CN105219797A - 一种超声波辅助外源基因转化乳酸乳球菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种超声波辅助外源基因转化乳酸乳球菌的方法，所述方法为：将携带外源基因的表达质粒与乳酸乳球菌感受态细胞悬液混合，在28～32℃、超声波场强200～500W的条件下进行转化反应，转化反应结束后，筛选获得含外源基因的乳酸乳球菌的阳性转化子；本发明所述超声波诱导基因转化方法更加环保，不依赖于细胞型，且转化率和电转化率相当，本发明转化率达到4.9×103个/μgDNA。
Description
(一)技术领域
本发明涉及外源基因导入微生物的方法，尤其涉及一种将构建的含有外源基因的质粒导入乳酸乳球菌的高效超声波转化方法。
(二)背景技术
乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)是乳品工业发酵的重要菌种，也是腌制蔬菜、肉制品的常用菌种，在食品加工中有着重要的作用。乳酸乳球菌由于具有生长迅速、易于操作、安全性高等诸多优点，使其在基因工程疫苗领域成为表达外源蛋白、作为活载体疫苗传递抗原的最佳选择。人们利用DNA重组技术，使其携带外源基因并表达外源基因产物，从而发挥更大应用价值。然而，作为革兰氏阳性细菌，乳酸乳球菌细胞壁含有丰富的肽聚糖，细胞壁较厚，机械强度大，利用传统的化学转化法很难将外源基因导入，故目前广泛采用的是电转化法。
传统基因转化方法有化学促进法，载体介导法和机械法等，这些方法尽管得到广泛应用，也取得不菲的成果，但是都有不同程度的缺陷。有的效率低下，有的过程繁冗，有的成本昂贵，特别是一些细胞只对某一个或某几个方法敏感。而物理方法是基于细胞膜的破坏来提高通透性，不依赖于细胞型，因此更具有广泛应用价值。超声波是一种传统的细胞破壁技术，被认为是一种潜在的转化方法。超声波作用细胞可以引起细胞发生多种变化，细胞变化范围可以是：无明显变化、细胞通透性增加和细胞全溶解。同是物理方法，超声波技术和电穿孔技术相比也有较直接优势，电穿孔不仅要求有较低的离子介质和较高的电压，并且接合要求有直接细胞-细胞接触。而超声波没有任何离子介质和电压要求，使得他更有优势。因此，超声波作为一种机械方法应用更加广泛，且不依赖于细胞型。从理论上讲可以在细菌、真菌、植物和哺乳动物细胞间转化，目前在哺乳动物和植物中应用较多，而在微生物上鲜见报道，建立较系统的转化方法，将有很广阔的应用前景。
(三)发明内容
本发明提供一种超声波辅助外源基因转化乳酸乳球菌的方法，该方法新颖、转化条件温和、成本低、绿色环境，易于实现基因转化的方法，解决了现有方法转化率低，细胞活力低，易死亡等问题。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种超声波辅助外源基因转化乳酸乳球菌的方法，所述方法为：将携带外源基因的表达质粒与乳酸乳球菌感受态细胞悬液混合，在28～32℃、超声波场强200～500W的条件下进行转化反应，转化反应结束后，筛选获得含外源基因的乳酸乳球菌的阳性转化子；所述乳酸乳球菌感受态细胞悬液是由乳酸乳球菌感受态细胞与冰水预冷的溶液Ⅰ重悬而成；所述溶液Ⅰ组成为：0.4～0.6mol/L蔗糖，90～110mL/L甘油，溶剂为水。
进一步，所述转化反应在28～32℃、超声波场强200～500W的条件下反应10～30min。
进一步，所述携带外源基因的表达质粒中外源基因为胆固醇氧化酶基因，核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。
进一步，所述乳酸乳球菌为乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)NZ3900，购自NTCC典型培养物保藏中心，保藏编号NZ3900。
进一步，所述携带外源基因的表达质粒与乳酸乳球菌感受态细胞悬液体积比为1:40-55，所述乳酸乳球菌感受态细胞悬液中湿菌体含量为1×107～1×108个细胞/ml。
