CN111560325B - 一株能够调节肠道紧密连接蛋白的发酵乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株能够调节肠道紧密连接蛋白的发酵乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明提供的发酵乳杆菌CCFM1058可以有效提高肠道粘膜的屏障功能，增加紧密连接蛋白Claudin‑1的表达(与结肠炎组相比，发酵乳杆菌CCFM1058将Claudin‑1蛋白基因表达水平提高了近两倍)，修复结肠黏膜损伤。发酵乳杆菌CCFM1058提高紧密连接蛋白Claudin‑1的水平要显著好于模式菌株发酵乳杆菌株CECT5716。因此，本发明所述具有调节紧密连接蛋白Claudin‑1保护肠粘膜屏障的发酵乳杆菌株在食品和微生态制剂方向具有广泛的应用前景。

Description

一株能够调节肠道紧密连接蛋白的发酵乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株能够调节肠道紧密连接蛋白的发酵乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
粘膜屏障是肠道最重要的一道屏障，它由完整的肠上皮细胞和相邻肠上皮细胞之间的连接构成，具有选择性通透作用并调控着水和溶质的跨上皮转运(如单糖、氨基酸、维生素和激素等)。肠道粘膜上皮细胞、内皮细胞间存在的各种连接结构，是肠道粘膜屏障功能的结构基础。细胞间的连接方式有紧密连接、缝隙连接、黏附连接以及桥粒等，而紧密连接是细胞间最重要的连接方式。紧密连接功能及结构的紊乱是很多肠道疾病共同的病理生理学特点，如小肠粘膜损伤，肠应激综合征和炎症性肠病等。紧密连接蛋白Claudin-1作为紧密连接家族代表性成员，在上皮屏障功能中发挥着重要作用。例如，有研究者显示，Claudin-1蛋白在便秘型肠易激综合征患者回肠末端黏膜和结肠黏膜中表达显著升高并且其在溃疡性结肠炎中与炎症活动呈正相关。此外，紧密连接蛋白Claudin-1与胃疾病、胆管、胰腺疾病、食管疾病以及肝脏疾病均存在一定的相关性，参与细胞的凋亡和增殖，促进肿瘤组织的生长发育。由此，改善肠道粘膜屏障功能、恢复肠道粘膜紧密连接蛋白Claudin-1对肠道机械屏障损伤具有重要的意义。
目前，一些专利涉及可以调节紧密连接蛋白Claudin-1改善肠道屏障恢复肠粘膜损伤。例如专利CN107412272A提供了一株植物乳杆菌Sc52，可以缓解由LPS刺激引起的肠道通透性增加并且提高回肠中紧密连接蛋白Claudin-1的表达水平。专利CN105795111A提供了一种包含唾液乳杆菌和鼠李糖乳杆菌微生态饲料添加剂，能降低肠道的通透性，增加Claudin-1的表达。专利CN105641015A涉及淫羊藿总黄酮可以促进肠道紧密连接蛋白Claudin-1的表达，调节衰老肠道屏障功能障碍。
发酵乳杆菌是一种革兰氏阳性细菌，属于乳杆菌属。它已于2009年通过欧洲食品安全局的GRAS(一般认为安全的物质)认证，并且在2011年被列入我国《可食用菌种名单》。根据伯杰氏手册描述，发酵乳杆菌在乳制品、发酵蔬菜和肉制品、动物肠道以及人体口腔和肠道中普遍存在。越来越多的研究表明，发酵乳杆菌在肠道生理调节方面发挥重要的作用。目前没有涉及发酵乳杆菌通过调节紧密连接蛋白缓解肠道屏障损伤的专利。有研究表明，发酵乳杆菌具有调节紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的水平降低肠道通透性缓解肠道粘膜损伤的潜质。2016年发表文章表示发酵乳杆菌Suo可以缓解化学导致胃损伤并且可以提高胃组织Occludin的表达水平达到胃损伤组的1.73倍(Nutrients，2016，8(3)，155)。2018年发表的一篇文章表明发酵乳杆菌明星菌株CECT5716可以提高肠道Occludin和ZO-1的水平来保护肠道粘膜损伤(Molecular nutrition&food research，2018，62(19)，1800298)。但是到目前为止，还没有发酵乳杆菌可以调节紧密连接蛋白Claudin-1的报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1058，该菌株已于2019年05月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No.60672。
本发明还提供了含有上述发酵乳杆菌CCFM1058的微生物制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物制剂中，发酵乳杆菌CCFM1058的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
本发明还提供了一种调节紧密连接蛋白Claudin-1的产品，所述产品中含有上述发酵乳杆菌CCFM1058或上述微生物制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，发酵乳杆菌CCFM1058的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中包括食品、药物或保健品。
在本发明的一种实施方式中，所述食品包括发酵果蔬、发酵乳、乳酪、含乳饮料、乳粉或其他含有上述发酵乳杆菌的食品。
本发明还提供了上述发酵乳杆菌CCFM1058或上述微生物制剂在制备改善肠道健康的药物中的应用。
本发明还提供了上述发酵乳杆菌CCFM1058或上述微生物制剂在制备益生菌食品中的应用。
