CN109481476B

CN109481476B - 发酵乳杆菌cqpc04在制备食品或改善溃疡性结肠炎的药品中的应用

Info

Publication number: CN109481476B
Application number: CN201811644925.4A
Authority: CN
Inventors: 赵欣; 杜木英; 周先容
Original assignee: Chongqing University of Education
Current assignee: THANKCOME BIOTECHNOLOGY (SUZHOU) CO.,LTD.
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2021-09-07
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN109481476A

Abstract

本发明公开了保藏编号为CGMCC NO.14493的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CQPC04在制备食品或改善溃疡性结肠炎的药品中的应用，不仅扩大了发酵乳杆菌CQPC04的应用范围，提高了其开发利用价值，而且给溃疡性结肠炎的改善带来了新的希望。

Description

发酵乳杆菌CQPC04在制备食品或改善溃疡性结肠炎的药品中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种发酵乳杆菌在制备食品或药品中的应用。

背景技术

四川泡菜的生产过程是将新鲜的泡菜洗净，密封于坛内，在盐水中厌氧发酵浸泡的泡菜。泡菜水中含有丰富的天然乳酸菌，对泡菜风味和品质的形成起着关键作用。其使用可溶性成分(主要是糖和含氮物质)进行增殖，产生酸性物质并代谢出风味成分，使泡菜产生独特的酸脆口味。泡菜水中含有的乳酸菌主要包括发酵乳杆菌、L.短杆菌、干酪乳杆菌、发酵酵母菌、嗜酸乳杆菌等。乳酸菌种类的差异可能是由于地域、气候和生产工艺习惯等因素造成的。某些乳酸菌也被用作益生菌，对人体健康有多种益处，包括维持肠道菌群的微生态平衡、加强机体免疫功能、预防和抑制肿瘤发生、降低胆固醇、延缓机体衰老等。为了更好的利用这些微生物资源，应开展更广泛的分离和鉴定工作，积累丰富的菌种资源，开发出丰富的工业用益生菌种类。

溃疡性结肠炎是一种炎症性肠病，主要表现为腹痛、腹泻和血便，其发病机制至今尚未完全阐明。研究发现，溃疡性结肠炎患者肠黏膜上皮细胞调亡增加、肠上皮细胞间紧密连接缺损、肠上皮黏液层变薄或缺失、肠道菌群失调或易位、固有层肠黏膜免疫系统异常激活，从而导致肠道上皮黏膜通透性增加、屏障功能受损。

发明内容

本发明的目的在于考察从泡菜水中分离得到的乳酸菌对溃疡性结肠炎的作用效果，以开发功能保健制品。

经研究，本发明提供如下技术方案：

保藏编号为CGMCC NO.14493的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CQPC04在制备食品或改善溃疡性结肠炎的药品中的应用。

优选的，所述食品为发酵食品。

优选的，所述发酵食品为乳酸菌奶饮料、发酵乳、乳粉或乳粉胶囊。

发酵乳杆菌CQPC04是从重庆农家自然发酵泡菜水中分离得到，于2017年8月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO.14493。

本发明的发酵乳杆菌CQPC04具有较强的抗胃酸能力，经pH3.0人工胃液处理3h后的存活率达到84.14％；同时该菌具有很好的耐胆盐能力，在0.30％胆盐中的生长效率达到无胆盐培养的66.38％。

葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导溃疡性结肠炎小鼠模型实验结果显示，发酵乳杆菌CQPC04能够显著增加小鼠结肠长度，对结肠粘膜具有较好的保护作用，而且随着浓度的增加，保护效果越好；能够增加小鼠血清中总超氧化物歧化酶(T-SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活力，减少血清中丙二醛(MDA)的含量，从而减少氧自由基对结肠炎小鼠的损伤作用；能够显著降低小鼠血清中促炎因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12的水平，显著升高抑炎因子IL-10的水平；能够减少小鼠结肠组织中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、NFKB-p65、COX-2和iNOS的mRNA表达，增加IL-10和IKB-α的mRNA表达。由此可见，发酵乳杆菌CQPC04可以有效地改善溃疡性结肠炎。