进一步，所述乳酸乳球菌感受态细胞按如下步骤制备：将乳酸乳球菌接种至GM17培养液中，28～32℃静置培养10-14h，取培养液以体积浓度5％的接种量接种到SGM17培养液中，28～32℃静置培养10-14h，再以体积浓度8-12％的接种量转接于SGM17培养液中，28～32℃静置培养2-6h，将培养液冰浴20～25min后，在4℃、4000-5000r/min条件下离心10-15min，收集湿菌体；将湿菌体用冰水预冷的溶液Ⅰ重悬，冰上静置20～25min后，于4℃，4000-5000r/min离心10-15min，弃上清，用冰水预冷的溶液Ⅱ重悬菌体，冰上静置20～25min后，4000-5000r/min离心10-15min，弃上清，用冰水预冷的溶液Ⅰ重悬菌体，冰上静置20～25min后，于4℃，4000-5000r/min离心10-15min，弃上清，最后用冰水预冷的溶液Ⅰ重悬菌体，获得乳酸乳球菌感受态细胞悬液，按50μL/支分装，立即使用或者-80℃存放；所述M17培养基购自英国Oxoid公司，所述GM17培养基组成为：M17培养基+4～6g/L葡萄糖；SGM17培养基组成为：0.4～0.6mol/L蔗糖+20～30g/L甘氨酸+4～6g/L葡萄糖+M17培养基；所述溶液Ⅰ组成为：0.4～0.6mol/L蔗糖，90～110mL/L甘油，溶剂为水；溶液Ⅱ组成为：0.4～0.6mol/L蔗糖，90～110mL/L甘油，0.04～0.06mol/LEDTA，溶剂为水。
进一步，所述携带胆固醇氧化酶基因的表达质粒为pNZ8149质粒。
本发明所述超声波辅助外源基因转化乳酸乳球菌的方法，具体按如下步骤进行：
(1)乳酸乳球菌感受态细胞的培养和收集
挑取乳酸乳球菌(优选乳酸乳球菌NZ3900)单菌落，接种在5mLGM17培养液中，28-32℃静置培养10h，再从其中取出500μL培养液转接于10mLSGM17培养液中，28-32℃静置培养10h；将8mL培养液转接于100mLSGM17培养液中，28-32℃静置培养2-6h，将培养液冰浴20min后，离心，弃上清；用40mL冰水预冷的溶液Ⅰ重悬菌体，冰上静置20min后，离心，弃上清；用25mL冰水预冷的溶液Ⅱ重悬菌体，冰上静置20min后，离心，弃上清；再用15mL冰水预冷的溶液Ⅰ重悬菌体，冰上静置20min后，离心，弃上清；最后加入1mL冰水预冷的溶液Ⅰ重悬菌体，获得乳酸乳球菌感受态细胞悬液；上述操作的所有离心条件均为4℃，5000r/min离心10min。
(2)以乳酸乳球菌为宿主的基因转化研究
将乳酸乳球菌感受态细胞悬液与携带胆固醇氧化酶基因的pNZ8149质粒混合，在pH值至5.0～6.0、28～32℃、超声波场强200～500W下，经超声波作用进行转化反应，分别考察场强和处理时间等参数对转化的影响；
(3)阳性转化子的筛选
当转化结束后，取40-50μL转化液，用SGM17培养液定容至1mL，冰上放置5min，28℃静置培养2～3h，取培养液涂布于溴甲酚紫筛选培养基平板，30℃培养36h，挑取溴甲酚紫筛选培养基平板上具有黄色菌斑的单菌落，得到阳性转化子；
(4)阳性转化子的鉴定
随机选取筛选平板上的转化子提取基因组DNA，以其为模板，采用特异性引物进行PCR验证。所用引物:5'-TTCCATGGCCGATAGCCGGGCGAACAG-3'和5'-GCGAATTCTCACTGGATGTCGGACGAGATGA-3'。PCR反应条件为:94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃5min；凝胶电泳检测重组载体是否插入乳酸乳球菌基因组。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
1)目前报道多集中在超声诱导植物和动物基因转化，本发明拟以超声波方法诱导微生物基因转化。
2)常用的基因转化方法有基因工程法和电穿孔法，基因工程法要求有高端仪器设备，所用试剂昂贵且大多对人体和环境有害；电穿孔要求有较低的离子介质和较高的电压，并且接合要求有直接细胞-细胞接触。本发明所述超声波诱导基因转化方法更加环保，不依赖于细胞型，且转化率和电转化率相当。与电转化相比除具有上述优势外，对乳酸乳球菌转化率也有明显提高，如孙磊等报道的乳酸乳球菌电转化条件的研究(山东大学学报，2005,40(3))，转化率为1.2×103个/μgDNA，本发明转化率达到4.9×103个/μgDNA。
