CN111529553B - 植物乳杆菌klds1.0386与色氨酸混合物在制备预防结肠炎的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了植物乳杆菌KLDS1.0386与色氨酸混合物在制备预防结肠炎的药物中的应用。具体公开了植物乳杆菌KLDS1.0386与色氨酸混合物在制备降低结肠组织髓过氧化物酶MPO活性的药物中的应用、在制备改善结肠炎免疫应答紊乱的药物中的应用、在制备保护肠道屏障的药物中的应用、在制备保护肠道粘膜的药物中的应用以及在制备调节肠道微生物的药物中的应用。本发明通过体外评估16株乳酸杆菌对色氨酸的降解能力,筛选出具有较高降解色氨酸能力的植物乳杆菌KLDS1.0386;植物乳杆菌KLDS1.0386生长性能好,具有较强的产酸能力和耐酸耐胆盐能力,展现了良好的益生功能以及预防结肠炎功能。
Description
技术领域
本发明涉及植物乳杆菌KLDS1.0386与色氨酸混合物的应用,具体涉及一种植物乳杆菌KLDS1.0386与色氨酸混合物在制备预防结肠炎的药物中的应用,属于医药技术领域。
背景技术
炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一种慢性且易复发的自身免疫性疾病,包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(crohn's disease,CD)两种疾病类型。过去一直认为IBD是西方疾病,主要集中在北美、欧洲、澳大利亚和新西兰等发达国家,而近年来IBD在亚洲、中东等新兴工业国家的发病率急剧上升,已发展为全球性的疾病。IBD临床表现为腹泻、便血、体重降低等症状,UC主要影响结肠黏膜,引起血便,CD可在整个胃肠道呈节段性分布,引起瘘管,严重影响人们生活质量,由于治疗周期长且易复发,给病人带来沉重的经济压力。目前,IBD的病因和发病机制尚未完全明确,但随着检测技术的发展,越来越多的证据表明宿主肠道的共生微生物失调引发先天性和适应性免疫反应紊乱进而导致遗传易感宿主出现肠道炎症。现有IBD的治疗方法主要通过药物治疗,虽然效果好,但存在较大的毒副作用,不适合长期使用,因此,寻找安全、有效的IBD治疗方法至关重要。
如:目前临床上治疗IBD的药物主要包括氨基水杨酸类药物、类固醇激素类药物和免疫抑制剂类药物。目前,氨基水杨酸主要包括5-氨基水杨酸、柳氮磺胺吡啶,主要用于治疗轻中度的IBD,其主要机制是通过激活PPARγ(Peroxisome proliferator-activatedreceptor gamma),降低促炎性因子的分泌,进而抑制NF-κB炎症通路的激活。糖皮质激素主要用于治疗中重度IBD患者,可抑制细胞分化和活化,减少促炎性细胞因子的产生,诱导DC和T细胞程序性凋亡,虽然抗炎效果好,但容易引起机体代谢失调,诱导不良反应,不可用于长期维持治疗的药物,仅可作为应急药物。对于不能使用氨基水杨酸类药物和糖皮质激素类药物进行治疗的IBD患者,免疫抑制类药物是重要的治疗药物,主要有硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤和甲氨喋吟;其作用机制为减少淋巴细胞在内的细胞增殖,抑制炎症基因的表达,但会产生特异性的不良反应,例如恶心、发热、关节痛、急性胰腺炎等。在IBD中使用硫嘌呤治疗会使恶性肿瘤、淋巴瘤和非黑色素瘤皮肤癌的相对风险增加三倍。
色氨酸是人体必需的芳香族氨基酸,其化学名称为α-氨基-β-吲哚丙酸,分子式为C11H12N2O2,是唯一含有吲哚结构的氨基酸,即双环化合物,由六元苯环与五元含氮吡咯环组成。在人体内不能合成,需从饮食中获取,很多研究发现色氨酸对维持肠道微生物和肠粘膜免疫之间的平衡发挥重要的作用。但肠道微生物分解利用色氨酸的能力是有限的,目前研究发现大肠埃希菌、梭状芽孢杆菌、拟杆菌、消化链球菌具有降解色氨酸的功能,马梅蕾从猪结肠中筛选出一株能够利用色氨酸的肠球菌属,但肠球菌是一种具有潜在致病性的病原菌,菌株对人体的安全性不能保证。
故亟需一种高效、安全的缓解结肠炎的药物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是,提供一种植物乳杆菌KLDS1.0386与色氨酸混合物在制备预防结肠炎的药物中的应用。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案为:
植物乳杆菌KLDS1.0386与色氨酸混合物在制备预防结肠炎药物中的应用。
植物乳杆菌KLDS1.0386与色氨酸混合物在制备降低结肠组织髓过氧化物酶MPO活性的药物中的应用。
植物乳杆菌KLDS1.0386与色氨酸混合物在制备改善结肠炎免疫应答紊乱的药物中的应用。
改善结肠炎免疫应答紊乱包括降低促炎性细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α的含量,并升高抗炎性细胞因子IL-10的含量。
植物乳杆菌KLDS1.0386与色氨酸混合物在制备保护肠道屏障的药物中的应用。
保护肠道屏障包括升高结肠组织中紧密连接蛋白Occludin、ZO-1的水平和黏蛋白MUC1、MUC2水平。
植物乳杆菌KLDS1.0386与色氨酸混合物在制备保护肠道粘膜的药物中的应用。
保护肠道粘膜包括植物乳杆菌KLDS1.0386在肠道中直接代谢色氨酸生成3-吲哚乙酸IAA,3-吲哚乙酸IAA作为芳香烃受体AHR的配体参与调控与肠道免疫密切相关的AHR信号通路。
