CN116064268A - 乳酸菌菌株的培养物及其用于抑制肠胃道病原菌生长以及促进肠道健康的用途 - Google Patents
乳酸菌菌株的培养物及其用于抑制肠胃道病原菌生长以及促进肠道健康的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种乳酸菌菌株的培养物及其用于抑制肠胃道病原菌生长以及促进肠道健康的用途。本发明揭示一种乳酸菌菌株的培养物。本发明亦揭示该培养物在抑制肠胃道病原菌生长以及促进肠道健康上的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种乳酸菌菌株的培养物。本发明亦涉及使用该乳酸菌菌株的培养物来抑制肠胃道病原菌(gastrointestinal pathogenic bacteria)的生长以及促进肠道健康(gut health)。
背景技术
肠胃道病原菌(gastrointestinal pathogenic bacteria)是一群存在于人类与动物的肠胃道、水以及腐败的食物中的细菌，常见的肠胃道病原菌包含有肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、李斯特单胞菌(Listeria monocytogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)以及肠炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus)。
肠胃道病原菌的感染与肠道黏膜[亦即，肠道上皮(intestinal epithelium)]的完整性以及功能之间有着密切的相关性，完整的肠道上皮所形成的屏障[亦即肠道上皮屏障(epithelial barrier)]能够隔绝肠胃道病原菌以及它们的分泌物的入侵，以维持肠道深层组织的无菌性。介于肠道上皮细胞之间的紧密连结(tight junctions,TJ)在肠道上皮屏障中扮演了重要的角色，它确保肠道上皮的不渗透性(impermeability)以阻隔肠胃道中共生菌(commesal bacteria)与病原菌的进入。然而，肠胃道病原菌在过度增生(overgrowth)时可通过调节TJ组成蛋白[例如，紧密连结蛋白claudins、occludins与连结黏附分子(junctional adhesion molecules,JAM)等]的表达以及伤害TJ组织来破坏屏障功能，进而入侵宿主并导致一系列肠胃道疾病，包括：大肠激躁症(irritable bowel syndrome)、肠胃炎(gastroenteritis)[例如，胃炎(gastritis)与肠炎(enteritis)]、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)、伤寒热(typhoid fever)以及菌血症(bacteremia)等。
目前大多使用抗生素来治疗肠胃道病原菌的感染，然而，抗生素会使得肠胃道病原菌产生抗生素耐性(antibiotic resistance)，并且会导致严重副作用(side effect)与不良反应(adverse effect)。因此，本领域的相关研究人员皆致力于开发可以有效地预防和/或治疗肠胃道病原菌感染并且不会产生非所欲的副作用的药物。
乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)属于一般被公认为安全的(generallyrecognized as safe,GRAS)并且为人所熟悉与广泛使用的益生菌(probiotics)。常见的乳酸菌包括：乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、小球菌属(Pediococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)以及明串珠菌属(Leuconostoc)等。
目前已有多种乳酸菌菌株被发现具有维持肠道上皮功能上的功效。例如，在R.Jariwalaetal.(2017),Microbiology(Reading,Engl.),163(9):1263–1272中，R.Jariwala等人测试了来自鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)、唾液乳杆菌(L.salivarius)以及植物乳杆菌(L.plantarum)的多个菌株在恢复肠道致病性大肠杆菌(EPEC)-诱发的肠道上皮屏障功能障碍[enteropathogenic E.coli(EPEC)-induced epithelial barrier dysfunction]上的功效，活体外(in vitro)实验结果显示，这些乳酸菌菌株皆能够有效地恢复经EPEC感染的人类结肠癌细胞系Caco-2细胞单层(monolayer)的不渗透性，特别地，鼠李糖乳杆菌GG(LGG)能够恢复不渗透性达约93.8％。此外，部分乳酸菌菌株亦能够显著地提升TJ组成蛋白的mRNA表达量，并且恢复TJ组成蛋白的正常分布。
另外，在M.Jungersen et al.(2014),Microorganisms.2(2):92–110中，M.Jungersen等人回顾了动物双歧杆菌乳亚种(B.animalis subsp.lactis)
对于人体已知的有益功效，包括抑制多种病原菌[包括大肠杆菌、李斯特单胞菌、肠道沙门氏菌鼠伤寒血清型(Salmonella enteric ser.Typhimurium)、仙人掌杆菌(Bacillus cereus)等]的生长、提升TJ强度与肠道上皮的屏障功能，以及诱导免疫细胞的抗发炎反应等。然而，综合多篇研究结果发现，动物双歧杆菌乳亚种
对于人体肠道细胞的吸附能力有限，而仅能短暂定殖(transiently colonize)于肠道内。
