CN115916253A - 半抗原化冠状病毒刺突蛋白 - Google Patents

Abstract

本公开内容提供了免疫原性组合物，其包含来自冠状病毒的半抗原化刺突蛋白（S蛋白）或其片段和至少一种药学上可接受的载体，其中所述冠状病毒包括严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS‑CoV‑2）。进一步提供了使用来自冠状病毒的半抗原化S蛋白使主体针对冠状病毒感染免疫的方法。

Description

半抗原化冠状病毒刺突蛋白

技术领域

本文所述的发明总体上涉及来自冠状病毒的半抗原化刺突蛋白（S蛋白）和用半抗原化刺突蛋白免疫人主体的方法。

背景技术

冠状病毒是导致动物和人中疾病的正链RNA病毒。2019年，开始了一种新的人兽互传的冠状病毒爆发。所述大流行性疾病现已被定义为新型冠状病毒疾病2019(Covid-19)，并由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)保持。

对于这种新疾病，仍然存在许多未解决的问题，甚至包括Covid-19病原体的传播方式。SARS-CoV-2病毒传播的主要风险显然是通过飞沫暴露和密切的个人接触；因此，减少这种冠状病毒传播的策略应类似于或模仿用于限制其他呼吸道感染的那些策略，即减少直接接触并使用预防暴露于飞沫的屏障措施。然而，由于潜伏期持续7至14天，并且非特异性初始症状与诸如流感的其他呼吸道感染的那些相似，所以Covid-19扩散的最大风险是未检测的病例。因此，需要备择的预防策略或疗法来治疗或预防冠状病毒感染，例如在人中发现的那些（例如导致Covid-19的SARS-CoV-2感染）。例如，需要鉴定和开发可以引出保护性免疫应答的针对冠状病毒感染的免疫原性和疫苗组合物。此外，需要可直接递送至或紧靠着感染部位以使治疗有效性达到最大的免疫原性组合物和疫苗制剂。

半抗原化蛋白已广泛用于提供用于测量抗体滴度和亲和力的确定的表位。虽然一些蛋白半抗原化被认为只不过是产生用于B细胞识别的表位，但其他已显示某些半抗原化蛋白可以在天然蛋白未能诱导适应性免疫应答的条件下诱导这种应答；因此，半抗原化不仅仅是产生用于抗原受体识别的表位（Palm, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 106:4782）。本发明满足了这种需要并且进一步提供了其他相关的优点。本发明提供了用于冠状病毒的半抗原化免疫原，并且满足了对可以直接递送至或紧靠着感染部位递送以使人主体中的保护性免疫应答达到最大的免疫原性组合物和疫苗制剂的需要。

发明内容

本文公开的实施方案是包含来自冠状病毒（包括严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2））的半抗原化S蛋白的免疫原性组合物或疫苗，以及用所述免疫原性组合物或疫苗对人主体进行免疫的方法。

附图说明

当连同附图一起阅读时，前述概述以及本发明的下述详细描述将得到更好的理解。

图1显示了CF-1小鼠中皮下施用BVX-0320后的抗刺突蛋白抗体应答。

图2显示了对BVX-0320的T细胞（γ干扰素）应答。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同含义。本文中提到的所有专利和出版物都整体引入作为参考。

定义

如本文所用的“免疫原性组合物”或“疫苗”指能够引发、加强、激活、引出、刺激、增大、强化、放大或增强适应性（特异性）免疫应答的任何一种或多种化合物或试剂或免疫原，所述适应性（特异性）免疫应答可以是细胞的（T细胞）或体液的（B细胞），或它们的组合。优选地，适应性免疫应答是保护性的，其可以包括冠状病毒的中和（减少或者消除病毒感染性）。免疫原的代表性例子是病毒抗原（例如一种或多种冠状病毒抗原）。在本说明书中，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围都被理解为包括所述范围内的任何整数值，并且，当适当时，包括其分数（诸如整数的十分之一和百分之一等），除非另外指出。

如本文所用的，“约”或“基本上包含”意指±10%。如本文所用的，不定冠词如“一（a）”或“一（an）”的使用应理解为指名词或名词短语的单数和复数（即，意指“一个（种）或多个（种）”或“至少一个（种）”列举的要素或组分）。备择方案（例如，“或”）的使用应被理解为意指备择方案中的任一种、两种或其任何组合。此外，应当理解，衍生自本文所述的序列、结构和取代基的各种组合的个别化合物或化合物组在本申请中被公开到好像每种化合物或化合物组被个别陈述的相同的程度。因此，特定序列、结构或取代基的选择在本发明的范围内。

术语“有效量”或“治疗有效量”指足以实现包括但不限于疾病治疗的预期应用的如本文所述的化合物或化合物组合的量。治疗有效量可取决于预期应用（体外或体内）、或正被治疗的主体和疾病状况（例如主体的重量、年龄和性别）、疾病状况的严重程度、施用方式等而变化，其可以由本领域普通技术人员容易地确定。所述术语也适用于将在靶细胞中诱导特定反应（例如血小板黏附和/或细胞迁移的减少）的剂量。具体剂量将取决于所选的特定化合物、要遵循的给药方案、化合物是否与其他化合物组合施用、施用时间的选择、施用的组织以及其中携带化合物的物理递送系统而变化。

术语“免疫原性”意指S蛋白免疫原引起针对冠状病毒的免疫应答的能力。半抗原化S蛋白制剂是否具有免疫原性可以通过例如DTH-测定或实验动物模型中的体内测定来测试。

如本文所用的术语“治疗效果”包括治疗益处和/或预防益处。预防效果包括延迟或消除冠状病毒感染的出现，延迟或消除冠状病毒感染症状的发作，减缓、停止或逆转冠状病毒感染的进展，或它们的任何组合。

“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”意图包括任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂以及惰性成分。将这种药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂用于活性药物成分是本领域中众所周知的。除非任何常规的药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂与活性药物成分不相容，否则预期其在本发明的治疗组合物中的用途。额外的活性药物成分，例如其他药物，也可以并入所述的组合物和方法中。

当本文使用范围以描述例如物理或化学性质如分子量或化学式时，意图包括范围的所有组合和亚组合以及其中的具体实施方案。当提及数字或数值范围时术语“约”的使用意指所提及的数字或数字范围是在实验变异（experimental variability）内（或在统计学实验误差内）的近似值，且因此数字或数字范围可以变化。所述变异一般为所陈述的数字或数值范围的0％至15％，优选0％至10％，更优选0％至5％。术语“包含（comprising）”（以及相关术语，例如“包含（comprise）”或“包含（comprises）”或“具有（having）”或“包括（including）”）包括那些实施方案，如例如，“由”所描述的特征“组成”或“基本上由”所描述的特征“组成”的任何物质组合物、方法或过程的实施方案。

如本文中所使用的，“同种型”指由重链恒定区基因编码的抗体类别（例如IgM或IgG1）。在哺乳动物中，有五种抗体同种型：IgA、IgD、IgG、IgM 和 IgE。在人中，有四个IgG同种型亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，和两个IgA同种型亚类：IgA1和IgA2。

在两个或更多个核酸或多肽的上下文中的术语“序列同一性”和“序列百分比同一性”指在不考虑将任何保守氨基酸取代作为序列同一性的一部分的情况下关于最大对应进行比较和比对（如果必要的话，则引入缺口）时两个或更多个相同或具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基的序列或子序列。百分比同一性可以使用序列比较软件或算法或通过目检来测量。本领域已知可用于获得氨基酸或核苷酸序列比对的各种算法和软件。确定百分比序列同一性的合适程序包括例如可从美国政府的国家生物技术信息中心（NationalCenter for Biotechnology Information）BLAST网站获得的一套BLAST程序。两个序列之间的比较可以使用BLASTN或BLASTP算法进行。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。可从DNASTAR获得的ALIGN、ALIGN-2（Genentech, South San Francisco,California）或MegAlign是可用于比对序列的额外的公开可用的软件程序。本领域技术人员可以通过特定的比对软件确定最大比对的适当参数。在某些实施方案中，使用比对软件的默认参数。