植物乳杆菌KLDS1.0386与色氨酸混合物激活芳香烃受体AHR并诱导IL-22/STAT3通路,增加IL-22和STAT3的表达,进而诱导抗菌肽REG3γ的表达,促进组织修复与再生,从而发挥保护肠道粘膜的作用。
植物乳杆菌KLDS1.0386与色氨酸混合物在制备调节肠道微生物的药物中的应用。
调节肠道微生物包括降低肠道中大肠杆菌志贺菌属、另枝菌属和螺杆菌属的相对丰度,增加普雷沃氏菌属UCG-001、阿克曼氏菌(Akkermansia)和鼠杆菌科(Muribaculaceae)的相对丰度。
所述混合物的量为:每108-109CFU/mL的植物乳杆菌菌悬液0.2mL中含有0.2-2mg色氨酸。
本发明所使用的乳酸菌作为益生菌的主要来源,是被公认为安全的食品级微生物,因此筛选出一株能够高效降解色氨酸的乳酸菌,以开发高效、安全的缓解结肠炎的天然药物。乳酸菌作为革兰氏阳性菌,通常从酸奶、泡菜等发酵食品中分离,是益生菌的主要来源。乳酸菌除了在食品中得到广大应用,已被证明可有效预防或治疗各种疾病,例如免疫调节、降胆固醇、抗肿瘤等益生功能。乳酸菌可通过黏附定植到肠道,调整肠道微生物结构,激活机体免疫,从而发挥出相应的益生功能。大量体内、体外及临床研究证实不同种属乳酸菌具有缓解肠道炎症的功能,但乳酸菌与色氨酸两者对结肠炎的影响尚未阐明,本发明以本实验室保藏的乳酸菌为研究对象,从中筛选出降解色氨酸能力较高的乳酸菌,并研究其对DSS诱导小鼠结肠炎的影响以及可能的机制,为开发具有缓解结肠炎的功能性乳酸菌提供理论基础和数据支持。
本发明具有以下有益效果:
1.通过体外评估16株乳酸杆菌对色氨酸的降解能力,筛选出具有较高降解色氨酸能力的植物乳杆菌KLDS1.0386。
2.植物乳杆菌KLDS1.0386生长性能好,具有较强的产酸能力和耐酸耐胆盐能力,展现了良好的益生功能。
3.色氨酸和植物乳杆菌KLDS1.0386都能在不同程度上缓解DSS诱导小鼠结肠炎引起的肠道炎症,但两者混合干预效果最好。混合组能显著降低DAI指数,阻止结肠变短,缓解组织病理损伤,降低MPO活性,混合组能显著降低促炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α的含量,并显著提高抗炎因子IL-10含量。此外,混合组还可以显著改善DSS引起的小鼠结肠肠道屏障损伤,保罗显著上调紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的基因表达量和黏蛋白MUC1和MUC2水平,保护肠道屏障完整性。
4.色氨酸和植物乳杆菌KLDS1.0386混合组干预后,显著升高小鼠肝脏、血清及结肠组织中色氨酸代谢产物IAA的含量,IAA作为AHR配体,激活AHR并诱导IL-22/STAT3通路,增加IL-22的分泌和STAT3的表达,诱导抗菌肽REG3γ的表达,进而缓解DSS诱导引起的肠炎损伤。
5.色氨酸和植物乳杆菌KLDS1.0386混合干预可以增加肠炎小鼠肠道菌群多样性,降低厚壁菌门和变形菌门的相对丰度,增加拟杆菌门的相对丰度。此外,在属水平上,可以著降低肠道中Escherichia-Shigella、Alistipes、Helicobacter有害菌的相对丰度,并增加Akkermansia、Prevotellaceae UCG-001和Muribaculaceae有益菌属的相对丰度,从而预防由DSS引起的肠道微生物紊乱。
附图说明
图1为色氨酸的标准曲线图;
图2为乳酸杆菌对色氨酸的降解能力图;注:不同小写字母表示各组差异性显著(P<0.05),相同字母表示差异不显著(P>0.05);
图3为植物乳杆菌KLDS1.0386的生长曲线图;
图4为植物乳杆菌KLDS1.0386的产酸性能图;
图5为各处理组对结肠组织髓过氧化物酶活性的影响图;注:不同小写字母表示各组差异性显著(P<0.05);
图6为各处理组对小鼠血清中细胞因子的影响图;注:A-D分别为TNF-α、IL-1β、IL-6、和IL-10含量,不同小写字母表示各组差异性显著(P<0.05);
图7为各处理组对紧密连接蛋白基因表达水平的影响图;注:不同小写字母表示各组差异性显著(P<0.05);
图8为各处理组对粘蛋白基因表达水平的影响图;注:Control:对照组;DSS:模型组;Trp:色氨酸组;LAB:KLDS1.0386组;Mix:混合组。(A)MUC1基因表达水平,(B)MUC2基因表达水平,不同小写字母表示各组差异性显著(P<0.05);
图9为各处理组对肝脏、血清和结肠组织中IAA含量的影响图;注:Control:对照组;DSS:模型组;Trp:色氨酸组;LAB:KLDS1.0386组;Mix:混合组;
图10为各处理组对AHR信号通路相关基因表达水平的影响图;注:(A)AHR基因表达水平,(B)STAT3基因表达水平,(C)REG3γ基因表达水平,(D)IL-22表达水平,不同小写字母表示各组差异性显著(P<0.05);
图11为维恩图和样品聚类图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
实施例1
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1供试菌株