本发明的有益效果在于：本发明提供了发酵乳杆菌CQPC04在制备食品或改善溃疡性结肠炎的药品中的应用，不仅扩大了发酵乳杆菌CQPC04的应用范围，提高了其开发利用价值，而且给溃疡性结肠炎的改善带来了新的希望。

附图说明

图1为发酵乳杆菌CQPC04的菌落形态。

图2为发酵乳杆菌CQPC04的革兰氏染色结果。

图3为发酵乳杆菌CQPC04的16S rDNA PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中M为DNA分子量标准，0为阴性对照，1为发酵乳杆菌CQPC04。

图4为小鼠的结肠长度。

图5为小鼠结肠组织形态学观察。

图6为小鼠血清中MDA、T-SOD和CAT的水平。

图7为小鼠血清中炎症相关细胞因子的水平。

图8为小鼠结肠组织中TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-10的mRNA表达水平。

图9为小鼠结肠组织中NFKB-p65、IKB-α、COX-2和iNOS的mRNA表达水平。

图4、图6至图9中，#与##表示与正常组比较存在显著(p<0.05)和极显著(p<0.01)差异；*与**分别表示与模型组比较存在显著(p<0.05)和极显著(p<0.01)差异。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。

一、发酵乳杆菌CQPC04的分离与鉴定

1、实验材料

采自重庆市南岸区农家自然发酵泡菜水6份，分别吸取40mL泡菜水放入无菌离心管中，置于食品采样箱内，放于实验室4℃冰箱保存备用。

2、乳酸菌的分离纯化

分别取1mL泡菜水样品，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释至10^-6，然后分别取10^-4、10^-5、10^-63个梯度的稀释液100μL进行平板涂布，37℃培养24-48h，观察并记录菌落形态。挑取平板上不同形态的菌落进行划线分离，经37℃培养48h后，再次挑取平板上不同形态的单菌落进行划线分离，如此重复2至3次，直至得到形态一致的纯的单菌落。

编号为CQPC04的菌株菌落形态如图1所示，菌落颜色多为白色或乳白色，形状为圆形，边缘整齐，表面湿润光滑。

3、乳酸菌的初步鉴定

挑取平板上的纯菌落接种于5mL MRS液体培养基中，37℃培养24h。取上述含菌培养基1mL于无菌离心管中，4000r/min离心10min后弃去上层培养基，菌体沉淀重悬于无菌生理盐水并进行革兰氏染色镜检，革兰氏染色镜检为阳性的初步鉴定为乳酸菌。

编号为CQPC04的菌株革兰氏染色呈现阳性，在100倍油镜下，菌株细胞形态如图2所示，细胞形态有长杆、短杆，且不存在出芽生殖。

4、乳酸菌DNA提取

将已纯化的疑似目标菌株接种于MRS肉汤中，37℃培养18-24h后，采用细菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取。提取的DNA放于-20℃冰柜保藏备用。

5、基因组DNAPCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测

取提取的DNA，PCR扩增16S rDNA，其中上游引物27F(5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3'，SEQ ID No.1)1μL、下游引物1495R(5'－CTACGGCTACCTTGTTACGA－3'，SEQ ID No.2)1μL，2×Taq plus Buffer 12.5μL、模板DNA 1μL，用无菌dd H₂O将体系补足至25μL。以无菌超纯水替代模板DNA作为阴性对照。扩增条件为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，共29个循环；最后72℃延伸5min。然后取5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖浓度为1.5％，电泳条件为110V，45min。

编号为CQPC04的菌株16S rDNA扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3所示，阴性对照组的泳道无条带，表明PCR扩增过程中未受到污染；编号为CQPC04的菌株的泳道有一条长度约为1500bp的条带，符合预期扩增片段的长度。

将编号为CQPC04的菌株的16S rDNA扩增产物委托北京擎科生物技术有限公司进行测序，测得序列如SEQ ID No.3所示。使用NCBI中的BLAST(Basic Local AlignmentSearch Tool)程序对测得序列进行同源性比对分析，结果显示，编号为CQPC04的菌株为乳酸菌中的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，其与Gene Bank数据库中已知乳酸菌的同源性均达99％。

