WO2004087767A1 - ポリペプチド - Google Patents

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WO2004087767A1 PCT/JP2004/004460 JP2004004460W WO2004087767A1 WO 2004087767 A1 WO2004087767 A1 WO 2004087767A1 JP 2004004460 W JP2004004460 W JP 2004004460W WO 2004087767 A1 WO2004087767 A1 WO 2004087767A1
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Toshiki Nishizawa
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Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo
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Definitions

  • the present invention includes a specific antigen peptide, a polypeptide that efficiently induces the production of a specific antibody against this antigen peptide by transmucosal administration even in the absence of an immune adjuvant, More specifically, in the context of compositions containing and their use, polypeptides, including B-cell epitopes and T-cell epitopes, of antigens to which antibodies are produced are recognized by proteases. It is linked with a linker peptide consisting of the amino acids of the sequence, and is efficiently linked to a polypeptide consisting of the amino acid sequence of the cell-binding motif.
  • the present invention relates to a polypeptide, a composition containing the polypeptide, and a use thereof. Hikyo fe technique
  • non-specific immune system A substance that enhances the specific immune response to an antigen by stimulating it
  • This method is widely used as the most effective preventive measure against various infectious diseases, and especially effective other preventive or therapeutic methods such as viruses against which antibiotics are ineffective and toxins produced by microorganisms. Without it, the only way to induce and protect the body from producing antibodies against these viruses and toxins This is often a countermeasure.
  • Inactivated vaccines that have inactivated infectious agents by inactivating pathogenic microorganisms with organic solvents or ultraviolet irradiation, etc., and attenuate pathogens to reduce their pathogenicity to living organisms. All vaccines except parental poliovirus vaccine are administered parenterally by injection. However, in the case of an inactivated vaccine, several injections must be repeated to obtain an antibody titer necessary for protection, which poses a problem that the burden on the living body is large and the convenience is poor.
  • a live vaccine in the case of a live vaccine, not only does it lack storage stability, but it can also mutate after administration of the vaccine and become a virulent strain, causing harm to the living body. Furthermore, both the inactivated vaccine and the live vaccine may give anaphylaxis to the living body, and thus lack safety. Furthermore, since the virus particles themselves or protein macromolecules are used as immunogens, the stability of vaccine preparations is lacking, and human serum albumin or gelatin, etc., which do not maintain stability, are used in preparations. In some cases it was used as a stabilizer.
  • a new type using a polypeptide consisting of a partial amino acid sequence of inactivated and live vaccines which has higher safety and efficacy than inactivated and live vaccines Vaccine Development research is being actively conducted around the world, and a recombinant pectin component vaccine represented by hepatitis B virus vaccin is a representative example of the new vaccine.
  • a recombinant pectin component vaccine represented by hepatitis B virus vaccin is a representative example of the new vaccine.
  • the shorter the chain length of the polypeptide used as a vaccine the better, but the shorter, the shorter the major histocompatibility antigen (hereinafter, ⁇ ⁇ HC) that the individual organism has.
  • Class II haplotypes can be broadly covered and difficult to design to have sufficient immunogenicity.
  • Methods for increasing the immunogenicity of the antigen upon transmucosal administration include the cholera toxin (hereinafter abbreviated as “CT”) and a heat-labile type derived from Escherichia coli, together with the target antigen.
  • CT cholera toxin
  • a heat-labile type derived from Escherichia coli a heat-labile type derived from Escherichia coli
  • Re La, / eIIe, E.C.
  • Imrn uno Iogy Vol. 9.9, pp. 30-37, (2000)
  • Japanese Patent Application Laid-Open Publication No. Hei 6-122633 discloses a fragment of a protein fragment from Streptococcus mutans that has adhesiveness to the tooth surface.
  • a method using the antibody of an animal immunized with a peptide (passive immunization) is disclosed.
  • Japanese Patent Application Laid-Open Publication No. 2002-511124 Streptococcus mutans T-cell epitopes derived from the same Streptococcus mutans
  • a vaccine for the prevention of dental caries consisting of B-cell epitopes (glucan binding protein) is described.
  • Streptococcus mutans serotype C (S treptoccocumutanssero type C), which is known to have a caries-preventing effect, has an initial adhesion to the tooth surface.
  • involved surface protein antigen hereinafter, abbreviated as gamma p a c ".) as the system an experimental model to induce the production of antibodies used for, Ri by the transmucosal administration, even in immune adjuvant Bok absence.
  • Research has been conducted to develop short-chain polypeptides that can efficiently induce the production of antibodies to PAc in multiple MHC class II haplotype individuals ( ⁇ gene type).
  • a method was proposed to enhance the production of antibodies capable of suppressing dental caries by linearly linking dipeptin linkers consisting of a gin-lysine sequence (Toshiki Nishizawa, Sho Imai, Nobuhiro Hanada, The 4th Annual Meeting of the Vaccine Society of Japan Program 'Abstracts', pp.
  • H8-5041118 discloses a technique for preventing infection of a trachomach lamella in which a B-cell epitope is bound to the carboxyl-terminal side of a T-cell epitope. Although synthetic peptide pectin is disclosed, transmucosal administration cannot induce sufficient antibody production.
  • an object of the present invention is to provide a peptide vaccine which can induce production of a sufficient amount of a desired antibody in vivo even in transmucosal administration and can be administered safely.
  • the present inventors have developed a model using a fragment peptide derived from PA c (cell surface protein antigen) of Streptococcus mutans, a microorganism that causes caries.
  • PA c cell surface protein antigen
  • the amino acid end of the polypeptide has an amino acid sequence containing a T cell epitope that is simultaneously restricted by a plurality of haplotypes of MHC class II ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , and the protease is converted into a linker peptide.
  • a polypeptide to which a peptide having an amino acid sequence is bound is transmucosally administered, for example, nasally in the absence of an immunological adjuvant, a plurality of MHC class II haplotypes can be used to detect specific antibodies against the antigen of interest. Efficiently enhances sufficient production, and has low ability to induce the production of antibodies other than the specific antibody of interest, and does not induce side effects such as anafluxia It was Heading that it is a high polypeptide de safety. Ma In addition, they have found that this polypeptide can induce antibody production even when administered transmucosally without an immune adjuvant, and furthermore, have found that this polypeptide has an immunoadjuvant effect, and completed the present invention. It has come.
  • the present invention has an amino acid sequence containing a T cell epitope on the amino terminal end, and a B cell epitope on the carboxy terminal end of the linker peptide.
  • the object is achieved by providing a polypeptide having a homologous amino acid sequence with a cell-binding motif of a cell adhesion molecule in a peptide having an amino acid sequence containing the same.
  • the antibodies referred to in the present invention are mainly immunoglobulin G ( ⁇ gG), immunoglobulin M (IgM), and immunoglobulin A (IgA) antibodies, Antibodies secreted into the nasal cavity, oral cavity, eyes, gastrointestinal tract, etc., as well as those secreted into body fluids, are of course included.
  • a B cell epitope or an amino acid sequence containing it is used as a site for inducing antibody production.
  • the amino acid sequence of this peptide is an antigen such as a toxin, an allergen, an enzyme, a cell membrane antigen, or a tumor-specific antigen derived from a microorganism, a cell, or a tumor cell.
  • the amino acid sequence of a known antigen epitope that has already been clarified may be the same, or various antigens that are actually immunogenic to the living body, or may be obtained by a conventional method.
  • a peptide sequence of the antigen may be identified by immunizing a partial peptide of the antigen, and the polypeptide having the identified amino acid sequence may be used as a B-cell peptide.
  • this B cell The pitope may be on the same antigen as the T-cell epitope described below, or may share part or all of the amino acid sequence with the ⁇ -cell epitope. Therefore, the cell epitope is used to protect against infection, prevent and treat inflammatory diseases such as cancer, tumors, ulcers, and hepatitis, and prevent and treat immune diseases such as allergies and atopic dermatitis, and neutralize enzymes.
  • a preferred antigen polypeptide can be selected.
  • a preferred antigen polypeptide in order to induce an antibody for preventing caries, , Toshiki Nishizawa, Sho Imai, Nobuhiro Hanada, The 4th Annual Meeting of the Vaccine Society of Japan Program ⁇
  • the above-mentioned PAc fragment peptides described in the Abstracts, p. 77 (2000) can be used.
  • Specific examples include a peptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • two or more B cell epitopes present on the same antigen can be linked in tandem, or the whole antigen can be used as a B cell epitope.
  • a single polypeptide can be used to treat a plurality of antigenic proteins. It is optional to design a polypeptide that can produce antibodies to the quality. In this case, by inserting a linker peptide described below between each B-cell epitope, processing of each individual epitope can be performed more reliably.
  • amino acid sequence of a polypeptide containing a T cell epitope used in the polypeptide of the present invention refers to a mammalian, bird, reptile, or fish MHC class II containing a human to be administered.
  • Any amino acid sequence that is restricted to the mouth type and is presented as a helper T cell antigen or an amino acid sequence containing it can be used.
  • the amino acid sequence of this polypeptide may be determined by using the amino acid sequence of cell epitopes, which has already been clarified in the literature.
  • the epitope sequence may be identified by immunizing a partial peptide of the antigen, and the polypeptide having the identified amino acid sequence may be used as a ⁇ -cell epitope.
  • the cell epitope may be on the antigen containing the cell epitope described above, or may share part or all of the amino acid sequence with the cell epitope. May be.
  • These ⁇ -cell epitope peptides may be used as they are, or the same or plural kinds of ⁇ -cell epitopes may be used by linking them to a tandem.
  • ⁇ cell epitopes contain amino acid residues other than amino acid residues that become agretope (amino acid residues required for binding to MHC class ⁇ ⁇ antigen). The function can be exhibited even when substituted with an acid residue. Therefore, as the cell-cell epitope polypeptide used in the present invention, any polypeptide in which agretope is preserved can be used.
  • the cell epitope polypeptide is used.
  • a polypeptide having an ug or letter for a plurality of types of MHC class II haplotypes in tandem or in an overlapping manner so-called multi-aggregate type polypeptide. Is extremely useful. At present, a number of basic structures and aggregates of binding peptides by MHC class II haplotypes have been disclosed in the literature. To design polypeptides containing Is also optional.
  • a polypeptide having a T cell epitope or an aggregate in a heterologous animal in a tandem or overlapping manner is used as a ⁇ cell epitope-one polypeptide, a plurality of species can be obtained. It can be used as an effective ⁇ -cell epitope polypeptide for animals.
  • a linker peptide consisting of an amino acid sequence serving as a protease recognition sequence is inserted between a T cell epitope sequence and a B cell epitope sequence.
  • both polypeptides are enzymatically cleaved and separated by a processing process in antigen presentation to induce the production of antibodies that recognize the amino acid sequence portion of the junction. Is designed to be suppressed. Therefore, it is excellent in immunogenicity, enhances the production of antibodies sufficient to show a protective effect in the living body, and is not an antibody against the immunized peptide, but an antigenic protein derived from the integrated B-cell epitope. Thus, it is possible to enhance the production of antibodies against the antibody.
  • the peptide used in the present invention for binding to a B-cell peptide-containing peptide and a T-cell peptide is an antigen processor. Any sequence may be used as long as it is a recognition sequence of a protease involved in the binding, and specific examples include dipeptides such as lysine-lysine (KK), lysine-arginine (KR), and arginine-arginine (RR). In particular, it is desirable to use a dipeptide consisting of lysine-lysine, which is a recognition sequence for cathepsin B. When using polypeptides in which T cell epitopes and B cell epitopes overlap, the polypeptides are linked to each other by a linker peptide. Can function as a T-cell epitope or a B-cell epitope.
  • the cell binding motif of the cell adhesion molecule used in the present invention can be used in the present invention as long as the peptide of the present invention can be retained on the mucosal surface for a long period of time.
  • the amino acid sequences of other cell binding motifs including binding motifs for the integer family, can be used.
  • amino acid sequences belonging to the integrin binding motif include fibronectin collagen, vitronectin, fibrinogen, laminin, and human immunodeficiency virus (hereinafter abbreviated as HiVj).
  • Arginine-glycine-aspartic acid (RGD: SEQ ID NO: 2 in the sequence listing) and arginine-glutamic acid, known as binding motifs present on cell adhesion molecules such as T at protein Acid-aspartic acid (RED: SEQ ID NO: 3 in the sequence listing), leucine-aspartic acid-palin (LDV: SEQ ID NO: 4 in the sequence listing), proline-histidine-serine-arginine-aspargine (PHSRN: SEQ ID NO: 5) in the column list, arginine-lysine-lysine (RKK: SEQ ID NO.
  • binding motifs other than the integrin family include tyrosine-isoleucine-glycine-serine-arginine (YIGSR: SEQ ID NO: 8 in the sequence listing), isoleucine-lysine-parin-alanine 1-variin (IKVAV: SEQ ID NO: 9 in the sequence listing), arginine-phenylalanine-tyrosine-parin-1 / lin-methionine-1 tributane-lidine (RFYVVMWK: SEQ ID NO: 10 in the sequence listing), Peptides having an amino acid sequence such as isoleucine-arginine-valin-valin-methionine (IRVVM: SEQ ID NO: 11 in the sequence listing) can be mentioned.
  • junction site of the peptide having the amino acid sequence of these cell binding motifs may be located at the amino-terminal or carboxyl-terminal side of the T-cell epitope polypeptide, or the B-cell epitope polypeptide. It can be selected from a total of four amino-terminal or carboxyl-terminal sites, and it is sufficient to connect at least one of them.
  • polypeptide of the present invention which is linked to one or both of the amino-terminal or carboxyl-terminal side of the T-cell epitope polypeptide, is capable of producing an antibody specific to the B-cell epitope polypeptide. It is particularly desirable because it will be strengthened.
  • the method for producing the polypeptide of the present invention there is no limitation on the method for producing the polypeptide of the present invention, and the partially synthesized peptides are combined with each other by a conventional peptide synthesis method or by a conventional peptide synthesis method.
  • the peptide is commercially available from each manufacturer. It can be synthesized using a peptide synthesizer according to the protocol of the apparatus. Further, the polypeptide of the present invention can be prepared by recombinant DNA technology.
  • a DNA encoding the amino acid sequence of the designed polypeptide is prepared, inserted into a vector capable of autonomous propagation, and then inserted into microorganisms such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, actinomycetes, yeast, etc. Transform the cells by introducing them into a host such as a cell or tissue, or prepare a transgenic animal or plant, culture and grow them, and then collect the polypeptide of the present invention by an appropriate method. be able to.
  • the polypeptide of the present invention may be an appropriate protein selected from a protein other than an amino acid sequence serving as a cleavage site for processing-related enzymes used for linking a cell cell epitope and a B cell epitope.
  • polypeptide of the present invention may be prepared by directly preparing a polypeptide having the entire amino acid sequence by any of the methods described above, or a partial amino acid sequence thereof may be prepared in advance. It is optional to prepare a synthetic version of the same polypeptide by chemical bonding.
  • the polypeptide of the present invention can be used alone or in combination of a plurality of polypeptides having the same B cell epitope for the purpose of inducing specific antibody production. . Furthermore, when antibodies against multiple antigens are simultaneously produced, it is optional to use a combination of two or more polypeptides having B cell epitopes corresponding to each antigen. . Also, does not impair the effects of the present invention. Insofar as the composition of the present invention is combined with one or more pharmaceutically acceptable excipients for pharmaceutical preparations, it can be advantageously carried out.
  • Pharmaceutical additives include reducing or non-reducing saccharides such as glucose, maltose, trehalose and sucrose, sugar alcohols such as sorbitol, mannitol and maltitol, agar, Water-soluble polymers such as pullulan, guar gum, and gum arabic, proteins such as gelatin and silk, and their hydrolysates, lipids, amino acids, buffers, stabilizers, antibacterial agents, fragrances, and nutritious foods And quasi-drugs or active ingredients of pharmaceuticals, immunoadjuvants such as alum, aluminum hydroxide and the like, and one or more of them can be used in an appropriate combination.
  • reducing or non-reducing saccharides such as glucose, maltose, trehalose and sucrose
  • sugar alcohols such as sorbitol, mannitol and maltitol
  • agar Water-soluble polymers such as pullulan, guar gum, and gum arabic
  • proteins such as gelatin and silk
  • hydrolysates
  • the form of the preparation containing the polypeptide of the present invention is not particularly limited as long as the polypeptide in the preparation can be stably retained for a long period of time. It may be appropriately selected from dosage forms such as tablets, sublingual tablets, troches, powders, granules, creams, ointments, syrups, and the like, in consideration of the administration subject, administration method, storage method of the preparation and transportation method.