本发明还提供了上述发酵乳杆菌CCFM1058或上述微生物制剂在制备益生菌保健品中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供的发酵乳杆菌CCFM1058可以有效提高肠道粘膜的屏障功能，增加紧密连接蛋白Claudin-1的表达(与结肠炎组相比，发酵乳杆菌CCFM1058将Claudin-1蛋白基因表达水平提高了近两倍)，修复结肠黏膜损伤。并且发酵乳杆菌CCFM1058提高紧密连接蛋白Claudin-1的水平要显著好于模式菌株发酵乳杆菌株CECT5716。因此，本发明所述具有调节紧密连接蛋白Claudin-1保护肠粘膜屏障的发酵乳杆菌株在食品和微生态制剂方向具有广泛的应用前景。
生物材料保藏
一种发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1058，该菌株已于2019年05月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No.60672。
附图说明
图1：发酵乳杆菌对结肠炎小鼠DAI的影响(与DSS组对比，###表示P<0.001，##表示P<0.01，#表示P<0.05)。
图2：小鼠结肠组织形态学观察(A：正常组；B：DSS组；C：发酵乳杆菌FWXBH115组；D：发酵乳杆菌FGDLZR121组；E：发酵乳杆菌CCFM1058组；F：发酵乳杆菌CECT5716)。
图3：发酵乳杆菌对结肠紧密连接蛋白Claudin-1的mRNA表达的影响(数据分析采用单因素方差分析，与正常组相比，*表示P<0.05，***表示P<0.001；与DSS组相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01，###表示P<0.001)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS液体培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖20g/L，无水乙酸钠2g/L，柠檬酸氢二胺2g/L，K2HPO4·3H2O 2.6g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，MnSO4·H2O0.25g/L，吐温-80 1g/L，蒸馏水1000g/L。
MRS固体培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖20g/L，无水乙酸钠2g/L、柠檬酸氢二胺2g/L，K2HPO4·3H2O 2.6g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，MnSO4·H2O0.25g/L，吐温-80 1g/L，琼脂20g/L，蒸馏水1000g/L。
LFMATA固体培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖20g/L，乙酸钠2g/L，柠檬酸二铵2g/L，K2HPO4·3H2O 2.6g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，MnSO4·H2O 0.25g/L，万古霉素20×10-3g/L，链霉素0.256×10-3g/L，庆大霉素6.4×10-6g/L，L-半胱氨酸0.5g/L，吐温80 1g/L，水1000g/L，最终pH值调节到5.0±0.1。
实施例1：发酵乳杆菌CCFM1058的分离筛选
1、样品采集
采集新疆省昌吉军户农场人群肠道内容物，样本置于装有30％甘油的大便管中，保存于装有冰袋的保温盒中，带回实验室后迅速置于-80℃冰箱待分离筛选。
2、乳酸菌的分离纯化
(1)稀释涂布：取0.5g左右的保存于30％甘油的内容物在无菌环境下加入装有4.5mL生理盐水的10mL离心管中，得到10-1稀释液，重复上述稀释步骤，依次得到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释液；
(2)涂布培养：分别吸取100μL上述10-4、10-5、10-6三个梯度稀释液于人体肠道中分离筛选发酵乳杆菌培养基LFMATA固体培养基上，用涂布棒涂布均匀，至37℃厌氧条件下培养48h，得到稀释涂布平板；
(3)一级纯化培养：取菌落数在30～300区间的稀释涂布平板，每个样本随机挑选10个乳白色或白色，表面光滑，边缘整齐，大小不一的单菌落在MRS固体培养基上划线，放至37℃厌氧条件下培养48h，得到单菌落；
(4)二级纯化培养：取步骤(3)划线平板上单菌落接种于MRS液体培养基中，至37℃厌氧条件下培养20h，得到二级纯化培养液。
3、菌种保藏与鉴定
(1)菌种保藏：
将上述二级纯化培养液混匀，取菌体(培养16-20h)至2mL干净的菌种保藏管，平行5份，其中4份加入750μL菌液和750μL 60％甘油重悬，静止30分钟后放入-80℃冰箱；1份加入1mL菌液用于菌种鉴定，6000r/min离心3min，弃上清得菌体。
(2)菌种鉴定：
步骤(1)用于菌种鉴定的保藏管中加入1mL无菌水吹打洗菌体后，10000r/min离心1min，弃上清得菌体，加入500μL无菌水重悬，作为菌液模板；
其中，16S rDNA PCR的体系和引物分别见表1和表2；
16S rDNA PCR的条件：第一步：94℃，5min第二步：94℃，30s第三步：55℃，30s，第四步：72℃，2min，第五步：72℃，10min，第二到四步进行30个循环。
表1细菌菌种鉴定25μL 16S rDNA PCR反应体系
组分 加量(μL)
27F 0.25
1492R 0.25
Taq酶Mix 12.5
模板 1
双蒸水 11
表2引物名称