为避免疑问，本文中连同本发明的特定方面、实施方案或实施例一起描述的特定特征（例如整数、特征、值、用途、疾病、式、化合物或基团）意图被理解为适用于本文所述的任何其他方面、实施方案或实施例，除非与其不相容。因此，这种特征可以在适当的场合连同本文定义的任何定义、权利要求或实施方案一起使用。本说明书（包括任何所附权利要求、摘要和附图）中公开的所有特征，和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤，可以以任何组合进行组合，除了其中至少一些特征和/或步骤是互斥的组合。本发明不限于任何公开的实施方案的任何细节。本发明延伸到本说明书（包括任何所附权利要求、摘要和附图）中公开的特征的任何新的一个或新的组合，或如此公开的任何方法或过程的步骤的任何新的一个或任何新的组合。

制备半抗原化S蛋白的方法

使用单一半抗原试剂制备自体疫苗是本领域技术人员已知的。在实施方案中，本发明提供了半抗原化的S蛋白冠状病毒疫苗，可以制备这种疫苗，包括重组产生S蛋白或其片段，并用半抗原化试剂进行半抗原化。

半抗原化步骤可以通过与半抗原化试剂2,4-二氟硝基苯（DNFB）温育30分钟用DNP修饰重组S蛋白来进行。半抗原化的S蛋白用HBSS洗涤。优选的半抗原化试剂可以靶向氨基酸的ε-氨基。

在一些实施方案中，半抗原化试剂选自三硝基氯苯（TNCB）、2,4-二氟硝基苯（DNFB）、N-碘乙酰基-N'-(5-磺基-1-萘基)乙二胺（AED）、对氨基苯磺酸（SA）、三硝基苯酚（TNP）、2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）及其组合。

半抗原化的S蛋白免疫原（和相应的免疫原性表位）及其片段和变体可以合成或重组产生。含有诱导针对冠状病毒的免疫应答的表位的冠状病毒S蛋白片段可以通过标准化学方法合成，包括通过自动化程序合成。通常，免疫原性肽是基于标准固相Fmoc保护策略以HATU作为偶联剂合成的。免疫原性肽用也使侧链官能团脱保护的含有适当清除剂的三氟乙酸从固相树脂切割下来。可以使用制备型反相层析进一步纯化粗免疫原性肽。可以使用其他纯化方法，例如分配层析、凝胶过滤、凝胶电泳或离子交换层析。可以使用本领域已知的其他合成技术来产生类似的免疫原性肽，例如tBoc保护策略、使用不同的偶联试剂等。此外，可以使用任何天然存在的氨基酸或其衍生物，包括D-氨基酸或L-氨基酸，以及它们的组合。在某些实施方案中，合成的S蛋白免疫原具有与SEQ ID NO:2相同或至少85%相同（其包括至少90%或95%或85%和100%之间的任何百分比）的氨基酸序列。

如本文所述的，半抗原化的S蛋白免疫原可以是重组的，其中所期望的S蛋白免疫原个别地或组合地从在核酸表达构建体中与表达控制序列（例如启动子）可操作地连接的多核苷酸表达。在某些实施方案中，重组S蛋白抗原将包含与SEQ ID NO:2相同或至少85%相同（其包括至少90%或95%或80%和100%之间的任何百分比）的氨基酸序列。在另一个实施方案中，重组S蛋白免疫原由如SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列组成。在其他实施方案中，重组S蛋白免疫原及其变体是SEQ ID NO：2的片段。在一些实施方案中，变体是在不同的SARS-CoV-2毒株中发现的SARS-CoV-2刺突蛋白变体。来自这些不同毒株的刺突蛋白的示例性变体在表1中陈述。变体包括，但不限于，来自B.1.1.7毒株、B.1.351毒株、P.1毒株、CAL 20毒株或其任何组合的刺突蛋白。

表1.相对于祖先毒株刺突蛋白(SEQ ID NO:2)，刺突蛋白不同变体中的氨基酸位置和相对氨基酸变化的表格。

在一个实施方案中，S蛋白被半抗原化。对本发明来说，实际上任何单独施用时未能诱导免疫应答的小蛋白或其他小分子都可以起半抗原的作用。多种具有相当不同的化学结构的半抗原已显示诱导相似类型的免疫应答，例如TNP（Kempkes, J. Immunol. (1991)147:2467）；磷酸胆碱（Jang, Eur. J. Immunol. (1991) 21:1303）；镍（Pistoor, J.Invest. Dermatol. (1995) 105:92）和砷酸盐（Nalefski, J. Immunol.(1993) 150:3806）。优选通过经由赖氨酸的ε-氨基或-COOH基团的缀合来完成半抗原与细胞的缀合以引出免疫应答。这组半抗原包括许多化学上不同的化合物：二硝基苯基、三硝基苯基、N-碘乙酰基-N'-(5-磺基1-萘基)乙二胺、三硝基苯磺酸、二硝基苯磺酸、异硫氰酸荧光素、砷酸苯异硫氰酸酯和二硝基苯-S-芥子气（Nahas, Cellular Immunol. (1980) 54:241）。一旦供给了本公开内容，熟练的技术人员就将能够选择用于本发明的半抗原。

通常，半抗原包括“识别基团”，其是与抗体相互作用的基团。识别基团与半抗原反应性基团不可逆地缔合。因此，当半抗原反应性基团与靶分子上的官能团缀合时，半抗原识别基团可用于与抗体结合。不同半抗原识别基团的实例包括，但不限于，二硝基苯基、三硝基苯基、荧光素、其他芳族化合物、磷酸胆碱、肽、高度糖基化终产物（AGE）、碳水化合物等。

半抗原还包括用于与蛋白或多肽的氨基酸侧链上的取代基缀合的官能团。可与半抗原缀合的氨基酸侧链基团包括，例如天冬氨酸或谷氨酸中的游离羧酸基团；赖氨酸的ε-氨基；半胱氨酸的硫醇部分；丝氨酸或酪氨酸的羟基；组氨酸的咪唑部分；或色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸的芳基。能够与特定氨基酸侧链反应的半抗原官能团描述如下。

与伯胺反应的官能团。将与存在于氨基酸侧链上的伯胺形成共价键的半抗原反应性基团包括，但不限于，酰基氯、酐、反应性酯、α,β-不饱和酮、亚氨酸酯和卤代硝基苯。能够与亲核基团如伯胺反应的各种反应性酯可商购获得。与羧酸反应的官能团。在有碳二亚胺（例如EDC）的情况下，羧酸可以被激活，从而允许与各种亲核物质（包括伯胺和仲胺）的相互作用。羧酸烷基化以形成稳定的酯可以通过与硫或氮芥子气或含有烷基或芳基氮丙啶部分的半抗原相互作用来实现。

与芳族基团反应的官能团。与某些氨基酸有关的芳族部分的相互作用可以通过在有蛋白或肽的情况下光活化芳基重氮化合物来完成。因此，组氨酸、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，特别是组氨酸和色氨酸的芳基侧链的修饰可以通过使用这种反应性功能性来实现。