植物乳杆菌(KLDS1.0317、KLDS1.0318、KLDS1.0386、KLDS1.0344、1-2、2-2、4-5、1-5、4-4、8-6)、嗜酸乳杆菌(KLDS1.0901、KLDS1.0902、KLDS1.1003)、鼠李糖乳杆菌(1.0911、1.0912、LGG)、均由乳品科学教育部重点实验室工业微生物菌种保藏中心(KLDS-DICC)提供。
1.1.2实验动物
清洁级C57BL/6N小鼠,雄性,8周龄,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2016-0006。
1.1.3培养基
1.1.3.1 MRS培养基
蛋白胨5.0g,胰蛋白胨10.0g,乙酸钠5.0g,酵母提取物5.0g,葡萄糖20.0g,吐温-80 1.0g,硫酸锰0.25g,柠檬酸氢二铵2.0g,硫酸镁0.58g,磷酸氢二钾2.0g,牛肉膏5.0g,用蒸馏水定容至1L,调节pH至5.8,121℃条件下灭菌15min。
1.1.3.2色氨酸培养基
按照上述MRS培养基配方的剂量溶解于800mL蒸馏水,调节pH至5.8,121℃条件下灭菌15min。称取2g色氨酸加入200mL无菌水中,使其充分溶解,用0.22μm水系滤膜过滤除菌之后加入灭完菌的MRS培养基,混匀后即为色氨酸培养基。
1.1.4主要试剂:酵母提取物、胰蛋白胨;胃蛋白酶、胰蛋白酶;甲醇;L-色氨酸;磷酸二氢钾;葡聚糖硫酸钠(DSS);便隐血试剂盒;髓过氧化物酶试剂盒;白细胞介素6(IL-6)试剂盒;白细胞介素10(IL-10)试剂盒;白细胞介素1β(IL-1β)提取试剂盒;肿瘤坏死因子α(TNF-α)试剂盒;白细胞介素22(IL-22)试剂盒;3-吲哚乙酸(IAA)试剂盒;革兰氏染色试剂盒。
1.1.5仪器与设备:LDZF-50KB-II立式压力蒸汽灭菌器;VD-1320型洁净工作台;DHP-9272型电热恒温培养箱;HPG-9245烘箱;涡旋振荡器;Lambda Bio35紫外-可见分光光度计;Model 680型酶标仪;PHS-25型pH计;GL-21M高速冷冻离心机;0.22μm滤膜。
1.2实验方法
1.2.1菌株活化与培养
将冻存于-80℃条件下的乳酸菌以2%的接种量接种在MRS培养基中,37℃培养24h,连续培养两代,37℃培养18h备用。
1.2.2降解色氨酸乳酸杆菌的筛选
1.2.2.1标准曲线的测定
配制1g/L的色氨酸溶液,并依次将浓度稀释至0.02g/L、0.03g/L、0.035g/L、0.045g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L,进样前经0.22μm滤膜过滤。HPLC条件:色谱柱为岛津C18(4.6×250mm,5μm);流动相为0.03%磷酸二氢钾溶液:甲醇=90:10(v:v),使用前需经0.45μm滤膜过滤,超声脱气;流速为1.0mL/min;二极管检测器,检测波长为278nm;柱温为39℃;进样量设置为20μL。
1.2.2.2色氨酸降解率的计算
式中:A为各菌株发酵后培养液的色氨酸含量;C为空白对照组的色氨酸含量;重复实验3次,取平均值。
1.2.2.3发酵液样品的处理
将活化好的乳酸菌接种于色氨酸培养基,以未接菌的色氨酸培养基作为空白对照,培养24h后,4℃,8000r/min,离心15min,将上清液稀释一定的倍数,混合均匀后取1mL上清液于无菌EP管,0.22μm水系滤膜过滤置于液相进样小瓶测定样品中色氨酸的含量。
1.2.3目标菌株益生特性的测定
1.2.3.1菌体及菌落形态的观察
将活化的植物乳杆菌KLDS1.0386在MRS固体培养基上进行平板划线,置于37℃培养24h,取出并观察菌落形态;并从MRS固体培养基上分别选取一个较大菌落,挑取其中的1/2菌落,进行革兰氏染色和油镜观察菌体形态,并照相。
1.2.3.2生长曲线的测定
将活化好的KLDS1.0386以2%的接种量接种于MRS液体培养基,置于37℃培养箱培养24h,每隔2h取样,在600nm波长下测定其光密度值(OD600),绘制生长曲线。
1.2.3.3产酸能力的测定
将活化好的KLDS1.0386以2%的接种量接种于MRS液体培养基,置于37℃培养箱培养24h,每隔2h取样,用酸度计测定其pH值。
1.2.3.4耐酸性能力的测定
1mol/L的盐酸将MRS培养基pH值调整为2、2.5、3,于121℃高压蒸汽灭菌20min,冷却备用。将活化好的植物乳杆菌KLDS1.0386以2%接种量接种于上述培养基,在37℃培养箱培养0、1、2、3h取样,在37℃恒温培养48h后测定活菌数。按下式计算菌株的存活率。
其中,Nt为作用不同时间后的活菌数,N0为初始活菌数。
1.2.3.5耐胆盐能力的测定
在MRS液体培养基中加入牛胆盐,使胆盐的质量浓度分别为0.1、0.2、0.3g/100mL,以不添加胆盐的MRS液体培养基作为对照,121℃高压蒸汽灭菌20min,冷却备用。将活化后的植物乳杆菌KLDS 1.0386以2%的接种量接种到上述处理后的培养基中,37℃恒温培养,分别于0、1、2、3h取样,采用平板计数法测定活菌数,按上式计算存活率。
1.2.4动物实验
1.2.4.1动物试验设计
将75只8周龄C57BL/6N雄鼠适应性饲养一周后随机分为5组,每组15只,即正常组、模型组、色氨酸组、KLDS1.0386组、色氨酸+KLDS1.0386。适应性饲养7天后,正常组和模型组在整个实验阶段内正常饮食与用水,每天灌胃无菌PBS 0.2mL;色氨酸组每天灌胃无菌色氨酸溶液0.2mL(含2mg色氨酸),KLDS1.0386组每天灌胃109CFU/mL的菌悬液0.2mL;KLDS1.0386+Trp组每天灌胃109CFU/mL的色氨酸菌悬液(含2mg色氨酸)。除正常组外,其它四组从第15天饮用2.5%DSS水溶液7天。DSS为葡聚糖硫酸钠,Trp代表色氨酸,LAB代表KLDS1.0386。