  • the polypeptide of the present invention or a composition containing the same can be used as an antigen by encapsulating it in ribosomes as necessary, or by using a penetration enhancer for skin or tissue, an iontophoresis method, or the like.
  • the polypeptide of the present invention can be contained in various foods and drinks such as tablet confections, candies, and soft drinks, and by ingesting it orally, the polypeptide can be ingested transmucosally. It is optional.
  • the polypeptide encoding the polypeptide of the present invention may be directly administered to a living body, or the polypeptide of the present invention may be expressed in a living body by, for example, so-called gene therapy for introducing DNA into cells. it can.
  • the polypeptides of the present invention include humans, dogs, cats and mice. Constituent proteins such as pathogenic viruses, microorganisms, and bacteria, and secreted proteins, to animals that produce antibodies such as mammals, chickens, ducks, birds, reptiles, fish, and fish, especially fishes Antibodies can be produced against the toxin. Therefore, it is effective in preventing or treating infectious diseases such as food poisoning, tetanus, diphtheria, and influenza caused by bacteria such as botulinum and Escherichia coli OH-157. In addition, treatment of Alzheimer's by producing antibodies against amyloid jS peptide, and predominantly producing specific IgG antibodies against allergens derived from mites, house dust, pollen, food, etc.
  • the polypeptide of the present invention can be administered into the oral cavity, nasal cavity, eyes, throat, vagina, trachea, abdominal cavity, thoracic cavity, alveoli, esophagus, and into the digestive tract such as stomach and intestine.
  • mucosal administration it is possible to induce IgA antibody production in the mucous membrane and induce IgG antibody production in body fluids.
  • administering by the usual vaccine administration route such as subcutaneous, intradermal, or intramuscular administration In addition, in some cases, intravascular administration is also possible.
  • polypeptide of the present invention can be used not only for producing a specific antibody against any protein or polypeptide, but also for producing an antibody against an oligopeptide polypeptide having low antigenicity alone. Can be advantageously used. Therefore, in order to produce antiserum and monoclonal antibodies by immunizing animals with synthetic oligopeptides, in addition to use in animals by the above-mentioned administration route, in addition to the use of immunocompetent cells in test tubes in vitro, It can be used advantageously for cropping.
  • the polypeptide of the present invention is administered to a living body simultaneously with another antigen or an antigenic protein derived from the B cell epitope in the polypeptide, whereby an antibody against the simultaneously administered antigen is obtained. It can be used as an immune adjuvant to induce body production.
  • the amount used at this time is not particularly limited as long as it is an amount capable of inducing antibody production against another antigen to be administered simultaneously or an antigen derived from the B cell epitope in the polypeptide.
  • the dose of the polypeptide of the present invention should be 10% by mass or less, preferably 1% by mass of the dose of the other antigen. %, More preferably 0.1% by mass or less.
  • any method can be used as long as the polypeptide can reliably reach the administration site.
  • an appropriate amount may be dropped on the mucous membrane using a spot syringe, orally ingested, applied to the mucous membrane in the form of a cream or jewel, or guided to the administration site with a catheter or the like.
  • it may be sprayed in the form of a mist with a spray nebulizer or the like, or may be sucked into the nose, trachea or lungs.
  • administration methods such as syringes, catheters, and infusions can be used.
  • the dose of the polypeptide of the present invention may be appropriately determined in consideration of the antibody-inducing ability, the type of disease, the administration route, the administration method, the animal to be administered, and the like, and is usually from 0.0001 to 100,000.
  • mg Z kg body weight preferably 0.0001 to 25 mg Z kg body weight, more preferably 0.0001 to 10 mg body weight.
  • polypeptides used in the following experiments were all manufactured by Peptide Synthesizer (Advansed ⁇ Chemtec, Adtech, Inc.)
  • the antibody titer against each antigen is the serum of blood bled from individual mice, the antibody of each continuous in two-fold diluted preparation, EL ⁇ SA method was used to detect using enzyme-labeled antibody, and each microtiter plate used for analysis was transferred to a microtiter plate reader (multi-scanner, Chromatic, Lab Systems). The absorbance at 405 nm was measured, and the absorbance was compared with the absorbance of a control well that did not use the coat antigen. The maximum dilution of the serum with a difference of 0.1 or more was determined. It was determined, averaged and expressed as the antibody titer.
  • the haplotype type of the MHC class I ⁇ of the mouse is also shown in parentheses.
  • H-2 three haplotypes of mouse IV1 HG class £ I (H-2) were i, d, or k-type BIO., ⁇ 10.D2, and BIO.BR.
  • production of antibodies specific to unit peptides and PAc was strongly induced (about 10%) compared to mice of other types of MHG class II (H-2) haplotype. More than double). Therefore, this unit peptide contains a B-cell peptide for inducing anti-PAc antibody in congenic mice of multiple haplotypes of d, f, and k type H-2 class II.
  • each of the congenic mice was synthesized by the same method and schedule as in Experimental Example 1 by synthesizing position-limited parinyl substitution peptides in which all amino acids involved in the putative agrtop were simultaneously substituted with valine.
  • the antibody titer in serum was measured using E-SA as in Experimental Example 1, and the ability to induce antibodies by immunization was examined to determine the corresponding haplotype for each MHC Class II. Agretopes on unit peptide antigens were determined. The results are summarized in Table 2. In Table 2, only the amino acids on the unit peptides recognized by each MHC class II haplotype are shown.
  • mice determined in Experimental Example 2 have sites on the unity peptide molecule where a part of the corresponding agrtop exists together.
  • SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 12 in the Sequence Listing in which the amino acid residue No.
  • YQTEL peptide SEQ ID NO: 13
  • YETDL peptide SEQ ID NO: 14
  • ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ AL peptide SEQ ID NO: 1
  • YEADL peptide SEQ ID NO: 1
  • SEQ ID NO: 15 in the sequence listing (hereinafter referred to as ⁇ ⁇ EADLKQY And a T-cell epitope recognized by B10.S (s) mice at the amino terminal of the peptide having the amino acid sequence described in (1) and the amino acid sequence of the unit peptide.
  • SEQ ID NO: 17 in the sequence listing (hereinafter, referred to as "unit peptide PAc (305-318)") or both of the above polypeptides.
  • the peptide having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 18 (hereinafter referred to as “PA c (305-318) —unit peptide”) in the sequence list linked in reverse order is:
  • PA c (305-318) unit peptide
  • Each of these polypeptides was synthesized, and these polypeptides were immunized to a series of B10 congenic mice using the same immunization method and schedule as in Experimental Example 1. Two weeks after the booster immunization, blood was collected from each mouse. After separating the serum, dilute it 5 12-fold with physiological saline and use the same EL ⁇ S ⁇ method as in Experimental Example 1.
  • B1 is a different type of MHC class II haplotype. 0.
  • Antibody production was induced in four kinds of mice except S (s).
  • PAc 305 to 318, a mouse that did not respond to this unit peptide at the amino terminal of the unit peptide, such as a unit peptide. B10.
  • Experimental Example 4 Artificial Construction of Multi-Aggregated Topotropic Peptide Antigen for Humans
  • HLA-DR known motif of the MHC class II haplotype
  • O An overlapping 'shift-type multi-aggressive peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 in the sequence listing and capable of simultaneously responding to the restriction of a plurality of MHC class II haplotypes.
  • the short unit peptide prepared in Experimental Example 3 was weakly immunogenic, and we examined linking the polypeptide to tandem to enhance its immunogenicity. Considering that the production of antibodies against the newly generated epitopes is also enhanced, the polypeptide containing the T cell epitopes is used for the purpose of accurately displaying the B cell epitopes.
  • KK which is a recognition sequence of endosomal protease (cathepsin B) involved in antigen processing in antigen-presenting cells, is defined as a linker peptide between the polypeptide containing B-cell epitopes and B-cell peptides.
  • ⁇ IVi P prepared in Experimental Example 4 also contains the amino acid sequence of mouse ⁇ -cell epitope, so that this OMP and unit peptides that become peptides containing B-cell epitopes And SEQ ID NO: 20 (hereinafter abbreviated as “ ⁇ ⁇ ⁇ — KK—unit peptide”) in the sequence listing, wherein the amino acid of KK was inserted between Abbreviated as “unit peptide—— ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ .”)
  • unit peptide—— ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ . Two kinds of polypeptides consisting of the amino acid sequence described were synthesized, and BALBZ c was obtained in the same manner as in Experimental Example 1.
  • the mice were immunized intraperitoneally, and the antibody titers against OMPs, immunized polypeptides, and PAc in the sera were measured by ELISA in the same manner as in Experimental Example 1. Table 6 shows the results. Table 6
  • a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing can induce the production of an antibody having anti-cariogenic activity, but these two molecules are linked by a linker consisting of lysine and lysine.
  • the polypeptide (SEQ ID NO: 22 in the Sequence Listing: unit peptide KK-unit peptide, hereinafter referred to as diunit peptide J) is used for immunization by injection (subcutaneously or intraperitoneally). Can induce antibody production more effectively Is possible and does not require an immune adjuvant. However, since nasal immunity does not show sufficient antibody-inducing ability, simultaneous administration of an immune adjuvant is necessary.
  • a polypeptide was prepared by linking any one or two species from K.
  • diunite peptide alone and this polypeptide were compared to SEQ ID NO: 23 (hereinafter referred to as “DRE ).
  • SEQ ID NO: 24 (hereinafter abbreviated as “DED”).
  • HAV The peptide having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 25 (hereinafter abbreviated as “HAV”) was obtained.
  • the ligated polypeptide was synthesized.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • BALB c mice SLC Japan, female, 5 weeks old
  • Various polypeptide solutions aseptically dissolved at a concentration of 1 ⁇ were inhaled from the nasal cavity by drip from the nasal cavity, 2 I per nose, a total of 4 I (50 / g Z individuals Z times).
  • unit peptide KK The Unitit peptide and the RGD-linked polypeptide were also administered intraperitoneally. Two weeks after the first immunization, a booster immunization was performed by intranasally administering the same type and amount of the polypeptide to the first immunization under the same conditions, respectively, and two weeks later, The same type and amount of polypeptide were administered under the same conditions, and one week later, a cell adhesion amino acid sequence was added to PAc, diunit peptide, CT, and diunit peptide in mouse serum. The antibody titer to each of the polypeptides was measured by the same ELISA method as in Experimental Example 1.
  • RGDS is known as an inhibitor to confirm that these peptides are involved in enhancing antibody production.
  • SEQ ID NO: 26 in the sequence listing or an excess amount of YIGSR (SEQ ID NO: 8 in the sequence listing) were simultaneously added, and immunization was performed in the same manner. Table 7 shows the results.
  • mice immunized with a junit peptide added with one or more selected from RGD, RED, LDV, PHSRN, RKK, DGEA and YIGSR, ⁇ KVAV, IRVVM, and RFYVV MWK In all cases, the production of antibodies against unit peptides was enhanced, and the production of antibodies against unit peptides in mice immunized with DRE, DED, or diunit peptides with HAV was all increased.
  • the peptide on the amino-side as a T cell epitope and the carboxy-terminal on the carboxyl side of the linker are also used.
  • the peptide is more effectively recognized as a B-cell epitope, effectively enhances the production of the antibody specific to the desired B-cell epitope, and furthermore, the linker is interposed. It became clear that by adding an RGD sequence to the amino terminal side, most of the produced antibodies could be made to react only with PAc.
  • Experimental example 8 Universality of basic design of transmucosal peptide vaccine RGD — T cell peptide prepared in Experimental example 7 T-cell peptide of polypeptide composed of KK-B cell epitope An experiment was conducted to determine the effect of replacing either the pitope or the B-cell epitope with a polypeptide other than OMP or unit peptide on the enhancement of antibody production against the B-cell epitope. The procedure was as follows. As a T-cell epitope, a multiaggregate derived from HIVIIIB gp120 described in SEQ ID NO: 36 in the Sequence Listing has already been reported for a wide range of MHC class II haplotypes regardless of species.
  • T1 T1 peptide
  • OVAJ ovalbumin
  • SEQ ID NO: 37 The amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 in the sequence listing A peptide of 14 residues from VA (hereinafter abbreviated as ro VA pJ) (D'F ⁇ Hunt (Hunt D.F.), Science (Science), No. 256) Volumes, pages 1817 to 1820 (1992)), using ⁇ RGD — OMP — KK — OVA p ”(SEQ ID NO: 38 in the sequence listing) or A polypeptide consisting of “T 1 — RGD — KK—unit peptide” (SEQ ID NO: 39 in the sequence listing) was synthesized.
  • mice immunized intranasally with RGD-OMP-KK-OVAp or T1-RGD-KK-unit peptide polypeptides had OVA or PA Production of c-specific antibodies was enhanced. That is, when immunization was performed with the polypeptide to which RGD was added, a stronger enhancement of antibody production was observed than when immunization was performed with the polypeptide to which RGD was not added.
  • Experimental Example 9 Enhancement of antibody production of other antigens by the polypeptide of the present invention
  • c ⁇ used as an adjuvant is strongly antigenic, and when administered nasally, not only antibodies to CT are induced, but also antibodies to non-CT antigens administered transmucosally at the same time as CT. It is known to enhance On the other hand, as is evident from Experimental Examples 7 and 8, RGD — OMP — KK — unit peptide, OMP — RGD — KK—one unit peptide, RGD — OMP — KK — OVA p or T 1 — RGD— KK—The polypeptides of the present invention, consisting of peptides, can be used for their nasal administration alone without using CT as an immunological adjuvant. Antibody production was induced. Further, an experiment for confirming whether or not the polypeptide of the present invention exhibits an antibody production enhancing effect on other antigens was performed as follows.
  • Bovine serum albumin (hereinafter abbreviated as “BSAJ”) 4 ⁇ g, 1 ⁇ g of genit peptide, RGD-unit peptide KK unit peptide 1 ⁇ g, OMP — KK—unit peptide 1 ⁇ g, OMP — RGD — KK—unit peptide 1 fl g, OMP — KK — O
  • a saline solution was prepared by mixing either VA p 1 g, RGD-OMP-KK-OVA p 1 ⁇ g, or CT 2 g, and the nasal immunization of BALBZc mice was performed in the same manner as in Experimental Example 6.
  • the antibody titer in the blood was measured. Table 10 shows the results. The measurement was performed on BSA, peptides administered together with BSA, and antibodies against CT.
  • a saline solution was prepared by mixing 4 ⁇ g of OVA and OMP — RGD — KK — 1 g of unit peptide, 1 ⁇ g of OMP-RGD-KK-OVA or 1 ⁇ g of C ⁇ 2 ⁇ g.
  • B10.D2 mice or BALB / c mice were immunized intranasally in the same manner as in Experimental Example 6, and the antibody titer in the blood was measured. Table 10 shows the results. The measurement was performed for OVA, OMP-RGD--OVAp, and antibodies against CT.
  • OMP—RGD—KK unit peptide
  • OMP—KK—OVA p OMP—KK—OVA p
  • RGD—OMP—KK—OVA p RGD—OMP—KK—OVA p
  • MP— RGD— KK—unit peptide, OMP— KK— OVA p or RGD— O iVi P— KK— OVA is an amount that induces less than or less than the amount that induces antibody production against self. It was confirmed that by intranasal administration of the same with another antigen, it can be used as an immunoadjuvant for inducing antibody production of an antigen other than the self administered simultaneously.
  • an antibody that recognizes an antigenic protein derived from the B-cell epitope used for immunization is efficiently produced.
  • the peptide does not require an immunological adjuvant, and serves as the target protective antibody, neutralizing antibody for the activity of toxins and enzymes, and antibody against allergens. It has been shown that antibodies can be induced against various antigens such as E.g., and that antibody production can be efficiently induced in individuals bound to a wide range of MHC class II haplotypes. It was shown that it can be used as a nasal mucosal immunity peptide vaccine for such purposes. It was also revealed that these polypeptides function as immunoadjuvants when mucosal immunization is performed simultaneously with other antigens.
