation described below. For this purpose, cloning vector 1 is digested with EcoRI as well as partially with PstI and a fragment comprising the sequence encoding the first 20 amino acids of the MFα presequence 8 is isolated. Further, the vector pUC19 is opened with EcoRI and KpN1 and the product is ligated to the two fragments described above to give cloning vector 3. This encodes the entire presequence of MFα up to amino acid 25.
Lähtömateriaalina suurimmalle osalle hirudiinisek-venssiä käytetään EP-A-hakemusjullkaisussa 0 171 024 'DNA-sekvenssinä 1’ esitettyä synteettistä geeniä, joka on esitetty oheisessa taulukossa 1 nimellä DNA-sekvenssi IV.For the majority of the hirudin sequence, the synthetic gene disclosed in EP-A application 0 171 024 'as DNA sequence 1', shown in Table 1 below as DNA sequence IV, is used.
30 Tässä sekvenssissä restriktioentsyymien pilkkomiskohdat on merkitty alleviivauksella: aminohappoalueella 1-3 pilk-koo Accl, aminohappoalueella 30/31 BamHI ja viimeisestä lopetuskodonista eteenpäin Sacl. Geenin 5'-päätteessä on Xbal-ylijäämäsekvenssi ja 3*-päätteessä Sall-ylijäämäsek- 35 venssi.In this sequence, restriction enzyme cleavage sites are underlined: amino acid regions 1-3 cleave Accl, amino acid region 30/31 BamHI, and from the last stop codon onwards Sacl. The 5 'terminus of the gene has an XbaI excess sequence and the 3' terminus has a SalI excess sequence.
7 96956 Tämä synteettinen geeni alakloonattiin kahtena palana (kuviot 1 ja 2 EP-A-hakemusjulkaissa 0 171 024). Nämä alakloonausvektorit on esitetty taulukossa 2 numeroilla 4 (joka vastaa EP-A 0 171 024 kuviota 2) ja 6 (joka vastaa 5 EP-A 0 171 024 kuviota 1).7 96956 This synthetic gene was subcloned in duplicate (Figures 1 and 2 in EP-A-0 171 024). These subcloning vectors are shown in Table 2 by the numbers 4 (corresponding to Figure 2 of EP-A 0 171 024) and 6 (corresponding to Figure 1 of EP-A 0 171 024).
Kloonausvektori 4 avataan Hindi:11a ja HindIII:lla, minkä jälkeen linearisoitu DNA ligatoidaan DNA-sekvenssiin II (taulukko 1). Näin saatuun kloonausvek-toriin 5 on muodostunut Ncol-pilkkomiskohta tylppäpäät-10 teisesti ligatoituun kohtaan.Cloning vector 4 is opened with Hindi and HindIII, after which the linearized DNA is ligated into DNA sequence II (Table 1). An NcoI cleavage site has been formed in the cloning vector 5 thus obtained at the blunt-ended ligated site.
Kloonausvektorista 6 leikataan irti hirudiiniosa-sekvenssiä koodaava fragmentti pilkkomalla vektori täysin BamHI:llä ja Accl:llä. Sitten fragmentti ligatoidaan BamHI:llä ja Kpnl:llä avattuun kloonausvektoriin 3 sekä 15 DNA-sekvenssiin III (taulukko 1). DNA-sekvenssissä IIIThe fragment encoding the hirudin moiety is excised from the cloning vector 6 by digesting the vector completely with BamHI and AccI. The fragment is then ligated into BamHI and KpnI-opened cloning vector 3 and DNA sequence III (Table 1). In the DNA sequence III
viimeiset kolme kodonia on numeroitu samalla tavalla kuin DNA-sekvenssissä IV (taulukko 1). Näin saadaan kloonausvektori 7, joka koodaa MFa-esisekvenssin 80 ensimmäistä aminohappoa sekä halutun hirudiinijohdannaisen 30 ensim-20 mäistä aminohappoa, mikä varmistetaan DNA-sekvenssoinnin avulla.the last three codons are numbered in the same manner as in DNA sequence IV (Table 1). This gives a cloning vector 7 which encodes the first 80 amino acids of the MFα presequence and the first 30 amino acids of the desired hirudin derivative, which are confirmed by DNA sequencing.