表1实验设计方案
1.2.4.2疾病活动指数(DAI)的测定
在小鼠造模及灌胃期间每天观察记录小鼠的生长状态,包括眼神毛发、体重变化、粪便形状及便血状况。参照Joh的评分方法,计算小鼠的疾病活动指数DAI,评分细则如表2所示。
表2 DAI评分细则
1.2.4.3小鼠结肠组织长度的测定
小鼠处死后,测量盲肠末端和近端直肠之间的结肠,测量结肠长度。
1.2.4.4小鼠器官指数的测定
小鼠解剖后,分离心脏、脾脏、肝脏、肾脏,用生理盐水清洗并用滤纸吸干表面水分,然后迅速称量。器官指数(%)=器官重量(g)/体重(g)×100。
1.2.4.5小鼠结肠组织病理评估
取小鼠远端结肠(距肛门1cm处)1cm浸泡于甲醛中固定组织,然后石蜡包埋切片,经二甲苯脱蜡后染色,用于结肠组织病理评估,组织学评分按照以下标准,轻度损伤(1分):由黏膜表层至隐窝基部局部正常结构消失,尚存少数杯状细胞,损伤占肠道横断面1/4左右范围;中度损伤(2分):黏膜全层固有的正常结构消失,结缔组织增生及炎性细胞浸润,黏膜下层水肿及炎性浸润,损伤连续性或续断性占肠道横断面1/3左右范围;重度损伤(3分):损伤特征同中度损伤,损伤连续性或续断性占肠道横断面1/2左右范围。
1.2.4.6结肠髓过氧化物酶活性的测定
髓过氧化物酶(MPO)活性是表征炎症程度的指标之一,根据MPO试剂盒说明书进行检测。具体操作步骤如下:准确称取各组小鼠结肠组织重量,以配置好的试剂二为匀浆介质,按重量体积比1:19加试剂二,研磨成5%的组织匀浆,用于MPO的测定。结肠组织MPO计算公式如下:
MPO酶活=(测定OD值-对照OD值)/11.3×取样量(g)。
1.2.4.7血清细胞因子的测定
灌胃结束后,眼球取血,室温下自然凝固1~2h,7000rpm离心5分钟,收集血清,冻存于-20℃冰箱,收集完毕后,通过ELISA试剂盒,用TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-22的检测。
1.2.4.8肝脏、血清和结肠中IAA的测定
准确称取小鼠肝脏、结肠组织,以PBS为匀浆介质,按照1:9的重量体积比,在冰上充分研磨,最后将匀浆液7000rpm离心5min,取上清检测;血清按上述细胞因子的前处理一致。利用ELISA试剂盒对各组小鼠肝脏、血清和结肠组织中吲哚乙酸(IAA)含量进行测定,按照试剂盒说明书进行检测。
1.2.4.9荧光定量PCR检测
(1)RNA提取与浓度测定
取2.0mL的无酶塑料管,加入1000uL的RNAiso,再加入适量结肠组织样本,组织匀浆机进行匀浆,参照RNAiso Plus操作说明书提取结肠组织内的总RNA,加入适量的RNase-free水40uL溶解RNA沉淀,采用超微量紫外分光光度计测定RNA浓度。
(2)cDNA合成
将提取好的RNA参照Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit RNA试剂盒进行反转录,按表3反转录反应体系进行反转录,反应液配制在冰上进行。吹打混匀并用离心机轻度离心。将上述20μL反转录体系于55℃反应30min,85℃反应5min使逆转录酶失活,得到cDNA。-80℃保存备用。
表3反转录体系
(3)RT-PCR检测
RT-PCR上机检测参照试剂盒Stormstar SybrGreen qPCR Master Mix说明书进行,采用20uL体系进行上机检测。实验以GAPDH基因作为内参基因,数据结果采用2–ΔΔCt法进行分析。所用引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。引物相关信息见表4。
表4 RT-PCR引物序列的设计
1.2.4.10结肠肠道微生物的检测
(1)测序流程
灌胃结束后,在无菌条件下对小鼠进行解刨,取出结肠内容物装入冻存管中,用液氮速冻并放在-80℃保存。每组随机选取3个样品送至博泰基因有限公司进行高通量测序。按照粪便试剂盒说明书对小鼠结肠内容物的DNA进行提取,通过NanoDrop ND-1000分光光度计和琼脂糖凝胶电泳分别检测DNA的数量和质量。之后以得到的基因组为模板,对16SrDNA的V3-V4区进行PCR扩增。将扩增子用agt AMPure Beads(Beckman Coulter,Indianapolis,IN)进行纯化,并使用PicoGreen dsDNA检测试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)定量。构建Miseq文库,利用Illlumina MiSeq平台进行测序,对高通量测序得到的原始数据进行生物信息分析。
(2)生物信息分析
对高通量测序得到的原始序列进行质量过滤,过滤后的序列进行拼接处理并进行质量控制和分类,归类成多个可操作分类单元(Operational Taxonomic Unita,OTU),其中每个OTU序列相似度达到97%。使用QIIME软件(V1.9.0)和R软件(V3.4.1)对alpha多样性和Beta多样性进行分析。alpha多样性包括Shannon、Simpson、Chao1和observed species指数。利用LefSe分析平台和线性判别分析(LDA)确定组间具有统计学差异的物种以及每个物种丰度在组间的差异大小。