  • Example 1 Composition for Enhancing the Production of Antibodies Against P Ac
  • RGD—OMP—KK unit peptide, RGD—OMP—KK—unit peptide, RGD—OMP—KK—unit peptide and OMP—KK—unit peptide prepared according to the method of Experimental Example 7.
  • the amount of RGD "j-power" is 100 g of ZmI and one of trehalose (reagent grade, sold by Hayashibara Biochemical Laboratory Co., Ltd.) is distilled water so that it becomes 40%.
  • the syrup was dissolved and sterilized in a conventional manner to give a syrup, which was dispensed into sterile vials at a rate of 2 ml each, sealed, and sealed. A syrup containing the peptide was prepared.
  • Example 2 Composition for enhancing the production of antibodies to PAc
  • RGD-T1—KK-unit peptide prepared according to the method of Experimental Example 7 was added to physiological saline containing 1% (w / V) sucrose, respectively. It was dissolved to 100 g / ml, 100 gUm Zml, or 1,000 gmI, and sterilized by filtration. This was dispensed into sterile vials at 1 ml increments, freeze-dried and sealed in a conventional manner to prepare a polypeptide-containing preparation.
  • This product is a preparation for transmucosal ingestion or injection with excellent stability and excellent caries prevention effect. Use this product after completely dissolving it in 1 ml of distilled water for injection.
  • Example 3 Toxicity test of a composition containing a polypeptide The polypeptide prepared in Example 1 or Example 2 was diluted with physiological saline containing 0.5% sucrose to a concentration of 12.5 mgmI.
  • DDY was administered orally, intraperitoneally, or intramuscularly to male DDY mice in the usual manner to give LD 5 . It was investigated. Both of these preparations is to D 5. Is 100 mg or more in terms of the weight of the mouse in terms of the mass of the polypeptide, indicating that the polypeptide of the present invention is non-toxic and safe when administered to human animals. It indicates that Example 4: Composition for enhancing antibody production against HIV
  • T1 HLA as a T-cell epitope—DR1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 51, 52, 53
  • Example 5 Composition for enhancing production of antibodies to influenza virus
  • RGD or YIGSR using any one selected from OMP, T1, a peptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43 in the sequence listing as a T cell epitope, At the amino or carboxyl terminus, and sandwich the KK linker peptide as a B cell epitope for inducing neutralizing antibodies to influenza virils at the end of lipoxyl.
  • HA hemaglutinin
  • RGD is disposed at the amino terminal or carboxyl terminal, and the KK linker peptide is used.
  • a B cell epitope for inducing a neutralizing antibody to human papillomavirus at the carboxyl terminal end a partial amino acid derived from L2: protein described in SEQ ID NO: 46 in the sequence listing. Peptides having an amino acid sequence homologous to the amino acid sequence (Kaywana, K.), Vaccine, Vol. 19, pp. 1496-1502 , (2001) was prepared.
  • a phosphate-buffered saline solution containing 200 g / mI of either one or two selected from these peptides and 0.225 mg of ZmI of gelatin was prepared. These were dispensed into 5 ml vials to give 0.5 ml vials and lyophilized by a conventional method. Because this product is restricted to a wide range of MHC Class II haplotypes, it is possible to produce antibodies specific to papillomavirus in many humans by transmucosal or transdermal administration to humans. Can be effectively enhanced, thereby preventing infection of human papillomavirus. In addition, this product can be advantageously used as an immunological adjuvant that enhances the production of antibodies to other antigens by transmucosal administration, such as by nasal administration.
  • Example 7 Composition for OVA antibody production
  • Example 8 Composition for enhancing antibody production of influenza vaccine
  • KK unitit peptide Per 1 ml of physiological saline, 4 g of commercially available influenza HA vaccine (available from Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.) or viral surface antigenic proteins such as HA and M protein and RGD—OMP—KK—OVA p or RGD— OMP — Contains 1 ⁇ g of KK unitit peptide A sample having the following formula was prepared. This was dispensed into sterile vials in 0.5 ml increments and sealed. Due to the immunoadjuvant effect of the virus surface antigenic protein and RGD-OMP-KK-OVAp or RGD-OMP-KK-unit peptide, the product can be used as an antibody even if transmucosal administration is used as it is.
  • Example 9 Composition for the treatment of oral desensitization of cedar pollinosis
  • RGD is placed at its amino or carboxyl terminus, and as a B-cell epitope for inducing cedar pollen allergen antibody to the carboxyl-terminal side with KK linker peptide, C VHPQDGDA, a B cell epitope of ryj1
  • this product is restricted to a wide range of MHC class II haplotypes, it can be obtained by transmucosal or transdermal administration to humans, and mucosal administration to humans by cedar pollen allergen Cryj 1 in many humans. Since it produces predominantly ⁇ gG antibody specific to Cryj 2 and Cryj 2, it is useful as a therapeutic agent for oral desensitization of cedar pollinosis by oral administration.
  • the present invention specifically enhances the production of a specific antibody against a target antigen peptide, containing a specific antigen peptide, even in the absence of an immunoadipant.
  • the present invention relates to a polypeptide and a composition containing the polypeptide.
  • the polypeptide of the present invention does not require the use of an immunoadjuvant, and can be used for transmucosal administration such as nasal administration and oral administration. Retained by a wide range of safe, extensive MHC Class II haplotypes to enhance the production of vaccines or specific antibodies for animals producing antibodies, including mammals, birds, reptiles and fish, including many humans Can be used as an antigen.
  • the polypeptide of the present invention can be used as an immunoadjuvant administered together with the antibody to enhance antibody production of other antigens.

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Abstract

免疫アジュバントを使用することなく、経粘膜投与で、抗体産生の増強を誘導することのできるポリペプチド、及び、そのポリペプチドを含有する組成物並びにその用途を提供し、ポリペプチドのアミノ末端側にマルチアグレトープ型T細胞エピトープのアミノ酸配列からなるペプチドを有し、リンカーぺプチドをはさんで、カルボキシル末端側にB細胞エピトープのアミノ酸配列を有し、さらに、このポリペプチドに細胞接着分子の接着モチーフのアミノ酸配列を結合させたポリペプチドを確立し、それを含有した組成物とその用途を提供することにより解決する。

Description

明 細 書 ポリベプチ ド 技術分野
本発明は特定の抗原ェピ トープを含み、 免疫アジュバン ト非存在 下においても、 経粘膜投与によ り、 この抗原ェピ トープに対する特 異抗体の産生を効率よ く誘導するポリペプチ ド、 このポリペプチ ド を含有する組成物、 およびその用途に関し、 よ り詳細には、 抗体産 生の対象となる抗原の B細胞ェピ トープを含むポリ ペプチ ドと T 細胞ェピ トープを、 プロテア一ゼの認識配列のアミノ酸からなる リ ンカーペプチ ドで違結し、 このポリペプチ ドに、 さ らに、 細胞結合 モチーフのアミ ノ酸配列からなるぺプチ ドを遑結した、 目的抗体の 産生を効率よ く誘導するポリペプチ ド、 このポリペプチ ドを含有す る組成物及びその用途に関する。 背京 fe術
生体に、 特定の抗原に対して特異的な抗体産生のみを誘導する場 合には、 精製した抗原を単独で、 或いは、 抗体産生を増強する活性 を有する免疫アジュバン ト （免疫機構を非特異的に刺激することに よって、 抗原に対する特異的免疫反応を強める物質） と共に生体に 投与する方法が一般的に用いられてきた。 この方法は、 種々の感染 症に対する最も有効な予防手段と しても汎用されており、 特に抗生 物質が無効であるウィルスや、 微生物が産生する毒素などのように 他に有効な予防或いは治療方法がない場合には、 生体に、 これらの ウィルスや毒素に対する抗体産生を誘導し、 防御することが唯一の 対策である場合も多い。 現在この方法が実用化されているものと し ては、 病原微生物を有機溶媒や紫外線照射等で不活化して感染性を 無く した不活化ワクチン及び病原体を弱毒化して生体への病原性 を弱めた弱毒化ワクチンであり、 ポリオウイルスワクチンを除き、 全て注射によ り非経口的に投与されている。 しかしながら、 不活化 ワクチンの場合、 防御に必要な抗体価を得るためには数回の注射を 繰り返す必要があり、 生体への負担が大きく 利便性にも劣っている との問題を抱えている。
また、 生ワクチンの場合、 保存安定性に欠けるだけでなく 、 ワク チン投与後に突然変異を起こ し強毒化株とな り生体に害を引き起 こす可能性がある。 さ らには、 不活化ワクチン、 生ワクチンとも生 体に対してアナフィ ラキシーショ ックを与えることもあり、 安全性 に欠ける面があった。 さ らにウィルス粒子そのもの、 或いは、 蛋白 巨大分子を免疫原と して用いるため、 ワクチン製剤と した際の安定 性に欠け、 安定性を保持するたぬヒ 卜血清アルブミ ンやゼラチン等 を製剤の安定剤と して用いる場合もあった。 このためこれら安定剤 に用いた物質に未知の感染性微生物の混入が否定できないこと、 或 いは、 安定剤に対する生体のアナフ ィ ラキシーショ ックが生じるこ ともあり、 安全性、 安定性に欠けるものであった。 また大部分のヮ クチンは注射剤と して製剤化されているものの、 感染症の発生によ リ多く の人命が奪われている地域の多く は発展途上国であり、 ワク チンの普及を図るには安定性に優れた製剤で、 かつ、 注射剤以外の よ り簡便な投与が可能な.ワクチン製剤が求められている。