Kloonausvektorista 5 leikataan BamHI:n ja HindIII:n avulla irti fragmentti, joka koodaa hirudiinin aminohappoja 31 - 64. Tämä fragmentti ligatoidaan samoilla entsyy-25 meillä avattuun kloonausvektoriin 7, jolloin saadaan kloo-‘ nausvektori 8, joka koodaa MFa-esisekvenssin 80 ensimmäis tä aminohappoa sekä halutun hirudiinijohdannaisen sekvenssiä kokonaisuudessaan. Tämän plasmidin rakenne varmistetaan restriktioanalyysin avulla.A fragment encoding amino acids 31 to 64 of hirudin is cleaved from the cloning vector 5 with BamHI and HindIII. This fragment is ligated into the cloning vector 7 opened with the same enzymes to give the cloning vector 8 encoding the first 80a of the MFα presequence 80. amino acid as well as the sequence of the desired hirudin derivative in its entirety. The structure of this plasmid is confirmed by restriction analysis.
30 Plasmidi Yepl3 (Broach et. ai., Gene 8 (1979) 121) . - avataan BamHI:llä ja ylijäämäpäätteet täytetään Klenow- ' polymeraasin avulla. DNA seostetaan etanolilla, minkä jäl keen sitä käsitellään emäksisellä naudan fosfataasilla.Plasmid Yepl3 (Broach et al., Gene 8 (1979) 121). - opened with BamHI and the excess terminals are filled in with Klenow polymerase. The DNA is mixed with ethanol and then treated with basic bovine phosphatase.
Kloonausvektorista 8 (taulukko 2) leikataan 35 NcoI:llä ja EcoRI:llä hirudiinijohdannaista ja MFa-esisek- 8 96956 venssiä koodaava fragmentti irti, ja ylijäämäpäätteet täytetään kuten edellä kuvattiin.The cloning vector 8 (Table 2) is excised with 35 NcoI and EcoRI to fragment the hirudin derivative and the MFa pre-secretion, and the excess terminals are filled in as described above.
Kyseiset kaksi tylppäpäätteistä DNA-sekvenssiä li-gatoidaan toisiinsa, jolloin saadaan plasmidit pafHirl7 ja 5 pafHirl8 (kuvio 2). Nämä kaksi plasmidia poikkeavat toisistaan vain insertoidun fragmentin suuntauksen osalta.The two blunt-ended DNA sequences are ligated together to give plasmids pafHirl7 and pafHirl8 (Figure 2). The two plasmids differ only in the orientation of the inserted fragment.
Kuten on kuvattu EP-A-hakemusjulkaisussa 0 171 024, insertoidun sekvenssin perään voidaan lisätä lopetussek-venssi (kuviot 4-6, EP-A 0 171 024). Tähän tarkoitukseen 10 soveltuvat Ncol- ja/tai BamHl-pilkkomiskohdat.As described in EP-A 0 0 17 024, a termination sequence may be added after the inserted sequence (Figures 4-6, EP-A 0 171 024). NcoI and / or BamHI cleavage sites are suitable for this purpose.