1.2.5数据处理
实验数据均以平均数±标准差来表示,至少重复3次,采用SPSS 18.0软件对不同组之间的数据进行单因素方差,Spearman相关系数用于评价两个统计变量的相关性,并用GraphPad Prism 5.0和Origin 9.0软件进行作图,P<0.05为统计学上有显著差异。
2结果与分析
2.1降解色氨酸乳酸杆菌的筛选
2.1.1色氨酸测定的标准曲线
以色氨酸浓度(g/L)为横轴,峰面积为纵轴,作标准曲线如图1所示,所得线性方程为:y=3.2×107x-6638.6,R2=0.9997,具有较好的线性关系,可以用于色氨酸的测定。
3.1.2乳酸杆菌对色氨酸的降解能力
乳酸杆菌对色氨酸的降解能力如图2所示。16株乳酸杆菌都呈现出一定的降解色氨酸的能力,不同菌株之间具有差异性,降解率为3.83%-20.43%,植物乳杆菌对色氨酸具有更好的降解作用,其中植物乳杆菌KLDS1.0317、KLDS1.0386、KLDS1.0344、4-5对色氨酸的降解率分别为12.78%、20.43%、18.77%、15.45%,显著高于其他菌株(P<0.05)。嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌对色氨酸的降解作用较弱,其中参考菌株LGG对色氨酸的降解率为5.51%。总体而言,根据乳酸菌对色氨酸的降解作用的不同,选取植物乳杆菌KLDS1.0386进行接下来的研究。
2.2植物乳杆菌KLDS1.0386的益生特性分析
2.2.1菌体及菌落形态
菌体染色镜检的结果:革兰氏染色为紫色,属于革兰氏阳性菌,镜检观察菌体为圆端短杆状,单个、成对或成链状排布;植物乳杆菌KLDS1.0386的菌落形态:菌落颜色为奶白色,且外表为光滑、不透明的圆形结构,边缘处比较整齐,这与典型的植物乳杆菌形态基本一致。
2.2.2生长曲线
将植物乳杆菌KLDS1.0386接种于无菌MRS液体培养基,于37℃培养箱进行培养,每隔2h测定其在600nm处的OD值,以时间为横坐标,OD值为纵坐标,制作生长曲线,具体如图3所示。植物乳杆菌KLDS1.0386在培养2h后,迅速增长,进入对数生长期,在16h左右进入生长的稳定期,菌体生长缓慢,具有较好的生长活性。
2.2.3产酸能力
将植物乳杆菌KLDS1.0386在37℃培养箱进行培养,每隔2h测定发酵液的pH值,以时间(h)为横坐标,pH值为纵坐标,制作植物乳杆菌的pH变化曲线,如图4所示,在2h后pH变化明显,在6h时pH已降到4.22,pH在2-16h期间快速下降,在16h后降至3.45,具有较好的产酸性能。
2.2.4酸耐受性
为了分析植物乳杆菌KLDS1.0386对酸的耐受能力,本研究通过测定菌株在pH为2、2.5和3的MRS液体培养基的活菌数及存活率进行评价。结果如表5所示,植物乳杆菌KLDS1.0386在pH为2的酸性条件下,活菌数明显下降,培养至3h其存活率降为零。但在pH为2.5和3的条件下,菌株活性较强,在1h其活菌数仍在109CFU/mL,其存活率分别达到96.26%和98.81%,培养至2h其活菌数出现一定的下降,但活菌数仍在108CFU/mL以上,在3h菌株活菌数有所回升,其存活率分别为95.51%、97.41%,尤其在pH为3的酸性条件下,其活菌数与初始菌数相比无显著性差异(P>0.05),说明植物乳杆菌KLDS1.0386具有较好的耐酸能力。
表5植物乳杆菌KLDS1.0386对酸的耐受性
注:同行小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。
2.2.5胆盐耐受性
菌株的胆盐耐受性通过测定菌株在含有0.1%、0.2%、0.3%胆盐浓度的活菌数和存活率来表示,结果如表6所示。KLDS1.0386在不同胆盐浓度的条件下维持1h后,活菌数出现一定程度的下降,但与初始菌数相比差异均不显著(P>0.05),在1~3h期间,不同条件下的菌株活菌数继续下降,与初始菌数相比具有显著差异性(P<0.05),但仍保持在108CFU/mL以上,存活率均在90%以上,说明植物乳杆菌KLDS 1.0386具有较好的胆盐耐受能力。
表6植物乳杆菌KLDS1.0386对胆盐的耐受性
注:同行小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。
2.3目标菌株对DSS诱导小鼠结肠炎的预防
2.3.1体重变化
在预防期,用色氨酸、KLDS1.0386和色氨酸+KLDS1.0386处理14天后,各组小鼠体重缓慢上升,并没有明显差异。在造模期间(15d-21d),每日称量小鼠体重,对照组小鼠体重平缓增加;模型组在第15-18天,体重保持缓慢增加,而第19天之后,体重开始大幅度下降,直到实验结束体重降到最低,显著低于正常组(P<0.05);而其它干预组的体重也从第18天开始出现不同程度的降低;实验结束时,色氨酸组体重为(21.25±1.22)g,KLDS1.0386组小鼠体重为(21.73±0.98)g,混合组小鼠体重为(23.35±0.89)g,可以看出,色氨酸与KLDS1.0386混合处理抑制小鼠体重减轻的程度更显著。
2.3.2DAI评分