与巯基反应的官能团。有几个反应性基团可以与氨基酸侧链上存在的巯基偶联。含有α,β-不饱和酮或酯部分的半抗原，如马来酰亚胺，提供了可与巯基以及氨基相互作用的反应性功能性。此外，诸如2-吡啶基二硫代基团或5,5'-二硫代-双-(2-硝基苯甲酸)基团的反应性二硫化物也可以适用。含有反应性二硫键的试剂的一些例子包括3-(2-吡啶基-二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯（Carlsson, Biochem J. (1978) 173:723-737）、S-4-琥珀酰亚胺基氧羰基-α-甲苄基-硫代硫酸钠和4琥珀酰亚胺基氧羰基-α-甲基-(2-吡啶基二硫代)-甲苯。包含具有与硫醇基团反应的双键的反应性基团的试剂的一些实例包括4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和间马来酰亚胺苯甲酸琥珀酰亚胺酯。

其他功能分子包括3-(马来酰亚胺)-丙酸琥珀酰亚胺酯、4-(对-马来酰亚胺-苯基)丁酸磺基琥珀酰亚胺酯、磺基-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基-环己烷)-1-羧酸酯、马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基-琥珀酰亚胺酯。

任何半抗原或不同半抗原的组合均可用于本发明的组合物中。例如在一个实施方案中，相同的半抗原识别基团通过S蛋白上的不同官能团与不同的氨基酸偶联。例如，试剂二硝基苯磺酸、二硝基苯基重氮和二硝基苯S芥子气均形成分别与氨基、芳族基团和羧酸基团偶联的二硝基苯基半抗原。类似地，胂酸半抗原可以通过使胂酸苯异硫氰酸酯与氨基反应或偶氮苯胂酸酯与芳族基团反应来偶联。

免疫原性组合物和疫苗

如本文所述的用于治疗和/或预防冠状病毒感染的免疫原性组合物或疫苗包含免疫原性半抗原化冠状病毒多肽，例如S蛋白、其片段和变体，并且还包括冠状病毒免疫原与其他肽或多肽（例如疏水氨基酸序列或组氨酸标签或非-S蛋白冠状病毒多肽或其片段）的融合物或其他修饰（例如糖基化）。在某些实施方案中，免疫原性S多肽可以包含具有能够引出针对冠状病毒感染的保护性免疫应答（例如引出中和抗体的产生和/或刺激细胞介导的免疫应答）的表位的S蛋白的任何部分。如本文所述的免疫原性多肽可以以线性形式排列、组合或融合，并且每种免疫原可以重复或可以不重复，其中重复可以发生一次或多次，并且可以位于免疫原性S或其他冠状病毒多肽免疫原的线性序列的N-末端、C-末端或内部。此外，可以选择多种不同的冠状病毒免疫原性多肽（例如来自多种冠状病毒物种的其他S蛋白、N蛋白、M蛋白或其他冠状病毒多肽及其变体或片段）并混合或组合成混合物组合物以提供多价疫苗，用于在没有有害或在其他方面不需要的有关免疫应答或副作用的情况下引出保护性免疫应答。本文还提供了用于生产半抗原化合成或重组多价冠状病毒多肽免疫原包括融合蛋白的方法。例如，可以培养含有S蛋白免疫原编码核酸表达构建体的宿主细胞以产生重组S蛋白免疫原或其变体（例如缺失突变体或缺乏C-末端跨膜结构域的S多肽片段）。还预期使用S蛋白免疫原或其变体或多肽（包括融合蛋白）的组合来治疗或预防冠状病毒感染或引出免疫应答的方法。

冠状病毒具有正义、非节段、单链RNA基因组，其编码至少18种病毒蛋白（如非结构蛋白（NSP）1-13、结构蛋白E、M、N、S）和依赖于RNA的RNA聚合酶）。冠状病毒具有三种主要的表面糖蛋白（称为S、E和M），且一些冠状病毒具有称为血凝素酯酶（HE）的另一种表面糖蛋白，其在SARS病毒中没有发现，N（核衣壳）蛋白是碱性磷蛋白，其通常与基因组缔合，且已报道是抗原性的（Holmes, Fields Virology, 第34章, 2013）。冠状病毒的主要抗原S（刺突）蛋白具有两个结构域：Sl，其据信与受体结合有关，和S2，其据信介导病毒和靶细胞之间的膜融合。

S（刺突）蛋白可以形成非共价连接的同三聚体（寡聚体），其可以介导受体结合和病毒感染性。S 蛋白的同三聚体可能是呈现受体结合结构域的正确天然构象和引出中和抗体应答所必需的。此外，S蛋白的细胞内加工与显著的翻译后寡糖修饰有关。N-聚糖基序分析预期的翻译后寡糖修饰（糖基化）表明，S蛋白具有多达23个用于这种修饰的位点。此外，C-末端半胱氨酸残基也可能参与蛋白折叠和保持天然（功能性）S蛋白构象。一些冠状病毒（例如一些II和III组病的毒株）的S蛋白可以在S蛋白中心附近被高尔基体中的胰蛋白酶样蛋白酶或细胞外定位的酶蛋白酶解加工成含有N-末端Sl和C-末端S2多肽的连接的多肽。II型组冠状病毒和I组病毒的一些成员可能不被这样加工。直到将SARS-相关病毒因子表征为冠状病毒为止，冠状病毒根据血清学和遗传性质分为三组，所述组称为第1组、第2组和第3组，其也在本领域中和本文中称为第I组、第II组和第III组（参见例如Holmes, FieldsVirology, 上述；Stadler,Nat. Rev. Microbiol. (2003) 209-18；Holmes, J Clin.Invest. (2003) 111 :1605-609）。目前，冠状病毒被细分为第1组、第2组、第3组和SARS-CoV（包括SARS-CoV-2在内的SARS-相关冠状病毒）。

示例性S蛋白具有1,255个氨基酸（参见图1，其为SEQ ID NO：2），具有12个氨基酸的信号序列、氨基酸12-672之间的Sl结构域和氨基酸673-1192之间的S2结构域。在某些实施方案中，具有一个或多个表位（即是免疫原）并且能够引出中和（例如IgA或IgG抗体）或细胞介导的免疫应答的冠状病毒S多肽及其变体包含在用于治疗或预防冠状病毒感染的组合物中。本文还描述了未糖基化且能够引出中和免疫应答的S蛋白免疫原（含有一个或多个免疫原性表位）的鉴定。在一个实施方案中，S蛋白免疫原是全长S蛋白的一部分或片段。例如，包含SEQ ID NO：2的位置417-560的氨基酸的S蛋白免疫原的一部分不含有N-聚糖取代位点并且是亲水区。所述区域也对应于被认为与细胞受体结合有关的S1结构域的区域。因此，包含SEQ ID NO：2的位置417-560的氨基酸的片段或其一部分可能是免疫原性的，并且对所述序列内的一个或多个表位特异的免疫应答可以防止冠状病毒进入靶细胞。此外，鉴定不含糖基化位点的这种S蛋白的免疫原性片段提供了这样的优点，即所述片段可以在细胞（例如细菌）中制备和产生，所述细胞不能以与哺乳动物细胞相同的方式对蛋白进行糖基化。