Figure GDA0002566310080000041
Figure GDA0002566310080000051
PCR产物经核酸电泳分析确认后，送华大基因测序；将测序返回的27F和1492R拼接序列上传到NCBI的BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)进行种属确认；比对结果发现编号为CCFM1058、FWXBH115和FGDLZR121的菌株为发酵乳杆菌株(发酵乳杆菌CCFM1058的曾用编号为FXJCJ61)；其中，发酵乳杆菌CCFM1058、FWXBH115和FGDLZR121的16S DNA扩增序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。
实施例2：发酵乳杆菌CCFM1058对紧密连接蛋白Claudin-1的调节作用
1、发酵乳杆菌CCFM1058灌胃液的制备
将实施例1获得的发酵乳杆菌CCFM1058的二级纯化培养液以2％～5％(v/v)的接种量接种于MRS固体培养基中，37℃厌氧条件下培养36-48h，得到单菌落；挑取MRS固体培养基上的单菌落接种于MRS培养基中，37℃厌氧条件下富集培养16～18h进行活化，连续活化两代，得到活化培养物；将活化培养物按2％～5％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧条件下富集培养16～18h得到菌液，经6000g离心10min得到菌泥，用无菌生理盐水洗涤3次后收集菌泥，将收集得到的上述菌泥用30％无菌甘油溶液重悬得到发酵乳杆菌CCFM1058悬浮液，用作工作发酵剂，放置于-20％保藏。实验之前取发酵乳杆菌CCFM1058悬浮液离心，用0.85％(0.85g/100mL)无菌生理盐水洗涤重悬至浓度为1×109CFU/mL，得到发酵乳杆菌CCFM1058灌胃液。
参照同样的方法获得发酵乳杆菌FWXBH115灌胃液、发酵乳杆菌FGDLZR121灌胃液和发酵乳杆菌CECT5716灌胃液(发酵乳杆菌CECT5716为模式菌株，其16S DNA序列如SEQIDNO.6所示)。
2、实验动物
SPF级8周龄雄性BALB/C小鼠，购于上海斯莱克有限公司；饲养于25±2℃、相对湿50±5％、12h光照12h黑暗的标准化实验室中，适应性喂养一周后开始实验。
3、实验方法
48只小鼠随机分为6组，每组8只，分别为正常组，DSS(造模)组，FWXBH115(发酵乳杆菌)组，FGDLZR121(发酵乳杆菌)组，CCFM1058(发酵乳杆菌)组和CECT5716(发酵乳杆菌)组；整个实验周期为10天，正常组饮用灭菌水并且每天灌胃0.85％的生理盐水作为安慰剂，DSS组自由饮用含40g/LDSS的水并且每天灌胃0.85％的生理盐水，其他四组干预组自由饮用含40g/LDSS的水并且每天灌胃步骤1制得的灌胃液，灌胃剂量均为100μL/只BALB/C小鼠。
从实验第一天起记录每只小鼠的体重以及血便和腹泻情况；第九天收集小鼠粪便置于2mL离心管中，置-80℃冰箱存放；实验结束后，所有小鼠禁食不禁水24h；禁食24h后对小鼠进行处死；取部分小鼠结肠组织置于10％福尔马林溶液中用于组织切片观察，剩下的结肠分段置于2mL离心管中置于-80℃冰箱。
4、小鼠体重、疾病活动指数(DAI)指标和结肠长度变化
DSS诱导小鼠结肠炎会导致小鼠体重下降，疾病活动指数(DAI)上升和结肠缩短，因此，体重、DAI和结肠长度是评价结肠炎小鼠炎症严重程度的重要指标。
体重变化如表3所示，第十天，DSS组小鼠体重下降为实验第一天的84.01％，与正常组相比，体重显著(p<0.05)降低；与DSS组相比，发酵乳杆菌CCFM1058组和发酵乳杆菌CECT5716组均显著增加了小鼠体重，分别为实验第一天的91.65％和91.69％。
表4是DAI的三个评分指标，DAI＝体重下降分数+大便性状分数+便血分数；根据实验第一天到第十天的评分结果，绘制了DAI变化曲线。DAI变化如图1所示，与DSS组相比，发酵乳杆菌CCFM1058组和发酵乳杆菌CECT5716组小鼠的疾病活动指数上升趋势明显要小。
结肠长度变化如表5所示，正常组小鼠的结肠长度最长，其他组小鼠的结肠长度都有不同程度的下降；与DSS组(结肠长度为6.48cm)相比，发酵乳杆菌CCFM1058组和发酵乳杆菌CECT5716组小鼠的结肠长度明显提高，分别为7.6cm和7.56cm.
以上研究结果表明，发酵乳杆菌CCFM1058能明显缓解DSS结肠炎小鼠体重下降，疾病活动指数上升和结肠缩短。
表3第十天小鼠体重变化
Figure GDA0002566310080000061
注：字母不同表示组间差异显著(p<0.05)，适用于所有表格，下面表格不再另行说明。
表4 DAI评分标准
Figure GDA0002566310080000062
Figure GDA0002566310080000071
表5发酵乳杆菌对结肠炎小鼠结肠长度的影响
Figure GDA0002566310080000072
5、小鼠结肠组织切片观察
取HE染色的结肠组织切片，在光学显微镜下观察组织形态变化。结肠组织切片观察结果如图2所示，正常组小鼠结肠粘膜上皮细胞完整，隐窝正常，腺体排列整齐有序，且无溃疡存在；与正常组相比，DSS组小鼠则出现了严重的结肠损伤和急性结肠炎症状，伴随溃疡，隐窝破坏，以及严重的炎性；给小鼠灌胃发酵乳杆菌CCFM1058后，结肠粘膜未出现明显糜烂，而且隐窝完整，腺体排列整齐，杯状细胞完整，与正常组结肠组织形态接近。以上实验结果表明，发酵乳杆菌CCFM1058能够很好地保护结肠粘膜的完整性，减少炎症对结肠的损伤。
6、小鼠结肠紧密连接蛋白表达水平检测
Claudin-1和内参基因β-actin的扩增引物如表6所示，Claudin-1的mRNA表达水平以相对于正常组表达水平显示。