これらの課題を解決するために、 不活化ワクチンや生ワクチンよ リ も高い安全性と有効性をもつ、 不活化ワクチンや生ワクチンの部 分アミ ノ 酸配列からなるポリ べプチ ドを利用 した新型ワクチンの 開発研究が世界中で鋭意進められており、 B型肝炎ウィルスヮクチ ンに代表される組換え型ヮクチンゃコ ンポーネン 卜ワクチンは、 そ の新型ワクチンの代表例である。 しかしながら、 ワクチンと して利 用するポリべプチ ドの鎖長は短いものほど望ま しいものの、 短く す ればするほど、 生体が個別にもつ主要組織適合性抗原 （以下、 Γ Μ H C」 と略記する。） のク ラス I I ハプロタイプの拘束性を幅広く カバ一し、 十分な免疫原性を有するようにデザイ ンすることが難し く なる。 また、 経粘膜投与時の抗原の免疫原性を高める方法と して は、 対象とする抗原と と もに、 コ レラ毒素 （以下、 「 C T」 と略記 する。） や大腸菌由来の熱不安定型のェンテロ トキシンや、 これら のアミ ノ 酸配列の一部を置換して弱毒化 したものを免疫アジュバ ン 卜と して投与する方法が知られてはいるものの （ィ一 ■ シ一 ■ ラ へ』レ 、 L a 、/ e I I e , E . C . ) 著、 ィムノ ロ ン一 ( ! m rn u n o I o g y )、 第 9 9卷、 3 0乃至 3 7頁、 （ 2 0 0 0年））、 目的と する抗原以外に、 免疫アジュバン 卜と して使用したコ レラ毒素ゃ大 腸菌由来の熱不安定型のェンテロ トキシンに対する抗体が産生さ れるなどの問題があり、 実用に供されていない。
一方、 歯科における微生物が原因とされるニ大疾患には、 う蝕症 と歯周病があり、 これらは、 一般的な疾患で、 且つ、 致死的でない ために、 その予防や治療にはよ り高度な安全性が求められている。 このう蝕症予防の手段と して、 例えば特開平 6 — 1 2 2 6 3 3号公 報には、 ス ト レプトコ ッカス ' ミュータ ンス菌由来の歯面への付着 性を有する蛋白質の断片べプチ ドで免疫した動物の抗体を利用す る （受動免疫） 方法が開示されてお り、 特表 2 0 0 2 — 5 1 1 4 2 2号公報においては、 ス ト レプ トコ ッカス ' ミュータ ンス由来の T 細胞ェピ トープに、 同 じス ト レプ トコ ッカス ' ミュータ ンス由来の B細胞ェピ トープ （グルカンバイ ンディ ング蛋白質） からなるう蝕 予防用のワクチンが記載されている。
また、 これとは別に、 本発明者は、 う蝕予防効果があるこ とが知 られているス ト レプ トコ ッカス . ミ ュータ ンス セロタイ プ C ( S t r e p t o c c o c u m u t a n s s e r o t y p e C ) の歯面への初期付着に関与する表層蛋白質抗原 （以下、 Γ p A c 」 と略記する。） に対する抗体の産生を誘導する系を実験モデルと し て使用 し、 経粘膜投与によ り、 免疫アジュバン 卜非存在下でも、 複 数の M H Cクラス I I のハプロタイ プ（遗伝子型）の個体において、 P A c に対する抗体産生を効率的に誘導できる短鎖ポリ べプチ ド を開発する目的で、 研究を行ってきた。 すなわち、 P A cのァミ ノ 末端から 3 6 5乃至 3 7 7番目 までのア ミ ノ 酸配列である と こ ろ の配列表における配列番号 1 記載のア ミ ノ 酸配列を有するぺプチ ドを B細胞ェピ トープと して使用 し、 このべプチ ドのァミノ末端側 に、 複数の M hi Gクラス ϊ Ϊ のハプロタイプの拘柬を同時に受ける T細胞ェピ トープを結合し、 その間を例えばリ ジン一 リ ジン配列か らなるジペプチ ドリ ンカ一で、 直線的に連結することによ り、 う蝕 を抑制することのできる抗体の産生を増強する方法を提案した （西 沢俊樹、 今井奨、 花田信弘、 第 4回日本ワクチン学会学術集会プロ グラム ' 抄録集、 第 7 7 頁 （ 2 0 0 0年）、 オオイ シ， ワイ （ O i s h i , Y . ) 等、 オーラル マイ ク ロバイオロジー アン ド ィ ノ ロ ン一 、 O r a l M i c r o b i o l o g y a n d I tn m u n o I o g y )、 第 1 6卷、 第 4 0 〜 4 4頁 （ 2 0 0 1 年））。 しかしながら、 これらの文献に開示されるポリペプチ ドも免疫アジ バン ト非存在下で経粘膜的に投与した場合には、 免疫原性が弱 く 、 ポリ べプチ ドを投与しても生体に対 して十分な抗体を誘導 しない という欠点が解決できなかった。 さ らに、 特表平 8 — 5 0 4 1 1 8 号公報には、 T細胞ェピ トープのカルボキシル末端側に B細胞ェピ トープを結合 した トラコーマーク ラ ミ ジァの感染防止用の合成べ プチ ドヮクチンが開示されているものの、 経粘膜投与では十分な抗 体産生を誘導することはできない。
斯かる状況に鑑み、 本発明の課題は、 経粘膜投与であっても十分 な量の目的とする抗体を生体内で産生誘導可能であり 、 安全に投与 できるぺプチ ドワクチンを提供することにある。 発明の開示
本発明者は、 上記課題を解決するために、 う蝕の原因となる微生 物のス ト レプ トコ ッカス ミュータ ンスの P A c (菌体表層蛋白質 抗原） 由来の断片ペプチ ドをモデルと して使用 して、 う蝕の原因と なる微生物の感染防御に有効な抗体の産生を増強できるポリ ぺプ チ ドの研究を進めてきた。 その結果、 ポリペプチ ドのァミ ノ末端側 に、 複数の M H Cクラス Ϊ 〖 のハプロタイプで同時に拘束される T 細胞ェピ トープを含むアミ ノ酸配列を有し、 リ ンカ一ペプチ ドと し てプロテアーゼの認識ァミ ノ酸配列を挟んで、 カルボキシル末端側 に抗体誘導用の B細胞ェピ トープを含むアミ ノ酸配列を有し、 さ ら に、 このポリべプチ ドに細胞結合モチーフと相同なアミノ酸配列を 有するペプチ ドを結合したポリペプチ ドが、 免疫アジュバン 卜非存 在下で経鼻などの経粘膜投与した場合において、 複数の M H Cクラ ス I I のハプロタイ プにおいて、 目的とする抗原に対する特異抗体 の十分な産生を効率よ く増強し、 しかも、 目的とする特異抗体以外 の抗体の産生誘導能が低く 、 また、 アナフラキシ一などの副作用を 誘発しない、 安全性の高いポリペプチ ドであるこ とを見出 した。 ま た、 このポリペプチ ドが、 免疫アジュバン トなしに経粘膜投与した 場合でも、 抗体産生を誘導できること、 さ らには、 このポリべプチ ドが免疫アジュバン ト効果を有することを見出し、 本発明を完成す るに至った。
すなわち、 本発明は、 ァミ ノ末端側に T細胞ェピ トープを含むァ ミ ノ酸配列を有し、 リ ンカ一ペプチ ドをはさんで、 そのカルボキシ ル末端側に B細胞ェピ トープを含むアミ ノ 酸配列を有するぺプチ ド内に、 細胞接着分子の細胞結合モチーフと相同アミ ノ酸配列を有 するポリ ペプチ ドを提供するこ とによって前記課題を解決するも のである。 発明を実施する上での最良の形態
本発明でいう抗体とは、主と してィムノグロブリ ン G ( Ϊ g G )、 ィムノ グロブリ ン M ( I g M )、 ィムノ グロ ブリ ン A ( I g A ) 抗 体でぁリ、血中や体液中に分泌されるものはもとより、鼻腔、口腔、 眼、 消化管などに分泌される抗体も当然これに含まれる。
本発明のポリペプチ ドにおいて、 抗体産生を誘発する部位と して 使用するのは、 B細胞ェピ トープ.或いはそれを含むアミ ノ酸配列部 分である。 また、 このペプチ ドのア ミ ノ酸配列は、 微生物、 細胞、 又は腫瘍細胞に由来する毒素、 アレルゲン、 酵素、 細胞膜抗原、 腫 瘍特異性抗原などの抗原であって、 その各々について文献的に既に 明らかにされている既知の抗原ェピ トープのア ミ ノ 酸配列そのも のでもよ く 、 また実際に生体に対して免疫原性をもつ様々な抗原そ のもの、 或いは、 常法によ り 、 抗原の部分ペプチ ドを免疫してェピ トープ配列を同定し、 この同定したアミ ノ酸配列を有するポリぺプ チ ドを B細胞ェピ トープと して用いてもよい。 また、 この B細胞ェ ピ トープは、 後述の T細胞ェピ トープと同 じ抗原上にあるものでも よく 、 Β細胞ェピ トープとそのアミ ノ酸配列の一部又は全部を共有 していてもよい。 従って、 Β細胞ェピ トープ部分については、 感染 防御、 癌、 腫瘍、 潰瘍、 肝炎など炎症性疾患、 アレルギー及ぴァ 卜 ピー性皮膚炎などの免疫性疾患などの予防や治療、 酵素の中和、 臨 床検査などに使用される各種抗原の検出など、 誘導する抗体の使用 目的に応じて、 好ま しい抗原ポリペプチ ドを選択することが出来る 例えば、 う蝕予防用の抗体を誘導するためには、西沢俊樹、今井奨、 花田信弘、 第 4回日本ワクチン学会学術集会プログラム ■ 抄録集、 第 7 7頁 （ 2 0 0 0年） に記載の前記 P A cの断片ペプチ ドを使用 することができ、 具体的には、 配列表における配列番号 1 記載のァ ミノ酸配列を有するぺプチ ドを挙げることができる。 これらの B細 胞ェピ トープを含むポリぺプチ ドはそのまま使用 してもよ く 、 タ ン デムに連結して、 その 2量体、 3量体あるいは多量体と して使用 し てもよい。 また、 同一抗原上に存在する 2種以上の B細胞ェピ トー プをタ ンデムに連結することも、 抗原全体を B細胞ェピ トープとす ることもできる。 また、 複数種の抗原性タ ンパク質が関与する疾患 治療の場合、 それらの B細胞ェピ トープをタ ンデムに連結すること によ り 、 1 つのポリべプチ ドで複数種の抗原性タ ンパク質に対する 抗体を産生できるポリペプチ ドを設計するこ と も随意である。 この 場合には、 各 B細胞ェピ トープの間に、 後述のリ ンカ一ペプチ ドを 揷入することによ り、 個々のェピ トープのプロセッシングをよ り確 実に行わせることもできる。
また、 本発明のポリペプチ ドに使用する、 T細胞ェピ トープを含 むポリペプチ ドのアミノ酸配列とは、 投与の対象となる ヒ トを含む 哺乳動物、 鳥類、 爬虫類、 または、 魚類の M H Cクラス I I のハプ 口タイプに拘束され、 ヘルパー T細胞用抗原と して提示を受けるァ ミ ノ酸配列或いは、 それを含むアミ ノ酸配列のものであれば何れで もよい。 このポリペプチ ドのアミ ノ酸配列は、 文献的に既に明らか にされている Τ細胞ェピ トープのア ミ ノ 酸配列を利用 してもよ く 、 また、 実際に生体に対して、 常法によ り、 抗原の部分ペプチ ドを免 疫してェピ トープ配列を同定し、 この同定したアミ ノ酸配列を有す るポリべプチ ドを Τ細胞ェピ トープと して用いてもよい。 この Τ細 胞ェピ トープは、 前述した Β細胞ェピ 卜ープを含む抗原上にあって もよ く 、 Β細胞ェピ トープとそのア ミ ノ酸配列の一部又は全部を共 有していてもよい。 これらの Τ細胞ェピ トープぺプチ ドはそのまま 使用 しても、 あるいは同種又は複数種の Τ細胞ェピ トープをタ ンデ ムに連結して使用してもよい。 また、 Τ細胞ェピ トープは、 ァグレ トープ （ M H Cクラス ϊ Ϊ 抗原との結合に必要なアミ ノ酸残基） と なるア ミ ノ 酸残基以外のア ミ ノ 酸残基は他のアミ ノ 酸残基に置換 しても機能を発揮することが可能である。 よって、 本発明で用いる Τ細胞ェピ トープポリぺプチ ドと して、 ァグレ トープが保存された ポリペプチ ドであれば用いることができる。 そこで、 本発明のポリ ぺプチ ドを感染防御ゃ抗ア レルギー等の予防又は治療を目的と し て用いる場合には、 多く の患者に対して適用可能となら しめるため に、 Τ細胞ェピ トープポリべプチ ド部分と して、 複数種の M H Cク ラス I I ハプロタ イ プに対するァグ,レ 卜一プをタ ンデムに又はォ 一バーラップして有するポリべプチ ド （いわゆるマルチァグレ トー プ型ポリペプチ ド） は極めて有用である。 現在、 M H Cクラス I I のハプロタ イ プによる拘束性べプチ ドの基本構造およびァグレ ト ープは、 文献的に数多く 開示されており、 これらを参考に、 使用目 的に併せて Τ細胞ェ ピ トープを含むポリ ペプチ ドを設計する こ と も随意である。 また、 異種の動物における T細胞ェピ トープ又はァ グレ トープをタ ンデムに又はオーバーラ ップして有するポリぺプ チ ドを τ細胞ェピ 卜一プポリペプチ ドと して用いれば、 複数種の動 物に対しても有効な τ細胞ェピ トープポリ べプチ ドとする こ とが できる。
また、 B細胞ェピ トープにおいても、 複数のェピ 卜一プを重複さ せたり、 タ ンデムに連結させたり して、 複数種の抗体を同時に誘導 させるよ うなポリペプチ ドを設計することも随意である。
T細胞ェピ トープを含むポリ ぺプチ ドと B細胞ェピ トープを含 むポリべプチ ドを連結しないで別々に免疫しても、 目的とする抗体 の効率的な産生の増強は望めない。 また、 B細胞ェピ トープを含む ポリ ぺプチ ドと T細胞ェピ トープを含むポリ ぺプチ ドとを連結し たポリぺプチ ドを用いて免疫した場合、 目的とする抗体と ともに、 連結部分のア ミ ノ 酸配列部分を認識する抗体を同時に誘導する こ とがある。 そこで、 本発明のポリペプチ ドにおいて、 T細胞ェピ ト ープ配列と B細胞ェピ ト一プ配列の間に、 プロテア一ゼの認識配列 となるア ミ ノ 酸配列からなる リ ンカーぺプチ ドを揷入する こ とに よ り、 抗原提示におけるプロセシングのプロセスによ リ両ポリぺプ チ ドを酵素的な切断を受けて分離させ、 連結部分のアミノ酸配列部 分を認識する抗体の産生誘導が抑制されるよ う にデザイ ンされて いる。 よって、 免疫原性に優れ、 生体に防御効果を示すために十分 な抗体の産生を増強し、 免疫したペプチ ドに対する抗体ではなく 、 組み込まれた B細胞ェピ トープが由来する抗原性タ ンパク質に対 する抗体産生を増強することが可能となる。
本発明で用いられる、 B細胞ェピ トープを含むペプチ ドと T細胞 ェピ トープと結合するためのリ ンカ一ペプチ ドは、 抗原プロセッシ ングに関与するプロテアーゼの認識配列であれば何れでもよ く 、 具 体的には、 リ ジン一リ ジン （ K K )、 リ ジン一アルギニン （ K R )、 アルギニン一アルギニン （ R R ) などジペプチ ドを挙げることがで き、 なかでも、 カテブシン Bの認識配列である リ ジン一リ ジンから なるジペプチ ドを使用することが望ま しい。 なお、 T細胞ェピ トー プと B細胞ェピ トープが重複して存在するポリ ぺプチ ドを用いる 場合には、 そのポリペプチ ド同士をリ ンカ一ペプチ ドで連結するこ とによ り、 それぞれを、 T細胞ェピ トープ或いは B細胞ェピ 卜一プ と しての機能を発揮させることができる。
本発明で使用する細胞接着分子の細胞結合モチーフと しては、 本 発明のぺプチ ドを粘膜表面に長期間保持するこ とのできるもので ある限り本発明に利用することができる。 例えば、 イ ンテグリ ンフ ア ミ リーに対する結合モチーフをはじめと し、 その他の細胞結合モ チーフのアミ ノ酸配列を用いることができる。 例えば、 インテグリ ン結合モチーフに属するアミ ノ酸配列と しては、 フイ ブロネクチン コラーゲン、 ビ トロネクチン、 フィ プリ ノーゲン、 ラ ミニン、 ヒ ト 免疫不全ウィルス （以下、 「H i V jと略記する。） の T a t タ ンパ ク質等々の細胞接着分子上に存在する結合モチーフ と して知られ る、 アルギニン一グリ シンーァスパラギン酸 （ R G D ： 配列表にお ける配列番号 2 )、アルギニン一グルタ ミ ン酸ーァスパラギン酸（ R E D ： 配列表における配列番号 3 )、 ロイ シン一ァスパラギン酸一 パリ ン （ L D V ： 配列表における配列番号 4 )、 プロ リ ン一ヒスチ ジンーセ リ ン一アルギニン一ァスパラギン （ P H S R N ： 配列表に おける配列番号 5 )、 アルギニン一 リ ジン一リ ジン （ R K K ： 配列 表における配列番号 6 )、 ァスパラギン酸一グリ シン一グルタ ミ ン 酸ーァラニン （ D G E A ： 配列表における配列番号 7 ) などのアミ ノ酸配列を有するペプチ ドが挙げられる。 また、 インテグリ ンのフ ア ミ リー以外の結合モチーフと しては、 チロシン一イ ソロイ シン一 グリ シンーセリ ン一アルギニン （ Y I G S R ： 配列表における配列 番号 8 )、 イ ソロイシン一 リ ジン一パリ ン一ァラニン一バリ ン （ I K V A V ： 配列表における配列番号 9 )、 アルギニン一フエニルァ ラニンーチロシン一パリ ン一 / リ ン一メ チォニン一 卜 リ ブ 卜ファ ン一 リ ジン （ R F Y V V M W K ： 配列表における配列番号 1 0 )、 イ ソロイシン一アルギニン一バリ ン一バリ ン一メチォニン （ I R V V M ： 配列表における配列番号 1 1 ) などのアミノ酸配列からなる ペプチ ドを挙げることができる。 なかでも、 R G D、 R E D , Y I G S Rのアミ ノ酸配列からなるぺプチ ドが、 特異的な抗体産生の誘 導能が強いことから望ま しい。 また、 これら細胞結合モチーフのァ ミノ酸配列を有するぺプチ ドの遑結部位は、 T細胞ェピ トープポリ ぺプチ ドのァミ ノ末端側又はカルボキシル末端側、 又は、 B細胞ェ ピ トープポリ ペプチ ドのァミ ノ 末端側又はカルポキシル末端側の 合計 4箇所から選択でき、 そのうちすく なく とも 1 箇所に連結すれ ばよい。 と りわけ、 T細胞ェピ 卜ープポリペプチ ドのァミ ノ末端側 又はカルポキシル末端側の片側又は両側に連結した本発明のポリ ペプチ ドは、 B細胞ェピ トープポリペプチ ドに特異的な抗体産生が 特に増強されるので望ま しい。