DAI可以反映出小鼠体重变化、大便状态以及便血情况三个方面的总体特征,DAI评分越高,说明肠炎症状越明显。从饮用DSS开始检测不同处理组小鼠粪便的DAI值,对照组小鼠的粪便正常,DAI基本为0,生长状态良好;模型组小鼠从第18天开始大便呈现松散的情况,部分小鼠粪便出现血迹,体重大幅度下降,DAI值逐渐升高,随着饮用DSS时间延长,模型组小鼠的粪便不成型,出现肉眼可见的红褐色血迹,黏附于肛门,DAI值达到最大值;其它干预组在一定程度上均缓解了与模型组相似的症状,降低DAI值,其中色氨酸+KLDS1.0386组的DAI值比色氨酸组、KLDS1.0386组较低,说明色氨酸和植物乳杆菌KLDS1.0386混合干预降低DAI评分效果更显著。
2.3.3结肠长度变化
结肠长度可直接反映结肠炎症的严重程度,饮用DSS可使小鼠结肠缩短。小鼠处死后,取出完整结肠,测量其长度,对照组的结肠长度为(7.03±0.25)cm,而模型组小鼠结肠明显缩短,为(3.8±0.1)cm,通过KLDS1.0386、色氨酸、以及KLDS1.0386和色氨酸混合处理均显著增加了小鼠结肠长度(P<0.05)。其中,混合组的结肠长度为(4.77±0.06)cm,与色氨酸组、KLDS1.0386组的小鼠结肠长度具有显著性差异(P<0.05),由此可以看出混合处理对抑制小鼠结肠缩短的效果最为显著。
2.3.4器官指数变化
器官指数可表明不同处理组小鼠的生长状态,各组小鼠采血结束后,解剖小鼠,取出心脏、肝脏、脾脏和肾脏进行称量,并分别计算各个器官的脏器指数,结果如表7所示。
心脏指数、肝脏指数和肾脏指数,各处理组直接无显著差异(P>0.05),这说明不同试验处理对小鼠心脏、肝脏、和肾脏并未产生影响。脾脏与机体免疫情况相关,肠道炎症增加,使免疫系统活化,便会引起脾脏重量的增加。由表7可知,模型组的脾脏指数明显高于对照组(P<0.05),色氨酸组和KLDS1.0386组的脾脏指数低于模型组,但差异不显著(P>0.05),而混合组的脾脏指数明显低于模型组(P<0.05),且与正常组无显著差异(P>0.05),表明色氨酸与KLDS1.0386混合处理可以显著改善肠炎小鼠的脾脏指数。
表7各处理组对小鼠脏器指数的影响
注:同行小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。
2.3.5结肠病理变化及评分
HE组织染色可以反映出肠道的病变状态,肠道上皮作为肠道粘膜的重要组成部分,以自身的更新能力来保肠道结构。对照组小鼠结肠黏膜层见有丰富的杯状细胞,黏膜表层黏膜上皮细胞呈高柱状,排列整齐;隐窝呈瓶状结构,中央见有小腔或无明显腔状结构;模型组黏膜全层固有结构消失,结缔组织增生及炎性细胞浸润,且模型组的组织损伤评分相对于空白对照组显著升高(P<0.05);与模型组相比,其它各处理组的都在一定程度上缓解了结肠组织的损伤,其中混合组显著改善了饮用DSS对小鼠结肠带来的肠道损伤,结肠粘膜层保留了大部分的杯状细胞,肠上层结构完整,炎症细胞浸润显著减轻,组织损伤评分显著低于模型组(P<0.05),说明KLDS1.0386和色氨酸混合组对结肠结构组织的保护效果最显著。
2.3.6结肠髓过氧化物酶活性
髓过氧化物酶(MPO)是中心粒细胞的功能标志和激活标志,反应了炎性细胞的浸润程度,MPO活性越高,代表炎症程度越深。从图5可以看出,与对照组相比,DSS可使模型组MPO活性显著升高(P<0.05),表明模型组小鼠结肠炎症细胞浸润严重;而色氨酸组、KLDS1.0386组和混合组均有不同程度的抑制作用,其中KLDS1.0386和色氨酸混合组对MPO活性的降低最明显,且与正常组无显著性差异(P>0.05),表明混合组可以显著改善肠炎小鼠结肠组织炎症程度。
2.3.7血清细胞因子水平
采用酶联免疫吸附法测定小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、和IL-10的含量,如图6所示,与对照组相比,模型组小鼠血清中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著升高(P<0.05),而色氨酸组、KLDS1.0386组和混合组均不同程度降低了促炎细胞因子水平,其中,混合组血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量下降最为显著,尤其混合组小鼠血清中IL-1β水平与正常组相比无显著差异(P>0.05);与此同时,与对照组相比,模型组小鼠血清中抗炎细胞因子IL-10显著降低,而其它处理组均不同程度升高抗炎性细胞因子水平,其中混合组效果最好,与空白组血清中IL-10水平无显著差异(P>0.05),表明色氨酸与KLDS1.0386混合干预对免疫调节的效果最显著。
2.3.8肠道屏障功能的变化
2.3.8.1紧密连接蛋白水平的变化
紧密连接蛋白是构成肠道屏障的重要组成部分,在维持肠道上皮结构稳定发挥着重要作用,因此采用RT-PCR检测结肠中Claudin-1、Occludin和ZO-1的基因表达量,如图7所示,跟对照组相比,模型组中Claudin-1、Occludin和ZO-1基因相对表达量均发生下调,其中,ZO-1基因水平发生显著性降低(P<0.05);与模型组相比,色氨酸、KLDS1.0386和混合组均不同程度的上调了Claudin-1、Occludin和ZO-1基因水平,其中混合组显著上调Occludin和ZO-1的基因表达量(P<0.05),能够显著保护小鼠结肠上皮结构的稳定。
2.3.7.2粘蛋白水平的变化