Plasmidi-DNA:ta monistetaan E. coli -kannassa MM294, minkä jälkeen plasmidi pafHirl7 transformoidaan leusiiniriippuvaisiin hiivakantoihin Y79 (a, trpl-1, leu2-l) (Cantrell et. ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82 15 (1985) 6250) ja DM6-6 (α/α leu2-3,112: :ura37leu2: :lys2*, trpl'/trpl", his3-ll, 15/his3-ll, 15, ura3‘/ura3', lys2'/ lys2*, arg4-17/arg4+, adel‘/adel+) (Maya Hanna., Dept. Mol. Biol. Massachusetts General Hospital, Boston, USA) Iton, H. et ai., J. Bacteriol. 153 (1983) 163, litiummenetelmän 20 mukaan. Eristetään ja erotetaan toisistaan pesäkkeet, jotka kykenevät kasvamaan selektiivisessä, leusiinia sisältämättömässä kasvualaustassa. Yksittäiset pesäkkeet siirros-tetaan hiivaminimivaatimuskasvualustaan, minkä jälkeen in-kuboidaan 24 tunnin ajan 28 °C:ssa. Solut erotetaan sen-25 trifugoimalla ja viljelmäsupernatantista määritetään hiru-diiniaktiivisuus trombiiniestokokeen avulla. Supernatan-tissa hirudiiniaktiivisuutta sisältävistä hiivaklooneista eristetään uudelleen plasmidi-DNA, jota karakterisoidaan restriktioentsyymianalyysin avulla. Transformoiduilla hii-30 vakannoilla suoritetaan seuraavat ilmaisukokeet.Plasmid DNA is amplified in E. coli strain MM294, after which plasmid pafHirl7 is transformed into leucine-dependent yeast strains Y79 (α, trp1-1, leu2-1) (Cantrell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82). (1985) 6250) and DM6-6 (α / α leu2-3,112:: ura37leu2:: lys2 *, trpl '/ trpl ", his3-ll, 15 / his3-ll, 15, ura3' / ura3 ', lys2' / lys2 *, arg4-17 / arg4 +, Adel '/ Adel +) (Maya Hanna., Dept. Mol. Biol. Massachusetts General Hospital, Boston, USA) Iton, H. et al., J. Bacteriol. 153 (1983) 163, according to Lithium Method 20. Isolate and separate colonies capable of growing in a selective leucine-free medium Individual colonies are inoculated into a yeast minimum medium, then incubated for 24 hours at 28 ° C. Cells are separated from the culture by centrifugation and culture. yeast clones containing hirudin activity in the supernatant. plasmid DNA, which is characterized by restriction enzyme analysis. The following expression experiments are performed on transformed hii-30 strains.
Esimerkki 2 »Example 2 »
Ilmaisu 10 ml:aan täydellistä hiivakasvualustaa siirroste-taan soluja yön yli selektiivisessä kasvualaustassa kas-35 vaneesta esimerkin 1 mukaan saadusta kannasta siten, että 9 96956 optisesti tiheydeksi tulee OD600 = 0, 1. Viljelmää ravistelu-kasvatetaan 8 tunnin ajan 28 °C:ssa, minkä jälkeen lisätään 90 ml tuoretta kasvualustaa. Sitten viljelmää ravis-telukasvatetaan edelleen 20 tunnin ajan. Solut erotetaan 5 sentrifugoimalla ja supernatant!sta määritetään hirudiini-aktiivisuus.Expression In 10 ml of complete yeast medium, cells are inoculated overnight from the strain obtained in Example 1 grown in selective medium to give an optical density of 9,695,956 OD600 = 0.1. The culture is shaken-grown for 8 hours at 28 ° C. , then 90 ml of fresh medium is added. The culture is then further shaken for 20 hours. The cells are separated by centrifugation and the supernatant is assayed for hirudin activity.