6、乳酸菌体外抗性筛选

(1)耐受0.3％胆盐的能力

在MRS-THIO培养基(含0.2％巯基乙酸钠的MRS肉汤)中添加猪胆盐使其浓度为0.3％，121℃灭菌15min；将活化好的5mL菌种以2％(v/v)的接种量分别接入不含胆盐(0.0％)的MRS-THIO培养基和含0.3％胆盐的MRS-THIO培养基中，以空白培养基(未接菌的MRS-THIO培养基)为对照，37℃培养24h后，分别测定上述不同浓度培养基的OD_600nm值，按公式(1)计算菌株对胆盐的耐受力：

结果显示，编号为CQPC04的菌株对胆盐具有很好的耐受能力，在0.3％胆盐中的生长效率达到无胆盐培养的66.38±0.55％。

(2)人工胃液耐受性试验

人工胃液的配制：由0.2％NaCl和0.35％胃蛋白酶组成，用1mol/L HCl调节pH为3.0，再用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌备用。

在超净工作台中吸取5mL培养好的含菌培养基于10mL无菌离心管中，经3000r/min离心10min，弃去上层培养基并收集菌体，加入5mL无菌生理盐水混匀制成菌悬液，然后取1mL菌悬液与9mL pH 3.0的人工胃液混匀，取1mL混合液作为人工胃液处理0h的样品，剩余9mL混合液置于恒温水浴摇床(37℃，150r/min)中培养3h。0h和3h的样品分别经10倍梯度稀释，选择合适梯度采用平板涂布的方法测定活菌数，在MRS固体培养基上37℃培养48h，按公式(2)计算存活率(％)。

结果显示，编号为CQPC04的菌株具有较好的抗胃酸能力，经pH3.0人工胃液处理3h后的存活率达到84.14±6.06％。

二、发酵乳杆菌CQPC04对溃疡性结肠炎的改善作用

1、实验动物

SPF级6周龄雄性昆明小鼠50只，购于重庆医科大学实验动物中心。饲养于室温25±2℃、相对湿度50±5％、12h光照/12h黑暗的标准化实验室中，适应性喂养一周后开始实验。

2、实验方法

50只小鼠随机分为5组，每组10只，分别为正常组、模型组、CQPC04高剂量组、CQPC04低剂量组和柳氮磺胺吡啶(SASP，主治炎症性肠病即Crohn病和溃疡性结肠炎的药物)组。整个实验周期为5周，正常组和模型组每天灌胃生理盐水；CQPC04高、低剂量组每天灌胃发酵乳杆菌CQPC04菌悬液，高剂量组浓度为5.0×10⁹CFU/mL，低剂量组浓度为1.5×10⁸CFU/mL；SASP组每天按500mg/kg灌胃SASP水溶液；每组小鼠灌胃体积均为0.1mL/10g.bw；第3周对实验小鼠进行结肠炎造模，造模方法如下：各组小鼠除正常灌胃外，正常组小鼠每天自由饮用无菌蒸馏水，模型组、CQPC04高、低剂量组和SASP组小鼠每天自由饮用5％DSS溶液，造模期间每隔2天换用新鲜的无菌水和5％DSS溶液，总共造模7天。整个实验结束后，所有小鼠禁食不禁水24h，通过摘眼球取血收集全血，4℃、4000r/min离心10min，收集上层血清，分装后于-80℃超低温冰箱保藏备用；然后脱颈处死小鼠，解剖取出结肠并测量其长度；取0.5cm左右的结肠组织，立即放于10％福尔马林溶液中固定48h，经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后进行HE染色；其余结肠经液氮冷冻后置-80℃超低温冰箱中保藏备用。