尽管乳酸菌具有上述益处，但是乳酸菌在口服后会容易遭受到胃酸与胆盐(bilesalt)的破坏并且可能不易吸附于肠道上，而导致其无法在肠道中发挥预期的功效。因此，本领域中仍然存在有需要去开发具有优异的胃酸与胆盐耐受性以及肠道吸附能力且能够有效地抑制肠胃道病原菌的生长而可促进肠道健康的乳酸菌以供产业界之用。
发明内容
在本发明中，申请人发现，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)BioF-115(CGMCC No.21684)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)BioF-126(CGMCCNo.21686)、动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)BioF-202(CGMCC No.21683)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BioF-208(CGMCC No.21682)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)BioF-224(CGMCC No.21685)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)BioF-278(CGMCC No.21687)以及长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)BioF-402(CGMCC No.21681)的混合培养物具有优异的胃酸与胆盐耐受性(gastric acid and bile salt tolerance)以及对人类肠道细胞的吸附能力，而能够有效地使这些乳酸菌菌体存活于人体消化道环境中，并到达肠道内来发挥其抗肠胃道病原菌以及促进肠道健康的效用。
于是，在第一个方面，本发明提供一种乳酸菌菌株的培养物，其通过将选自于下列的乳酸菌菌株组合培养于适于该乳酸菌菌株组合生长的培养基中而被制得：
包含有动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)BioF-202(CGMCC No.21683)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)BioF-224(CGMCC No.21685)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)BioF-278(CGMCC No.21687)以及长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)BioF-402(CGMCC No.21681)的乳酸菌菌株组合；以及
包含有鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)BioF-115(CGMCC No.21684)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)BioF-126(CGMCC No.21686)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BioF-208(CGMCC No.21682)、乳酸乳球菌BioF-224以及嗜热链球菌BioF-278的乳酸菌菌株组合。
较佳地，该乳酸菌菌株组合包含有鼠李糖乳杆菌BioF-115、副干酪乳杆菌BioF-126、动物双歧杆菌乳亚种BioF-202、植物乳杆菌BioF-208、乳酸乳球菌BioF-224、嗜热链球菌BioF-278，以及长双歧杆菌婴儿亚种BioF-402。
较佳地，该鼠李糖乳杆菌BioF-115、副干酪乳杆菌BioF-126、动物双歧杆菌乳亚种BioF-202、植物乳杆菌BioF-208、乳酸乳球菌BioF-224、嗜热链球菌BioF-278，以及长双歧杆菌婴儿亚种BioF-402以1：1：1：1：1：1：1的菌数比来进行培养。
在第二个方面，本发明提供一种如上所述的乳酸菌菌株的培养物供应用于制备用来抑制肠胃道病原菌生长的组合物的用途。
较佳地，该肠胃道病原菌选自于由下列所构成的群组：肠道沙门氏菌肠道亚种(Salmonella enterica subsp.enterica)、李斯特单胞菌(Listeria monocytogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肠炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、痢疾杆菌(Shigella boydii)、痢疾志贺杆菌(Shigelladysenteriae)、克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、小肠大肠炎耶氏杆菌(Yersinia enterocolitica)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)，以及它们的组合。
在第三个方面，本发明提供一种如上所述的乳酸菌菌株的培养物供应用于制备用来促进肠道健康的组合物的用途。
较佳地，该肠道健康的促进包括下列至少一者：抑制肠胃道病原菌的生长、恢复健康的肠道菌相、促进肠道上皮的修复，以及维持肠道上皮的功能。
较佳地，该组合物是食品组合物或药学组合物。
更佳地，该药学组合物呈供非经肠道投药或口服投药的剂型。
附图说明
图1的A与图1的B分别显示动物双歧杆菌乳亚种BB-12培养物以及七菌混合培养物在胃酸与胆盐耐受性测试的第0至第7小时所测得的存活菌数(log CFU/mL)；
图2显示各组Caco-2细胞在与不同的乳酸菌菌株培养物进行共培养之后所测得的吸附于Caco-2细胞上的乳酸菌菌数；以及
图3显示各组Caco-2细胞被处理以不同的乳酸菌菌株培养物后所测得的CLDN1基因的相对mRNA表达水平，其中“****”表示当与七菌实验组作比较，p<0.0001。
具体实施方式