粘蛋白是结肠粘液层的组成成分,由肠上皮杯状细胞分泌,主要包括MUC1和MUC2,采用RT-PCR对小鼠结肠中MUC1和MUC2基因的相对表达量进行检测。由图8可知,相比于对照组,模型组小鼠结肠中MUC1和MUC2的基因表达量显著降低(P<0.05)。色氨酸、KLDS1.0386以及混合组均可上调MUC1和MUC2水平,而混合组改善的效果最显著,其中混合组中MUC1的基因表达量与正常组相比无显著性差异(P>0.05),由以上结果可知,色氨酸和KLDS1.0386混合组保护肠道屏障功能的效果最显著。
2.3.9肝脏、血清、结肠中IAA含量变化
乳杆菌在宿主肠道内能将色氨酸代谢为AHR配体,其中3-吲哚乙酸(IAA)可作为AHR的高亲和力配体,能够激活AHR信号通路,增加AHR依赖的IL-22产生和分泌,进而发挥保护肠道的作用。为了检测植物乳杆菌KLDS1.0386是否在体内降解色氨酸产生IAA,通过ELISA测定了小鼠肝脏、血清和结肠组织中IAA的含量。
如图9所示,DSS组小鼠肝脏中的IAA含量显著低于对照组(P<0.05),与模型组相比,色氨酸组、KLDS1.0386组和混合组均不同程度的增加肝脏中IAA水平,其中混合组可显著上调肝脏中IAA水平(P<0.05)。
通过对小鼠血清中IAA的测定发现,对照组、模型组、色氨酸组和KLDS1.0386组血清中的IAA水平无显著性差异(P>0.05),但混合组血清中的IAA水平显著高于其它组(P<0.05)。
与对照组相比,模型组小鼠结肠组织中IAA水平显著下调(P<0.05),与模型组相比,色氨酸组、KLDS1.0386组以及混合组均不同程度上调小鼠结肠组织中的IAA水平,其中色氨酸组、KLDS1.0386组与对照组相比没有明显差异(P>0.05),而混合组显著高于正常组(P<0.05)。由此可知,KLDS1.0386和色氨酸混合干预能够显著增加小鼠肝脏、血清和结肠组织中IAA水平。
2.3.10结肠AHR信号通路相关基因表达水平变化
很多研究表明色氨酸微生物代谢产物可能通过AHR信号通路来缓解结肠炎症状,因此通过RT-PCR检测色氨酸联合KLDS1.0386对DSS诱导结肠炎小鼠结肠组织中AHR通路中相关基因表达水平的影响,如图10所示,与对照组相比,模型组小鼠结肠组织中AHR基因的相对表达量显著降低(P<0.05);与模型组相比较,KLDS1.0386组未能上调AHR基因的相对表达量,显著低于模型组(P<0.05)。而色氨酸组和混合组显著上调AHR基因的表达量(P<0.05),其中混合组显著高于色氨酸组(P<0.05);结果表明KLDS1.0386和色氨酸混合组能够激活AHR通路增加AHR的表达。
与对照组相比,模型组小鼠结肠组织中STAT3基因表达量显著降低(P<0.05),色氨酸组和KLDS1.0386组与模型组相比无显著性差异(P>0.05),而混合组可显著上调结肠组织中STAT3的表达量,且与正常组相比差异不显著(P>0.05)。
与对照组相比,模型组中REG3γ显著降低(P<0.05),色氨酸组与模型组相比略有升高但无显著性差异(P>0.05),KLDS1.0386组未能上调结肠组织中REG3γ的基因表达量,而与模型组相比,混合组小鼠结肠组织中的REG3γ基因表达量显著上调(P<0.05)。
通过ELISA进一步分析不同处理组小鼠血清中IL-22的含量,如图10(D)所示,模型组中IL-22含量显著高于正常组(P<0.05),与模型组相比,色氨酸组和KLDS1.0386组无显著性差异(P>0.05),而混合组可显著上调小鼠血清中IL-22含量(P<0.05)。
综上,可以得出乳酸菌KLDS1.0386和色氨酸混合组的干预可以激活AHR并诱导IL-22/STAT3通路,增加IL-22和STAT3的表达,进而诱导抗菌肽REG3γ的表达,促进组织修复与再生,从而发挥保护肠道粘膜的作用。
2.3.11肠道微生物结构的变化
2.3.11.1肠道微生物多样性分析
Alpha多样性能够反映出样品中物种丰度、多样性以及测序深度,本研究采用Shannon、Simpson、Chao1和observed species指数来衡量样品的Alpha多样性,其中Shannon和Simpson指数用于表征群落的多样性,observed species和Chao1指数用于衡量肠道菌群的丰富度。由表8可知,五组间的shannon指数无显著性差异(P>0.05);Simpson指数越大,微生物的多样性就越小,与对照组相比,模型组simpson指数显著升高(P<0.05),说明模型组小鼠肠道菌群多样性显著降低,而与模型组相比,色氨酸、KLDS1.0386、和混合组的simpson指数略微下降但无显著性差异(P>0.05),其中混合组的肠道菌群多样性相对于色氨酸组和KLDS1.0386组较高,这说明混合组可一定程度上增加肠炎小鼠的肠道菌群多样性;与对照组相比,模型组的Observed species和chao1指数差异不显著(P>0.05),而色氨酸组和混合组的Observed species指数与模型组相比显著升高(P<0.05)。此外,与其它四组相比,混合组能够显著升高chao1指数(P<0.05),以上结果可以看出混合组干预比单独使用色氨酸、KLDS1.0386相比更能显著增加肠道微生物的多样性。如图11A所示,对照组、模型组、色氨酸组、KLDS1.0386组和混合组共享366个OTU,这表明各组中存在着强大的核心微生物群;其中不同的组还具有独特的分类群,对照组特有48个OTU,模型组特有31个OTU,色氨酸组特有38个OTU,KLDS1.0386组特有56个OTU,混合组特有56个OTU。说明不同处理组小鼠的肠道微生物结构具有一定的差异。