3、小鼠状态观察

实验期间每天观察各组小鼠排便状况和精神状态。实验第1～2周时，各组小鼠毛发光泽、饮食正常、精神状态良好。造模第2天，模型组小鼠出现不同程度的粪便不成形，其余各组小鼠排便正常；造模第3天，模型组有1只小鼠出现血便，其余小鼠出现轻微隐血，小鼠毛发轻微松动，而CQPC04高、低剂量组和SASP组小鼠排便正常，精神状态较好；造模第4天，模型组几乎所有小鼠出现血便，小鼠整个身体蜷缩，毛发松动无光泽，CQPC04低剂量组和SASP组小鼠粪便出现不成形的情况，小鼠活动减缓，而CQPC04高剂量组小鼠排便较正常、精神状态依旧较好；造模第5天，模型组小鼠继续出现血便，CQPC04高、低剂量组和SASP组小鼠均表现出不同程度的稀便或者粪便隐血、小鼠活动减缓、毛发开始松动，但CQPC04高剂量组小鼠精神状态明显好于除正常组外的其余3组；造模第6天，模型组小鼠出现严重便血，所有小鼠身体蜷缩，毛发疏松无光泽，部分小鼠出现身体发凉的症状，CQPC04低剂量组小鼠4只出现血便现象，高剂量组小鼠3只出现血便现象，而SASP组小鼠7只出现血便现象；造模第7天，除正常组外，其余各组小鼠均出现不同程度的血便，其中模型组最严重。停止造模后2天，除正常组外，其余各组小鼠仍旧维持便血状态，其中模型组小鼠出现3只小鼠死亡，CQPC04低剂量组和SASP组各出现1只小鼠死亡，CQPC04高剂量组小鼠未出现死亡情况。从停止造模第3天开始，各组小鼠精神状态逐渐恢复、血便消失，但模型组小鼠恢复情况明显不如CQPC04高、低剂量组和SASP组；实验最后一天，模型组小鼠虽然便血情况消失，但小鼠精神状态仍旧萎靡、毛发疏松、行动缓慢，而CQPC04高、低剂量组和SASP组小鼠基本恢复至造模前的状态。

4、小鼠结肠长度测量

DSS诱导小鼠结肠炎会导致结肠缩短，所以结肠长度是评价结肠炎小鼠炎症严重程度的重要指标之一。各组小鼠结肠长度如图4所示，正常组小鼠的结肠长度为10.10±0.80cm，模型组小鼠的结肠长度为7.31±0.50cm，极显著短于正常组(p<0.01)，说明结肠炎造模成功；与模型组相比，CQPC04低剂量组和SASP组小鼠的结肠长度显著增加(p<0.05)，分别为8.54±1.05cm、8.48±1.03cm；CQPC04高剂量组小鼠的结肠长度极显著增加(p<0.01)，为8.74±0.88cm。以上实验结果表明，发酵乳杆菌CQPC04能够减少结肠缩短情况。

5、小鼠结肠组织切片观察

取HE染色的结肠组织切片，在光学显微镜下观察组织形态变化。结果如图5所示，正常组小鼠结肠粘膜上皮细胞完整，隐窝正常，腺体排列整齐有序，且无溃疡存在；与正常组相比，模型组小鼠结肠粘膜糜烂严重，隐窝几乎全部被破坏，杯状细胞急剧减少，固有层细胞浸润严重，腺体排列紊乱，而且可见严重溃疡灶；给予结肠炎小鼠发酵乳杆菌CQPC04和SASP灌胃处理后发现，虽然CQPC04低剂量组小鼠结肠粘膜存在糜烂现象，杯状细胞有所减少，可见少量溃疡灶，但损伤程度明显轻于模型组；CQPC04高剂量组和SASP组小鼠结肠粘膜未出现明显糜烂，而且隐窝完整，腺体排列整齐，杯状细胞完整，与正常组结肠组织形态接近。以上实验结果表明，发酵乳杆菌CQPC04能够很好地保护结肠粘膜的完整性，减少炎症对结肠的损伤。

6、小鼠血清中氧化指标的测定

已有研究表明氧自由基在结肠炎发病过程中具有重要作用。机体正常情况下，氧自由基的生成和清除处于平衡状态，当炎症发生时，机体局部缺氧导致氧自由基大量生成，从而导致细胞凋亡或者损伤。MDA是脂质过氧化的产物，它能引起DNA损伤、酶及激素失活。SOD是一种抗氧化酶，它能特异性清除机体内的超氧阴离子，并把超氧化自由基分解为对机体无害的水和氧分子。CAT同样为抗氧化酶，能够清除机体内的过氧化自由基，减少氧自由基对机体的损伤。