为了本说明书的目的，将被清楚地了解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限于”，以及文字“包括(comprises)”具有对应的意义。
除非另外有所定义，在本文中所使用的所有技术性与科学术语具有本领域技术人员所共同了解的意义。本领域技术人员会认知到许多与那些被描述于本文中者相似或等效的方法和材料，它们可被用于实施本发明。当然，本发明决不受到所描述的方法和材料的限制。
本发明提供一种乳酸菌菌株的培养物，其通过将选自于下列的乳酸菌菌株组合培养于适于该乳酸菌菌株组合生长的培养基中而被制得：
包含有动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)BioF-202(CGMCC No.21683)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)BioF-224(CGMCC No.21685)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)BioF-278(CGMCC No.21687)以及长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)BioF-402(CGMCC No.21681)的乳酸菌菌株组合；以及
包含有鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)BioF-115(CGMCC No.21684)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)BioF-126(CGMCC No.21686)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BioF-208(CGMCC No.21682)、乳酸乳球菌BioF-224以及嗜热链球菌BioF-278的乳酸菌菌株组合。
依据本发明，该乳酸菌菌株的培养物可通过将具有范围落在104至1012CFU/mL内的细菌浓度的这些乳酸菌菌株组合培养于适于生长的培养基中而被获得。在本发明的一个较佳具体例中，这些乳酸菌菌株具有范围落在105至1011CFU/mL内的细菌浓度。
如本文中所使用的，术语“培养(culturing)”、“发酵(fermentation)”以及“培育(cultivation)”可被交换地使用。
有关培养的操作过程与参数条件等落在本领域技术人员的专业素养与例行技术范畴内。在此方面，可以参考，例如，Hsieh P.S.et al.(2013),New Microbiol.,36:167-179。
依据本发明，适用于培养这些乳酸菌菌株组合的培养基可以是本领域技术人员自行配制的，或者是商业上可购得的产品，这包括，但不限于：MRS肉汤培养基(MRS broth)以及添加有半胱氨酸(cysteine)的MRS肉汤培养基。在本发明的一个较佳具体例中，适用于培养这些乳酸菌菌株组合的培养基是添加有半胱氨酸(BD Biociences,Difco)的MRS肉汤培养基(BD Biociences,Difco)。
较佳地，该乳酸菌菌株组合包含有动物双歧杆菌乳亚种BioF-202、乳酸乳球菌BioF-224、嗜热链球菌BioF-278以及长双歧杆菌婴儿亚种BioF-402，并且该乳酸菌菌株的培养物是通过将这些乳酸菌菌株以1：1：1：1的菌数比来进行培养而被制得的。
较佳地，该乳酸菌菌株组合包含有鼠李糖乳杆菌BioF-115、副干酪乳杆菌BioF-126、植物乳杆菌BioF-208、乳酸乳球菌BioF-224以及嗜热链球菌BioF-278，并且该乳酸菌菌株的培养物是通过将这些乳酸菌菌株以1：1：1：1：1的菌数比来进行培养而被制得的。
更佳地，该乳酸菌菌株组合包含有鼠李糖乳杆菌BioF-115、副干酪乳杆菌BioF-126、动物双歧杆菌乳亚种BioF-202、植物乳杆菌BioF-208、乳酸乳球菌BioF-224、嗜热链球菌BioF-278，以及长双歧杆菌婴儿亚种BioF-402。在本发明的一个较佳具体例中，该乳酸菌菌株的培养物是通过将这些乳酸菌菌株以1：1：1：1：1：1：1的菌数比来进行培养而被制得的。
依据本发明，该乳酸菌菌株的培养物可以是液态培养物，并且该液态培养物可进一步进行选自于下列的干燥处理而呈粉末状：冷冻-干燥(freeze-drying)、喷雾干燥(spray-drying)，以及流化床干燥(bed drying)。在本发明的一个较佳具体例中，该乳酸菌菌株的液态培养物被进一步进行冷冻-干燥而呈粉末状。
依据本发明，该液态培养物在进行该干燥处理前可先进行选自于由下列所构成的群组中的固液分离(solid-liquid separation)处理来收集菌体：离心[例如，多级离心(Multi-stage centrifugation)]、过滤、重力沉降(gravity settling)，以及它们的组合。
本发明亦提供一种如上所述的乳酸菌菌株的培养物供应用于制备用来抑制肠胃道病原菌(gastrointestinal pathogenic bacteria)生长的组合物的用途。
依据本发明，该肠胃道病原菌选自于由下列所构成的群组：肠道沙门氏菌肠道亚种(Salmonella enterica subsp.enterica)、李斯特单胞菌(Listeria monocytogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肠炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、痢疾杆菌(Shigella boydii)、痢疾志贺杆菌(Shigelladysenteriae)、克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、小肠大肠炎耶氏杆菌(Yersinia enterocolitica)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)，以及它们的组合。