如本文所述的，S蛋白免疫原包括分别保留或具有包含在全长S蛋白或野生型S蛋白中的至少一个表位的S蛋白片段或S蛋白变体（其可以是如本文所述的全长S蛋白或S片段的变体），所述至少一个表位引出针对冠状病毒，优选针对SARS冠状病毒的保护性免疫应答。S蛋白片段或S蛋白变体具有全长或野生型（天然）S蛋白的至少一种生物活性或功能（例如受体结合或细胞融合活性），或具有多种S蛋白特异性生学活性或功能。例如，S蛋白变体可以包含诱导免疫应答（例如，诱导产生特异性结合野生型或全长S多肽的抗体）的表位或可以具有S蛋白受体结合活性。在一个实施方案中，S-蛋白片段是截短的S-蛋白，其包含在SEQ ID NO：2的位置1-1200所述的氨基酸。被缺失的S-蛋白部分是跨膜区。S蛋白免疫原性片段还包括上述S蛋白氨基酸片段的更小部分或片段。包含刺激、诱导或引出免疫应答的表位的S蛋白片段可以包含范围为SEQ ID NO:2 的8个氨基酸和150个氨基酸之间的任意数目的连续氨基酸（例如8、10、12、15、18、20、25、30、35、40、50 或更多个氨基酸）的序列。在相关实施方案中，冠状病毒S多肽变体与如SEQ ID NO：2所述的全长S蛋白（其来自SARS-CoV-2毒株；SEQ ID NO：1是编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核酸序列）的氨基酸序列具有至少85%至100%的氨基酸序列同一性（即，至少85%、90%、95%或99%序列同一性）。这种S蛋白变体和片段保留至少一种S蛋白特异性生物活性或功能，例如（1）引出保护性免疫应答的能力（即，S多肽变体含有诱导或引出保护性免疫应答的表位），例如，针对冠状病毒例如SARS-CoV-2的中和应答和/或细胞介导的免疫应答；（2）通过受体结合介导病毒感染的能力；和（3）介导病毒体和宿主细胞之间的膜融合的能力。本领域可获得全长SARS冠状病毒S（刺突）多肽序列的额外例子。

如本文所述的，本文所述的S蛋白免疫原、其片段和变体含有半抗原化表位，其引出或诱导免疫应答，优选保护性免疫应答，其可以是体液应答和/或细胞介导的免疫应答。保护性免疫应答可以通过以下的至少一种来显示：防止宿主被冠状病毒感染；改变或限制感染；帮助、改善、增强或刺激宿主从感染恢复；以及产生免疫记忆，其将防止或限制后来被冠状病毒感染。体液应答可包括产生中和感染性、溶解病毒和/或感染的细胞、促进宿主细胞去除病毒（例如，促进吞噬作用）以及结合病毒抗原材料并促进去除病毒抗原材料的抗体。体液应答还可以包括黏膜应答，其包括引出或诱导特定的黏膜IgA应答。

本文所述的通过半抗原化S蛋白、片段或变体在主体或宿主（人或非人动物）中的免疫应答的诱导可以通过本文所述和本领域常规实施的方法来确定和表征。这些方法包括体内测定，例如动物免疫研究（例如使用兔、小鼠或猕猴模型），以及多种体外测定中的任何一种，例如用于检测和分析抗体的免疫化学方法，包括蛋白免疫印迹分析、ELISA、免疫沉淀法、放射免疫测定等，以及它们的组合。例如，动物模型可用于确定冠状病毒抗原在动物中引出和诱导保护性免疫应答的能力，其可以通过与特定模型相关的终点来确定。

可用于分析和表征免疫应答的其他方法和技术包括中和测定（例如空斑数降低测定或测量细胞致病作用（CPE）的测定或本领域技术人员实施的任何其他中和测定）以评估半抗原化S蛋白免疫原或其变体是否能够引出免疫应答，特别是中和免疫应答。

半抗原化的S蛋白免疫原（全长蛋白、其变体、片段和融合蛋白）以分离的形式提供，并且在某些实施方案中，被纯化至同质性。如本文所用的，术语“分离的”意指多肽从其原始或天然环境取出。

在一个实施方案中，本发明提供了一种使人主体针对冠状病毒进行免疫的方法，所述方法包括施用有效量的来自冠状病毒包括SARS-CoV-2冠状病毒的半抗原化S蛋白。在一些实施方案中，S蛋白来自SARS-CoV-2冠状病毒并且具有如图1中所述的氨基酸序列。

在一些实施方案中，半抗原化S蛋白每隔一周施用达至少八周。在一些实施方案中，半抗原化S蛋白每周施用一次达至少六周。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在第一次注射后约六个月半抗原化S蛋白的至少一次强化注射。在一些实施方案中，强化注射每六个月继续或直到在人主体中发生针对冠状病毒的免疫原性应答为止。

在一些实施方案中，每隔一周施用有效量的半抗原化S蛋白，直到迟发型超敏反应诊断试验呈阳性或检测到中和抗体应答（例如，在人主体的血液或血清中检测到抗-S蛋白抗体）为止。

在实施方案中，本发明提供了一种在人主体中产生针对冠状病毒，包括SARS-CoV-2冠状病毒的免疫原性应答的方法，所述方法包括施用有效量的来自冠状病毒，包括SARS-CoV-2冠状病毒的半抗原化S蛋白。在一些实施方案中，S蛋白来自SARS-CoV-2冠状病毒并且具有如图1中所述的氨基酸序列（SEQ ID NO:2）。

免疫方法

本文还描述了用于治疗和/或预防冠状病毒感染的方法，包括向有需要的主体施用组合物，所述组合物包含至少一种半抗原化冠状病毒S蛋白免疫原，其中所述S蛋白免疫原包含与SEQ ID NO:2相同或至少85%相同（其包括至少90%或95%或85%和100%之间的任何百分比）的氨基酸序列，并且其中所述半抗原化S蛋白免疫原具有引出保护性免疫应答的表位，其是体液免疫应答（包括，例如，黏膜IgA、全身IgA、IgG、IgM应答）和/或细胞介导的免疫应答，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。半抗原化S蛋白免疫原组合物以足以引出对所施用的一种或多种半抗原化S蛋白免疫原或其变体特异的免疫应答的剂量施用。在某些实施方案中，被预防或治疗的感染可由第1组冠状病毒、第2组冠状病毒、第3组冠状病毒、SARS组冠状病毒（包括SARS-CoV-2）或其组合引起。

适合用冠状病毒免疫原组合物或制剂治疗的人主体或宿主可以通过非常确实的发展诸如Covid-19的疾病的风险指标或通过现有冠状病毒疾病的非常确实的标志来鉴定。例如，感染的指标包括发热、干咳、呼吸困难（气短）、头痛、低氧血症（低血氧浓度）、淋巴细胞减少（lymphopaenia）（减少的淋巴细胞数目）、轻度升高的转氨酶水平（表明肝损伤）、微生物阳性培养物、炎症等。可以用如本文所述的半抗原化冠状病毒S蛋白免疫原疫苗治疗或预防的感染包括由冠状病毒引起或归因于冠状病毒的那些，不管所述感染是原发、继发还是机会感染。冠状病毒的例子包括这些病毒的任何亚型、毒株、抗原变体等，包括SARS冠状病毒，例如SARS-CoV-2。例如，SARS感染的特征在于流感样症状，包括高热、肌痛、干性和非排痰性（non-productive）呼吸困难、淋巴细胞减少和胸放射照相术上的浸润液。

含有本发明的一种或多种半抗原化冠状病毒S蛋白免疫原的免疫原性组合物可以是允许将组合物施用于主体例如人或非人动物的任何形式。例如，半抗原化的S蛋白免疫原可以作为液体溶液制备和施用，或作为固体形式制备（例如冻干的），其可以固体形式施用，或重悬浮在和施用一起的溶液中。制备或配制杂种多肽组合物以允许其中所含的活性成分在将组合物施用于主体或患者时是生物可利用的或是通过缓慢释放生物可利用的。将施用于主体或患者的组合物采用一种或多种剂量单位的形式；例如，片剂可以是单一剂量单位，而具有一种或多种气溶胶形式的本发明化合物的容器可以容纳多个剂量单位。在某些优选的实施方案中，任何上述包含本发明的半抗原化冠状病毒S蛋白免疫原的免疫原性组合物或疫苗在容器中，优选在无菌容器中。