按照常规生化试剂盒说明书测定小鼠血清中MDA、T-SOD和CAT的含量。结果如图6所示，与其它组相比，模型组小鼠血清中的MDA含量最高，T-SOD和CAT酶活力最低，而正常组的趋势与其完全相反；与模型组相比，CQPC04低剂量组小鼠血清中的MDA含量显著降低(p<0.05)，CQPC04高剂量组小鼠血清中的MDA含量极显著降低(p<0.01)而T-SOD和CAT酶活力极显著升高(p<0.01)。以上结果说明，发酵乳杆菌CQPC04能够增加结肠炎小鼠体内T-SOD和CAT的活力，降低血清中MDA的含量，从而减少氧自由基对结肠炎小鼠造成的氧化损伤。

7、小鼠血清中炎症相关细胞因子的水平检测

TNF-α以自分泌和旁分泌的方式在肠粘膜发挥局部作用，增强IL-1、IL-8等炎症介质的释放，扩大炎症范围，从而造成肠粘膜损伤。IFN-γ在结肠炎模型中分泌增多会导致肠粘膜局部缺氧，进一步促进诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的合成，从而加重局部炎症。另外IL-1β、IL-6、IL-12等因子也具有促进炎症的作用。IL-10具有重要的抑炎作用，它能降低髓过氧化物酶(MPO)活性、抑制炎症细胞NF-KB的活化，同时对其他促炎因子具有抑制作用。

采用ELISA试剂盒检测小鼠血清中促炎因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12的水平，同时测定抑炎因子IL-10的水平。结果如图7所示，与正常组相比，模型组小鼠血清中IFN-γ和IL-12的水平极显著升高(p<0.01)，TNF-α、IL-1β和IL-6的水平显著升高(p<0.05)，而IL-10的水平极显著下降(p<0.01)；与模型组相比，CQPC04高、低剂量组均能降低血清中促炎因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12的水平，增加抑炎因子IL-10的水平，而且随着灌胃浓度的增加，炎症因子的改变越显著，灌胃高剂量发酵乳杆菌CQPC04可极显著降低血清中IFN-γ和IL-12的水平(p<0.01)，显著降低血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平(p<0.05)，同时极显著增加血清中IL-10的水平(p<0.01)。

8、小鼠结肠组织中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-10、NFKB-p65、IKB-α、COX-2和iNOSmRNA表达水平检测

NF-KB是机体免疫应答过程中重要的转录因子，正常情况下以无活性的方式和其抑制蛋白IKB结合，研究发现DSS造模会加速IKB蛋白的磷酸化作用，使得NF-KB被激活，而活化的NF-KB进一步增加促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β等的释放，也会致使COX-2、iNOS的释放增加，而COX-2、iNOS可协同诱导机体炎症的发生。

按照Trizol(Invitrogen公司)说明书提取结肠总RNA，用超微量分光光度计测定总RNA的纯度和浓度，将每个样本的RNA浓度调整到同一水平(1μg/μL)。然后取1μg/μL的RNA样品1μL，加入(oligo)primer dT 1μL和无菌超纯水10μL，混合，65℃反应5min，再加入Ribolock RNase Inhibitor 1μL、100mM dNTP mix 2μL、5×Reaction buffer 4μL和Revert Aid M-mu/v RT 1μL，混匀，在42℃、60min和70℃、5min条件下合成cDNA。接着对目标基因进行反转录和扩增(所用引物序列见表1)。反应条件为：95℃变性15min，60℃退火1h，95℃延伸15min，总共40个循环。以GAPDH作为持家基因，通过2^-ΔΔCT计算目标基因的相对表达量。

表1 引物序列

小鼠结肠组织中TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-10mRNA的表达水平如图8所示，模型组小鼠结肠组织中的TNF-α、IFN-γ和IL-1β的mRNA表达水平极显著高于正常组(p<0.01)，而IL-10水平极显著低于正常组(p<0.01)；与模型组比较，灌胃发酵乳杆菌CQPC04的小鼠结肠组织中TNF-α、IFN-γ和IL-1β的mRNA表达水平均有降低，而IL-10的mRNA表达水平升高，其中高剂量组能极显著降低小鼠结肠组织中TNF-α、IFN-γ和IL-1β的mRNA表达水平(p<0.01)，极显著提高IL-10的mRNA表达水平(p<0.01)。结肠组织中TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-10的mRNA表达水平与其在血清中的水平相一致，进一步说明发酵乳杆菌CQPC04不仅能够减少血清中促炎因子的水平，增加抑炎因子的水平，还能从基因层面对抑炎因子和促炎因子的表达起到调控作用。