Esimerkki 3Example 3
JatkokäsittelyFurther treatment
Esimerkin 2 mukaan saatua supernatanttia tehdään 10 happamaksi pH-arvoon 3 - 5, minkä jälkeen se panostetaan 0,1 M etikkahapolla tasapaino!tettuun adsorptiokolonniin, joka on pakattu huokoisella, styroli-divinyylibentseeni -kopolymeeristä koostuvalla adsorptiohartsilla (DiaionRHP 20). Kolonnia pestään Tris/HCl:llä (pH 8,5) ja 50 mM etik-15 kahapolla, minkä jälkeen sitä eluoidaan 30-%:isella iso-propanolilla. Hirudiinijohdannaista sisältävät fraktiot yhdistetään, minkä jälkeen niitä puhdistetaan Q-SepharoseR-kolonnissa, joka on etukäteen tasapainoitettu piperatsii-ni/HCl:llä (pH 6). Tässä tapauksessa eluointi tapahtuu 20 käyttäen 0 ->0,25 M NaCl-gradienttia. Hirudiinijohdannais ta sisältävät fraktiot yhdistetään jälleen, minkä jälkeen niitä puhdistetaan HPLC-ajon avulla C18-käänteisfaasi-kro-matografiakolonnissa. Näin saadulla puhtaalla tuotteella suoritetaan sitten proteiinisekvenssianalyysi automaatti-25 sen analysaattorin avulla.The supernatant obtained according to Example 2 is acidified to pH 3 to 5, after which it is loaded onto an adsorption column equilibrated with 0.1 M acetic acid packed with a porous adsorption resin consisting of a styrene-divinylbenzene copolymer (DiaionRHP 20). The column is washed with Tris / HCl (pH 8.5) and 50 mM acetic acid, then eluted with 30% isopropanol. The fractions containing the hirudin derivative are combined and then purified on a Q-Sepharose® column pre-equilibrated with piperazine / HCl (pH 6). In this case, elution is performed using a 0 -> 0.25 M NaCl gradient. Fractions containing hirudin derivatives are recombined and then purified by HPLC on a C18 reverse phase K-chromatography column. The pure product thus obtained is then subjected to protein sequence analysis using an automated analyzer.
Esimerkki 4Example 4
VertailuesimerkkiComparative Example
Jos menetellään muutoin kuten esimerkissä 1 paitsi, että DNA-sekvenssin III (taulukko 1) asemesta käytetään 30 seuraavaa sekvenssiä, hiivaviljelmäsupernatantista kyetään osoittamaan vain erittäin vähäistä hirudiiniaktiivisuutta.If the procedure is as otherwise as in Example 1, except that the following 30 sequences are used instead of DNA sequence III (Table 1), only very little hirudin activity can be detected in the yeast culture supernatant.
10 96956 1 2 (Pro) Leu Asp Lys Arg Thr (Tyr)10 96956 1 2 (Pro) Leu Asp Lys Arg Thr (Tyr)
5 ’ CT TTG GAT AAA AGA ACG T5 ’CT TTG GAT AAA AGA ACG T
Ilia 3' CAT GGA AAC CTA TTT TCT TGC ATAIlia 3 'CAT GGA AAC CTA TTT TCT TGC ATA
5 (Kpnl) (AccI) 1 2 (Pro) Leu Asp Lys Arg lie (Tyr)5 (Kpnl) (AccI) 1 2 (Pro) Leu Asp Lys Arg lie (Tyr)
10 5' CT TTG GAT AAA AGA ΑΤΑ T10 5 'CT TTG GAT AAA AGA ΑΤΑ T
Illb 3' CAT GGA AAC CTA TTT TCT TAT ATAIllb 3 'CAT GGA AAC CTA TTT TCT TAT ATA
(Kpnl) Käytettäessä DNA-sekvenssiä IIIb kloonausvektoreita 7 ja 8 15 (taulukko 2) vastaavat vektorit eivät sisällä Accl-pilk-komiskohtaa.(Kpnl) When using the DNA sequence IIIb cloning vectors 7 and 8 (Table 2), the corresponding vectors do not contain an Accl cleavage site.