在一个实施方案中，免疫原性组合物或疫苗经鼻施用，其中半抗原化冠状病毒S蛋白免疫原可以被细胞摄取，例如位于鼻相关淋巴组织中的细胞。其他典型的施用途径包括，但不限于，肠胃外、经皮/跨黏膜、鼻和吸入。如本文所用的术语“肠胃外”描述绕过胃肠道的施用途径，包括动脉内、皮内、肌内、鼻内、眼内、腹膜内、静脉内、皮下、黏膜下和阴道内注射或输注技术。如本文所用的术语“经皮/跨黏膜”是一种施用途径，其中免疫原性组合物通过皮肤或取道皮肤施用，包括局部的。术语“鼻”和“吸入”包括施用技术，其中将免疫原性组合物引入肺树，包括肺内或经肺。在一个实施方案中，本发明的组合物经鼻施用。

在一些实施方案中，免疫原性组合物或疫苗含有每剂约60μg至约240μg的量的半抗原化冠状病毒S蛋白。在一些实施方案中，每剂施用的半抗原化冠状病毒S蛋白的量为约1μg至约240μg。在一些实施方案中，每剂施用的半抗原化S蛋白的量为约1 µg、3 µg、5 µg、10µg、25 µg、30 µg、40 µg、50 µg、60 µg、70 µg、80 µg、90 µg、100 µg、110 µg、120 µg、130 µg、140 µg、150 µg、160 µg、170 µg、180 µg、190 µg、200 µg、210 µg、220 µg、230 µg、240 µg或更多。在一些实施方案中，半抗原化冠状病毒S蛋白的量取决于给药方案而变。例如，初始剂量可以与任何后来的免疫剂量包括加强免疫剂量相同、比其低或比其高。可以根据人主体的年龄、重量和身体状况调整每剂施用于任何人主体的半抗原化S蛋白的量。

佐剂

在一些实施方案中，本发明提供了进一步包含疫苗佐剂的用于注射的包含半抗原化S蛋白的免疫原性组合物或疫苗。

在一个实施方案中，可用作用于治疗和/或预防冠状病毒感染的免疫原性组合物的组合物含有至少一种如本文所述的能够引出免疫应答的冠状病毒抗原（免疫原）和protollin或蛋白体佐剂（参见例如美国专利No. 5,726,292）。如本领域中所理解的，佐剂可以增强或改善免疫原的免疫原性（即，充当免疫刺激剂），并且许多抗原的免疫原性很差，除非与佐剂组合或掺合或混合。多种来源可用作抗原来源，例如活减毒病毒、死病毒、片段抗原制剂（split antigen preparations）、亚单位抗原、重组或合成病毒抗原及其组合。为了使亚单位、重组或合成疫苗的有效性达到最大，可以将抗原与有效的免疫刺激剂或佐剂组合。其他示例性佐剂包括明矾（氢氧化铝，REHYDRAGEL）；磷酸铝；病毒体；具有和不具有脂质A的脂质体；或其他水包油乳剂型佐剂，例如MF-59（Novartis），也例如纳米乳剂（nanoemulsions）（参见例如美国专利No. 5,716,637）或亚微粒乳剂（submicronemulsion）（参见例如美国专利No. 5,961,970）；和弗氏完全和不完全佐剂。

基于蛋白体的佐剂（即protollin或蛋白体）可用于疫苗组合物或制剂中，所述疫苗组合物或制剂包括如本文所述的多种冠状病毒抗原（免疫原）来源中的任何一种或多种。蛋白体一般包含来自奈瑟氏球菌属（Neisseria）物种的外膜蛋白（OMP），但可以衍生自其他革兰氏阴性细菌（参见例如美国专利No. 5,726,292）。蛋白体具有自动装配（auto-assemble）成20-800 nm的小泡或小泡样OMP簇，以及与蛋白抗原特别是具有疏水部分的抗原非共价结合、协调、缔合或以其他方式合作的能力。蛋白体是疏水的，对人使用是安全的，并且在大小上与某些病毒类似。作为背景，并且不希望受理论束缚，将蛋白体与抗原例如蛋白抗原混合，提供了一种组合物，所述组合物包含抗原和蛋白体之间的非共价缔合或协调，所述缔合或协调在选择性去除增溶去污剂或降低其浓度时形成，例如，通过透析。

在蛋白体的范围内包括任何结果形成小泡或小泡样形式的外膜蛋白组分的制备方法，包括一种或多种OMP的熔球样OMP组合物。在一个实施方案中，蛋白体来自奈瑟氏球菌属物种以及来自脑膜炎奈瑟氏球菌（Neisseria meningitidis）。在某些其他实施方案中，蛋白体可以是佐剂和抗原递送组合物。在实施方案中，免疫原性组合物包含一种或多种冠状病毒抗原和佐剂，其中所述佐剂包含Projuvant或Protollin。如本文所述的，冠状病毒抗原可以从病毒颗粒、被冠状病毒感染的细胞或重组来源分离。在某些实施方案中，免疫原性组合物进一步包含第二免疫刺激剂，例如脂糖（liposaccharide）。也就是说，可以制备佐剂以包括额外的免疫刺激剂。例如，可以将projuvant与脂糖混合以提供OMP-LPS佐剂。因此，OMP-LPS（protollin）佐剂可以包含两种组分。第一组分包括由革兰氏阴性细菌如脑膜炎奈瑟氏球菌制备的蛋白体的外膜蛋白制剂（即Projuvant），且第二组分包括脂糖制剂。还预期第二组分可以包括脂质、糖脂、糖蛋白、小分子等，以及它们的组合。如本文所述的，OMP-LPS佐剂的两种组分可以以特定的初始比例组合（掺合或配制）以最优化组分之间的相互作用，从而导致供免疫原性组合物的制备之用的组分的稳定缔合和配制。方法通常包括在选择的去污剂溶液（例如Empigen BB、Tritonx-100或Mega-10）中混合组分，且然后在通过透析或通过渗滤/超滤方法将去污剂的量减少到预定的优选浓度的同时实现OMP和LPS组分的复合物形成。两种组分的混合、共沉淀或冻干也可用于实现充分且稳定的缔合、组合或配制。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含一种或多种冠状病毒半抗原化S蛋白抗原和佐剂，其中佐剂包含projuvant（即蛋白体）和脂糖。

在实施方案中，作为总蛋白体蛋白的百分比的按重量计的最终脂糖含量可以在约1％至约500％的范围内，也在约10％至约200％的范围内，或在约30％至约150％的范围内。另一个实施方案包括佐剂，其中蛋白体由脑膜炎奈瑟氏球菌制备，且脂糖由弗氏志贺氏菌（ Shigellaflexneri）或类志贺邻单胞菌（ Plesiomonasshigelloides）制备，且最终脂糖含量为按重量计总蛋白体蛋白的50％至150％。在另一个实施方案中，制备具有范围为总OMP的约0.5％最多到约5％的内源性低脂寡糖（LOS）含量的蛋白体。在另一个实施方案中，蛋白体具有范围为约12％至约25％的内源性脂糖，并且在又另一个实施方案中，内源性脂糖为总OMP的约15％至约20％。本公开内容还提供了一种免疫原性组合物，所述组合物含有衍生自任何革兰氏阴性细菌物种的脂糖，其可以来自作为蛋白体来源的相同革兰氏阴性细菌物种，或者可以来自不同的细菌物种。在某些实施方案中，免疫原性组合物中的蛋白体或protollin与冠状病毒抗原的比率大于1:1、大于2:1、大于3:1或大于4:1。在其他实施方案中，免疫原性组合物中的蛋白体或protollin与半抗原化冠状病毒S蛋白抗原的比率为约1:1、2:1、3:1或4:1。比率可以是 8:1 或更高。在其他实施方案中，免疫原性组合物的蛋白体或protollin与半抗原化冠状病毒S蛋白抗原的比率范围为约1:1至约1:500，并且为至少1:5、至少1:10、至少1: 20、至少 1:50、或至少 1:100或至少 1:200。范围为1:2至1:200的protollin与半抗原化冠状病毒S蛋白抗原比率的优点是，可以在对冠状病毒抗原引出免疫应答的能力没有显著影响的情况下显著减少基于蛋白体的佐剂的量。在另一个实施方案中，免疫原性组合物包含与蛋白体或protollin组合（掺合或配制）的一种或多种半抗原化冠状病毒S蛋白免疫原，其中所述S蛋白免疫原包含与SEQ ID NO:2相同或至少85%相同（其包括至少90%或95%或85%和100%之间的任何百分比）的氨基酸序列或其片段，并且其中半抗原化的S蛋白免疫原或其片段具有引出针对冠状病毒感染的保护性免疫应答的表位。示例性半抗原化S蛋白免疫原包含如SEQ ID NO：2所示或由SEQ ID NO：2组成的氨基酸序列。在其他实施方案中，S蛋白免疫原是SEQID NO:2的片段，所述片段包含与选自SEQ ID NO:2的氨基酸相同或至少85%相同（其包括至少90%或95%或85%和100%之间的任何百分比）的氨基酸序列。