小鼠结肠组织中NFKB-p65、IKB-α、COX-2和iNOS的mRNA表达水平如图9所示，与其它组相比，正常组小鼠结肠组织中NFKB-p65、COX-2和iNOS的mRNA表达水平最低，IKB-α的表达水平最高；DSS造模会引起模型组小鼠结肠组织中NFKB-p65、COX-2和iNOS的mRNA表达水平极显著升高(p<0.01)，IKB-α的表达水平显著降低(p<0.05)；CQPC04高、低剂量组小鼠结肠组织中NFKB-p65、COX-2和iNOS的mRNA表达水平均低于模型组，IKB-α的水平均高于模型组，且随着CQPC04灌胃浓度的增加，各基因的表达水平与模型组的基因表达水平差异越明显。以上实验结果说明，发酵乳杆菌CQPC04能够增加小鼠结肠组织中IKB-α的表达水平，抑制NFKB-p65的活性，进而减少结肠组织中COX-2和iNOS的表达，降低炎症对结肠造成的损伤。

实施例3、利用发酵乳杆菌CQPC04制备发酵食品

发酵乳杆菌CQPC04原始菌种的保存：在温度-75℃下以30wt％甘油悬液形式保存，或在温度4℃下以冷冻干燥菌粉的形式保存。

发酵乳杆菌CQPC04工作发酵剂的制备，采用下述两种方法中的任意一种：

第一种方法：将发酵乳杆菌CQPC04的原始菌种接种于经110℃灭菌10min的12wt％脱脂乳中，37℃培养14-16h至凝乳，连续培养活化两代，用作母发酵剂；然后将母发酵剂按3-5vol％接种于灭菌乳中，培养14-16h至凝乳，凝乳中的活菌数约10⁹cfu/mL，用作工作发酵剂。

第二种方法：将发酵乳杆菌CQPC04的原始菌种接种于MRS液体培养基中，37℃培养12-16h进行活化，连续活化两代，然后将活化培养物按2-4vol％接种于MRS培养基中，培养16-18h，4℃、4000r/min离心15min，去除上清夜，细胞沉淀用无菌脱脂乳制成悬浮液，用作工作发酵剂。

1、制备乳酸菌奶饮料

将原料乳(选自脱脂奶、鲜奶和复原奶中的一种或多种)在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，冷却到4℃，加入发酵乳杆菌CQPC04工作发酵剂使其浓度达到10⁶cfu/ml以上，即得到含发酵乳杆菌CQPC04的乳酸菌奶饮料，4℃冷藏保存。

2、制备发酵乳

将原料乳(选自脱脂奶、鲜奶和复原奶中的一种或多种)在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，冷却到37℃，按照原料乳体积的4％加入发酵乳杆菌CQPC04工作发酵剂，37℃发酵16h，即得到发酵乳杆菌CQPC04发酵乳，4℃冷藏保存。

或者，将原料乳(选自脱脂奶、鲜奶和复原奶中的一种或多种)在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，冷却到37℃，按照原料乳体积的4％加入发酵乳杆菌CQPC04工作发酵剂，再按照原料乳体积的4％加入其它可共生的制备发酵乳的商业发酵剂(如保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌)，混匀，37℃混菌发酵至滴定酸度以乳酸计为0.6-0.7％，即得到混菌发酵乳，4℃冷藏保存。

3、制备乳粉

将原料乳(选自脱脂奶、鲜奶和复原奶中的一种或多种)在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，冷却到37℃，按照体积比3：1加入发酵乳杆菌CQPC04发酵乳，均质，真空浓缩，喷雾干燥，即得到含发酵乳杆菌CQPC04的乳粉。

4、制备乳粉胶囊

将含发酵乳杆菌CQPC04的乳粉装入胶囊壳中，即得到乳粉胶囊。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110> 重庆第二师范学院