本発明のポリべプチ ドを製造するための方法に限定はなく 、 慣用 のペプチ ド合成法によるか、 或いは、 慣用のペプチ ド合成法によ り あらかじめ、 部分的に合成したペプチ ド同士を結合して、 調製する ことができる （例えば、 社団法人日本生化学会編 「新生化学実験講 座」、 第 1 卷、 「タ ンパク質 V I 」、 第 3 ~ 4 4頁、 1 9 9 2年、 東 京化学同人発行参照。）。 また当該ペプチ ドは、 各メーカーから市販 されているべプチ ドシンセサイザーを用いて装置のプロ 卜コール に従って合成することができる。 また、 本発明のポリペプチ ドは、 組換え D N A技術によ り調製することができる。 例えば、 設計した ポリペプチ ドのアミ ノ酸配列をコー ドする D N Aを調製し、 これを 自立増殖可能なベクターに挿入し、それを大腸菌、枯草菌、放線菌、 酵母などの微生物、 動植物やそれらの細胞又は組織等の宿主に導入 して形質転換体と したり、 トランスジ ニック動植物を作製して、 それらを培養、 育成した後、 本発明のポリペプチ ドを適宜の方法に よ り、 採取 ■ 精製することができる。 また、 本発明のポリペプチ ド を、 丁細胞ェピ トープと B細胞ェピ トープを連結するのに用いたプ ロセシング関連酵素切断部位となるア ミ ノ酸配列以外から選ばれ た適宜のタ ンパク質分解酵素の切断部位となるアミ ノ 酸配列で連 結して発現させた後 当該酵素で分解したものを使用すること も自 由である。 さ らには、 本発明のポリ ペプチ ドを発現させた菌体、 動 物体或いは植物体をそのまま加工して、 本発明のポリぺプチ ドを含 有する経口摂取用の組成物と して使用することも随意である。 また 本発明のポリペプチ ドは、 前記の何れかの方法によ り、 その全アミ ノ酸配列を有するポリペプチ ドを直接調製してもよ く 、 或いは、 予 め、 その一部アミ ノ酸配列を有するポリペプチ ドを合成したもの同 士を、 化学的に結合して調製することも随意である。
本発明のポリペプチ ドは、 特異的な抗体産生の誘導のために、 こ のまま単独で、 或いは、 同一の B細胞ェピ トープを有するポリぺプ チ ドを複数組み合わせて使用するこ とができる。 さ らに、 複数種の 抗原に対する抗体を同時に産生させる場合には、 個々の抗原に対応 する B細胞ェピ トープを有するポリ ペプチ ドの 2種以上を組み合 わせて使用することも随意である。 また、 本発明の効果を妨げない 限り、 本発明のポリペプチ ドに、.製剤学的に許容できる 1 種又は 2 種以上の製剤用添加剤を組み合わせた組成物を調製する こ と も有 利に実施できる。 製剤用の添加剤と しては、 グルコース、 マル トー ス、 ト レハロース、 ショ糖などの還元性或いは非還元性の糖質、 ソ ルビ トール、 マンニ トール、 マルチ トールなどの糖アルコール、 寒 天、 プルラン、 グァガム、 アラ ビアガムなどの水溶性高分子、 ゼラ チン、 シルクなどのタ ンパク質やそれらの加水分解物、 脂質、 アミ ノ酸、 緩衝剤、 安定化剤、 抗菌剤、 香料、 栄養機能食品、 医薬部外 品或いは医薬品の有効成分、 ミ ヨ ウパン、 水酸化アルミニウムなど の免疫アジュバン トなどが挙げられ、 1 種又は 2種以上を適宜組み 合わせて使用できる。 また、 本発明のポリペプチ ドを含有する製剤 の形態と しては、 その製剤中のポリぺプチ ドが長期間安定に保持さ れるものであれば特に制限はなく 、 溶液、 凜結乾燥品、 錠剤、 舌下 錠、 トローチ、 粉末、 顆粒、 ク リーム、 軟膏、 シラップなどの剤形 から、 投与対象、 投与方法、 製剤の保存方法や輸送方法を考慮して 適宜選択すればよい。 また、 本発明のポリペプチ ド又はそれを含有 する組成物は、 必要に応じて、 リボソームに封入したり、 皮膚、 組 織への浸透促進剤やイオン導入法などを併用することによ り、 抗原 提示細胞の存在部位への浸透を促進させるこ と も有利に実施でき る。 また、 本発明のポリペプチ ドは、 錠菓、 飴、 清涼飲料などの各 種飲食品に含有せしめ、 これを経口的に摂取することによ り、 ポリ ペプチ ドを経粘膜的に摂取させることも随意である。 また、 本発明 のポリべプチ ドをコー ドする R N Aを直接生体に投与したり、 細胞 に D N Aを導入するいわゆる遺伝子治療などによ り、 生体内におい て本発明のポリペプチ ドを発現させることもできる。
本発明のポリペプチ ドは、 ヒ ト、 ィヌ、 ネコ、 マウスをはじめと する哺乳類、 ニヮ トリ、 ァヒルをはじめとする鳥類、 爬虫類、 魚類 と りわけ養殖魚類などの抗体産生を行う動物に対して、 病原性のゥ ィルス、 微生物、 細菌などの構成蛋白質やそれらが分泌する毒素に 対する抗体を産生させることができる。 したがって、 ボツリヌス、 大腸菌 O H— 1 5 7などの細菌に起因する食中毒、 破傷風、 ジフテ リア、 インフルエンザなどの感染性疾患の予防又は治療に有効であ る。 また、 アミロイ ド jSぺプチ ドに対する抗体を産生させるこ'とに よるアルツハイマーの治療、 ダニ、 ハウスダス ト、 花粉、 食物など に由来のするアレルゲンに対する特異的な I g G抗体を優位に産 生させることによる各種アレルギー症ゃァ トビー性皮膚炎などの 経口減感作療法に有利に利用できる。 また、 本発明のポリぺプチ ド は、 口腔内、 鼻腔、 眼、 咽喉、 膣内、 気管内、 腹腔、 胸腔、 肺胞内、 食道内、 及び、 胃や腸などの消化管内などへの経粘膜的な投与で粘 膜における I g A抗体産生の誘導及び体液中への I g G抗体産生 の誘導が可能であり、 皮下、 皮内、 筋肉内などの通常のワクチンの 投与経路での投与、 さらに、 場合によっては、 血管内投与も可能で ある。 また、 本発明のポリペプチ ドは、 任意の蛋白質やポリぺプチ ドに対する特異的な抗体の生産に利用できるだけでなく 、 単独では 抗原性の低いオリ ゴぺプチ ドゃポリぺプチ ドに対する抗体の生産 に有利に用いることができる。 したがって、 合成ォリゴぺプチ ドを 動物に免疫することによる抗血清やモノ ク ローナル抗体産生を目 的と して、 前記投与経路による動物での使用に加えて、 試験管内で の免疫担当細胞の感作に有利に使用することができる。
また、 本発明のポリペプチ ドは、 他の抗原あるいはそのポリぺプ チ ドにおける B細胞ェピ トープが由来する抗原性タ ンパク質と同 時に生体に投与することにより、 同時に投与された抗原に対する抗 体産生を誘導する免疫アジュバン トと して使用することができる。 その際の使用量は、 同時に投与する他の抗原あるいはそのポリぺプ チ ドにおける B細胞ェピ トープが由来する抗原に対する抗体産生 を誘導できる量であれば特に制限はない。 ただし、 本発明のポリべ プチ ドに対する抗体産生が誘導されることを望まない場合は、 本発 明のポリペプチ ドの投与量は、 他の抗原の投与量の 1 0質量％以下 好ましく は 1 質量％以下、 さらに好ましくは、 0. 1 質量％以下の とすればよい。
本発明のポリぺプチ ドのヒ トを含む動物への投与方法には、 特に 制限はなく、 このポリぺフチ ドが、 投与部位へ確実に到達できる方 法であれば何れでよい。 例えば、 スポィ トゃ注射器を使用して適量 を粘膜上に滴下してもよく 、 経口摂取や、 ク リーム或いはジエル状 にして粘膜に塗布したり、 カテーテル等で投与部位に誘導してもよ く 、 さらには、 スプレーゃネブライザ一などによ り霧状にして吹き 付けたり、 鼻、 気管或いは肺へ吸引させてもよい。 皮下、 皮内、 筋 肉内 血管内、腹腔内や胸腔内などの体腔内への投与には、注射器、 カテーテル、 点滴などの投与方法を使用することができる。 本発明 のポリペプチ ドの投与量は、 抗体誘導能、 疾患の種類、 投与経路、 投与方法、投与対象動物などを考慮して適宜決定すればよく、通常、 0. 0 0 0 0 1 乃至 1 O O m g Z k g体重、 好ましく は 0. 0 0 0 1 乃至 2 5 m g Z k g体重、 さらに好ましく は 0. 0 0 1 乃至 1 0 m g体盧であ 。
以下、 実験例に基づいて本発明のポリべプチ ドについてより詳細 に説明する。 実験例 生体の感染防御用のワクチンと して利用できるポリ べプチ ドの 開発を考慮して、 う蝕症の病原体であるス 卜レプトコ ッカス ミュ 一 ン人 \ r e p t o c o c c u s /n u t a n s s e r o t y p e C ) の歯面付着因子の一つである P A c (菌体表層タンパ ク質抗原） に対する抗体産生系をモデルに使用 して、 経粘膜的に投 与して、 効率的に誘導することのできる、 ワクチンと しての機能を 有するポリべプチ ドを調製するための実験を以下のよ う にして行 つた。また、実験には、 P A c 中のアミノ酸配列であって、すでに、 遺伝子クローニング、 塩基配列、 アミノ酸配列、 生物活性部位、 B 細胞ェピ トープ、 T細胞ェピ 卜一プの解析から、 P A c分子に交叉 反応性を持ち、 そのう蝕を阻害する活性を有する抗体のみを誘導で きる最小単位のペプチ ド抗原である ことが公知の配列表における 配列番号 1 記載のア ミ ノ 酸ア ミ ノ 酸配列のペプチ ド （以下、 「ュニ ッ 卜ペプチ ド」 としゝう。） を使用 した （ H . S E N P U K U ら、 I n f e c ί i o n a n d i m m u n i t , o 3 : 4 6 9 o —
4 7 0 3 ( 1 9 9 5 ) 参照）。 なお、 以下の実験で使用したポリぺ プチ ドは、 全てぺプチ ドシンセサイザー （ァ ドバンス ド ■ ケムテツ ク （ A d v a n c e d C e m t e c h ) 社製造、 M o d e I 3
5 0 M u l t i p l e P e p t i d e S y n t h e s i z e r ) を用いて F m o c法にて合成し、 T S K— G E Lカラム （力 ラムサイズ ： 直径 1 c m、 長さ 3 0 c m、 東ソ一株式会社製造） を 使用 した逆相 H P L Cで精製した純度 9 5 %以上の標品である。 実験例 1 ： ユニッ トペプチ ドに対するマウスの M H Cクラス I I の ハプロタイプの拘束性の解析
M H Cクラス I I のハプロタイ プのみが異なる 8種類の B 1 0 コンジヱニックマウス （日本 S L C株式会社販売、 雌 ； 5週令、 ― 群 ； 5匹） のそれぞれに前記ユニッ トペプチ ド （ 2 0 0 g Zマウ ス） をフロイン 卜の不完全アジュバン ト （ F I A) と共に腹腔免疫 し、 2週間後に初回免疫と同条件で追加免疫した。 その 1 週間後に 採血し、 その血清中のュニッ トぺプチ ド及び P A cに対する抗体価 を、 ュニッ 卜ペプチ ド或いは P A c をコー ト抗原と して使用 した、 常法の E L I S A法によ り測定した。その結果を表 1 に示す 9なお、 以下の実験における、 各抗原に対する抗体価は、 個々のマウスから 採血した血液の血清を、 それぞれ連続的に 2倍希釈した標品中の抗 体量を、 E L 〖 S A法により、 酵素標識抗体を使用して検出 し、 分 析に使用したマイクロタイタープレー 卜の各ゥエルについて、 マイ クロタイタープレー ト リーダー （マルチスキャン パ、イクロマテツ ク、ラボシステム社販売）によ リ、 4 0 5 n mの吸光度を測定して、 その吸光度と、 コー 卜抗原を使用 していない対照のゥエルの吸光度 を比較し、 その差が 0. 1 以上となる血清の最高希釈倍率を求め、 平均して、 抗体価と して表した。 また、 コ ンジエニックマウスの種 類の名称の後に、 そのマウスの M H Cクラス 〖 〖 のハプロタイ プの 型を括弧内に併記した。
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表 1 から明らかなように、 マウスの IV1 H Gクラス £ I ( H - 2 ) のハプロタイプが i 、 d 、 或いは、 k型の B I O . , Β 1 0. D 2、 B I O . B Rの 3種のコ ンジエニックマウスでは、 他のタイプ M H Gクラス I I ( H - 2 ) のハプロタイプのマウス比較して、 ュ ニッ 卜ぺプチ ド及び P A c に特異的な抗体の産生が強く 誘導され た (約 1 0倍以上）。 このことから、 このユニッ トペプチ ドには、 H— 2のクラス ί I が d 、 f 、 k型の複数のハプロタイプのコ ンジ エニックマウスにおいて、 抗 P A c抗体を誘導するための B細胞ェ ピ 卜ープと、 抗原提示に必要な、 複数の M H Cクラス I I のハプロ タイプ （ H— 2 d， f , k型） の拘束を受ける複数の Τ細胞ェピ ト ープとが、 共存していることが明らかになった。 また、 1 3残基の 短鎖ペプチ ドからなるユニッ トペプチ ド中に、 M H Cクラス I I ( Η - 2 A ) の複数種のハプロタイプに同時に応答できる、 マルチ ァグレ トープ型の T細胞ェピ トープを有するぺプチ ド抗原が存在 することは、 1 種類の短いポリペプチ ドを使用 しても、 M H Cクラ ス I I ハプロタイプの異なる複数の個体に、 効率的に抗体産生を誘 導できる T細胞ェピ トープを有するポリペプチ ドを、 人為的に設計 できる可能性を示唆している。 実験例 2 ： マウスにおけるマルチァグレ トープ型 T細胞ェピ トープ の確認
実験例 1 でュニッ トぺプチ ドに、 マルチアグレ ト一プ型の τ細胞 ェピ トープの存在が確認されたため、 マウスにおけるマルチァグレ 卜ープ型 τ細胞ェピ トープと して機能するア ミ ノ酸配列とその位 置関係を確認するための実験を以下のようにして行った。 ュニッ ト ペプチ ドのア ミ ノ酸残基を順次バリ ンに置き換えたパリ ン置換べ プチ ドを合成し、 それらを前述のュニッ 卜ぺプチ ド応答マウスに免 疫することによ り、 抗体誘導に不可欠のァミノ酸残基をそれぞれ推 定した。 さ らに、 推定ァグレ トープに関与する全てのアミノ酸をバ リ ンで同時に置換した位置限定パリ ン置換べプチ ドをそれぞれ合 成し、 実験例 1 と同様の方法、 スケジュールで、 各コ ンジエニック マウスを免役し、 実験例 1 と同様に、 血清中の抗体価を E し 〖 S A を用いて測定し、 その免疫による抗体誘導能の検討から、 それぞれ の M H Cク ラス I I のハプロタ イ プに対応するュニッ 卜ぺプチ ド 抗原上のァグレ トープを決定した。 その結果を表 2にまとめて示す なお、 表 2 には、 各々の M H Cクラス I I のハプロタイ プで認識さ れるュニッ トペプチ ド上のアミノ酸のみを表記した。 t
o o
1 2 3 4 5 .6 7 8 9 10 11 12 13
ュニットペプチドのアミノ酸
曰しクリ Thr Glu Ala Ala Leu Gin Glu Aal Asp Leu
B 10. A (a) のマウスの
拘束に関与するアミノ酸 Ala Lys Gin Ala
BI O. D 2 (d) のマウス
の拘束に関与するアミノ酸 Glu Leu Lys Asp Leu
B 10. M (f ) のマウスの
拘束に関与するアミノ酸 Leu Tyr Glu Leu
B 10. BR (k) のマウス
の拘束に関与するアミノ酸 Thr Tyr Ala Gin
t o
02 表 2から明らかなように、 それぞれの M H Cクラス I I のハプロ タイプで認識されるために必要な 4又は 5個のアミノ酸残基 （ァグ レ トープ） 力《、 何れでも、 アミノ酸 1 3残基のュニッ 卜ペプチ ド分 子内に重複およびシフ 卜 して共存しており、 ュニッ トぺプチ ド内に マルチァグレ トープ型 T細胞ェピ トープと して、 各々の M H Cクラ ス I I のハプロタイ プによ り認識されるアミ ノ酸の位置関係が確 認された。 実験例 3 ： マルチァグレ トープ型ペプチ ド抗原の人為的構築