小鼠结肠紧密连接蛋白表达水平检测如图3所示，DSS组小鼠的肠道紧密连接蛋白Claudin-1表达水平显著下降，说明，DSS造成小鼠肠道屏障的破坏；与DSS组相比，CCFM1058组和CECT5716组小鼠的肠道紧密连接蛋白Claudin-1表达水平显著提升，其中，发酵乳杆菌CCFM1058组小鼠的肠道紧密连接蛋白Claudin-1表达水平提升最明显，从0.48提升到了1.33，明显高于发酵乳杆菌CECT5716，这说明，在紧密连接蛋白调节方面，发酵乳杆菌CCFM1058较发酵乳杆菌CECT5716具有明显的优势。综上所述，发酵乳杆菌CCFM1058可以显著提高结肠炎小鼠结肠紧密连接蛋白Claudin-1的水平从而保护肠粘膜屏障。
表6 RT-PCR引物序列
Figure GDA0002566310080000073
Figure GDA0002566310080000081
实施例3：发酵乳杆菌CCFM1058的应用
发酵乳杆菌CCFM1058可用于制备牛乳，牛乳的具体制备过程如下：
(1)将实施例1获得的发酵乳杆菌CCFM1058的二级纯化培养液以3％(v/v)的接种量接种到培养基中，在温度37℃下培养18h，得到菌液；将菌液离心，得到菌泥；将菌泥用pH7.2的磷酸盐缓冲液清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到悬浮液；将悬浮液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到发酵剂；
其中，培养基的制备方法为：使用以培养基总重量计87.7％的水将10％酶水解脱脂乳、0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨与0.3％酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6.8，得到培养基；
保护剂的成分包含：100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖、10g/L L-谷氨酸钠；
(2)将脱脂奶在95℃热杀菌20min后冷却至4℃，得到原料；在原料中添加步骤(1)制得的发酵剂至浓度为不低于1×106CFU/mL，得到牛乳(牛乳需在4℃下冷藏保存)。
实施例4：发酵乳杆菌CCFM1058的应用
发酵乳杆菌CCFM1058可用于制备豆奶，豆奶的具体制备过程如下：
(1)将实施例1获得的发酵乳杆菌CCFM1058的二级纯化培养液以3％(v/v)的接种量接种到培养基中，在温度37℃下培养18h，得到菌液；将菌液离心，得到菌泥；将菌泥用pH7.2的磷酸盐缓冲液清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到悬浮液；将悬浮液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到发酵剂；
其中，培养基的制备方法为：使用以培养基总重量计87.7％的水将10％酶水解脱脂乳、0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨与0.3％酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6.8，得到培养基；
保护剂的成分包含：100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖、10g/L L-谷氨酸钠；
(2)将大豆在温度80℃下浸泡2h后去除大豆皮，得到去皮大豆；将去皮大豆沥去浸泡水后加沸水磨浆，得到豆浆；将豆浆在高于80℃的温度条件下保温12min，得到熟豆浆；将熟豆浆用150目筛网过滤后离心分离，得到粗豆奶；将粗豆奶加热到温度140～150℃后迅速导入真空冷却室进行抽真空，使得粗豆奶中的异味物质随着水蒸汽迅速排出，得到熟豆奶；将熟豆奶降温至约37℃后在熟豆奶中添加步骤(1)制得的发酵剂至浓度为不低于1×106CFU/mL，得到豆奶(豆奶需在4℃下冷藏保存)。
实施例5：发酵乳杆菌CCFM1058的应用
发酵乳杆菌CCFM1058可用于制备蔬菜饮料，蔬菜饮料的具体制备过程如下：
(1)将实施例1获得的发酵乳杆菌CCFM1058的二级纯化培养液以3％(v/v)的接种量接种到培养基中，在温度37℃下培养18h，得到菌液；将菌液离心，得到菌泥；将菌泥用pH7.2的磷酸盐缓冲液清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到悬浮液；将悬浮液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到发酵剂；
其中，培养基的制备方法为：使用以培养基总重量计87.7％的水将10％酶水解脱脂乳、0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨与0.3％酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6.8，得到培养基；
保护剂的成分包含：100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖、10g/L L-谷氨酸钠；
(2)将新鲜蔬菜洗净后榨汁，得到蔬菜汁；将蔬菜汁在温度140℃下高温热杀菌2秒，得到杀菌后的蔬菜汁；将杀菌后的蔬菜汁降温至约37℃后在杀菌后的蔬菜汁中添加步骤(1)制得的发酵剂至浓度为不低于1×106CFU/mL，得到蔬菜饮料(蔬菜饮料需在4℃下冷藏保存)。
实施例6：发酵乳杆菌CCFM1058的应用
发酵乳杆菌CCFM1058可用于制备胶囊制品，胶囊制品的具体制备过程如下：
(1)将实施例1获得的发酵乳杆菌CCFM1058的二级纯化培养液以3％(v/v)的接种量接种到培养基中，在温度37℃下培养18h，得到菌液；将菌液离心，得到菌泥；将菌泥用pH7.2的磷酸盐缓冲液清洗2次后用脱脂乳重悬至浓度为2×1010CFU/mL，得到悬浮液；
(2)将步骤(1)制得的悬浮液添加至浓度为30g/L的海藻酸钠溶液中至浓度为2×109CFU/mL后，充分搅拌，使得发酵乳杆菌CCFM1058的细胞均匀地分散于海藻酸钠溶液中，得到混合液；将混合液挤压到浓度为20g/L的氯化钙溶液中形成胶粒；待形成的胶粒静止固化30min后，过滤收集胶粒；将收集得到的胶粒进行冷冻干燥48h，得到粉剂；将粉剂装入到药用胶囊中，得到胶囊制品。
实施例7：发酵乳杆菌CCFM1058的应用
发酵乳杆菌CCFM1058可用于制备发酵乳，发酵乳的具体制备过程如下：
(1)将实施例1获得的发酵乳杆菌CCFM1058的二级纯化培养液以3％(v/v)的接种量接种到培养基中，在温度37℃下培养18h，得到菌液；将菌液离心，得到菌泥；将菌泥用pH7.2的磷酸盐缓冲液清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到悬浮液；将悬浮液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到冻干粉；
其中，培养基的制备方法为：使用以培养基总重量计87.7％的水将10％酶水解脱脂乳、0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨与0.3％酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6.8，得到培养基；
保护剂的成分包含：100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖、10g/L L-谷氨酸钠；
(2)将冻干粉与商业干粉发酵剂保加利亚乳杆菌和商业干粉发酵剂嗜热链球菌按照质量比1:1:1的比例混合，得到发酵剂；
(3)将糖添加至鲜奶中至浓度为50g/L，得到混合液；将混合液在65℃、20MPa的条件下进行均质后在95℃下保温杀菌5min，得到发酵原料；将发酵原料降温至35℃后以0.03％(v/v)的接种量将步骤(2)制得的发酵剂接种至发酵原料中，于35℃下保温发酵16h，得到发酵乳；将发酵乳于42℃下放置4h进行凝乳后，在4℃下冷藏24h进行后熟，得到发酵乳成品。
实施例8：发酵乳杆菌CCFM1058的应用
发酵乳杆菌CCFM1058可用于制备片剂，片剂的具体制备过程如下：
(1)将实施例1获得的发酵乳杆菌CCFM1058的二级纯化培养液以3％(v/v)的接种量接种到培养基中，在温度37℃下培养18h，得到菌液；将菌液离心，得到菌泥；将菌泥用pH7.2的磷酸盐缓冲液清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到悬浮液；将悬浮液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到菌粉；
其中，培养基的制备方法为：使用以培养基总重量计87.7％的水将10％酶水解脱脂乳、0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨与0.3％酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6.8，得到培养基；
保护剂的成分包含：100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖、10g/L L-谷氨酸钠；
(2)称取步骤(1)制得的菌粉25.7重量份、淀粉55.0重量份、纤维素衍生物4.5重量份、羧甲基淀粉钠12.0重量份、滑石粉0.8重量份、蔗糖1.0重量份与水1.0重量份，得到原材料；将原材料混合，得到湿颗粒；将湿颗粒用中南制药机械厂的压片机进行压片后使用青州市益康中药机械有限公司的小型药物干燥机进行干燥，得到片剂。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一株能够调节肠道紧密连接蛋白的发酵乳杆菌及其应用
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagtttgat cctggcctca 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 1417
<212> DNA
<213> 发酵乳杆菌
<400> 3
gctggctcct aaaaggttac cccaccgact ttgggtgtta caaactctca tggtgtgacg 60
ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcggca tgctgatccg cgattactag 120
cgattccgac ttcgtgcagg cgagttgcag cctgcagtcc gaactgagaa cggttttaag 180
agatttgctt gccctcgcga gttcgcgact cgttgtaccg tccattgtag cacgtgtgta 240
gcccaggtca taaggggcat gatgatctga cgtcgtcccc accttcctcc ggtttgtcac 300
cggcagtctc actagagtgc ccaacttaat gctggcaact agtaacaagg gttgcgctcg 360
ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acgaccatgc accacctgtc 420
attgcgttcc cgaaggaaac gccctatctc tagggttggc gcaagatgtc aagacctggt 480
aaggttcttc gcgtagcttc gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt 540
caattccttt gagtttcaac cttgcggtcg tactccccag gcggagtgct taatgcgtta 600
gctccggcac tgaagggcgg aaaccctcca acacctagca ctcatcgttt acggcatgga 660
ctaccagggt atctaatcct gttcgctacc catgctttcg agtctcagcg tcagttgcag 720
accaggtagc cgccttcgcc actggtgttc ttccatatat ctacgcattc caccgctaca 780
catggagttc cactaccctc ttctgcactc aagttatcca gtttccgatg cacttctccg 840
gttaagccga aggctttcac atcagactta gaaaaccgcc tgcactctct ttacgcccaa 900
taaatccgga taacgcttgc cacctacgta ttaccgcggc tgctggcacg tagttagccg 960
tgactttctg gttaaatacc gtcaacgtat gaacagttac tctcatacgt gttcttcttt 1020
aacaacagag ctttacgagc cgaaaccctt cttcactcac gcggtgttgc tccatcaggc 1080
ttgcgcccat tgtggaagat tccctactgc tgcctcccgt aggagtatgg gccgtgtctc 1140
agtcccattg tggccgatca gtctctcaac tcggctatgc atcatcgcct tggtaggccg 1200
ttaccccacc aacaagctaa tgcaccgcag gtccatccag aagtgatagc gagaagccat 1260
cttttaagcg ttgttcatgc gaacaacgtt gttatgcggt attagcatct gtttccaaat 1320
gttgtccccc gcttctgggc aggttaccta cgtgttactc acccgtccgc cactcgttgg 1380
cgaccaaaat caatcaggtg caagcaccat caatcaa 1417
<210> 4
<211> 1437
<212> DNA
<213> 发酵乳杆菌
<400> 4
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ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcggca tgctgatccg cgattactag 120
cgattccgac ttcgtgcagg cgagttgcag cctgcagtcc gaactgagaa cggttttaag 180
agatttgctt gccctcgcga gttcgcgact cgttgtaccg tccattgtag cacgtgtgta 240
gcccaggtca taaggggcat gatgatctga cgtcgtcccc accttcctcc ggtttgtcac 300
cggcagtctc actagagtgc ccaacttaat gctggcaact agtaacaagg gttgcgctcg 360
ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acgaccatgc accacctgtc 420
attgcgttcc cgaaggaaac gccctatctc tagggttggc gcaagatgtc aagacctggt 480
aaggttcttc gcgtagcttc gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt 540
caattccttt gagtttcaac cttgcggtcg tactccccag gcggagtgct taatgcgtta 600
gctccggcac tgaagggcgg aaaccctcca acacctagca ctcatcgttt acggcatgga 660
ctaccagggt atctaatcct gttcgctacc catgctttcg agtctcagcg tcagttgcag 720
accaggtagc cgccttcgcc actggtgttc ttccatatat ctacgcattc caccgctaca 780
catggagttc cactaccctc ttctgcactc aagttatcca gtttccgatg cacttctccg 840
gttaagccga aggctttcac atcagactta gaaaaccgcc tgcactctct ttacgcccaa 900