<120> 发酵乳杆菌CQPC04在制备改善溃疡性结肠炎的食品或药品中的应用

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctacggctac cttgttacga 20

<210> 3

<211> 1419

<212> DNA

<213> 发酵乳杆菌CQPC04 (Lactobacillus fermentum CQPC04)

<400> 3

ttaggcggtg gctctaaagg ttacccaccg actttgggtg ttaaaactct catggtgtga 60

cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc cgcgattact 120

agcgattccg acttcgtgca ggcgagttgc agcctgcagt ccgaactgag aacggtttta 180

agagatttgc ttgccctcgc gagttcgcga ctcgttgtac cgtccattgt agcacgtgtg 240

tagcccaggt cataaggggc atgatgatct gacgtcgtcc ccaccttcct ccggtttgtc 300

accggcagtc tcactagagt gcccaactta atgctggcaa ctagtaacaa gggttgcgct 360

cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacgaccat gcaccacctg 420

tcattgcgtt cccgaaggaa acgccctatc tctagggttg gcgcaagatg tcaagacctg 480

gtaaggttct tcgcgtagct tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc 540

gtcaattcct ttgagtttca accttgcggt cgtactcccc aggcggagtg cttaatgcgt 600

tagctccggc actgaagggc ggaaaccctc caacacctag cactcatcgt ttacggcatg 660

gactaccagg gtatctaatc ctgttcgcta cccatgcttt cgagtctcag cgtcagttgc 720

agaccaggta gccgccttcg ccactggtgt tcttccatat atctacgcat tccaccgcta 780

cacatggagt tccactaccc tcttctgcac tcaagttatc cagtttccga tgcacttctc 840

cggttaagcc gaaggctttc acatcagact tagaaaaccg cctgcactct ctttacgccc 900

aataaatccg gataacgctt gccacctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc 960

cgtgactttc tggttaaata ccgtcaacgt atgaacagtt actctcatac gtgttcttct 1020

ttaacaacag agctttacga gccgaaaccc ttcttcactc acgcggtgtt gctccatcag 1080

gcttgcgccc attgtggaag attccctact gctgcctccc gtaggagtat gggccgtgtc 1140

tcagtcccat tgtggccgat cagtctctca actcggctat gcatcatcgc cttggtaggc 1200

cgttacccca ccaacaagct aatgcaccgc aggtccatcc agaagtgata gcgagaagcc 1260

atcttttaag cgttgttcat gcgaacaacg ttgttatgcg gtattagcat ctgtttccaa 1320

atgttgtccc ccgcttctgg gcaggttacc tacgtgttac tcacccgtcc gccactcgtt 1380

ggcgaccaaa atcaatcagg tgcaagcacc atcaatcaa 1419

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caggcggtgc ctatgtctc 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctgcaacag ggggtaacat 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gccacggcac agtcattga 19

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgctgatggc ctgattgtct t 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaaatgccac cttttgacag tg 22

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tggatgctct catcaggaca g 21

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cttactgact ggcatgagga tca 23

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcagctctag gagcatgtgg 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaggcacgag gctccttttc t 21

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gtagctgcat ggagactcga aca 23

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tgaaggacga ggagtacgag c 21

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgcaggaacg agtctccgt 19

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggtgcctggt ctgatgatg 19

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tgctggtttg gaatagttgc t 21

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gttctcagcc caacaataca aga 23

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gtggacgggt cgatgtcac 19

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aggtcggtgt gaacggattt g 21

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ggggtcgttg atggcaaca 19

Claims

1.保藏编号为CGMCC NO. 14493的发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）CQPC04在制备食品或改善溃疡性结肠炎的药品中的应用。

2.如权利要求1所述的保藏编号为CGMCC NO. 14493的发酵乳杆菌CQPC04在制备食品或改善溃疡性结肠炎的药品中的应用，其特征在于，所述食品为发酵食品。

3.如权利要求2所述的保藏编号为CGMCC NO. 14493的发酵乳杆菌CQPC04在制备食品或改善溃疡性结肠炎的药品中的应用，其特征在于，所述发酵食品为乳酸菌奶饮料、发酵乳、乳粉或乳粉胶囊。