前記ュニッ トペプチ ドのアミノ酸配列に手を加えることによ り 、 人為的に M H Gクラス I I ハプロ タイ プによる拘束に関するマウ スの免疫応答を変化させることが可能か否か検討した。 実験例 2で 決定した B I O . D 2 ( d ) 或し、は B I O . M ( f ) マウスにそれ ぞれ対応するァグレ トープの一部が共存するュニッ 卜べプチ ド分 子上の部位 （配列表における配列番号 1 のアミノ酸配列を有するュ ニッ トペプチ ドのァミノ末端から 1 0〜 1 2番） のアミノ酸残基を 意図的に他のアミノ酸残基と置換した、 配列表における配列番号 1 2 (以下、 「 Y Q T E Lペプチ ド」 という。）、 配列番号 1 3 (以下、 「 Y E T D Lペプチ ド」 という。）、 配列番号 1 4 (以下、 Γ Υ Ε Τ A Lペプチ ド」 という。）、 また、 配列番号 1 (以下、 「 Y E A D L ペプチ ド」 という。） に記載のアミ ノ酸配列を有するペプチ ド、 ュ ニッ トぺプチ ドのカルポキシル末端にリ ジン一グルタ ミ ン一チロ シンをさ らに結合した、 配列表における配列番号 1 5 (以下、 Γ Υ E A D L K Q Yペプチ ド」 とし、う。） に記載のアミノ酸配列を有す るペプチ ド、 及び、 ユニッ トペプチ ドのァミノ末端に、 B 1 0. S ( s ) マウスが認識する T細胞ェピ トープと して公知の P A cのァ ミノ末端から 3 0 5 〜 3 1 8のア ミ ノ酸配列を有する配列表にお ける配列番号 1 6に記載のアミ ノ酸配列を有するペプチ ド （以下、 Γ P A C ( 3 0 5〜 3 1 8 )」 という。） を連結して、 配列表におけ る配列番号 1 7 (以下、 「ユニッ トペプチ ド一 P A c ( 3 0 5〜 3 1 8 )」 という。） 又は上記両ポリペプチ ドを逆順に連結した配列表 における配列番号 1 8 (以下、 「 P A c ( 3 0 5 - 3 1 8 ) —ュニ ッ トペプチ ド」 という。） に記載のア ミ ノ酸配列を有するペプチ ド を、 それぞれ合成して、 これらのポリペプチ ドを、 実験例 1 と同様 の、 免疫方法、 スケジュールで一連の B 1 0 コンジエニックマウス に免疫し、 追加免疫の 2週間後に、 各マウスから採血し、 これから 血清を分離後、 生理食塩水で 5 1 2倍に希釈して、 実験例 1 と同様 の E L ί S Α法で測定し、 免疫に使用 した各々のポリペプチ ドに対 する各々のコ ンジエニックマウスにおける抗体産生の誘導程度を、 4 0 5 n mの吸光度で比較した。 その結果を表 3に示す。 また、 ュ ニッ トペプチ ド一 P A c ( 3 0 5〜 3 1 8 ) 或いは P A c ( 3 0 5 〜 3 1 8 ) —ュニッ トペプチ ドで免疫したマウスの血清中のュニッ 卜ペプチ ドに特異的な抗体量の測定結果を表 4に示す。 なお、 吸光 度が、 0. 1 以上の場合には、 希釈した血清中に、 ユニッ トぺプチ ドに対する抗体が存在すると判定した。
b
O ατ o
ユニットペプチドに対する抗体価 （405皿吸光度）
フス
コンジエニックマ MHCク PAc
I Iのハプロ
ウスの種類 YQTEL YETDL YETAL YEADL YQADLK (305-3J8)- タイプ
ぺプチド ペプチド ペプチド ペプチド ユニット
ペプチド
ペプチド'
B10. A a 0.01 0.01 0.01 0.28 0.29 0.29
BIO. D2 d 0.01 0.32 0.32 0.33 0.32 0.30
Bl 0. M f 0.01 0.12 0.33 0.32 0.32 0.32
BIO. BR k 0.22 0.31 0.30 0.30 0.30 0.30
BIO. S s 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.31
BIO. SM V 0.01 0.01 0.01 0.01 0.32 0.31
bo
CO
03 表 4 ：
Figure imgf000025_0001
表 3から明らかなように、 ュニッ トぺプチ ドのアミノ酸を意図的 にデザインすることによ り、 Y Q T E Lペプチ ドで免疫した場合に は、 B 1 0. B R ( k ) 1 種類のみに抗体産生産生が誘導されたの に対して、 Y E A D しペプチ ド （ユニッ トペプチ ド） で免役した場 合には、 B 1 0. S ( s ) 及ぴ B 1 0. S ( V ) を除く 3種のマ ウスに同時に抗体の産生が誘導された。 このことから、 ぺフチ ド中 の 1 〜 3個のアミノ酸の種類を変えることによ り、 異なる M H Cク ラス I I のハプロタイプを有する個体において、 そのユニッ トぺプ チ ドに対する免疫応答性を変化させる ことができることが確認さ れた。 また、 Y E A D L K Q Yペプチ ドのように、 ユニッ トぺプチ ドのカルポキシル末端にリ ジン一グルタ ミ ン一チ口シンを附加す ることによ り、 M H Cクラス I I のハプロタイ プの型の異なる、 B 1 0. S ( s ) を除く 4種類のマウスで抗体の産生が誘導された。 さらに、 表 3及び表 4から明らかなように、 P A c ( 3 0 5〜 3 1 8 ) —ユニッ トペプチ ドのように、 ユニッ トペプチ ドのァミ ノ末端 に、 このユニッ トペプチ ドに不応答マウスである B 1 0. S ( s ) が応答することが知られている T細胞ェピ トープである P A c ( 3 0 5〜 3 1 8 ) ペプチ ドを連結することによ り s型を含む 5種類の M H Cクラス I I 型を有する個体で、 同時にュニッ トぺプチ ドに対 する抗体が誘導できるマルチァグレ トープ型ペプチ ド抗原となる ことが確認された。 これらのことから、 抗原上の複数の M H Cクラ ス I I のハプロタイ プによる拘束性に関与するアミ ノ酸配列の解 析を行い、 その結果に基づき、 個々の M H Cクラス I I のハプロタ イ ブの拘束を受けるアミ ノ 酸配列を重複させたア ミ ノ酸配列を有 するペプチ ドを人為的にデザインすることによ り、 抗原に対する抗 体産生を効率的に誘導でき、 複数の M H Cクラス I I のハプロタイ プの拘束を同時に受けるこ とができる重複型のマルチァグレ トー プ型 T細胞ェピ トープの構築が可能であることが確認された。 また. 複数の丁細胞ェピ トープをタ ンデムに結合するこ とによ り調製し たクラスター型 T細胞ェピ 卜一プも、 重複型ェピ 卜ープと同様に、 複数の M H Cクラス I I のハプロタイ プの拘束を受ける個体に対 する、 抗体産生を効率よ く誘導する τ細胞ェピ トープとなることが 確認された。 また、 表 4から明らかなように、 P A c ( 3 0 5 〜 3 1 8 ) とユニッ トペプチ ドを連結したポリペプチ ドで免役したマウ スにおける、 ュニッ 卜ペプチ ドに対する抗体の産生は、 免疫に使用 したポリぺプチ ドのカルボキシル末端側にュニッ トぺプチ ドを連 結した場合の方が、 ァミ ノ末端側に連結したものよ り も、 抗体産生 の増強が強い傾向が認められた。 実験例 4 ： ヒ ト用マルチァグレ トープ型ペプチ ド抗原の人為的構築 上記実験例 3の結果に鑑み、 M H Cクラス I I ハプロタイプの拘 束に起因するヒ 卜による免疫原性の強弱の解決策と して、 公知のヒ 卜の M H Cクラス I I ハプロタイプ （ H L A— D R ) 拘束に対する T細胞ェピ トープの拘束モチーフ （ァグレ トープ配置） に基づき、 配列表における配列番号 1 9に記載のァミノ酸配列を有する、 複数 の M H Cク ラス I I のハプロ タ イ プの拘束に対して同時に応答可 能な重複 ' シフ ト型のマルチァグレ トープ型ペプチ ド （ O v e r I a p p I n g M u I t i a g r e t o p e P e p t i d e : 以 下の実験では、 このペプチ ドを 「 O M P」 と略記する。） を構築し た。 なお、 真体的なデータは示さないが、 このポリペプチ ドは、 マ ウスにおいても、 Τ細胞のマルチァグレ トープと しての機能を有す ることが確認された。 なお、 表 5 と して、 ヒ 卜の M H Cクラス I I である H L A— D Rの各々のハプロ タ イ プによ り認識される Ο Μ Ρ上のアミノ酸のみを示した。
to t
o o cn
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
OMPのアミノ酸配列 Leu Ala Val Tyr Trp Glu Leu Leu Ala Lys Tyr Leu Leu Asp Arg Val Gin Lys Val Ala
HLA-DRlの拘束に関与
Tyr Leu
するアミノ酸 Leu
Ala
HLA-DR3の拘束に関与
Val Glu
するアミノ酸
HLA-DR4の拘束〖こ関与
するアミノ酸 Tyr Asp Val Gin
HLA- DR5の拘束をに関与
するアミノ酸 Leu Arg Val Lys
HLA-DK6の拘束に関与 t するアミノ酸 Leu Arg Val Lys Ala
HLA-DR7の拘束に関与
Tyr Leu
するアミノ酸 Leu
HLA - DR8の拘束に関与
するアミノ酸 Leu Val Lys
HLA - DR- 11の拘束に閧
与するア 酸 Trp Leu Lys
05 実験例 5 ： ポリペプチ ドの特異抗体産生の増強に及ぼすリ ンカ一べ プチ ドの影響
実験例 3で調製 した短鎖のュニッ トペプチ ドでは免疫原性が弱 く 、 その免疫原性の増強のために、 ポリペプチ ドをタ ンデムに連結 することを検討したものの、 このままでは、 連結によ り生じた新た なェピ トープに対する抗体産生も増強されることを考慮し、 B細胞 ェピ トープが正確に提示されることを目的と して、 T細胞ェピ トー プを含むポリ べプチ ドと B細胞ェピ トープを含むポリ ぺプチ ドの 間に、 抗原提示細胞で抗原のプロセッシングに関与するェン ドソー ム内プロテアーゼ (カテブシン B ) の認識配列である K Kをリ ンカ 一ペプチ ドと して挿入し、 その抗体産生の増強に対^る影響を確認 する実験を以下のように行った。 実験例 4で調製した◦ IVi Pはマウ スの τ細胞ェピ トープのアミ ノ酸配列も含んでいることから、 この O M P と、 B細胞ェピ トープを含むペプチ ドとなるュニッ 卜ぺプチ ドとの間に、 K Kのアミ ノ酸を挿入した、 配列表における配列番号 2 0 (以下、 Γ θ Μ Ρ — K K—ユニッ トペプチ ド」 と略記する。）、 及び、 配列番号 2 1 (以下、 「ュニッ 卜ペプチ ド— Κ Κ一 Ο Μ Ρ」 と略記する。） 記載のアミ ノ 酸配列からなる 2種類のポリぺプチ ド を合成し、 実験例 1 と同様の方法によ り、 B A L B Z cマウスの腹 腔内に免疫し、 実験例 1 と同様に、 E L I S Aによ り、 その血清中 の、 O M P、 免役したポリペプチ ド、 及び、 P A c に対する抗体価 を測定した。 その結果を表 6に示す。 表 6
Figure imgf000030_0001
表 6から明らかなように、 リ ンカ一ぺプチ ドの K Kを挟んで T細 胞ェピ トープである◦ M Pをポリぺプチ ドのァミ ノ末端側に、 B細 胞ェピ トープであるュニッ トぺプチ ドをカルボキシル末端側に位 置 せることによ り、 効率の良い抗体の誘導が認められた。 また、 この傾向は、 実験例 3でもマウスの系統にかかわらず同様であ り 、 と りわけ、 ュニッ 卜ペプチ ドのアミ ノ酸配列には T細胞ェピ トープ が存在せず、 P A c ( 3 0 5〜 3 1 8 ) のアミ ノ酸配列にのみに T 細胞ェピ トープが存在する B 1 0 . S ( s ) においては顕著であつ た （表 4参照）。 以上から、 リ ンカ一ペプチ ドを挟んでアミ ノ 末側 のぺプチ ドが T細胞ェピ 卜ープと して、 またカルボキシル末側のぺ プチ ドが B細胞ェ ピ 卜一プと してよ リ効果的に認識されるこ とが 明らかとなった。 実験例 6 ： 細胞接着分子の細胞結合モチーフ附加によるペプチ ド抗 原の鼻腔免疫における免疫原性の増強
配列表における配列番号 1 のア ミ ノ 酸配列を有するポリ ぺプチ ドは抗う蝕活性を有する抗体を産生誘導することができるが、 この 2分子を リ ジン一リ ジンからなる リ ンカ一で連結したポリ ぺプヂ ド （配列表における配列番号 2 2 ： ュニッ 卜ペプチ ド一 K K—ュニ ッ トペプチ ド、 以下、 「ジユニッ トペプチ ド J という。） は、 注射 （皮 下或いは腹腔） による免疫においては、 よ り効果的に抗体産生誘導 が可能であり 、 免疫アジュバン 卜を必要しない。 しかしながら、 経 鼻免疫においては十分な抗体誘導能を示さないので、 免疫アジュバ ン トの同時投与が必要である。 そこで、 経鼻免疫における抗原性を 増強することを目的と して、 ジユニッ トペプチ ドを粘膜面に長く 留 めるために、 インテグリンファ ミ リ一等を介しての細胞接着性が証 明されているタ ンパク質 （フイ ブロネクチン、 ラ ミニン、 コラーゲ ン等） のインテグリ ン結合モチーフや他の細胞接着モチーフのアミ ノ 酸配列を当該べプチ ドに附加する こ とによる免疫原性に対する 影響を確認するための実験を以下のように行った。 すなわち、 前記 ジュニッ 卜ペプチ ドの、 ァミ ノ末端側に、 細胞接着アミノ酸配列と して R G D、 R E D、 L D V、 P H S R N、 R K K、 D G E A及ぴ Y i G S R、 I K V A V、 i R V V iVl、 及ぴ R F Y V V MW Kから 遷ばれる何れか 1 種又は 2種を連結したポリぺプチ ドを合成した。 また、 対照と して、 ジユニッ トペプチ ドのみ、 及び、 このポリぺプ チ ドに、 単独では細胞接着能が無いとされている力 ドヘリ ン関連の 配列表における配列番号 2 3 (以下、 「 D R E」 と略記する。）、 配 列番号 2 4 (以下、 Γ D E D」 と略記する。） 配列番号 2 5 (以下、 「 H A V」 と略記する。） に記載のアミ ノ酸配列を有するペプチ ド を連結したポリぺプチ ドを合成した。 一群 5匹の B A L B c マウ ス （日本 S L C株式会社、 雌、 5週令） に、 リ ン酸緩衝生理食塩水 (以下、 「 P B S」 と略記する。） または蒸留水に 5 0 g Z 4 I の濃度で無菌的に溶解した各種ポリ ペプチ ド溶液を、 片鼻 2 I 、 計 4 I ( 5 0 / g Z個体 Z回）、鼻腔から滴下によ り吸入させた。 なお、 さ らに、 陰性対照と して、 ジユニッ トペプチ ドのみを経鼻投 与した群、 及び、 陽性対照と して、 ジュニッ トペプチ ドと共に C T 1 μ g を投与した群を設定した。 また、 ュニッ トペプチ ド一 K K— ュニッ トぺプチ ド及びこれに R G Dを連結したポリべプチ ドは、 腹 腔内投与も行った。 初回免疫の 2週間後に、 追加免疫と して、 各々 初回と同種類、 同量のポリべプチ ドを同条件下に経鼻的に投与した, さ らに、 その 2週間後に、 各々前回と同一種類、 同一量のポリぺプ チ ドを同条件下で投与し、その一週後、マウスの血清中の、 P A c、 ジユニッ トペプチ ド、 C T、 ジユニッ トペプチ ドに細胞接着アミノ 酸配列を附加 したポリべプチ ドの各々に対する抗体価を、 実験例 1 と同様の E L I S A法によ りそれぞれ測定した。 また、 R G D或い Y I G S Rを附加したポリペプチ ドについては、 これらのぺプチ ド が、 抗体産生の増強に関与していることを確認するために、 その阻 害剤と して知られている、 R G D S (配列表における配列番号 2 6 ) 或いは Y I G S R (配列表における配列番号 8 ) の過剰量を同時に 添加 して、 同様に免疫を行った。 その結果を表 7 に示す。 なお、 R G D、 R E D , L D V、 P H S R N、 R K K、 D G E A及び Y I G S R、 Ϊ K V A V , I R V V M、 及ぴ R F Y V V MW Kから選ばれ る何れか 1 種又は 2種以上を附加 したジュニッ トぺプチ ドで免疫 したマウスでは、 何れも、 ュニッ 卜ペプチ ドに対する抗体の産生が 増強され、 D R E、 D E D、 或いは、 H A V附加したジユニッ トぺ プチ ドで免疫したマウスでは何れも、 ュニッ トぺプチ ドに対する抗 体の産生が増強されなかったので、表 7 では、 ジュニッ トぺプチ ド、 配列表における配列番号 2 7 (以下、 Γ R G D—ジユニッ トべプチ ド J という。）、 配列番号 2 8 (以下、 「 R E D—ジユニッ トぺプチ ド J という。）、 配列番号 2 9 (以下、 Γ Y I G S R—ジユニッ トぺ プチ ド」 という。）、 配列番号 3 0 (以下、 「 D E D—ジユニッ トぺ プチ ド」 という。）、 配列番号 3 1 (以下、 「 H A V—ジユニッ トぺ プチ ド」 'という。） に記載のアミ ノ 酸配列を有するポリペプチ ドで 免疫した結果のみを示す。
Figure imgf000033_0001
表 7から明らかなように、 ジュニッ 卜ペプチ ドを単独で経鼻投与 したのでは、 ほとんどュニッ トぺプチ ドに対する抗体産生の誘導が 認められないのに対して、 イ ンテグリ ン結合モチーフの R G D 、 R E D、 或いは、 ラ ミニン結合タ ンパク質に対するラ ミニン分子上の 結合モチーフの Y 〖 G S Rを附加 した R G D—ジュニッ 卜ぺプチ ド、 R E D—ジユニッ トペプチ ド、 或いは、 Y I G S R—ジュニッ トぺプチ ドを経鼻投与した場合には、 抗体産生の増強効果が認めら れた。 なお、 その際に、 イ ンテグリ ンへの結合阻害剤である R G D Sや Y I G S Rの短鎖ペプチ ドを過剰量共存させた場合には、 P A c に特異的な抗体の産生が抑制された。 この結果は、 R G Dや Y I
G S Rなどの細胞接着分子のモチーフの附加が、 ポリべプチ ドのも つ抗体産生の誘導能をさ らに増強する効果があること、 その効果は ジュニッ トぺプチ ドが粘膜細胞膜に存在するイ ンテグリ ンに結合 することによ り発揮するこ とが示唆された。 実験例 7 ： 経粘膜投与ペプチ ドワクチンの抗体産生増強に対する細 胞接着分子の影響.