< 11 96956 TAULUKKO 1 DNA-SEKVENSSIT 50 55<11 96956 TABLE 1 DNA SEQUENCES 50 55
I. 5' C GAT GTT GCT GTT TTG CCA TTC TCCI. 5 'C GAT GTT GCT GTT TTG CCA TTC TCC
5 3' TA CAA CGA CAA AAC GGT AAG AGG5 3 'TA CAA CGA CAA AAC GGT AAG AGG
(Taql) 60 65(Taql) 60 65
AAC AGT ACT AAT AAC GGT TTA TTG TTCAAC AGT ACT AAT AAC GGT TTA TTG TTC
TTG TCA TGA TTA TTG CCA AAT AAC AAGTTG TCA TGA TTA TTG CCA AAT AAC AAG
10 7010 70
ATT AAT ACT ACT ATT GCT AGC ATT GCTATT AAT ACT ACT ATT GCT AGC ATT GCT
TAA TTA TGA TGA TAA CGA TCG TAA CGATAA TTA TGA TGA TAA CGA TCG TAA CGA
15 75 80 GCT AAA GAA GAA GGG GTA C 3' CGA TTT CTT CTT CCC 5' (Kpnl) 20 II. 5' CATGGA 3' 3' GTACCTTCGA 5' (Hindlll) 25 (Pro) Leu Asp Lys Arg Leu Thr (Tyr) III. 5' CT TTG GAT AAA AGA CTT ACG T 3 ' 3' CAT GGA AAC CTA TTT TCT GAA TGC ATA 5' (Kpnl) (Accl) 12 9695615 75 80 GCT AAA GAA GAA GGG GTA C 3 'CGA TTT CTT CTT CCC 5' (Kpnl) 20 II. 5 'CATGGA 3' 3 'GTACCTTCGA 5' (HindIII) 25 (Pro) Leu Asp Lys Arg Leu Thr (Tyr) III. 5 'CT TTG GAT AAA AGA CTT ACG T 3' 3 'CAT GGA AAC CTA TTT TCT GAA TGC ATA 5' (Kpnl) (Accl) 12 96956
DNA-sekvenssi IVDNA sequence IV
Triplettinro 0 1 2 3 4 5Triplet No. 0 1 2 3 4 5
Aminohappo j äännös Met Thr Tyr Thr Asp CysAmino acid residue Met Thr Tyr Thr Asp Cys
Nukleotidinro 1 10 20Nucleotide No. 1 10 20
Koodaava säie 5' CT AGA ATG ACG TAT ACT GAC TGCCoding strand 5 'CT AGA ATG ACG TAT ACT GAC TGC
5 Ei-koodaava säie 3' T TAC TGC ATA TGA CTG ACG5 Non-coding strand 3 'T TAC TGC ATA TGA CTG ACG
6 7 8 9 1C 11 12 13 14 156 7 8 9 1C 11 12 13 14 15
Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys 30 40 50Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys 30 40 50
ACT GAA TCT GGT CAG AAC CTG TGC CTG TGCACT GAA TCT GGT CAG AAC CTG TGC CTG TGC
-GA CTT AGA CCA GTC TT G GAC ACG GAC ACC-GA CTT AGA CCA GTC TT G GAC ACG GAC ACC
10 16 17 18 19 20 21 22 23 24 2510 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Gin Gly Asn 60 70 80Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Gin Gly Asn 60 70 80
GAA GGA TCT AAC GTT TGC GGC CAG GGT AACGAA GGA TCT AAC GTT TGC GGC CAG GGT AAC
CTT CCT AGA TT G CAA ACG CCG GTC CCA TTGCTT CCT AGA TT G CAA ACG CCG GTC CCA TTG
26 27 28 29 30 31 32 33 34 3526 27 28 29 30 31 32 33 34 35
Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys 90 100 110Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys 90 100 110
15 AAA TGC ATC CTT GGA TCC GAC GGT GAA AAG15 AAA TGC ATC CTT GGA TCC GAC GGT GAA AAG
TTT ACG TAG GAA CCT AGG CTG CCA CTT TTCTTT ACG TAG GAA CCT AGG CTG CCA CTT TTC
36 37 38 39 40 41 42 43 44 4536 37 38 39 40 41 42 43 44 45
Asn Gin Cys Vai Thr Gly Glu Gly Thr Pro 120 130 140Asn Gin Cys Vai Thr Gly Glu Gly Thr Pro 120 130 140
AAC CAG TGC GTT ACT GGC GAA GGT ACC CCGAAC CAG TGC GTT ACT GGC GAA GGT ACC CCG
TTG GTC ACG CAA TGA CCG CTT CCA TGG GGCTTG GTC ACG CAA TGA CCG CTT CCA TGG GGC
46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 20 Lys Pro Gin Ser His Asn Asp Gly Asp Phe 150 160 17046 47 48 49 50 51 52 53 54 55 20 Lys Pro Gin Ser His Asn Asp Gly Asp Phe 150 160 170
AAA CCG CAG TCT CAT AAC GAC GGC GAC TTCAAA CCG CAG TCT CAT AAC GAC GGC GAC TTC
TTT GGC GTC AGA GTA TTG CTG CCG CTG AAGTTT GGC GTC AGA GTA TTG CTG CCG CTG AAG
56 57 58 59 60 61 62 63 6456 57 58 59 60 61 62 63 64
Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gin Stp 180 190 200Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gin Stp 180 190 200
GAA GAG ATC CCT GAG GAA TAC CTT CAG TAAGAA GAG ATC CCT GAG GAA TAC CTT CAG TAA
25 CTT CTC TAG GGA CTC CTT ATG GAA GTC ATT25 CTT CTC TAG GGA CTC CTT ATG GAA GTC ATT
Stp 210 TAG AGC TCG 3' ATC TCG AGC AGC T 5' 13 96956Stp 210 TAG AGC TCG 3 'ATC TCG AGC AGC T 5' 13 96956
TAULUKKO 2 KLOONAUSVEKTORITTABLE 2 CLONING VECTORS
5 Nro pUC5 No. pUC
1 19 -E··*(1,75 kb α-fragmentti)···Ε- 2 18 -Κ···(α-80-49)···Τ···(a-48-8)···P- 3 19 —B-K**·(a-80-49)···T···(a-48-8)···Ρ···E- 4 8 -B---(Hir31-64)-S-Hc-Hd- 10 5 8 -B---(Hir31-64)-S-N-Hd- 6 12 -B (Hir30-3) A---X-A- 7 19 -Hd-B (Hir30-3)---A---K···(a-80-8)···Ρ···Ε- 8 19 -Hd-N-S (Hir64-3) A---K···(a-80-8)···Ρ···E- 15 ··· MFa-sekvenssit --- hirudiinisekvenssit1 19 -E ·· * (1.75 kb α-fragment) ··· Ε- 2 18 -Κ ··· (α-80-49) ··· Τ ··· (a-48-8) · ·· P- 3 19 —BK ** · (a-80-49) ··· T ··· (a-48-8) ··· Ρ ··· E- 4 8 -B --- (Hir31 -64) -S-Hc-Hd- 10 5 8 -B --- (Hir31-64) -SN-Hd- 6 12 -B (Hir30-3) A --- XA- 7 19 -Hd-B ( Hir30-3) --- A --- K ··· (a-80-8) ··· Ρ ··· Ε- 8 19 -Hd-NS (Hir64-3) A --- K ··· (a-80-8) ··· Ρ ··· E- 15 ··· MFa sequences --- hirudin sequences
Restriktioentsyymeistä käytetyt lyhenteetAbbreviations used for restriction enzymes
A = Accl 20 B = BamHI E = EcoRI He = Hindi Hd = Hindlll K = Kpnl 25 N = Ncol P = PstIA = Accl 20 B = BamHI E = EcoRI He = Hindi Hd = HindIII K = Kpnl 25 N = Ncol P = PstI
5 = Sali T = Taql X = Xbal5 = Sali T = Taql X = Xbal
Claims (3)
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
HU851341A HU198085B (en) | 1984-04-18 | 1985-04-11 | Process for producing new hirudine derivatives with anticoagulant effect and pharmaceutical compositions comprising same as active ingredient |
HU134185 | 1988-01-13 | ||
DE3805540 | 1988-02-23 | ||
DE3805540 | 1988-02-23 |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI890127A0 FI890127A0 (en) | 1989-01-11 |
FI890127A FI890127A (en) | 1989-07-14 |
FI96956B true FI96956B (en) | 1996-06-14 |
FI96956C FI96956C (en) | 1996-09-25 |
Family
ID=25865106
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI890127A FI96956C (en) | 1985-04-11 | 1989-01-11 | A process for preparing a therapeutically useful hirudin derivative |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0324712B1 (en) |
AT (1) | ATE87938T1 (en) |
DE (2) | DE19775033I2 (en) |
DK (1) | DK172350B1 (en) |
ES (1) | ES2055149T3 (en) |
FI (1) | FI96956C (en) |
IL (1) | IL88925A (en) |
LU (1) | LU90127I2 (en) |
NL (1) | NL970027I2 (en) |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3835815A1 (en) * | 1988-10-21 | 1990-04-26 | Hoechst Ag | NEW ISOHIRUDINE |
US5663141A (en) * | 1989-12-01 | 1997-09-02 | Basf Aktiengesellschaft | Hirudin/polyalkylene glycol conjugates and hirudin muteins |
DE4140381A1 (en) * | 1991-12-07 | 1993-06-09 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt, De | NEW SYNTHETIC ISOHIRUDINE WITH IMPROVED STABILITY |