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tgactttctg gttaaatacc gtcaacgtat gaacagttac tctcatacgt gttcttcttt 1020
aacaacagag ctttacgagc cgaaaccctt cttcactcac gcggtgttgc tccatcaggc 1080
ttgcgcccat tgtggaagat tccctactgc tgcctcccgt aggagtatgg gccgtgtctc 1140
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cgaccaaaat caatcaggtg caagcaccat caatcaattg ggccaacgcg ttcgact 1437
<210> 5
<211> 1439
<212> DNA
<213> 发酵乳杆菌
<400> 5
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ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcggca tgctgatccg cgattactag 120
cgattccgac ttcgtgcagg cgagttgcag cctgcagtcc gaactgagaa cggttttaag 180
agatttgctt gccctcgcga gttcgcgact cgttgtaccg tccattgtag cacgtgtgta 240
gcccaggtca taaggggcat gatgatctga cgtcgtcccc accttcctcc ggtttgtcac 300
cggcagtctc actagagtgc ccaacttaat gctggcaact agtaacaagg gttgcgctcg 360
ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acgaccatgc accacctgtc 420
attgcgttcc cgaaggaaac gccctatctc tagggttggc gcaagatgtc aagacctggt 480
aaggttcttc gcgtagcttc gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt 540
caattccttt gagtttcaac cttgcggtcg tactccccag gcggagtgct taatgcgtta 600
gctccggcac tgaagggcgg aaaccctcca acacctagca ctcatcgttt acggcatgga 660
ctaccagggt atctaatcct gttcgctacc catgctttcg agtctcagcg tcagttgcag 720
accaggtagc cgccttcgcc actggtgttc ttccatatat ctacgcattc caccgctaca 780
catggagttc cactaccctc ttctgcactc aagttatcca gtttccgatg cacttctccg 840
gttaagccga aggctttcac atcagactta gaaaaccgcc tgcactctct ttacgcccaa 900
taaatccgga taacgcttgc cacctacgta ttaccgcggc tgctggcacg tagttagccg 960
tgactttctg gttaaatacc gtcaacgtat gaacagttac tctcatacgt gttcttcttt 1020
aacaacagag ctttacgagc cgaaaccctt cttcactcac gcggtgttgc tccatcaggc 1080
ttgcgcccat tgtggaagat tccctactgc tgcctcccgt aggagtatgg gccgtgtctc 1140
agtcccattg tggccgatca gtctctcaac tcggctatgc atcatcgcct tggtaggccg 1200
ttaccccacc aacaagctaa tgcaccgcag gtccatccag aagtgatagc gagaagccat 1260
cttttaagcg ttgttcatgc gaacaacgct gttatgcggt attagcatct gtttccaaat 1320
gttgtccccc gcttctgggc aggttaccta cgtgttactc acccgtccgc cactcgttgg 1380
cgaccaaaat caatcaggtg caagcaccat caatcaattg ggccaacgcg ttcgactgc 1439
<210> 6
<211> 1437
<212> DNA
<213> 发酵乳杆菌
<400> 6
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cgggaagagc gaggtaatca taaagatcaa gacgtttaag gaaacgatca tcaccacgtt 120
aaggttttgc acccccagcg ccaagagaat gaagtaggga attaggtagt aaaaggccaa 180
ctggactaag gtcaccaccg agaccttagc gagcttgccg tactcctgac gcatcttcaa 240
gctctcctgg taaaaggagt caatccgctc gtctaagacc cgctgccagt tctggtaacg 300