実験例 6 のジュニッ トぺプチ ドで証明されたイ ンテグリ ン結合 モチーフの附加の及ぼす、 他のぺプチ ド抗原による抗体産生の増強 への影響、 及び、 インテグリ ン結合モチーフの附加部位の違いによ る抗体産生増強への影響を調べる実験を、 以下のように行った。 実 験例 5で P A c に対する特異抗体の産生増強能の高いこ とが確認 された、 O M P— K K—ユニッ トペプチ ドの O M P、 或いは、 ュニ ッ トぺプチ ドのァミ ノ末端側又はカルボキシル末端側に、 実験例 6 で、 ポリぺフチ ドの抗体産生の誘導の増強作用が示唆された細胞接 着分子のイ ンテグリ ン結合モチーフ と して知られている R G Dを、 揷入 して、 Γ R G D— O iVi P—！《 K一ユニッ トペプチ ド」 （酉己列表 における配列番号 3 2 )、 Γ Ο Μ Ρ — R G D — K K—ュニッ トぺプ チ ド J (配列表における配列番号 3 3 )、 「 O M P— K K— R G D— ユニッ トペプチ ド J (配列表における配列番号 3 4 )、 Γ O M P— K K一ュニッ 卜ぺプチ ドー R G D」 （配列表における配列番号 3 5 ) という配列を有する合計 4種類のポリべプチ ドを合成した。 なお、 陽性対照と して、 経粘膜投与でアジュバン 卜活性を有することが既 に知られている C T を使用 した。 これらのポリぺプチ ド或いはポリ ペプチ ドと C Tの混合液を使用 して、 実験例 6 と同 じ方法によ り、 B 1 0マウスを免疫して、 その抗体産生の増強.を誘導する効果の有 無を判定した。 その結果を表 8に示す。 表 8
Figure imgf000035_0001
表 8から明らかなように、 O M P— K K—ュニッ 卜ペプチ ドに R G Dを挿入すると P A c に対する抗体産生が強く増強された。 特に R G D を O M Pのァ ミ ノ 末端側或いはカルボキシル末端側に揷入 した場合に 言い換えれば、 リ ンカ一を挟んで N末端側に揷入した 場合に、 目的とする抗体の産生量はアジュバン 卜と して G Tを用い た場合よ り も顕著に強く増強され、 かつ、 誘導される抗体のほとん どが P A c と反応する抗体である こ とが確認された。 一方、 リ ンカ 一を挟んで C末端側に挿入した場合、 誘導される抗体の多く は、 R D G配列を含むぺプチ ド部分由来と反応する抗体である こ とが確 認された。
これらのこ とから、 アジュバン ト非存在下における経鼻免疫にお いても リ ンカーを挟んでァ ミ ノ 末側のぺプチ ドが T細胞ェピ トー プと して、 またカルボキシル末側のぺプチ ドが B細胞ェピ 卜ープと してよ り効果的に認識され、 目的とする B細胞ェピ トープに特異的 な抗体産生を効率的に増強し、 しかも、 リ ンカ一を挟んでアミノ 末 端側に R G D配列を附加することによ り、 産生される抗体のほとん どを P A c のみと反応する抗体とする こ とができる こ とが明かと なった。 実験例 8 ： 経粘膜投与べプチ ドワクチンの基本デザイ ンの普遍性 実験例 7 で調製 した R G D — T細胞ェ ピ 卜一ブー K K一 B細胞 ェピ トープで構成されたポリ ペプチ ドの T細胞ェピ トープと B細 胞ェピ トープの何れか一方を、 O M P或いはュニッ トぺプチ ド以外 のポリペプチ ドで置き換えた場合の、 B細胞ェピ トープに対する抗 体産生の増強への影響を調べる実験を以下のよう に行った。 T細胞 ェピ トープと して、 種を問わず幅広い M H Cクラス I I ハプロタイ プの拘束性がすでに報告されている、 配列表における配列番号 3 6 記載の H I V I I I B g p 1 2 0 由来のマルチアグレ ト一プ 型 T細胞ェピ 卜一プである T 1 ペプチ ド （ジエイ ' ディー ' ァーラ —ズ （ A h I e r s J . D . ) 著、 プロシーディ ングズ ' ォブ ■ ザ ' ナショナル ' アカデミー ■ ォブ ' サイエンシーズ ■ ユーエスェ ィ 、 P r o c e e d i n g s o f ' t h e N a t i o n a l A c a d e m o f S c i e n c e s U S A 弟 9 4卷、 第 2 0号、 1 0 8 5 6乃至 1 0 8 6 1 頁 （ 1 9 9 7年） 参照。） （以 下、 「 T 1 」 と略記する。） を使用 し、 Β細胞ェピ 卜一プと して Β Α L B Z c マウスにおいて卵白アルブミ ン (以下、 Γ O V A J と略記 する。） に対する抗体を誘導するこ とが知られている、 配列表にお ける配列番号 3 7 記載のアミ ノ 酸配列からなる◦ V A由来の 1 4 残基のペプチ ド （以下、 r o V A p J と略記する） （ディー ' エフ ■ ハン ト （ H u n t D . F . )、 サイエンス （ S c i e n c e )、 第 2 5 6巻、 1 8 1 7乃至 1 8 2 0頁 （ 1 9 9 2年） 参照。） を使用 して、 Γ R G D — O M P — K K— O V A p」 （配列表における配列番 号 3 8 )、 或いは、 「 T 1 — R G D — K K—ュニッ トペプチ ド」 （配 列表における配列番号 3 9 ) からなるポリペプチ ドを合成した。 ま た、 対照と して、 Γ O M P— K K— O V A p」 （配列表における配列 番号 4 0 ) 又は 「 T 1 — K K一ユニッ トペプチ ド」 （配列表におけ る配列番号 4 1 ) を用意した。 これらのポリペプチ ドを、 各々、 実 験例 6 と同様の方法で、 B A L B Z cマウスに鼻腔免疫を行った。 その結果を表 9に示す。
bo
O O
CO
Figure imgf000038_0001
09 表 9から明らかなように、 R G D — O M P — K K一 O V A p、 或 いは、 T 1 — R G D — K K一ュニッ トぺプチ ドからなるポリべプチ ドを経鼻免疫したマウスでは、 O V A或いは P A c特異的な抗体の 産生が増強された。 すなわち、 R G Dを附加 したポリペプチ ドで免 疫した場合には、 R G Dを附加していないポリペプチ ドで免役した 場合よ り も強い抗体産生の増強が認められた。 実験例 9 ： 本発明のポリペプチ ドによる他の抗原の抗体産生増強効
M
通常、 アジュバン トと して用いる c τは抗原性が強く 、 経鼻的に 投与すると、 C Tに対する抗体が誘導されるだけでなく 、 C T と同 時に経粘膜投与した、 C T以外の抗原に対する抗体産生を増強する ことが知られている。 一方、 実驗例 7及ぴ実験例 8から明らかなよ うに、 R G D — O M P — K K—ユニッ トペプチ ド、 O M P — R G D — K K一ユニッ トペプチ ド、 R G D — O M P — K K — O V A p或い は T 1 — R G D— K K—ュニッ トペプチ ドからなる本発明のポリ ペプチ ドは、 C Tを免疫アジュバン トと して用いなく ても、 それら の単独の経鼻投与で、 それぞれのポリべプチ ドに特異的な抗体の産 生が誘導された。 さらに、 本発明のポリぺプチ ドが、 他の抗原に対 して抗体産生増強作用を示すかどうかの確認のための実験を以下 のように行った。
<牛血清アルブミ ンの経鼻投与に及ぼす各種ポリペプチ ド影響〉 牛血清アルブミ ン （以下、 「 B S A J と略記する。） 4 〃 g と、 ジ ュニッ 卜ペプチ ド 1 μ g、 R G D—ュニッ トペプチ ド一 K Kーュニ ッ トペプチ ド 1 μ g、 O M P — K K—ユニッ トペプチ ド 1 〃 g、 O M P — R G D — K K—ュニッ トペプチ ド 1 fl g、 O M P — K K — O V A p 1 g、 R G D - O M P - K K - O V A p 1 β g或いは C T 2 gの何れかを混合した生理食塩水溶液を調製し、 各々、 実験例 6 と同様の方法で、 B A L B Z cマウスに鼻腔免疫を行い、 血中の 抗体価を測定した。 その結果を表 1 0に示す。 なお、 測定は、 B S A、 B S Aと共に投与したペプチ ド、 及び、 C Tに対する抗体につ いて行った。
<卵白アルブミ ンの経鼻投与に及ぼす各種ポリペプチ ド影響
O V A 4 〃 g と O M P — R G D — K K —ユニッ トペプチ ド 1 g、 O M P - R G D - K K - O V A p 1 μ g或いは C Τ 2 μ gの何 れか 1 種を混合した生理食塩水溶液を調製し、 各々、 実験例 6 と同 様の方法で、 B 1 0. D 2マウス或いは B A L B / cマウスに鼻腔 免疫を行い、 血中の抗体価を測定した。 その結果を表 1 0に示す。 なお、 測定は、 O V A、 O M P - R G D - - O V A p , 及ぴ、 C Tに対する抗体について行った。
表 1 o
Figure imgf000041_0001
表 1 0から明らかなように、 B S A或いは O V Aを単独で経鼻投 与しても、 血液中には、 これらのポリべプチ ドに対する抗体はほと んど誘導されなかった。 これに対して、 B S A又は O V Aと、 O M P— R G D— K K—ュニッ 卜ぺプチ ド、 O M P — K K— O V A p又 は R G D— O M P — K K— O V A p の何れか 1 種とを同時に投与 したマウスでは、 B S A或いは O V Aに対する強い抗体の産生が誘 導された。 また、 B S A と R G D—ユニッ トペプチ ド一 K Kーュニ ッ トペプチ ド又は O M P — K K—ュニッ 卜ペプチ ドとを同時に投 与した場合にも、 B S A又は O V Aに対する抗体の産生が誘導され るものの、 増強の程度は、 O M P— R G D— K K—ユニッ トぺプチ ド、 O M P— K K— O V A p又は R G D— O M P— K K— O V A p と同時に投与した場合より も低かった。 B S A又は O V Aと、 C T とを投与しした場合にも、 B S A又は O V Aと、 O M P— R G D— K K一ュニッ トペプチ ド、 O M P— K K— O V A p又は R G D—◦ M P — K K一 O V A pの何れか 1 種を同時に投与した場合と同程 度の抗体産生が認められた。 しかしながら、 実験に使用した 1 g の O M P— R G D— K K—ュニッ トペプチ ド、 O M P— K K— O V A p或いは R G D - O M P - K K - O V A pの何れかを同時に投 与した場合には、 これらのペプチ ドに対する抗体の産生は、 わずか であったのに対して、 2 gコ レラ トキシンを同時に投与した場合 には、 C Tに対する抗体も強く 誘導された。 これらのことから、 o
M P— R G D— K K—ュニッ トペプチ ド、 O M P— K K— O V A p 或いは R G D— O iVi P— K K— O V A は、 自己に対する抗体産生 を誘導する量以下の量、あるいは、少量の自己抗体を誘導する量を、 他の抗原と同時経鼻投与することによ り 、 同時に投与した自己以外 の抗原の抗体産生を誘導する免疫アジュバン 卜と して使用できる ことが確認された。
以上の実験結果から、 種々の T細胞ェピ トープと種々の B細胞ェ ピ 卜ープを組み併せて、 その間に K Kなどのプロテアーゼの認識配 列をリンカ一ペプチ ドと して挿入し、 さらに、 このぺフチ ドに細胞 接着分子のモチーフを附加したポリペプチ ドは、 B細胞ェピ 卜一プ 或いはそれを含む抗原に対する抗体の産生を増強することのでき ることが明らかとなった。 また、 これらのポリペプチ ドは、 経鼻の ような経粘膜投与でも免疫アジュバン トを併用することなしに、 投 与したポリべプチ ドの中の B細胞ェピ トープに対する抗体を、 効率 よく誘導でき、 しかも、 それ以外の部位に対する不要な抗体の産生 がほとんどないため、 特異的な抗体産生の誘導剤、 或いは、 抗体産 生の増強剤と して使用できることが確認された。 また、 これらのポ リベプチ ドを投与された生体では、 免疫に使用 した B細胞ェピ トー プが由来する抗原性タ ンパク質を認識する抗体が効率よ く 産生さ れることから、 本発明のポリべプチ ドは、 経鼻免疫をはじめとする 経粘膜免疫において、 免疫アジュバン トを必要とせずに、 目的とす る感染防御抗体や毒素、 酵素類の活性の中和抗体やアレルゲンに対 する抗体などの種々の抗原に対す抗体の誘導が可能であるこ と を 示しており、 しかも、 広範な M H Cクラス I I のハプロタイプに拘 束された個体に、 抗体産生を効率的に誘導できることから、 感染防 御などの目的で使用する、 経鼻粘膜免疫用ぺプチ ドワクチンと して 使用できることが示された。 また、 これらポリペプチ ドは、 他の抗 原と同時に粘膜免疫されたとき、 免疫アジュパン 卜と して機能する ことも明かとなった。
以下に、， 実施例で、 本発明のポリペプチ ドについて具体的に説明 する。 しかし、 本発明はこれらの実施例によって限定されるもので はない。 実施例 1 ： P A c に対する抗体の産生の増強用の組成物
実験例 7の方法に準じて調製した、 R G D— O M P— K Kーュニ ッ トペプチ ド、 R G D— O M P— K K—ユニッ トペプチ ド、 R G D 一 O M P — K K—ュニッ 卜ペプチ ド及ぴ O M P — K K—ュニッ 卜 ペプチ ド一 R G Dの "j可れ力、 1 種を 1 0 0 〃 g Zm I と ， 一 ト レ ハロース （試薬級 株式会社林原生物化学研究所販売） を 4 0 %と なるよう に、 蒸留水に溶解し、 常法によ り滅菌してシラップ剤を得 た。 これを滅菌バイアル瓶に 2 m I ずつ分注し、 密閉して、 ポリべ プチ ド含有シラップ剤を調製した。 本品は、 安定性に優れ、 広範な M H Cクラス I I のハプロタイプに拘束されるため、 多く のヒ トゃ 動物で、 経鼻、 或いは、 経口的に投与することによ り、 う蝕予防活 性を有する抗体産生を効率的に増強するワクチン効果を発揮する ことができる。 また、 本品は、 経粘膜や経皮などの投与によ り、 こ れとともに投与した、 他の抗原の抗体産生を増強する免疫アジュバ ン 卜と しても有利に利用できる。 実施例 2 ： P A c に対する抗体の産生の増強用の組成物
安定剤と して、 1 % ( w/ V ) のショ糖を含む生理食塩水に、 実 験例 7 の方法に準 じて調製した R G D— T 1 — K K—ュニッ トぺ プチ ドを、 各々 1 0 g /m l 、 l O O jU g Zm l 、 又は、 1 ， 0 0 0 g m I となるように溶解し、 ろ過滅菌した。 これを滅菌バ ィアル瓶に 1 m I ずつ分注し、常法によ り、凍結乾燥して、密閉し、 ポリペプチ ド含有製剤を調製した。 本品は、 安定性に優れた、 う蝕 予防効果に優れた、経粘膜摂取或いは注射用の製剤である。本品は、 何れも、 注射用蒸留水 1 m I に完全に溶解して使用する。 また、 本 品は、 何れも、 安定性に優れ、 広範な M H Cクラス 〖 〖 のハプロタ イブに拘束されるため、 多く のヒ 卜や動物で、 経鼻、 或いは、 経口 的に投与することによ り 、 う蝕予防活性を有する抗体産生を効率的 に増強するワクチン効果を発揮する ことができる。 また、 本品は、 経粘膜や経皮などの投与によ り、 これと ともに投与した、 他の抗原 の抗体産生を増強する免疫アジュバン 卜 と しても有利に利用でき る。 実施例 3 ： ポリペプチ ド含有組成物の毒性試験 実施例 1 或いは、 実施例 2で調製したポリペプチ ドを 1 2. 5 m g m I となるように、 0. 5 %のショ糖を含有する生理食塩水で 希釈し、 これを、 生後 5週令の D D Y系の雄マウスに、 常法によ り 経口、 腹腔内又は、 筋肉内に投与して、 L D 5。を検討した。 これら の標品は何れも、し D 5。がポリぺプチ ド質量に換算して 1 0 0 m g Z k gマウス体重以上であり、 このことは、 本発明のポリペプチ ド が、 ヒ トゃ動物に投与しても、 毒性のない、 安全な製剤であること を示している。 実施例 4 ： H I Vに対する抗体産生の増強用の組成物