另一方面，如本文所述的任何半抗原化S蛋白免疫原可以与脂质体组合（掺合或配制）在免疫原性组合物中。优选地，含有一种或多种冠状病毒免疫原的脂质体进一步包含耐放射异常球菌（ Deinococcusradiodurans）脂质或α-半乳糖基磷脂酰甘油烷基胺。在脂质体中添加这种脂质可以通过增加保护性免疫来增强冠状病毒疫苗组合物的功效。本发明的半抗原化冠状病毒S蛋白免疫原可以进一步包含共价附着的疏水部分。疏水部分可以是，例如，氨基酸序列或脂质，如美国专利No. 5,726,292中所公开的。具有SEQ ID NO:2所述序列的天然存在的冠状病毒S蛋白和重组表达的S蛋白含有疏水跨膜结构域（SEQ ID NO:2的约氨基酸1195至约1240），其可以起具有S蛋白免疫原片段的疏水部分的作用。在某些其他实施方案中，半抗原化S蛋白免疫原可进一步含有第二氨基酸序列以形成融合蛋白，其中所述第二氨基酸序列是如本文所述的标签、载体或酶。

在其他实施方案中，免疫原性组合物可包含（projuvant或protollin），或进一步包含能够通过与由疫苗接受者的一种或多种宿主细胞产生的某些受体（例如Toll-样受体或“TLR”）相互作用来刺激宿主免疫应答的组分（例如受体配体）。根据一个实施方案，包含冠状病毒蛋白的免疫原性表位的组合物可以含有能够与Toll-样受体相互作用的多肽表位，从而促进先天免疫应答，这可能或可能不引起后来的适应性免疫应答。

先天免疫应答是一种非特异性保护性免疫应答，其不是特异性抗原依赖性或抗体依赖性应答（即，不涉及T细胞和/或B细胞的克隆扩充），并且可能由本文所述的众多抗原、免疫原或冠状病毒的任一种引出。本文所述的免疫刺激组合物包含蛋白体和脂糖（protollin），其任一个或两者都可引出非特异性保护应答。在不希望受理论束缚的情况下，本文公开的疫苗组合物或制剂的一种或多种组分可以与与疫苗接受者的先天或适应性免疫应答有关的Toll-样受体相互作用。除了TLR8和TLR10之外，已鉴定了一种或多种与某些TLR相互作用并接着将其激活的配体。脑膜炎奈瑟氏球菌的某些外膜蛋白，例如OMP2（也称为PorB），与TLR2相互作用，而大多数但不是所有革兰氏阴性细菌的LPS与TLR4相互作用。因此，本文所述的疫苗组合物或制剂的一种可能有助于生物效果的活性包括TLR2和TLR4之一或两者的活化。其他TLR（除TLR2和TLR4以外）的激活可能起到类似的功能或进一步增强所表达的细胞因子的定性或定量概况，并可能与宿主Thl/Th2免疫应答有关。还预期除LPS和PorB以外的TLR配体可单独或组合使用以激活TLR2或TLR4。一种或多种TLR的定性或定量激活预期在具有或不具有伴随的体液抗体应答的情况下引出、实现或影响Th1或Th2免疫应答的相对刺激（平衡的或不平衡的）。与除TLR2和TLR4以外的TLR相互作用的配体也可用于本文所述的疫苗组合物中。这种疫苗组分可单独或组合用于影响足以治疗或保护免受病毒感染的宿主免疫应答的发展，如本文所述的。

本领域已知的其他组分可用于本文所述的组合物中。半抗原化S蛋白免疫原的一些实施方案可以进一步包含佐剂，例如卡介苗（BCG），细胞因子（对于非限制性实例，粒细胞-巨噬细胞集落刺激（GM-CSF）），铝凝胶或铝盐，或本领域已知的非特异性刺激免疫应答和增强对疫苗的免疫应答功效的其他佐剂。在至少一个优选的实施方案中，佐剂是BCGTice。

半抗原化S蛋白免疫原性组合物或疫苗可以进一步包含本领域中已知的防腐剂，包括但不限于，甲醛、抗生素、谷氨酸一钠、2-苯氧乙醇、酚和苄索氯铵。半抗原化S蛋白免疫原性组合物或疫苗可以进一步包含无菌注射用水、注射用平衡盐溶液。

尽管本文中显示和描述了本发明的一些实施方案，但这种实施方案仅作为例子提供，且并不意图以其他方式限制本发明的范围。在实践本发明时可以采用本发明所述实施方案的各种备择方案。因此，附加的权利要求的精神和范围不应限于其中所含的优选版本的描述。

读者请注意与本说明书同时提交的并且与本说明书一起对公众检查开放的所有文章和文件，以及所有这些文章和文件的内容都引入本文作为参考。除非另有明确说明，否则说明书（包括任何所附权利要求、摘要和附图）中公开的所有特征都可以被起相同、等同或类似目的的备择特征代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是等同或相似特征的通用系列的一个实例。

实施例

现在参考以下实施例描述本文所包括的实施方案。这些实施例仅为了举例说明起见提供，并且本文包括的公开内容决不应解释为限于这些实施例，而是应解释为包括作为本文提供的教导的结果而变得显而易见的任何和所有改变。

实施例1：制备半抗原化S蛋白

以下程序举例说明了示例性半抗原化程序。

DNP修饰。用DNP或另一种半抗原修饰制备的细胞可以通过已知方法进行，例如通过Miller, J. Immunol.(1976) 117:151l的方法，其包括在无菌条件下将S蛋白与DNFB温育30分钟，继之以用无菌盐水或HBSS-HSA洗涤。例如，可以将约100 mg的DNFB（SigmaChemical）溶解在约0.5 ml的70%乙醇中。加入约99.5 ml PBS。将溶液在37℃水浴中搅拌过夜。所述溶液的贮存期限约为四个星期。S蛋白悬浮在Hanks平衡盐溶液中。向每个S蛋白样品添加约0.1 ml DNFB溶液，并于室温温育约30分钟。

SA修饰。用SA修饰S蛋白可以通过已知方法进行。例如，在一个实施方案中，通过添加饱和量的亚硝酸钠将对氨基苯磺酸（SA）转化为重氮盐。将用冰预冷的、无菌过滤的（0.2µm）10%亚硝酸钠溶液逐滴添加到溶解于10 ml 0.1N NCl中的100 mg无水SA的SA溶液中直到饱和为止。（饱和点大约对应于约40 mM的对氨基苯磺酸重氮盐的终浓度）。然后将SA重氮盐溶液无菌过滤（0.2 µm膜），并在HBSS（不含HSA）中1:8（v/v）稀释。如果需要，则通过逐滴添加1N NaOH将pH调节到7.2。然后通过过滤（0.2 µm膜）对SA重氮盐-HBSS溶液进行灭菌。S蛋白悬浮在重氮盐-HBSS溶液中。将混合物于室温温育5分钟。五分钟温育时间段后，通过向混合物中添加0.5 ml的25％HAS-HBSS溶液来停止半抗原化反应。