本发明亦提供一种如上所述的乳酸菌菌株的培养物供应用于制备用来促进肠道健康的组合物的用途。
如本文中所使用的，术语“促进肠道健康(improving gut health)”意指摄取该组合物的个体表现出健康的肠道菌相，其有益于人类或动物的健康，并且适用于维持和/或改善该个体的消化(digestion)。这种健康的肠道菌相最终会有关于适当的营养吸收(nutrient absorption)、适当的生长、少绞痛(less colic)、少感染(less infection)、少腹泻(less diarrhea)，以及最佳的肠道健康。
依据本发明，该肠道健康的促进包括下列至少一者：抑制肠胃道病原菌的生长、恢复健康的肠道菌相、促进肠道上皮的修复(promoting intestinal epithelial repair)[或维持肠道上皮的完整性(maintaining the integrity of intestinal epithelium)]，以及维持肠道上皮的功能(maintaining the function of intestinal epithelium)。
依据本发明，该组合物可以是食品组合物(food composition)，例如，呈食品添加物(food additive)的形式，其可以被添加至可食性材料(edible material)中以制备供人类或动物食用的食品产品。依据本发明，该食物产品的种类可包括，但不限于：奶粉(milkpowder)、发酵乳(fermented milk)、优格(yogurt)、奶酪(butter)、饮料(beverages)(例如，茶、咖啡)、机能性饮料(functional beverages)、面制品(flour product)、烘焙食品(baked foods)、甜点(confectionery)、糖果(candies)、发酵食品(fermented foods)、动物饲料(animal feeds)、保健食品(health foods)、婴儿食品(infant food)，以及膳食补充品(dietary supplements)。
依据本发明，该组合物可以是药学组合物(pharmaceutical composition)。
依据本发明，该药学组合物可呈适合于非经肠道投药(parenteraladministration)或口服投药(oral administration)的剂型(dosage form)。
依据本发明，该药学组合物可进一步包含有被广泛地使用于药物制造技术的药学上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，该药学上可接受的载剂可包含一种或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、粘结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、稳定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome)以及类似物。有关这些试剂的选用与数量落在本领域技术人员的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明，该药学组合物可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成适合于非经肠道投药的剂型[包括注射品(injection)，例如，无菌的水性溶液(sterileaqueous solution)或分散液(dispersion)]，且以腹膜内注射(intraperitonealinjection)或舌下投药(sublingual administration)的途径来投药。较佳地，该药学组合物被制造成适于以舌下投药的剂型。
依据本发明，该药学组合物可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成适合于口服投药的剂型，这包括，但不限于：无菌的粉末、锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pellet)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)以及类似物。较佳地，该药学组合物被制造成胶囊剂型。
本发明亦提供一种用来抑制在个体中的肠胃道病原菌的生长的方法，其包括对该个体投予如上所述的组合物。
如本文中所使用的，术语“投予(administering)”以及“投药(administration)”可被交换地使用，并且意指通过任何合适的途径来对个体导入(introducing)、提供(providing)或递送(delivering)预定的活性成分以执行其预期的效用。
如本文中所使用的，术语“个体(subject)”意指任何感兴趣的哺乳类动物，诸如人(humans)、猴子(monkeys)、牛(cows)、绵羊(sheeps)、马(horses)、猪(pigs)、山羊(goats)、狗(dogs)、猫(cats)、小鼠(mice)以及大鼠(rats)。
依据本发明，该组合物的投药剂量与投药次数会视下列因素而变化：要被改善的疾病的严重性，投药途径，以及要被改善的个体的体重、年龄、身体状况与反应。一般而言，该组合物可呈单一剂量或是分成多个剂量的形式而被非经肠地道或口服地投药。
本发明将就下面的实施例来做进一步说明，但应了解的是，这些实施例仅供例示说明用，而不应被解释为本发明的实施上的限制。
＜实施例＞
一般实验材料：
1.乳酸菌菌株：
在下面实施例中所使用的7个乳酸菌菌株是申请人自行分离的并委托中国台湾的食品工业发展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center,BCRC)(300新竹市食品路331号，中国台湾)来进行菌种鉴定，并且已有依据布达佩斯条约(the BudapestTreaty)的规定被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center,CGMCC)。为表清楚，这些乳酸菌菌株的相关信息(包括：学名、分离来源、保藏编号以及保藏日期等)已被整合于下面表1中。
表1.各个乳酸菌菌株的相关信息
为供比较，下面的实施例中亦有使用下列已知具有促进肠道健康效用的乳酸菌菌株：购自科汉森股份有限公司(Chr.Hansen A/S,Denmark)的动物双歧杆菌乳亚种BB-12以及鼠李糖乳杆菌GG。
2.肠胃道病原菌菌株(gastrointestinal pathogenic bacteria strains)的来源与培养：
在下面实施例中所使用的肠胃道病原菌菌株皆购自于FIRDI的BCRC。为表清楚，各个肠胃道病原菌的学名以及保藏编号已被整合于下面表2中，而它们所适用的培养基与培养条件如下面表3所示。
表2.各个肠胃道病原菌菌株的相关信息
表3.各个肠胃道病原菌菌株的培养基与培养条件
3.乳酸菌菌株培养物的制备：
首先，将上面第1项当中所述的乳酸菌菌株分别接种至补充有0.05％半胱氨酸(cysteine)的MRS肉汤培养基(MRS broth)(Difco,Cat.No.288130)中，并在培养箱(37℃、5％CO2)中进行培养历时24小时，以活化这些乳酸菌菌株。接着，将经活化的菌株分别以2％(v/v)的接种量接种至MRS肉汤培养基中，并在培养箱(37℃、5％CO2)中进行继代培养(subculture)历时24小时。接着，将所得到的菌液以MRS肉汤培养基予以10倍序列稀释(serial dilution)，并通过使用MRS琼脂培养基的平板菌落计数法(plate countingmethod)来进行菌数计数之后，进行冷冻干燥处理，借此得到呈干燥粉末状的各个乳酸菌菌株的培养物(各自具有105至1011CFU/g的细菌浓度)，并储存于4℃下备用。
另外，申请人亦将上面第1项当中所述的鼠李糖乳杆菌BioF-115、副干酪乳杆菌BioF-126、动物双歧杆菌乳亚种BioF-202、植物乳杆菌BioF-208、乳酸乳球菌BioF-224、嗜热链球菌BioF-278以及长双歧杆菌婴儿亚种BioF-402以1：1：1：1：1：1：1的菌数比来予以混合而得到七菌组合。接着，依据上面所述的步骤而将该七菌组合制备成呈干燥粉末状的七菌混合培养物，并储存于4℃下备用。
在进行下面的实验之前，各个乳酸菌菌株培养物以及七菌混合培养物有预先被回溶于适当的培养基中，而各自具有1×109CFU/mL的细菌浓度。
4.人类结肠腺癌细胞系(human colon adenocarcinoma cell line)
Caco-2的来源与培养：
在下面实施例中所使用的人类结肠腺癌细胞系Caco-2购自于FIRDI的BCRC(BCRC60182)。Caco-2细胞被培养于含有杜贝可氏改良的依格氏培养基(Dulbecco’s Modi fiedEagle’s Medium,DMEM)[添加有10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)以及1％盘尼西林-链霉素(penicillin-streptomycin)]的10cm培养皿(Petri dish)中，并在培养条件被设定为37℃、5％CO2的培养箱中进行培养。之后，大约每隔2-3天更换新鲜的培养基。当细胞密度达到约80-90％汇聚(confluence)时，进行继代培养步骤如下：移除培养基并以磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,PBS)(pH 7.4)来清洗细胞，接着加入胰蛋白酶-EDTA(trypsin-EDTA)以使细胞自培养皿的底部脱离。之后，加入新鲜的培养基来中和胰蛋白酶的活性并以定量吸管(pipette)反复地吸冲培养基以充分打散细胞，然后将所形成的细胞悬浮液分配到新的培养皿中，并在培养条件被设定为37℃、5％CO2的培养箱中进行培养。
一般实验方法：
1.统计学分析(statistical analysis)：
在下面的实施例中，各组的实验被重复3次，所得到的实验数据以“平均值(mean)±标准偏差(standard deviation,SD)”来表示。实施例1.乳酸菌菌株的培养物在抗肠胃道病原菌上的效用评估实验材料：
1.MRS琼脂培养板(MRS agar plate)：
将1.5％(w/v)的琼脂粉末(agar powder)添加到MRS肉汤培养基中，并依据本领域技术人员所详知且惯用的技术来制备MRS琼脂培养板以供后续实验之用。
2.上层琼脂培养基(top agar medium)：
将1.5％(w/v)的琼脂粉末分别添加到如上面表4所示的NB培养基、BHI培养基以及添加有2.5％氯化钠的TSB培养基中，继而于121℃下进行灭菌处理历时15分钟。之后，将这些经融化的培养基置于45℃的水浴槽中，以供在后续实验中作为上层琼脂培养基之用。
3.肠胃道病原菌菌液的制备：
将上面“一般实验材料”第2项当中所述的各个肠胃道病原菌以上面表3所示的适用的培养基与培养条件来培养历时20小时，以活化菌株。接着，将经活化的菌株分别以2％(v/v)的接种量并以表3所示的培养基与培养条件进行继代培养，借此得到细菌浓度约为105至1011CFU/mL的各个肠胃道病原菌的菌液。
实验方法：
在本实施例中，大体上参考Y.T.Chen et al.(2020),Lett.Appl.Microbiol.,70(4):310-317当中所述的方法来进行双层琼脂覆盖法(double agar overlay method)，以评估各个乳酸菌菌株培养物在抑制肠道病原菌生长上的效用。
首先，以上面“一般实验材料”第3项当中所得到的鼠李糖乳杆菌BioF-115、副干酪乳杆菌BioF-126、动物双歧杆菌乳亚种BioF-202、植物乳杆菌BioF-208、乳酸乳球菌BioF-224、嗜热链球菌BioF-278以及长双歧杆菌婴儿亚种BioF-402的培养物以及七菌混合培养物作为不同组别(亦即，BioF-115组、BioF-126组、BioF-202组、BioF-208组、BioF-224组、BioF-278组、BioF-402组以及七菌组)，并以经灭菌处理的棉棒分别沾取各组的培养物(约1mL)，继而于MRS琼脂培养板上沿着直径划一条约2cm宽的线，继而在37℃下进行培养历时48小时，而使得各组乳酸菌在MRS琼脂培养板表面形成一条约2cm宽的乳酸菌生长区(growth zone)。另外，以不含有任何乳酸菌的MRS肉汤培养基于MRS琼脂培养板上画线来作为空白对照组。