T細胞ェピ トープと して O M P、 T 1 、 H L A— D R 1 、 2、 3 、 4、 5、 6、 7 、 8、 9、 5 1 、 5 2、 5 3に結合するこ とが報告 されている、 配列表における配列番号 4 2記戴の H I V - 1 由来の g a g 2 9 8 - 3 1 2 ぺプチ ドと相同のア ミ ノ 酸配列を有するぺ プチ ド、 又は、 配列表における配列番号 4 3記載の H I V - 1 由来 の p o I 5 9 6 — 6 1 0 (シー ' シー ' ウイ Jレソン （W i I s o n , C . C . ) 著、 ジャーナル ' ォブ ' バイ ロ ロジー （ J o u r n a I o f V i r o l o g y . 7 5 , 4 1 9 5 - 4 2 0 7 ( 2 0 0 1 ) 参照。） と相同のア ミ ノ酸配列を有するペプチ ドから選ばれる何れ か 1 つを用い、 R G Dをそのァ ミ ノ 又はカルボキシル末端に配し、 K Kからなる リ ンカーべプチ ドをはさんで力ルポキシル末端側に H I V中和抗体を誘導するための B細胞ェピ トープと して、 配列表 における配列番号 4 4 に記載のア ミ ノ 酸配列からなる H I Vの g p i 2 0蛋白の V 3の I o o pペプチ ドと相同のペプチ ド （ビー ■ エフ ' ヘイネス著 （ H a y n e s , B . F . )、 ザ ' ジャーナル ' ォ ノ - ィムノ 1!3ン一 h e J o u r n a l ο τ I m m u n o I o g y )、 第 1 5 1 卷、 1 6 4 6乃至 1 6 5 3頁、 （ 1 9 9 3年）） を配したポリペプチ ドを調製した。 これらのペプチ ドから選ばれる 何れか 1 種又は 2種を各々 1 5 0 g Zm I とマンニ トール 1 0 O m g Zm l 含有する生理食塩水溶液を調製した。 これらを、 5 m I 容のバイアル瓶に 1 m I Zバイアルとなるように分注し、 常法に よ り凍結乾燥した。 本品は、 広範な M H Cク ラス I I のハプロタイ プに拘束されているため、 ヒ トに経粘膜や経皮などの投与によ り 、 多く のヒ 卜で H I Vに特異的な抗体の産生を効率よ く 増強するこ とができることから、 H I V感染の広がり 、 或いは、 H I V感染者 の発症を遅延させるワクチンの目的で有利に使用できる。 また、 本 品は、 経粘膜投与などによ り 、 これと ともに投与した 他の抗原の 抗体産生を増強する免疫アジュパン 卜と しても有利に利用できる。 実施例 5 ： インフルエンザウイルスに対する抗体の産生増強用の組 成物
T細胞ェピ トープと して O M P、 T 1 、 配列表における配列番号 4 2及び配列番号 4 3記載のア ミ ノ 酸配列を有するぺプチ ドから 選ばれる何れか 1 つを用い、 R G D或いは Y I G S Rをそのアミノ 又はカルボキシル末端に配し、 K K リ ンカ一べプチ ドをはさんで力 ルポキシル末端側にイ ンフルェンザゥィルスの中和抗体を誘導す るための B細胞ェピ トープと して、 配列表の配列番号 4 5記載のィ ンフルェンザウィルスのヘムァグルチニン （ H A ) 蛋白アミ ノ末端 からの 9 1 〜 1 0 8番目のアミ ノ 酸配列と相同のアミ ノ 酸配列を 有するペプチ ド （ティー . ベン一イエディディア著 （ B e n — Y e d i d i a , T . )、 モ レキュラー ' ィムノ ロジー （M o I e c u I a r I m m u n o l o g y )、 第 3 9巻， 3 2 3乃至 3 3 1 頁、 ( 2 0 0 2年）） を配したペプチ ドワクチンを、 常法によ り合成し た。 これらのポリぺプチ ドから選ばれる何れか 1 種又は 2種を各々 7 5 〃 g Zm I と ヒ トアルブミ ン 0. 5 m g Zm I 含有する生理食 塩水溶液を調製した。 これらを、 5 m I 容のバイアル瓶に 1 m I / バイアルとなるように分注し、 常法によ り凍結乾燥した。 本品は、 広範な M H Cクラス I I のハプロタイプに拘束されるため、 多く の ヒ 卜や動物で、 経粘膜や経皮などで投与することによ り、 インフル ェンザウィルスに特異的な抗体の産生を効率よ く 増強するこ とが できるワクチン効果を有することから、 イ ンフルエンザウイルスの 感染を防御することができる。 また、 本品は、 経粘膜投与などによ リ、 これとともに投与した、 他の抗原の抗体産生を増強する免疫ァ ジュパン トと しても有利に利用できる。 実施例 6 ： パピローマウィルスワクチン
T細胞ェピ トープと して O M P T 1 、 配列表における配列番号
4 2及ぴ配列番号 4 3記載のア ミ ノ 酸配列を有するぺプチ ドから 選ばれる何れか 1 つを用い、 R G Dをそのアミノ末端又はカルボキ シル末端に配し、 K K リ ンカーべプチ ドをはさんでカルボキシル末 端側にヒ 卜パピローマウィルスの中和抗体を誘導するための B細 胞ェピ トープと して、 配列表における配列番号 4 6記載の L 2 ： 蛋 白由来の部分ア ミ ノ 酸配列と相同のア ミ ノ 酸配列を有するぺプチ ド （ゲイ ' カヮナ （ K a w a n a , K . ) 著、 ワクチン （ V a c c i n e )、 第 1 9巻、 1 4 9 6乃至 1 5 0 2頁、 （ 2 0 0 1 年）） を 配したポリペプチ ドワクチンを調製した。 これらのペプチ ドから選 ばれる何れか 1 種又は 2種を各々 2 0 0 g / m I とゼラチンを 0. 2 5 m g Zm I 含有する リ ン酸緩衝生理食塩水溶液を調製した これらを、 5 m I 容のバイアル瓶に 0. 5 m I バイアルとなるよ うに分注し、 常法によ り凍結乾燥した。 本品は、 広範な M H Cクラ ス I I のハプロタイ プに拘束されるため、 ヒ トに経粘膜や経皮など の投与によ り、 多く のヒ 卜でパヒローマウィルスに特異的な抗体の 産生を効率よ く増強することができることから、 ヒ 卜パピローマウ ィルスの感染を防御できる。 また、 本品は、 経鼻投与などの経粘膜 によ り、 これと ともに投与した、 他の抗原の抗体産生を増強する免 疫アジュバン 卜と しても有利に利用できる。 実施例 7 ： O V A抗体産生用組成物
実験例 8の方法で調製した、 R G D— O M P— K K— O V A pの アミノ酸配列を有するポリペプチ ドを 1 0 0 g / m l と Of , a' — ト レハロース（試薬級、/ 式会社林原生物化学研究所販売）を 4 0 % となるよ うに、 蒸留水に溶解し、 常法によ り滅菌してシラップ状物 を得た。 これを滅菌バイアル瓶に 2 m I ずつ分注し、 密閉して、 ぺ プチ ドワクチン含有シラップを調製 した。 本品は、 安定性に優れ、 動物に、経鼻、或いは、経口的、経皮的などに投与することによ り、 O V Aに対する抗体を効率的に増強することができる。 また、 本品 は、 経鼻投与などによ り、 これと と もに投与した、 他の抗原の抗体 産生を増強する免疫アジュパン 卜と しても有利に利用できる。 実施例 8 ： イ ンフルエンザワクチンの抗体産生増強用の組成物
生理食塩水 1 m I あた り 、 市販のイ ンフルエンザ H Aワクチン (藤沢薬品工業株式会社販売） 4 g あるいは H Aや M蛋白質など のウィルス表層抗原性タ ンパク質と R G D— O M P — K K— O V A p又は R G D— O M P — K K一ュニッ トペプチ ド 1 μ g と を含 有する標品を調製した。 これを、 滅菌バイアル瓶に 0. 5 m I ずつ 分注し、 密閉した。 本品は、 ウィルス表層抗原性タ ンパク質と R G D— O M P — K K— O V A p又は R G D— O M P — K K—ュニッ トペプチ ドのもつ免疫アジュバン ト作用によ り、 そのままでは、 経 粘膜投与しても抗体産生を誘導する こ とのできないイ ンフルェン ザワクチンの経鼻などの経粘膜投与による抗体産生を増強するの で、本品を、 2週おきに 3回ないし 4回鼻腔に投与することによ り、 イ ンフルエンザの感染を防御する抗体の産生を増強するこ とがで きるワクチンと して使用することができる。 実施例 9 ： スギ花粉症経口減感作治療用組成物
T細胞ェピ 卜一プと して O M P、 T 1 、 配列表における配列番号 4 2及ぴ配列番号 4 3記載のア ミ ノ 酸配列を有するぺプチ ドから 選ばれる何れか 1 つを用い、 R G Dをそのア ミノ 末端又はカルボキ シル末端に配し、 K K リ ンカーぺプチ ドをはさんでカルボキシル未 端側にスギ花粉ア レルゲン抗体を誘導するための B細胞ェピ トー プと して、 C r y j 1 の B細胞ェピ トープである V H P Q D G D A
(ワイ ' タムラ （ T a m u r a , Y . ) 著、 イ ンターナショナル - アーカイ ブズ ' ォブ ' アレルギー ■ アン ド ' ィムノ ロジー （ I n t e r n a t ι o n a I A r c h i v e s o r A I I e r g y a n d I m m u n o l o g y )、 第 1 2 3卷、 第 3号、 2 2 8乃至 2 3 5頁、 （ 2 0 0 1 年）） 及び C r y j 2の B細胞ェピ トー プである KWV N G R E I (ワイ ' タムラ （ T a m u r a , Υ . ) 著、 ク リニカル ' アン ド ' ェクスペリ メ ンタル ' アレルギー （ C I
I n I c a I a n d t x p e r i m e n t a I A l l e r g y )、 第 3 3卷、 第 2号、 2 1 1 7¾至 2 1 フ 頁、 （ 2 0 0 3年）） を K Kで連結した配列表における配列番号 4 7記載のアミ ノ酸配 列を有するポリペプチ ドを配し、 これらのペプチ ドから選ばれる何 れかを各々 2 0 0 jU g Z m I とゼラチンを 0 . 2 5 m g Z m I 含有 するリ ン酸緩衝生理食塩水溶液を調製し、 スギ花粉症減感作治療用 の組成物を得た。 本品は、 広範な M H Cクラス I I のハプロタイ プ に拘束されるため、 ヒ 卜に経粘膜や経皮などの投与によ り、 多く の ヒ 卜で粘膜投与によ り、 スギ花粉アレルゲン C r y j 1 及び C r y j 2に特異的な 〖 g G抗体を優位に産生することから、 経口投与に よるスギ花粉症経口減感作治療薬と して有用である。 産業上の利用可能性
以上説明したとおり、 本発明は、 特定の抗原ペプチ ドを含み、 目 的とする抗原ェピ 卜ープに対する特異的な抗体の産生を、 免疫アジ ュパン ト非存在下においても特異的に増強するポリ ペプチ ド及そ のポリペプチ ドを含有する組成物に関するものである。 しかも、 本 発明のポリペプチ ドは、 免疫アジュパン トを用いる必要もなく、 ま た、 経鼻投与や経口投与などの経粘膜投与で使用できることから、 注射による経皮投与などに比して、 簡易かつ安全な、 広範な M H C クラス I I のハプロタイプに拘束されるため、 多くのヒ トを含む哺 乳動物や鳥類、 爬虫類、 魚類などの抗体産生を行う動物用のワクチ ン或いは特異抗体産生の増強用の抗原と して使用する こ とができ る。 また、 本発明のポリペプチ ドは、 これとともに投与した、 他の 抗原の抗体産生を増強する免疫アジュパン 卜と して使用する こ と もできる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . ァミ ノ末端側に T細胞ェピ トープのア ミ ノ酸配列を含むアミ ノ酸配列を有し、 リ ンカ一ペプチ ドをはさんで、 そのカルボキシ末 端側に Β細胞ェピ トープのア ミ ノ 酸配列を含むア ミ ノ 酸配列を有 するぺプチ ド内に、 1 種又は 2種以上の細胞接着分子の細胞結合モ チーフのアミ ノ酸配列を 1 種又は 2種以上有するこ と を特徴とす るポリ プチ ド。
2 . リ ンカ一ペプチ ドが、 リ ジン一リ ジン、 リジン一アルギニン 及びアルギニン一アルギニンからなるジぺプチ ドから選ばれる 1 種又は 2種以上で構成されている こ と を特徴とする請求の範囲第 1 項に記載のポリぺプチ ド。
3 . 細胞接着分子の細胞結合モチーフが、 配列表における配列番 号 2、 配列番号 3、 配列番号 4、 配列番号 5、 配列番号 6、 配列番 号 7 、 配列番号 8 、 配列番号 9 、 配列番号 1 0及び配列番号 1 1 記 載のア ミ ノ 酸配列を有するぺプチ ドから選ばれる 1 種又は 2種以 上である こ と を特徴とする請求の範囲第 1 項又は第 2 項記載のポ リぺプチ ド。
4 . 細胞接着分子の細胞結合モチーフが、 イ ンテグリ ンファ ミ リ 一結合モチーフから選ばれる 1 種又は 2種以上である こと を特徴 とする請求の範囲第 1 項又は第 2項記載のポリペプチ ド。
5 . T細胞ェピ 卜一プが、 マルチアグレ ト一プ型であるこ とを特 徴とする請求の範囲第 1 項、 第 2項、 第 3項又は第 4項記載のポリ ペプチ ド。
6 . B細胞ェピ トープが、 疾患の原因となる抗原性タ ンパク質由 来であることを特徴とする請求の範囲第 1 項、 第 2項、 第 3項、 第 4項又は第 5項に記載のポリべプチ ド。
7 . 疾患の原因となる抗原性タ ンパク質がス ト レプトコカス ' ミ ユータ ンス セロタイプ C菌の表層蛋白質抗原、 H I Vタ ンパク質. イ ンフルエンザウイルスタ ンパク質、 パピローマウィルスタ ンパク 質、 ォブアルブミ ン及びスギ花粉抗原から選ばれる 1 種又は 2種以 上であるこ とを特徴とする請求の範囲第 6項に記載のポリべプチ ド、。
8 . 請求の範囲第 1 項、 第 2項、 第 3項、 第 4項、 第 5項、 第 6 項又は第 7項に記載のポリぺプチ ドをコ一ドする D N A又は R N A。
9 . 請求の範囲第 8項に記載の D N Aを導入した微生物叉は動植 物。
1 0 . 請求の範囲第 1 項、 第 2項、 第 3項、 第 4項、 第 5項、 第 6 項又は第 7 項に記載のポリ べプチ ド及び製剤学的に許容し う る製 剤用添加剤を 1 種又は 2種以上含有することを特徴とする組成物。
1 1 . さ らに抗原性タ ンパク質を含有するこ とを特徴とする請求の 範囲第 1 0項に記載の組成物。
1 2 . 請求の範囲第 1 項、 第 2項、 第 3項、 第 4項、 第 5項、 第 6 項又は第 7項に記載のポリぺプチ ド、 請求の範囲第 8項に記載の D N A又は R N A、 請求の範囲第 9項に記載の動植物又は微生物、 又 は請求の範囲第 1 0項又は第 1 1 項に記載の組成物を生体に投与 又は摂取することによる抗体産生方法。
1 3 . 経粘膜投与又は摂取による請求の範囲第 1 2項に記載の方法
1 4 . 疾患の予防又は治療のために行なわれる請求の範囲第 1 2項 又は第 1 3項記載の方法。
1 5 . 請求の範囲第 1 項、 第 2項、 第 3項、 第 4項、 第 5項、 第 6 項又は第 7項に記載のポリ べプチ ドを免疫アジュバン 卜と して用 いる こ とを特徴とする抗原性タ ンパク質に対する抗体産生を増強 する方法。
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