DE4404168A1 (en) * | 1994-02-10 | 1995-08-17 | Hoechst Ag | Hirudin derivatives and process for their preparation |
DE19529997C1 (en) * | 1995-08-16 | 1997-04-10 | Hoechst Ag | A method for inactivating carboxypeptidase Y in hirudin-containing culture broths |
DE19543737A1 (en) * | 1995-11-24 | 1997-05-28 | Hoechst Ag | Process for the ultrafiltration of biological matrices containing peptides or proteins |
DE19544233A1 (en) | 1995-11-28 | 1997-06-05 | Hoechst Ag | Process for using the yeast ADH II promoter system for the biotechnological production of heterologous proteins in high yields |
EP0787569B1 (en) | 1996-01-31 | 2002-10-02 | Sumitomo Bakelite Company Limited | Method of producing epoxy resin-encapsulated semiconductor device |
DE19607239A1 (en) | 1996-02-27 | 1997-08-28 | Behringwerke Ag | Pharmaceutical composition containing hirudin and process for its preparation |
DE19944870A1 (en) * | 1999-09-18 | 2001-03-29 | Aventis Pharma Gmbh | Signal sequences for the production of Leu-hirudin via secretion by E. coli in the culture medium |
DE10033195A1 (en) * | 2000-07-07 | 2002-03-21 | Aventis Pharma Gmbh | Bifunctional fusion proteins from hirudin and TAP |
US7638618B2 (en) | 2001-02-20 | 2009-12-29 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Nucleic acids encoding a hirudin and pro-insulin as superscretable peptides and for parallel improvement of the exported forms of one or more polypeptides of interest |
US7202059B2 (en) | 2001-02-20 | 2007-04-10 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Fusion proteins capable of being secreted into a fermentation medium |
JP2006096668A (en) * | 2002-11-08 | 2006-04-13 | Ono Pharmaceut Co Ltd | Medicine comprising combination of elastase inhibitor with enzyme inhibitor of blood coagulation system and/or fibrinolysis system |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3438296A1 (en) * | 1984-04-18 | 1985-11-07 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | NEW POLYPEPTIDES WITH A BLOOD-CLOTHING EFFECT, METHOD FOR THE PRODUCTION OR THEIR RECOVERY, THEIR USE AND THE CONTAINERS THEREOF |
EP0209061B1 (en) * | 1985-07-17 | 1994-01-12 | Hoechst Aktiengesellschaft | Peptides having an anticoagulant activity, process for their preparation, obtention, their use and agents containing them |
-
1989
- 1989-01-11 IL IL8892589A patent/IL88925A/en active IP Right Grant
- 1989-01-11 EP EP89710003A patent/EP0324712B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-11 DE DE19775033C patent/DE19775033I2/en active Active
- 1989-01-11 FI FI890127A patent/FI96956C/en not_active IP Right Cessation
- 1989-01-11 AT AT89710003T patent/ATE87938T1/en active
- 1989-01-11 ES ES89710003T patent/ES2055149T3/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-11 DE DE8989710003T patent/DE58903988D1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-12 DK DK013189A patent/DK172350B1/en not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-07-23 NL NL970027C patent/NL970027I2/en unknown
- 1997-08-20 LU LU90127C patent/LU90127I2/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NL970027I2 (en) | 1998-04-01 |