实施例2：临床研究

所述实施例概述了用半抗原化S蛋白进行免疫的临床研究。

根据实施例1制备人冠状病毒疫苗，其由用半抗原二硝基苯基（DNP）修饰的来自SARS-CoV-2的重组S蛋白组成。

 进行了在患有Covid-19的患者中的半抗原化疫苗的I期试验，测试了四个剂量水平。主要终点是对DNP-修饰的、SA-修饰的和未修饰的S蛋白的中和抗体应答的存在。同样，还评估了Covid-19的进展。接着，进行了使用在I期试验中发现免疫有效的最低剂量的II期试验。

实施例3：施用方案

下表显示了半抗原化S蛋白的示例性施用方案。

实施例4：用二硝基苯基修饰的SARS-COV-2 S蛋白（BVX-0320）的制备

以下制备代表用于制备半抗原化S蛋白的方法。以前制备（prep）的规模在括号中给出。添加过滤步骤以产生无菌产品。水应为低内毒素水（无核酸酶或WFI级）。

1. 在水（无核酸酶或WFI级）中制备0.1M碳酸氢钠pH 8.2缓冲液。通过0.2-微米过滤器（Sigma s6014）过滤。

2. 解冻必要量的S-蛋白（5 mg）（如必需，则通过0.2-微米过滤器过滤）。

3. 用碳酸氢盐缓冲液对S-蛋白进行缓冲液更换。

4. 确定S-蛋白的浓度（A280，1.14 ml/mg *cm，靶浓度1 mg/mL）。

5. 在0.1M碳酸氢钠缓冲液中制备0.35M二硝基苯磺酸盐（Sigma 556971）。通过0.2-微米过滤器过滤。

6. 将S-蛋白（5 mL）和二硝基苯磺酸盐（0.375 mL，2000当量）溶液在适当大小的容器中组合（原始制备将材料分成10个小瓶）并于30℃温和搅拌18小时。

7.确保pH大于或等于8.0。

8. 使用Zeba柱（用0.1M碳酸氢盐缓冲液平衡的）将反应混合物纯化到PBS（pH7.4）中。所述步骤的目的是去除过量的试剂以及进行缓冲液更换两者。当去除所有二硝基苯磺酸盐时，溶液将无色。通过0.2-微米过滤器过滤到无菌容器中。

9. 使用BCA测定确定终浓度。

10. 分析最终材料的纯度（SEC @ 280 nm）、游离半抗原（RP-HPLC @ 235 nm）、通过LAL的内毒素、半抗原加样（与天然蛋白的MS比较）。

实施例5：CF-1小鼠中通过皮下注射的BVX-0320的毒性研究

通过皮下注射向CF-1小鼠（Charles River）施用最多到10 µg的BVX-0320。死亡率是毒性的评估。所有动物都存活到预定的尸体剖检。没有异常的BVX-0320-相关临床/兽医观察结果。额外的临床观察结果在所述年龄、性别和物种的群养（group-housed）动物的正常发现范围内，或者是程序相关的并且不被认为与测试物品施用相关。

体重和体重增加。没有BVX-0320-相关的体重影响。平均体重和个别体重之间的额外的较小波动被认为是零星的，与生物变异一致，和/或在幅度中可忽略，并且与测试物品施用不相关。没有BVX-0320-相关的食物消耗效应。平均和个别笼食物消耗之间的较小波动被认为是零星的，与生物变异一致，和/或在幅度中可忽略，并且与测试物品施用不相关。没有异常的宏观病理学发现。

总之，没有BVX-0320-相关的对体重、食物消耗或临床病征的影响。基于这些发现，BVX-0320被确定为在最多到10 µg/剂（最高测试的剂量）是良好耐受的。

实施例6：CF-1小鼠中通过皮下注射的BVX-0320的免疫学研究

通过皮下注射向CF-1小鼠（Charles River）施用0.3、1或3 µg的BVX-0320，继之以第二次注射，并在六周时获得终点（参见图1-2）。对于1 µg组：一只小鼠具有基线抗体滴度1:5。对于3 µg组，获得的滴度为1:120,000。不同组之间的统计学分析得出以下结果：0.3µg组对3 µg组，p=0.002，1 µg组对3 µg组，p=0.041，3 µg组对10 µg组，p=0.522。

因此，两次注射BVX-0320诱导了（1）针对SARS-Cov-2刺突蛋白S1亚基的抗体（图1）。所有4个剂量均诱导抗体，但在两个最高剂量（3 µg、10 µg组）中滴度显著更高。单独的佐剂（剂量 = 0 µg）不诱导抗体应答。除了在单个样品中检测到的非常低的滴度之外，疫苗前血清均为阴性。（2）在体外用衍生自S1亚基的肽库再刺激时，产生I型细胞因子、γ干扰素的脾T细胞（图 2）。所有四个剂量都是有效的。单独的佐剂（剂量 = 0 µg）没有诱导可测量的应答。（3）在体外用肽库再刺激时变得活化的脾T细胞，CD4+（表2和4）和CD8+（表3和5）两者。CD25（表4和5）和CD69（表2和3）的表达表明了活化。对于四个参数中的三个，只有两个最高剂量（3 µg、10 µg）诱导了活化。单独的佐剂（剂量 = 0 µg）不诱导T细胞活化。这些结果证实，用半抗原（DNP）修饰的刺突蛋白S1亚基BVX-0320进行免疫诱导了针对未修饰的天然刺突蛋白的抗体和T细胞应答两者。

表2：两剂BVX-0320后百分比活化的脾CD4+、CD69+ T细胞

细胞未被刺激或用衍生自SARS-Cov-2刺突蛋白S1亚基的肽库刺激。通过配对t-检验分析未刺激和肽刺激的脾细胞之间的差异。

表3：两剂BVX-0320后百分比活化的脾CD8+、CD69+ T细胞

细胞未被刺激或用衍生自SARS-Cov-2刺突蛋白S1亚基的肽库刺激。通过配对t-检验分析未刺激和肽刺激的脾细胞之间的差异。

表4：两剂BVX-0320后百分比活化的脾CD4+、CD25+ T细胞

细胞未被刺激或用衍生自SARS-Cov-2刺突蛋白S1亚基的肽库刺激。通过配对t-检验分析未刺激和肽刺激的脾细胞之间的差异。

表5：两剂BVX-0320后百分比活化的脾CD8+、CD25+ T细胞

细胞未被刺激或用衍生自SARS-Cov-2刺突蛋白S1亚基的肽库刺激。通过配对t-检验分析未刺激和肽刺激的脾细胞之间的差异。

尽管已连同具体选择的实施方案对本发明进行了描述，但应理解，所要求保护的发明不应过度限于这种具体实施方案。实际上，对于生物化学和生物技术或相关领域中的那些技术人员显而易见的用于进行本发明的所述方式的各种改变均意图在以下权利要求书的范围之内。