(四)附图说明
图1为实施例1阳性转化子筛选凝胶电泳图，泳道M为Marker，泳道1为阳性转化子。
图2为实施例2阳性转化子筛选凝胶电泳图，泳道M为Marker，泳道1为阳性转化子。
图3为实施例3阳性转化子筛选凝胶电泳图，泳道M为Marker，泳道1为阳性转化子。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例所述培养基和试剂：
M17培养基购自英国Oxoid公司；
GM17培养基组成：M17培养基+4～6g/L葡萄糖；
SGM17培养基：0.4～0.6mol/L蔗糖+20～30g/L甘氨酸+4～6g/L葡萄糖+M17培养基；
GM17MC恢复培养基：M17培养基+4～6g/L葡萄糖+18～22mmol/LMgCl2+1.8～2.2mmol/LCaCl2；
(NZ3900/pNZ8149)溴甲酚紫筛选培养基：M17培养基+4～6g/L乳糖+0.03～0.05g/L溴甲酚紫+13～20g/L琼脂；
溶液Ⅰ：0.4～0.6mol/L蔗糖，90～110mL/L甘油，溶剂为水；
溶液Ⅱ：0.4～0.6mol/L蔗糖，90～110mL/L甘油，0.04～0.06mol/LEDTA，溶剂为水。
实施例1
(1)乳酸乳球菌感受态细胞的培养和收集
挑取乳酸乳球菌NZ3900单菌落(购自NTCC典型培养物保藏中心，保藏编号NZ3900)，接种到5mLGM17培养液中，28℃静置培养10h，再从其中取出500μL培养液转接于10mLSGM17培养液中，28℃静置培养10h。将8mL培养液转接于100mLSGM17培养液中，28℃静置培养5h，冰浴20min后，离心，弃上清。用40mL冰水预冷的溶液Ⅰ重悬菌体，冰上静置20min后，离心，弃上清。用25mL冰水预冷的溶液Ⅱ重悬菌体，冰上静置20min后，离心，弃上清。再用15mL冰水预冷的溶液Ⅰ重悬菌体，冰上静置20min后，离心，弃上清。最后加入1mL冰水预冷的溶液Ⅰ重悬菌体，得待转化感受态宿主细胞悬液，按50μL/支分装，立即使用或者-80℃存放。上述操作的所有离心条件均为4℃，5000r/min离心10min。
(2)以乳酸乳球菌为宿主的基因转化研究
将胆固醇氧化酶基因choB克隆到pNZ8149质粒(pNZ8149质粒购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心)上。
将1mL含胆固醇氧化酶基因choB的pNZ8149(质粒浓度应不小于70ng/μL)与40mL步骤(1)获得的感受态宿主细胞悬液(悬液中湿菌体含量为1×108个细胞/ml)混合，移入转化杯中，pH调至5.0；温度调至28℃，超声波场强为200W，处理时间为20min。
(3)阳性转化子的筛选
当转化结束后，取40μL转化液加入960μL的SGM17培养液，冰上放置5min，28℃静置培养2h，涂布于溴甲酚紫筛选培养基平板，30℃培养36h，挑取溴甲酚紫筛选培养基平板上具有黄色菌斑的单菌落，获得阳性转化子。超声波转化同时设立阴性对照，阴性对照除不加质粒DNA外，其余过程与其它处理完全相同。在溴甲酚紫筛选培养基平板上阴性对照没有菌落生长的情况下，统计转化子数，计算转化效率。
转化效率＝转化子数/加入的质粒DNA量(μg)×稀释倍数。
(4)阳性转化子的鉴定
随机选取筛选平板上的转化子提取基因组DNA，以其为模板，采用特异性引物进行PCR验证。所用引物:5'-TTCCATGGCCGATAGCCGGGCGAACAG-3'和5'-GCGAATTCTCACTGGATGTCGGACGAGATGA-3'。PCR反应条件为:94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃5min；凝胶电泳检测重组载体是否插入乳酸乳球菌基因组，结果见图1。
上述转化过程中，转化率为2.7×103阳性转化子/μg质粒DNA。
实施例2