接着，将经融化的NB琼脂培养基(即上层琼脂培养基)倒入各组的培养盘并均匀覆盖于MRS琼脂培养板上，待NB琼脂培养基凝固后，以经灭菌处理的棉棒沾取大肠杆菌菌液(约1mL)，并均匀涂抹于各组的NB琼脂培养基表面，而使得各组NB琼脂培养基的表面上具有大致相同的大肠杆菌菌数，继而在培养箱(37℃、5％CO2)中进一步进行培养历时24小时。各组乳酸菌菌株培养物在抑制大肠杆菌生长上的效用通过测量于各组在双层琼脂培养基表面上所形成的抑制区(inhibition zone)的宽度而被评估。
各组乳酸菌菌株培养物对于肠道沙门氏菌肠道亚种、李斯特单胞菌以及肠炎弧菌的抑制效用大体上参照上面针对大肠杆菌所描述的方式来进行评估，不同之处在于：分别以肠道沙门氏菌肠道亚种、李斯特单胞菌以及肠炎弧菌菌液来代替大肠杆菌菌液，并且分别以经融化的NB琼脂培养基、BHI琼脂培养基以及添加有2.5％氯化钠的TSB琼脂培养基来作为上层琼脂培养基。
结果：
各组乳酸菌菌株培养物对于各个肠胃道病原菌的抑制效用如下面表4所示。
表4.各组乳酸菌菌株培养物对于肠胃道病原菌的抑制效用
注：抑制效用是以所形成的抑制区宽度来衡量的，其中“－”表示抑制区宽度为0cm，“+”表示>0至<2cm，“++”表示2至<3cm，“+++”表示3至<4cm，“++++”表示4至<5cm，以及“++”表示5至<9cm。
由表4可见，BioF-115组、BioF-126组、BioF-202组、BioF-208组、BioF-224组、BioF-278组以及BioF-402组对于不同的肠胃道病原菌皆具有抑制效用，而与此相较之下，七菌组的抑制效用具有显著的提升。这表示：鼠李糖乳杆菌BioF-115、副干酪乳杆菌BioF-126、动物双歧杆菌乳亚种BioF-202、植物乳杆菌BioF-208、乳酸乳球菌BioF-224、嗜热链球菌BioF-278以及长双歧杆菌婴儿亚种BioF-402的混合培养物能够在抑制肠胃道病原菌的生长上展现出协同效应(synergistic effect)。
实施例2.乳酸菌菌株的培养物的胃酸与胆盐耐受性试验(gastric acid andbile salt tolerance assay)
基于鼠李糖乳杆菌BioF-115、副干酪乳杆菌BioF-126、动物双歧杆菌乳亚种BioF-202、植物乳杆菌BioF-208、乳酸乳球菌BioF-224、嗜热链球菌BioF-278以及长双歧杆菌婴儿亚种BioF-402的混合培养物在抑制肠胃道病原菌生长上的优异效用，申请人进一步进行下面的试验，以确认该混合培养物中的乳酸菌菌体在消化道环境中的存活能力。
实验方法：
在本实施例中，大体上参考P.S.Hsieh et al.(2021)Exp.Ther.Med.,21(3):188当中所述的方法来进行乳酸菌菌株的胃酸与胆盐耐受性试验。首先，将上面“一般实验材料”第3项当中所得到的七菌混合培养物分为8个实验组(亦即，实验组1至8)(每组10mL)。测试开始时(亦即，培养第0小时)，对实验组1添加以5mL的pH 6.5的MRS肉汤培养基并予以混合均匀，随即通过平板菌落计数法(plate counting method)并使用MRS琼脂培养基来计算出实验组1混合培养物中的存活菌数，至于实验组2至8则被添加以5mL的pH 3.5的MRS肉汤培养基并予以混合均匀，继而置于培养箱(37℃、5％CO2)中进行培养。在开始培养后的第1、2与3小时，分别取出实验组2、3与4的混合培养物，并以平板菌落计数法来计算其中的存活菌数。
另外，在开始培养后的第3小时，同时取出实验组5至8的混合菌株培养物，于4℃下以4,000rpm予以离心历时10分钟，继而去除上清液，并以5mL RO水清洗实验组5至8的沉淀物(pellets)2次，再予以离心并去除残余的RO水。接着，使用5mL的添加有1.5％牛胆汁(bovine bile)(Sigma Aldrich，Cat.No.B3883)来予以散浮，继而置于培养箱(37℃、5％CO2)中继续进行培养。在开始培养后的第4、5、6与7小时，分别取出实验组5、6、7与8的混合培养物，并以平板菌落计数法来计算其中的存活菌数。
为供比较，申请人亦使用上面“一般实验方法”第3项当中所得到的动物双歧杆菌乳亚种BB-12的培养物，并大体上参考上面所述的方法来进行胃酸与胆盐耐受性测试。
之后，依照上面“一般实验方法”的第1项“统计学分析”当中所述的方法来分析所得到的实验数据。
结果：
图1A与1B分别显示动物双歧杆菌乳亚种BB-12培养物以及七菌混合培养物在胃酸与胆盐耐受性测试的第0至第7小时所测得的存活菌数(以log CFU/mL表示)。
由图1A与1B可见，动物双歧杆菌乳亚种BB-12培养物在pH 3.5的培养基中的存活菌数会随着时间而逐渐下降，而当移至含有牛胆汁的培养基之后，存活菌数更是明显地降低。相较之下，七菌混合培养物在整个试验期间的存活菌数皆无明显变化。这表示：鼠李糖乳杆菌BioF-115、副干酪乳杆菌BioF-126、动物双歧杆菌乳亚种BioF-202、植物乳杆菌BioF-208、乳酸乳球菌BioF-224、嗜热链球菌BioF-278以及长双歧杆菌婴儿亚种BioF-402的混合培养物能够有效地耐受胃酸以及胆盐作用，而被认为在经摄食后乳酸菌菌体能够于人类消化道环境中存活并到达肠道内来发挥作用。
实施例3.乳酸菌菌株的培养物的肠道吸附能力测试(intestinal adhesionassay)
实验方法：
在本实施例中，大体上参考P.S.Hsieh et al.(2021)Exp.Ther.Med.,21(3):188当中所述的方法来测定乳酸菌菌株对于肠道细胞的吸附能力。