gttctcttta acaaaccaac gcaccggcct taataagagg ttggtggccc gcttggtaaa 360
ggagtgccag tacatgacta agagcaaggc gacgatcacg ctcaggtgaa tgacaaagcc 420
aaagaccacc agcaaggaca gggcctggag cttggtggca atgtagtgaa agccaatcag 480
catgctgata atgaagttaa ttacgatcat cccctgaaag acgacgaact tcatcaagag 540
gaccgagctg gcccggccgc catcgacccc agcctggagc atcgccacta gttgggcggg 600
ttggcccccg gtggaaaagg gagtaatccc gttgaagagt tgttcgacca gcggcacccg 660
catggtgttt ttccagctaa agtccgggta acggtcggcc atgaagagct tggtaacgac 720
cccttccagc cccaggtaaa ggcaaataca taagacggcc acgctaaacc agccccagtt 780
gaggttggcg aggtcaatgc ttaactgatg taaatcggtg ttgcgcaacg aaaaggcgaa 840
gatgccggca ccggcaacga gcatcaagat caaaacgacc cagttttttc gcgacatcct 900
attccctccc cgtttgcgtt cgataaaagt ggtaccactc attagccagg tggtccttgg 960
agtagcgttg ggcggccgtt agtgactttt gctttaggtc agctagggcg accggatcct 1020
gggcaatccg cactagttct gcttgcattt ggtcgacgtc tttagccggt tggtagtagc 1080
cgccgatgat tgagtggtac aaatcgaggt cgcgcaacat gaccggggtc ccacacgaaa 1140
aggcttcaag taccgacatc gggaagagct cgttatagga aggcaataaa aataggtcgg 1200
cgatgttgtt taactcggca atctggtcgc gggtaacgat ccccgggaac aagaggttgg 1260
ccggcgggtt agcgacaacc ttcttgagct cttggtagcc atcggtgatc cggccaaagg 1320
aaaagccccc ggcccagatg aattgaaagt gggggttttg tttggctagt ttgatgaaat 1380
caaagacgcc cttccgttct tggatttgac cgctaccgac gaccgtgaag cgctcgg 1437
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
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<210> 8
<211> 20
<212> DNA
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<400> 8
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<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggctgtattc ccctccatcg 20
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ccagttggta acaatgccat gt 22

Claims (8)

1.一株发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CCFM1058，其特征在于，所述发酵乳杆菌已于2019年05月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60672。
2.含有权利要求1所述的发酵乳杆菌的微生物制剂。
3.如权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂中，发酵乳杆菌的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
4.一种调节紧密连接蛋白Claudin-1的产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1所述的发酵乳杆菌或权利要求2或3所述的微生物制剂，所述产品为食品或药物。
5.如权利要求4所述的产品，其特征在于，所述产品中，发酵乳杆菌的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
6.权利要求1所述的发酵乳杆菌或权利要求2或3所述的微生物制剂在制备改善肠道健康的药物中的应用。
7.权利要求1所述的发酵乳杆菌或权利要求2或3所述的微生物制剂在制备益生菌食品中的应用。
8.权利要求1所述的发酵乳杆菌或权利要求2或3所述的微生物制剂在制备益生菌保健品中的应用。
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