EP0324712A3 (en) | 1990-07-04 |
DK13189D0 (en) | 1989-01-12 |
NL970027I1 (en) | 1997-10-01 |
EP0324712B1 (en) | 1993-04-07 |
LU90127I2 (en) | 1997-10-06 |
ATE87938T1 (en) | 1993-04-15 |
FI890127A0 (en) | 1989-01-11 |
DE58903988D1 (en) | 1993-05-13 |
FI890127A (en) | 1989-07-14 |
DE19775033I2 (en) | 2011-01-20 |
FI96956C (en) | 1996-09-25 |
IL88925A (en) | 1995-11-27 |
DK172350B1 (en) | 1998-04-06 |
ES2055149T3 (en) | 1994-08-16 |
EP0324712A2 (en) | 1989-07-19 |
DK13189A (en) | 1989-07-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FI104255B (en) | Process for Preparation of Fusion Proteins Containing N-Terminal Fragments of Human Serum Albumin | |
FI96956B (en) | Process for the preparation of a therapeutically useful hirudin derivative | |
JP3085973B2 (en) | Application of a novel DNA fragment as a sequence encoding a signal peptide related to secretion of mature protein by recombinant yeast, expression cassette, transformed yeast and method for producing corresponding protein | |
CA1304020C (en) | High level expression in yeast | |
US4870008A (en) | Secretory expression in eukaryotes | |
KR0156246B1 (en) | Proteinase inhibitors, method for their preparation and pharmaceutical composition containing them | |
US5814484A (en) | Expression of macrophage inducible proteins (MIPS) in yeast cells | |
AU625214B2 (en) | Vascular anticoagulant proteins | |
NO180593B (en) | Method of Preparation, in Saccharomyces cerevisiae, of a Homologous Heterologous Protein | |
JPH03504009A (en) | Aprotinin analogue and its production method | |
HU209146B (en) | Method for producing desulphato-hydrudine | |
ES2199217T3 (en) | PROMOTER OF YEAST AND ITS USE. | |
Ernst et al. | O–Glycosylation and Novel Processing Events During Secretion of α–Factor/GM–CSF Fusions by Saccharomyces cerevisiae | |
US5180668A (en) | Hirudin derivative | |
FI104428B (en) | Process for production of aprotinin and aprotinin homologues in yeast | |
RU2091490C1 (en) | Method of preparing the heterologic polypeptide in eucaryotic microorganisms | |
AU701136B2 (en) | Novel inhibitor | |
AU623881B2 (en) | Modified proteins | |
EP0662514A1 (en) | Hirustasin, an antistasin type serine proteinase inhibitor from Hiruda | |
FI96121B (en) | DNA structure and method for producing a heterologous protein | |
PT592358E (en) | PROCESS FOR THE PRODUCTION OF PROTEASE INHIBITORS | |
PT716705E (en) | PROCESS FOR THE PREPARATION BY RECOMBINATION OF PROTEINS IN HANSENULA YEAST | |
CA1340264C (en) | Recombinant dna expression of novel diuretic/vasodilator compounds | |
DE3900626A1 (en) | Hirudin derivative | |
Koji et al. | Structure of the two genes coding for polypeptide chain elongation factor lα (EF-lα) froni Saccharomyces cerevisiae |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
BB | Publication of examined application | ||
ND | Supplementary protection certificate (spc) granted | ||
SPCG | Supplementary protection certificate granted |
Spc suppl protection certif: L92 Extension date: 20120313 |
|
FG | Patent granted |
Owner name: SCHERING AKTIENGESELLSCHAFT |
|
MA | Patent expired |