首先，取多片经灭菌处理(sterilized)的盖玻片并分别置于6-孔培养板的各孔中，接着将依据上面“一般实验材料”的第4项来进行继代培养的Caco-2细胞分为1个实验组以及2个比较实验组(亦即，比较实验组1与2)，并将各组的Caco-2细胞以3×105细胞/孔的数量分别培养于含有5μL的MEM培养基与盖玻片的6-孔培养板的各孔中，并在培养箱(37℃、5％CO2)中进行培养至细胞达至100％汇聚，亦即，形成细胞单层(monolayer)。接着，将各组的细胞培养物分别更换以新鲜的培养基，在培养箱(37℃、5％CO2)中与以培育1小时之后，移除培养基，并以PBS洗涤细胞2次。之后，将上面“一般实验材料”的第3项当中所得到的七菌混合培养物、鼠李糖乳杆菌GG的培养物以及动物双歧杆菌乳亚种BB-12的培养物各取1.5mL而分别添加至实验组、比较实验组1以及比较实验组2的细胞培养物中，再对各组分别添加以1.5mL的新鲜培养基，继而在培养箱(37℃、5％CO2)中进行共培养(co-culture)历时1至4小时。
以PBS洗涤各组的细胞培养物之后，使用10％甲醇溶液来固定细胞历时10分钟。接着，取出各组附着有细胞培养物的盖玻片并予以进行革兰氏染色(Gram staining)，继而使用直立式显微镜(Carl Zeiss MicroImaging,Inc.)并在1,000倍的放大倍率下观察，并计数在单个视野中附着于Caco-2细胞上的乳酸菌菌数。
之后，依照上面“一般实验方法”的第1项“统计学分析”当中所述的方法来分析所得到的实验数据。
结果：
图2显示各组细胞培养物中所测得吸附于Caco-2细胞上的乳酸菌菌数。
由图2可见，实验组中所测得的乳酸菌菌数显著地高于比较实验组1与2所具者，甚至是接近比较实验组1与2所具者的两倍之多。这表示：鼠李糖乳杆菌BioF-115、副干酪乳杆菌BioF-126、动物双歧杆菌乳亚种BioF-202、植物乳杆菌BioF-208、乳酸乳球菌BioF-224、嗜热链球菌BioF-278以及长双歧杆菌婴儿亚种BioF-402的混合培养物中的乳酸菌菌体对于肠道细胞具有优异的吸附能力，并且显著地优于市售的乳酸菌菌株所具者。
实施例4.乳酸菌菌株的培养物对于肠道细胞紧密连接蛋白(tight junctionprotein)claudins的表达量的影响
紧密连结(tight junction,TJ)在肠道上皮屏障(epithelial barrier)中扮演了重要的角色，其中紧密连接蛋白claudins是TJ结构中最重要的组成蛋白，而claudins的表达量失衡也是造成多种发炎性肠道疾病的原因之一。
在本实施例中，申请人通过测定Caco-2细胞中的紧密连结蛋白claudins的表达情形来评估乳酸菌菌株培养物对于肠道上皮结构与屏障功能的影响。
实验材料：
1.四菌混合培养物与五菌混合培养物的制备：
首先，将上面“一般实验材料”的第1项中的各个乳酸菌菌株依据下面表5所示的比例来予以混合，而得到2种乳酸菌菌株组合(亦即，四菌组合以及五菌组合)。接着，依据上面“一般实验材料”的第3项当中所述的步骤而将这些菌株组合制备成四菌混合培养物以及五菌混合培养物(皆具有1×109CFU/mL的细菌浓度)。
表5.各个菌株组合所使用的菌数比
实验方法：
A、以乳酸菌菌株的培养物处理人类结肠腺癌细胞Caco-2细胞：
将依据上面“一般实验材料”的第4项来进行继代培养的Caco-2细胞分为11组，其中包括7个单菌比较组(亦即，单菌比较组1至7)、1个四菌实验组、1个五菌实验组、1个七菌实验组，以及1个对照组。将各组细胞以3×105细胞/孔的数量分别培养于含有3mL的DMEM培养基(添加有10％FBS以及1％盘尼西林-链霉素)的6-孔培养板的各孔中，并在培养箱(37℃、5％CO2)中进行培养历时11天，期间每3天更换一次培养基。
接着，移除各孔中的培养基，将上面“一般实验材料”的第3项当中所得到的鼠李糖乳杆菌BioF-115、副干酪乳杆菌BioF-126、动物双歧杆菌乳亚种BioF-202、植物乳杆菌BioF-208、乳酸乳球菌BioF-224、嗜热链球菌BioF-278以及长双歧杆菌婴儿亚种BioF-402的培养物与七菌混合培养物以及上面“实验材料”当中所得到的四菌混合培养物与五菌混合培养物分别各取3mL，并依据下面表6所示而分别添加至各组细胞培养物中，至于对照组则被添加以不含有任何乳酸菌菌株培养物的DMEM肉汤培养基，继而在培养箱(37℃、5％CO2)中予以进行共培养历时6小时。接着，将所得到的细胞培养物拿来进行下面第B项的分析。
表6.各组细胞所处理的乳酸菌菌株培养物
| 组别 | 乳酸菌菌株培养物 |
| 单菌比较组1 | 鼠李糖乳杆菌BioF-115培养物 |
| 单菌比较组2 | 副干酪乳杆菌BioF-126培养物 |
| 单菌比较组3 | 动物双歧杆菌乳亚种BioF-202培养物 |
| 单菌比较组4 | 植物乳杆菌BioF-208培养物 |
| 单菌比较组5 | 乳酸乳球菌BioF-224培养物 |
| 单菌比较组6 | 嗜热链球菌BioF-278培养物 |
| 单菌比较组7 | 长双歧杆菌婴儿亚种BioF-402培养物 |
| 四菌实验组 | 四菌混合培养物 |
| 五菌实验组 | 五菌混合培养物 |
| 七菌实验组 | 七菌混合培养物 |
| 对照组 | － |
B、CLDN1基因的mRNA表达水平的测定：
首先，使用总RNA微量提取系统套组(Total RNA Extraction Miniprep System)(VIOGENE,Cat.No.GR1001)并依据制造商所提供的操作指引来进行各组细胞培养物的总RNAs(total RNAs)的提取。由此所得到的各组的总RNAs分别以cDNA反转录试剂(GoScriptTMReverse Transcriptase,Promega,Cat.No.A5003)并且依据制造商所提供的操作指引来进行反转录反应(reverse transcription reaction)，以合成第一链cDNA(first-strand cDNA)。
接着，以所得到的第一链cDNA作为模板(template)，并参考A.M.
et al.(2005),Breast Cancer Res.7(2):R296-305而使用其中针对CLDN1基因所设计的特异性引物对(specific primer pair)来进行定量实时聚合酶链式反应(quantitative real-timepolymerase chain reaction，以下简称定量实时PCR)。另外，甘油醛-3-磷酸去氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的基因表达被使用作为内部对照组(internal control)。有关这些引物对的相关信息(包括：标的基因、各个引物的核苷酸序列以及所扩增出的PCR产物大小)已被整合于下面表7中。
表7.被用来进行定量实时PCR的引物
定量实时PCR使用StepOnePlusTM实时PCR系统(StepOnePlusTMReal-Time PCRSystem)(Appl ied BiosystemsTM)并依据制造商的操作指引来执行，而有关定量实时PCR的操作条件与反应条件被显示于下面的表8中。
表8.定量实时PCR的反应条件
由此所得到的各个PCR产物是以SYBR Green(双链DNA结合染料)的荧光(fluorescence)来进行侦测的，借此计算出CLDN1基因的循环阈值[cycle threshold(Ct)value]。各组CLDN1基因相对的mRNA表达水平(relative mRNA expression level)是使用比较性Ct方法(comparative Ct method)，将各自所得到的CLDN1基因循环阈值以GAPDH基因所得到的循环阈值来进行标准化，继而减去对照组所得到的经标准化的CLDN1基因循环阈值而获得的。
之后，依照上面“一般实验方法”的第1项“统计学分析”当中所述的方法来分析所得到的实验数据，并且通过史徒登氏t-试验(Student’s t-test)来做分析，以评估各组相较于七菌实验组之间的差异性。若所得到的统计分析结果是p<0.05，这表示有统计学显著性(statistical significance)。
结果：
图3显示在各组Caco-2细胞中所测得的CLDN1基因的相对mRNA表达水平。由图3可见，各个实验组的CLDN1相对mRNA表达水平皆明显地高于单菌比较组1至7所具者，而其中七菌实验组的相对mRNA表达水平更显著地高于四菌与五菌实验组所具者。这个实验结果显示：该四菌组合、五菌组合以及七菌组合所得到的混合培养物皆能协同地刺激紧密连接蛋白claudins的表达，而有助于肠道上皮的屏障功能。
虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述，明显地在不背离本发明的范围和精神之下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明仅受如随文检附的权利要求书所示者的限制。
生物材料保藏信息说明
保藏编号：CGMCC No.21684
分类命名：鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus
保藏日期：2021年1月20日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏编号：CGMCC No.21686
分类命名：副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei
保藏日期：2021年1月20日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏编号：CGMCC No.21683
分类命名：动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.
lactis
保藏日期：2021年1月20日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏编号：CGMCC No.21682
分类命名：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum
保藏日期：2021年1月20日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏编号：CGMCC No.21685
分类命名：乳酸乳球菌Lactococcus lactis
保藏日期：2021年1月20日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏编号：CGMCC No.21687
分类命名：嗜热链球菌Streptococcus thermophilus
保藏日期：2021年1月20日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏编号：CGMCC No.21681
分类命名：长双歧杆菌婴儿亚种Bifidobacterium longum subsp.infantis
保藏日期：2021年1月20日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
序列表
<110> 锦乔生物科技有限公司
<120> 乳酸菌菌株的培养物及其用于抑制肠胃道病原菌生长以及促进肠道健康的用途
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于CLDN1的定量实时PCR的正向引物
<400> 1
gcgcgatatt tcttcttgca gg 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于CLDN1的定量实时PCR的反向引物
<400> 2
ttcgtacctg gcattgactg g 21
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于GAPDH的定量实时PCR的正向引物
<400> 3
gaaggtgaag gtcggagt 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于GAPDH的定量实时PCR的反向引物
<400> 4
gaagatggtg atggatttc 19
Claims (9)
1.一种乳酸菌菌株的培养物，其通过将选自于下列的乳酸菌菌株组合培养于适于所述乳酸菌菌株组合生长的培养基中而被制得：
包含有动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)BioF-202(CGMCC No.21683)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)BioF-224(CGMCC No.21685)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)BioF-278(CGMCC No.21687)以及长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)BioF-402(CGMCC No.21681)的乳酸菌菌株组合；以及
包含有鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)BioF-115(CGMCC No.21684)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)BioF-126(CGMCC No.21686)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BioF-208(CGMCC No.21682)、乳酸乳球菌BioF-224以及嗜热链球菌BioF-278的乳酸菌菌株组合。
2.根据权利要求1所述的乳酸菌菌株的培养物，其特征在于：所述乳酸菌菌株组合包含有鼠李糖乳杆菌BioF-115、副干酪乳杆菌BioF-126、动物双歧杆菌乳亚种BioF-202、植物乳杆菌BioF-208、乳酸乳球菌BioF-224、嗜热链球菌BioF-278，以及长双歧杆菌婴儿亚种BioF-402。
3.根据权利要求2所述的乳酸菌菌株的培养物，其特征在于：鼠李糖乳杆菌BioF-115、副干酪乳杆菌BioF-126、动物双歧杆菌乳亚种BioF-202、植物乳杆菌BioF-208、乳酸乳球菌BioF-224、嗜热链球菌BioF-278，以及长双歧杆菌婴儿亚种BioF-402以1：1：1：1：1：1：1的菌数比来进行培养。
4.一种根据权利要求1至3中任一项所述的乳酸菌菌株的培养物供应用于制备用来抑制肠胃道病原菌生长的组合物的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述肠胃道病原菌选自于由下列所构成的群组：肠道沙门氏菌肠道亚种(Salmonella enterica subsp.enterica)、李斯特单胞菌(Listeria monocytogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肠炎弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、痢疾杆菌(Shigellaboydii)、痢疾志贺杆菌(Shigella dysenteriae)、克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiellapneumoniae)、小肠大肠炎耶氏杆菌(Yersinia enterocolitica)、普通变形杆菌(Proteusvulgaris)，以及它们的组合。
6.一种根据权利要求1至3中任一项所述的乳酸菌菌株的培养物供应用于制备用来促进肠道健康的组合物的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述肠道健康的促进包括下列至少一者：抑制肠胃道病原菌的生长、恢复健康的肠道菌相、促进肠道上皮的修复，以及维持肠道上皮的功能。
8.根据权利要求4或6所述的用途，其特征在于：所述组合物是食品组合物或药学组合物。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述药学组合物呈供非经肠道投药或口服投药的剂型。
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