Beta多样性是衡量不同样本之间的差别度量,可以体现出不同样本间肠道微生物组成的差异性,本研究通过非加权UniFrac来计算Beta多样性。各组间的Beta差异如图11B所示,对照组和其它四组的距离较大,说明DSS对小鼠肠道菌群结构具有重要的影响,而色氨酸组、KLDS1.0386组和模型组三组先聚类在一起,再与混合组聚类。以上研究结果表明混合组可以修复DSS破坏的肠道微生物结构。
表8各组样品Alpha多样性指数
2.3.11.2肠道微生物结构在门水平上的差异
在门水平上,小鼠肠道菌群组成,其中拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、变形菌门(Proteobacteria)是小鼠肠道中的主要菌群。与对照组相比,DSS组小鼠肠道中厚壁菌门和变形菌门的相对丰度分别从53.59%和0.55%增加到57.41%和11.65%,而拟杆菌门从42.70%下降到19.52%。而与模型组相比,色氨酸组、KLDS1.0386组、和混合组均可降低小鼠肠道中的变形菌门,色氨酸组未能降低厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度,而KLDS1.0386组和混合组的厚壁菌门分别降低到55.69%和48.12%,拟杆菌门的相对丰度分别增加至27.14%和31.73%;此外,其它干预组与模型组相比也增加了疣微菌门的相对丰度。由此可知,混合组改善DSS破坏的小鼠肠道微生物组成效果最为显著。
3.3.11.3肠道微生物结构在属水平上的差异
基于门水平的分析,在属水平上肠道菌群的分布,与对照组相比,模型组小鼠肠道中大肠杆菌志贺菌属(Escherichia-Shigella)、另枝菌属(Alistipes)、螺杆菌属(Helicobacter)的丰度升高,而这些菌属的丰度在色氨酸组、KLDS1.0386组和混合组中都有不同程度的降低;模型组小鼠肠道中阿克曼氏菌属(Akkermansia)的相对丰度与对照组相比略微升高,而与模型组相比,色氨酸组、KLDS1.0386组和混合组都显著增加了肠炎小鼠肠道中阿克曼氏菌属的相对丰度;而相比于对照组,模型组小鼠肠道中普雷沃氏菌属UCG-001(Prevotellaceae UCG-001)的相对丰度明显降低,而这些菌属的丰度在色氨酸组、KLDS1.0386组和混合组中都有不同程度的增加;此外,与模型组相比,KLDS1.0386组和混合组还显著升高了Muribaculaceae的相对丰度,其中混合组对其增加的丰度最明显。与对照组相比,模型组中毛螺旋菌科NK4A136菌属(Lachnospiraceae NK4A136 group)的相对丰度显著升高,只有混合组显著降低了其相对丰度,由此可知,色氨酸与KLDS1.0386混合干预更能有效逆转属水平上微生物结构的变化。
2.3.11.4肠道菌群Lefse分析
基于色氨酸和KLDS1.0386混合干预对肠道菌群的研究结果,通过LEfSe软件分析模型组和混合组小鼠肠道中的标志微生物。相比于混合组,模型组中Romboutsia、ASF356、Helicobacter、LachnospiraceaeUCG-006、Alistipes、RuminococcaceaeUCG-009菌属的丰度显著增加(P<0.05);而混合组促进了Stenotrophomonas、Solibacillus、Gemmobacter、Ruminococcaceae UCG-014、Staphylococcus菌属的丰度(P<0.05),这与前文所述的属水平上的差异一致。
3.2.12肠道屏障相关基因与肠道菌群Spearman相关性分析
为了研究肠道微生物在肠道屏障中的作用,本研究对肠道微生物与肠道屏障相关基因的相关性进行分析。Muribaculaceae与Claudin-1、ZO-1、MUC1和MUC2呈显著正相关;Lactobacillus与Occludin呈显著负相关;Lachnospiraceae NK4A136 group与ZO-1、MUC1和MUC2呈显著负相关;Romboutsia、ASF356、Escherichia-Shigella和Oscillibacter都与Claudin-1、ZO-1、MUC1和MUC2呈显著负相关;Ruminococcaceae UCG-014与Occludin呈显著正相关;Akkermansia与Occludin呈显著正相关,而Alistipes与Occludin呈显著负相关。以上结果表明肠道微生物与肠道屏障之间具有一定的相关性。
实施例2
本实施例与实施例1的区别仅在于:每108CFU/mL的植物乳杆菌菌悬液0.2mL中含有0.2mg色氨酸。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)KLDS1.0386与色氨酸的混合物在制备预防结肠炎的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,所述混合物的量为:每0.2mL植物乳杆菌KLDS1.0386的菌悬液中含有0.2-2mg色氨酸;所述植物乳杆菌KLDS1.0386的菌悬液的浓度为108-109CFU/mL。
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