(1)乳酸乳球菌感受态细胞的培养和收集
挑取乳酸乳球菌NZ3900单菌落，接种到5mLGM17培养液中，30℃静置培养12h，再从其中取出500μL培养液转接于10mLSGM17培养液中，30℃静置培养12h。将10mL培养液转接于100mLSGM17培养液中，30℃静置培养5h，冰浴20min后，离心，弃上清。用40mL冰水预冷的溶液Ⅰ重悬菌体，冰上静置20min后，离心，弃上清。用25mL冰水预冷的溶液Ⅱ重悬菌体，冰上静置20min后，离心，弃上清。再用15mL冰水预冷的溶液Ⅰ重悬菌体，冰上静置20min后，离心，弃上清。最后加入1mL冰水预冷的溶液Ⅰ重悬菌体，得待转化感受态宿主细胞悬液，按50μL/支分装，立即使用或者-80℃存放。上述操作的所有离心条件均为4℃，5000r/min离心10min。
(2)以乳酸乳球菌为宿主的基因转化研究
将胆固醇氧化酶基因choB克隆到pNZ8149质粒(pNZ8149质粒购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心)上。
将1mL含胆固醇氧化酶基因choB的pNZ8149(质粒浓度应不小于70ng/μL)与45mL步骤(1)获得的感受态宿主细胞悬液(悬液中湿菌体含量为1×108个细胞/ml)混合，移入转化杯中，pH调至5.0；温度调至28℃，超声波场强为200W，处理时间为20min。
(3)阳性转化子的筛选
取45μL转化液加入955μL的SGM17培养液，冰上放置5min，30℃静置培养2h，涂布于溴甲酚紫筛选培养基平板，30℃培养36h，挑取溴甲酚紫筛选培养基平板上具有黄色菌斑的单菌落，获得阳性转化子。超声波转化同时设立阴性对照，阴性对照除不加质粒DNA外，其余过程与其它处理完全相同。在溴甲酚紫筛选培养基平板上阴性对照没有菌落生长的情况下，统计转化子数，计算转化效率。
转化效率＝转化子数/加入的质粒DNA量(μg)×稀释倍数。
上述方法转化，转化率为1.5×104阳性转化子/μg质粒DNA。
(4)阳性转化子的鉴定
随机选取筛选平板上的转化子提取基因组DNA，以其为模板，采用特异性引物进行PCR验证。所用引物:5'-TTCCATGGCCGATAGCCGGGCGAACAG-3'和5'-GCGAATTCTCACTGGATGTCGGACGAGATGA-3'。PCR反应条件为:94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃5min；凝胶电泳检测重组载体是否插入乳酸乳球菌基因组，结果见图2。
实施例3
(1)乳酸乳球菌感受态细胞的培养和收集
挑取乳酸乳球菌NZ3900单菌落，接种到5mLGM17培养液中，32℃静置培养10h，再从其中取出500μL培养液转接于10mLSGM17培养液中，32℃静置培养10h。将12mL培养液转接于100mLSGM17培养液中，32℃静置培养5h，冰浴20min后，离心，弃上清。用40mL冰水预冷的溶液Ⅰ重悬菌体，冰上静置20min后，离心，弃上清。用25mL冰水预冷的溶液Ⅱ重悬菌体，冰上静置20min后，离心，弃上清。再用15mL冰水预冷的溶液Ⅰ重悬菌体，冰上静置20min后，离心，弃上清。最后加入1mL冰水预冷的溶液Ⅰ重悬菌体，得待转化感受态宿主细胞悬液，按50μL/支分装，立即使用或者-80℃存放。上述操作的所有离心条件均为4℃，5000r/min离心10min。
(2)以乳酸乳球菌为宿主的基因转化研究
将胆固醇氧化酶基因choB克隆到pNZ8149质粒(pNZ8149质粒购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心)上。
将1mL含胆固醇氧化酶基因choB的pNZ8149(质粒浓度应不小于70ng/μL)与40mL步骤(1)获得的感受态宿主细胞悬液(悬液中湿菌体含量为1×108细胞/ml)混合，移入转化杯中，pH调至5.0；温度调至28℃，超声波场强为200W，处理时间为20min。
(3)阳性转化子的筛选