                         序列表

<110>  拜奥维萨公司

<120>  半抗原化冠状病毒刺突蛋白

<130>  121399-5002

<150>  62/992,722

<151>  2020-03-20

<160>  2

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  3822

<212>  DNA

<213>  冠状病毒2分离物武汉-Hu-1

<400>  1

atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc      60

agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac     120

aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc     180

aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat     240

aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata     300

ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt     360

aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt     420

ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat     480

tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa     540

ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat     600

tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt     660

tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact     720

ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct     780

ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat     840

gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag     900

tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc     960

caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa    1020

gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac    1080

tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat    1140

ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt    1200

gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat    1260

tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat    1320

cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat    1380

ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt    1440

aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact    1500

aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca    1560

ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat    1620

ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg    1680

cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag    1740

acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca    1800

ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc    1860

cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct    1920

aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat    1980

gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct    2040

cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt    2100

gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt    2160

agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg    2220

tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt    2280

acacaattaa accgtgcttt aactggaata gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa    2340

gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt    2400

aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca agaggtcatt tattgaagat    2460

ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc    2520

cttggtgata ttgctgctag agacctcatt tgtgcacaaa agtttaacgg ccttactgtt    2580

ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact gttagcgggt    2640

acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg    2700

caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttctcta tgagaaccaa    2760

aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc actttcttcc    2820

acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agctttaaac    2880

acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc    2940

ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga    3000

cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct    3060

tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc aaaaagagtt    3120

gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc tcatggtgta    3180

gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga acttcacaac tgctcctgcc    3240

atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca    3300

cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca    3360

tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct    3420

ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca    3480

tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa    3540

aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc    3600

caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt    3660

atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat gaccagttgc    3720

tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct gcaaatttga tgaagacgac    3780

tctgagccag tgctcaaagg agtcaaatta cattacacat aa                       3822

<210>  2

<211>  1273

<212>  PRT

<213>  冠状病毒2分离物武汉-Hu-1

<400>  2

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1               5                   10                  15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

            20                  25                  30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

        35                  40                  45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

    50                  55                  60

Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

65                  70                  75                  80

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

                85                  90                  95

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

            100                 105                 110

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

        115                 120                 125

Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr

    130                 135                 140

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

145                 150                 155                 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

                165                 170                 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

            180                 185                 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

        195                 200                 205

Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

    210                 215                 220

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

225                 230                 235                 240

Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

                245                 250                 255

Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

            260                 265                 270

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

        275                 280                 285

Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys

    290                 295                 300

Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val

305                 310                 315                 320

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

                325                 330                 335

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

            340                 345                 350

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

        355                 360                 365

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

    370                 375                 380

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

385                 390                 395                 400

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

                405                 410                 415

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

            420                 425                 430

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

        435                 440                 445

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

    450                 455                 460

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

465                 470                 475                 480

Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

                485                 490                 495

Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

            500                 505                 510

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

        515                 520                 525

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

    530                 535                 540

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

545                 550                 555                 560

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

                565                 570                 575

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe

            580                 585                 590

Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

        595                 600                 605

Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile

    610                 615                 620

His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser

625                 630                 635                 640

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val

                645                 650                 655

Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

            660                 665                 670

Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala

        675                 680                 685

Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser

    690                 695                 700

Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile

705                 710                 715                 720

Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val

                725                 730                 735

Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu

            740                 745                 750

Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr

        755                 760                 765

Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln

    770                 775                 780

Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe

785                 790                 795                 800

Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser

                805                 810                 815

Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly

            820                 825                 830

Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp

        835                 840                 845

Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu

    850                 855                 860

Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly

865                 870                 875                 880

Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile

                885                 890                 895

Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr

            900                 905                 910

Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn

        915                 920                 925

Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala

    930                 935                 940

Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn

945                 950                 955                 960

Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val

                965                 970                 975

Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln

            980                 985                 990

Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg  Leu Gln Ser Leu Gln  Thr Tyr Val

        995                 1000                 1005

Thr Gln  Gln Leu Ile Arg Ala  Ala Glu Ile Arg Ala  Ser Ala Asn

    1010                 1015                 1020

Leu Ala  Ala Thr Lys Met Ser  Glu Cys Val Leu Gly  Gln Ser Lys

    1025                 1030                 1035

Arg Val  Asp Phe Cys Gly Lys  Gly Tyr His Leu Met  Ser Phe Pro

    1040                 1045                 1050

Gln Ser  Ala Pro His Gly Val  Val Phe Leu His Val  Thr Tyr Val

    1055                 1060                 1065

Pro Ala  Gln Glu Lys Asn Phe  Thr Thr Ala Pro Ala  Ile Cys His

    1070                 1075                 1080

Asp Gly  Lys Ala His Phe Pro  Arg Glu Gly Val Phe  Val Ser Asn

    1085                 1090                 1095

Gly Thr  His Trp Phe Val Thr  Gln Arg Asn Phe Tyr  Glu Pro Gln

    1100                 1105                 1110

Ile Ile  Thr Thr Asp Asn Thr  Phe Val Ser Gly Asn  Cys Asp Val

    1115                 1120                 1125

Val Ile  Gly Ile Val Asn Asn  Thr Val Tyr Asp Pro  Leu Gln Pro

    1130                 1135                 1140

Glu Leu  Asp Ser Phe Lys Glu  Glu Leu Asp Lys Tyr  Phe Lys Asn

    1145                 1150                 1155

His Thr  Ser Pro Asp Val Asp  Leu Gly Asp Ile Ser  Gly Ile Asn

    1160                 1165                 1170

Ala Ser  Val Val Asn Ile Gln  Lys Glu Ile Asp Arg  Leu Asn Glu

    1175                 1180                 1185

Val Ala  Lys Asn Leu Asn Glu  Ser Leu Ile Asp Leu  Gln Glu Leu

    1190                 1195                 1200

Gly Lys  Tyr Glu Gln Tyr Ile  Lys Trp Pro Trp Tyr  Ile Trp Leu

    1205                 1210                 1215

Gly Phe  Ile Ala Gly Leu Ile  Ala Ile Val Met Val  Thr Ile Met

    1220                 1225                 1230

Leu Cys  Cys Met Thr Ser Cys  Cys Ser Cys Leu Lys  Gly Cys Cys

    1235                 1240                 1245

Ser Cys  Gly Ser Cys Cys Lys  Phe Asp Glu Asp Asp  Ser Glu Pro

    1250                 1255                 1260

Val Leu  Lys Gly Val Lys Leu  His Tyr Thr

    1265                 1270

Claims (17)

1.免疫原性组合物，其包含来自冠状病毒的半抗原化刺突蛋白（S蛋白）或其片段和至少一种药学上可接受的载体。

2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述S蛋白来自SARS-CoV-2。

3.根据权利要求2所述的免疫原性组合物，其中所述其片段包含S蛋白的S1结构域。

4. 根据权利要求2所述的免疫原性组合物，其中所述S蛋白包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

5.根据任一项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述半抗原化S蛋白以60至240μg的量存在。

6.根据任一项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述半抗原是二硝基氟苯（DNFB）。

7.根据任一项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述半抗原选自三硝基氯苯（TNCB）、2,4-二氟硝基苯（DNFB）、N-碘乙酰基-N'-(5-磺基-1-萘基)乙二胺（AED）、对氨基苯磺酸（SA）、三硝基苯酚（TNP）和2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）。

8.根据任一项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。

9.根据权利要求8所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂是水包油乳剂。

10.根据权利要求9所述的免疫原性组合物，其中所述油是角鲨烯油。

11.根据权利要求10所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂是M59。

12.使人主体针对冠状病毒免疫的方法，其包括向所述人主体施用根据权利要求1-11中任一项所述的免疫原性组合物。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述免疫原性组合物每周施用一次达至少三周。

14.根据权利要求13所述的方法，所述方法进一步包括在第一次注射后约十二个月施用免疫原性组合物的至少一次强化注射。

15.根据权利要求12-14中任一项所述的方法，其中施用所述免疫原性组合物直到在所述人主体中检测到冠状病毒中和抗体应答为止。

16.根据权利要求12-15中任一项所述的方法，其中所述人主体患有Covid-19。

17.根据权利要求12-15中任一项所述的方法，其中所述人主体未患有Covid-19。

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