取50μL转化液加入950μL的SGM17培养液，冰上放置5min，32℃静置培养2h，涂布于溴甲酚紫筛选培养基平板，30℃培养36h，挑取溴甲酚紫筛选培养基平板上具有黄色菌斑的单菌落，获得阳性转化子。超声波转化同时设立阴性对照，阴性对照除不加质粒DNA外，其余过程与其它处理完全相同。在YPD平板上阴性对照没有菌落生长的情况下，统计转化子数，计算转化效率。
转化效率＝转化子数/加入的质粒DNA量(μg)×稀释倍数。
(4)阳性转化子的鉴定
随机选取筛选平板上的转化子提取基因组DNA，以其为模板，采用特异性引物进行PCR验证。所用引物:5'-TTCCATGGCCGATAGCCGGGCGAACAG-3'和5'-GCGAATTCTCACTGGATGTCGGACGAGATGA-3'。PCR反应条件为:94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃5min；凝胶电泳检测重组载体是否插入乳酸乳球菌基因组，结果见图3。
上述方法转化，转化率为4.9×103阳性转化子/μg质粒DNA。
Claims (7)
1.一种超声波辅助外源基因转化乳酸乳球菌的方法，其特征在于，所述方法为：将携带外源基因的表达质粒与乳酸乳球菌感受态细胞悬液混合，在28～32℃、超声波场强200～500W的条件下进行转化反应，转化反应结束后，筛选获得含外源基因的乳酸乳球菌的阳性转化子；所述乳酸乳球菌感受态细胞悬液是由乳酸乳球菌感受态细胞与冰水预冷的溶液Ⅰ重悬而成；所述溶液Ⅰ组成为：0.4～0.6mol/L蔗糖，90～110mL/L甘油，溶剂为水。
2.如权利要求1所述超声波辅助外源基因转化乳酸乳球菌的方法，其特征在于所述转化反应在28～32℃、超声波场强200～500W的条件下反应10～30min。
3.如权利要求1所述超声波辅助外源基因转化乳酸乳球菌的方法，其特征在于所述携带外源基因的表达质粒中外源基因为胆固醇氧化酶基因。
4.如权利要求1所述超声波辅助外源基因转化乳酸乳球菌的方法，其特征在于所述乳酸乳球菌为乳酸乳球菌NZ3900。
5.如权利要求1所述超声波辅助外源基因转化乳酸乳球菌的方法，其特征在于所述携带外源基因的表达质粒与乳酸乳球菌感受态细胞悬液体积比为1:40-55，所述乳酸乳球菌感受态细胞悬液中湿菌体含量为1×107～1×108个细胞/ml。
6.如权利要求1所述超声波辅助外源基因转化乳酸乳球菌的方法，其特征在于所述乳酸乳球菌感受态细胞按如下步骤制备：将乳酸乳球菌接种至GM17培养液中，28～32℃静置培养10-14h，取培养液以体积浓度5％的接种量接种到SGM17培养液中，28～32℃静置培养10-14h，再以体积浓度8-12％的接种量转接于SGM17培养液中，28～32℃静置培养2-6h，将培养液冰浴20～25min后，在4℃、4000-5000r/min条件下离心10-15min，收集湿菌体；将湿菌体用冰水预冷的溶液Ⅰ重悬，冰上静置20～25min后，于4℃，4000-5000r/min离心10-15min，弃上清，用冰水预冷的溶液Ⅱ重悬菌体，冰上静置20～25min后，4000-5000r/min离心10-15min，弃上清，用冰水预冷的溶液Ⅰ重悬菌体，冰上静置20～25min后，于4℃，4000-5000r/min离心10-15min，弃上清，最后用冰水预冷的溶液Ⅰ重悬菌体，获得乳酸乳球菌感受态细胞悬液；所述GM17培养基组成为：M17培养基+4～6g/L葡萄糖；SGM17培养基组成为：0.4～0.6mol/L蔗糖+20～30g/L甘氨酸+4～6g/L葡萄糖+M17培养基；所述溶液Ⅰ组成为：0.4～0.6mol/L蔗糖，90～110mL/L甘油，溶剂为水；溶液Ⅱ组成为：0.4～0.6mol/L蔗糖，90～110mL/L甘油，0.04～0.06mol/LEDTA，溶剂为水。
7.如权利要求1所述超声波辅助外源基因转化乳酸乳球菌的方法，其特征在于所述携带胆固醇氧化酶基因的表达质粒为pNZ8149质粒。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160106 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |